DE2547105A1 - N-acetyl-muramyl-l-alanyl-d-isoglutamin enthaltende oelfreie adjuvanzien - Google Patents

N-acetyl-muramyl-l-alanyl-d-isoglutamin enthaltende oelfreie adjuvanzien

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DE2547105A1
DE2547105A1 DE19752547105 DE2547105A DE2547105A1 DE 2547105 A1 DE2547105 A1 DE 2547105A1 DE 19752547105 DE19752547105 DE 19752547105 DE 2547105 A DE2547105 A DE 2547105A DE 2547105 A1 DE2547105 A1 DE 2547105A1
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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr.K.Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber,
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22
BUHZ - EG/SLV/JTa 543 75 B
AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (A N V A R), Rue Madeleine Michelis, F 92 522-Neuilly-sur-Seine
N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthaltende ölfreie
Adjuvanzien
Zusatz zu Patent
Patentanmeldung P 24 50 355.7
Die Erfindung betrifft ölfreie pharmazeutische Zusammensetzungen, die als immunologische Adjuvanzien wirken und in den damit behandelten Wesen die Immunreaktionen auf Antigene unterschiedlicher Art stimulieren. Die Erfindung betrifft insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Wirkung schwacher Immunogene verstärken und steigern.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere als Adjuvanzien geeignete Mittel, die für die Immunisierung des Menschen und
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warmblütiger Tiere gegen durch Bakterien, Viren und Parasiten hervorgerufene Infektionen und gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen Ursprungs, insbesondere gegen Tumore, geeignet sind.
In der Patentanmeldung P 22 56 838.3, die am 20. Nov. 1972 eingereicht wurde,-sind Adjuvanzien beschrieben, die mittels eines Verfahrens erhalten werden, das' im wesentlichen darin besteht, einen Mycobakterienstamm, Nocardia-Zellen oder verwandte Mikroorganismen zu züchten, die Zellen des gezüchteten Stammes zu gewinnen, sie aufzubrechen, die aufgebrochenen Zellwände beispielsweise durch Differentialzentrifugieren zu gewinnen, die Wachse, freie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren abzutrennen und zu entfernen, das von den Zellwänden stammende, von Lipiden befreite Material mit einem murolytischen Enzym, wie Lysozym, zu digerieren, den festen Rückstand zu beseitigen und die wäßrige Fraktion zu gewinnen, die die genannten löslichen Stoffe enthält, welche ggfo noch weiter gereinigt werden, z«B. durch Filtration der genannten wäßrigen Fraktion über ein Molekularsieb von der Art eines Polydextrangels (SEPHADEX^) oder von entsprechender Art.
Wie bereits in der genannten Patentanmeldung angegeben, besteht der wirksame Bestandteil dieser Adjuvanzien im wesentlichen aus einem Oligomeren, dessen monomere Einheiten im wesentlichen jenen der Polymeren der Zellwände der Mycobakterien oder Nocardia-Zellen,aus denen sie extrahiert worden sind, entsprechen.
Wie bereits in der genannten Patentanmeldung gezeigt, besitzen die fraglichen wasserlöslichen Adjuvanzien eine bemerkenswerte Aktivität, wenn sie Versuchstieren in Form einer Öl-Wasser-Emulsion verabreicht werden. Unter
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bestimmten Versuchsbedingungen besitzen sie auch dann eine gewisse Adjuvans-Aktivität, wenn sie" in Form einer wäßrigen Lösung verabreicht werden (Versuch von N.K. JERNE et al, beschrieben in "Cells bound antibodies", herausgegeben von B. Ames und H. Koprovski, Wistar Institute Press, Philadelphia, 1963). Indessen betrifft der Versuch von Jerne nur örtlich begrenzt gebildete Antikörper und er ist nicht zur Ermittlung einer die Antikörperbildung stimulierenden Aktivität geeignet, die unspezifisch auf eine Vervielfachung des Spiegels an ständig umlaufenden Antikörpern gerichtet ist; nun induzieren aber diese Adjuvanzien in wäßriger Lösung in vivo keine Erhöhung des Spiegels der ständig umlaufenden Antikörper (die im Serum vorhanden sind).
Es zeigt sich also, daß die Adjuvans-Aktivität bei wäßrigen Lösungen der in der genannten Patentanmeldung beschriebenen Mittel nur von sehr vermindertem therapeutischem Interesse sein konnte, so daß sämtliche weiteren Untersuchungen hinsichtlich der therapeutischen Anwendbarkeit dieser Mittel an Öl-Wasser-Emulsionen durchgeführt wurden. Ebenso war es mit den verschiedenen Produkten immer geringeren Molekulargewichts, die Extrakte oder Derivate der genannten Adjuvantien darstellten.
Tatsächlich muß, wie aus der Patentanmeldung P 24 50 355.7, eingereicht am 23. 10. 1974, hervorgeht, die Adjuvans-Aktivität der in Form einer Öl-Wasser-Emulsion verabreichten Zusammensetzungen der Anwesenheit löslicher Bruchstücke von Peptidoglykanen zugeschrieben werden, welche in den molekularen Aufbau der Zellwände der Bakterien, auf die mittels des genannten Verfahrens eingewirkt wird, eintreten. Genauer gesagt,werden in dieser Patentanmeldung wasserlösliche Adjuvanzien beschrieben,
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die aus Bruchstücken von Peptidoglykanen bestehen, welche wiederum aus Polysaccharid-Polypepti'den von geringem Molekulargewicht gebildet sind, d.h. aus Oligosaccharid-Oligopeptiden, deren Polysaccharidteil teils aus N-Acetyl-glukosamin-Einheiten, teils aus N-Acyl-muraminsäure-Einheiten, insbesondere aus N-Glykolyl-muraminsäure-Einheiten aufgebaut ist.
Weiter geht aus der Patentanmeldung P 24 50 355.7 hervor, daß der N-Acetyl-glokosamin-Teil nicht notwendig ist, um die Adjuvans-Eigenschaft der auf der Grundlage von löslichen Peptidoglykan-Bruchstücken aufgebauten Zusammensetzungen zu bewirken. In dieser Patentanmeldung wird ein synthetisches wasserlösliches Adjuvans beschrieben, das aus einem N-Acetyl-muraminsäure-dipeptid besteht, wobei die Dipeptidseitenkette vorzugsweise aus L-Alanin, das direkt an die N-Acetyl-muraminsäure gebunden ist, und D-Glutaminsäure, welche vorzugsweise als c*-Amid vorliegt, besteht. Im letzteren Fall handelt es sich um N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (Mur-NAc-L-Ala-D-Glu- (X-NH2) mit der Formel:
O H> 0H
NHAc
-CONH-CHCONH-CH-CONH
:h
ooh
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Diese Verbindung kann auch als 2-(2-Acetamido-2-desoxy- -3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-o<-isoglutamin bezeichnet werden.
Wie die aus den wichtigeren Molekülen gebildeten Adjuvanzien, deren Aufbau oben genannt wurde, besitzt auch das Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-oC-NHp eine ausgezeichnete Adjuvans-Aktivität bei Verabreichung an Versuchstiere in Form einer Öl-Wasser-Emulsion.
Die Notwendigkeit jedoch, auf Öl-Wasser-Emulsionen zurückzugreifen, damit die Adjuvans-Wirkung der Agenzien der in Rede· stehenden Art deutlich zu Tage tritt, ist mit Unannehmlichkeiten verbunden. Die meisten bekannten bis heute zur Herstellung dieser Emulsionen verwendeten Öle bestehen im allgemeinen aus Paraffinölen oder entsprechenden nicht metabolisierbaren Ölen. Überdies besitzen die Emulgatoren, die diesen Emulsionen die notwendige Stabilität verleihen, z.B. diejenigen, die unter der Bezeichnung 11ARLACEL" (Mannitol-mono-oleat) bekannt sind, überhaupt nicht die wünschenswerte Unschädlichkeit. Alle diese Unannehmlichkeiten beschränken doch beträchtlich den Gebrauch der wasserlöslichen Adjuvanzien der beschriebenen Art bei therapeutischen Anwendungen, zum mindesten bei der Humantherapie.
Um diese Unannehmlichkeiten wenigsten zum Teil zu vermeiden, ist vorgeschlagen worden, Öl-Wasser-Emulsionen mit Öl pflanzlichen Ursprungs zu schaffen, und verschiedene Versuche wurden in diesem Sinne unternommen, aber die meisten Autoren stießen auf Probleme im Zusammenhang mit der Stabilisierung dieser Emulsionen. Dieses Problem ist zu einem großen Teil durch die in der französischen Patentanmeldung 75/04003, eingereicht am 7. 2. 1975, beschriebene Erfindung gelöst worden. Dort wird eine stabilisier-
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te Pflanzenöl-Wasser-Emulsion beschrieben, die als Träger für die Verabreichung von Mitteln der in Rede stehenden Art geeignet ist, insbesondere als Träger für das erwähnte N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin. Obwohl diese Erfindung einen wichtigen Fortschritt darstellt, vermag sie nicht die Notwendigkeit, auf eine Öl-Wasser-Emulsion zurückzugreifen, zu beseitigen.
Die Erfindung beruht auf der ganz besonders wichtigen Entdeckung, daß entgegen jeder Erwartung das N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin eine bemerkenswerte unspezifische Adjuvans-Aktivität sogar dann besitzt, wenn es einem Wesen in ölfreier wäßriger Lösung verabreicht wird. Wegen seiner chemischen Verwandtschaft mit den früheren, aus Bakterienextrakten bestehenden Adjuvanzien konnte nichts darauf hindeuten, daß N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin diese Wirkung haben könnte, insbesondere die Eigenschaft haben könnte, die Bildung von in vivo ständig umlaufenden Antikörpern zu begünstigen, und zwar ohne Mitwirkung eines mineralischen oder pflanzlichen Öles im Verabreichungsmedium. Die erfindungsgemäße Bereitstellung ölfreier Zusammensetzungen in Form wäßriger Lösungen mit Adjuvans-Eigenschaften stellt einen wesentlichen Fortschritt auf dem Gebiet der therapeutischen Verabreichung von als unspezifische Adjuvanzien wirkenden Immunmedikamenten dar, insbesondere auf dem Gebiet der Human therapie. Da das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin nicht nur löslich, sondern darüber hinaus in wäßriger Lösung aktiv ist, kann es seine Aktivität in physiologischen Flüssigkeiten entfalten, was bei den früher bekannten unspezifischen Immunadjuvanzien nicht der Fall war.
Außerdem wurde festgestellt, daß im Gegensatz zu den früher beschriebenen wasserlöslichen Mitteln das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin weder eine Sensibilisierung
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des Lebewesens gegen das N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D- -isoglutamin selbst,noch gegen die verschiedenen vorstehen! genannten und ausgehend von Mycobakterien und entsprechenden Mikroorganismen hergestellten Adjuvanzien hervorruft. Diese Sensibilisierung, die durch die früher beschriebenen wasserlöslichen Adjuvanzien hervorgerufen wird, wird durch Hypersensibilisierungsreaktionen vom Tuberkulin-Typ bei Lebewesen offenbar, die schon früher mit denselben Adjuvanzien oder mit Keimen oder Extrakten von Mycobakterien in Berührung gekommen sind. Das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin stellt jedoch kein Sensitin dar; anders ausgedrückt, es besitzt keine immunogenen Eigenschaften und ruft insbesondere keine Reaktionen bei den Lebewesen hervor; die gegenüber Tuberkelbazillen empfindlich oder sensibilisiert sind. Es besitzt keine Antigenstruktur von der Art der früheren Adjuvanzien. Das N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin ist in dieser Beziehung absolut unschädlich bei Lebewesen, die schon früher mit ihm selbst, mit den erwähnten bekannten Ad^uvanzien oder mit Mycobakterien oder entsprechenden Mikroorganismen in Berührung gekommen sind.
Die Erfindung betrifft auch ölfreie Zusammensetzungen, die N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen enthalten.
Die Erfindung betrifft insbesondere ölfreie Lösungen, die N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthalten, genauer sterile oder sterilisierbare, injizierbare oder zur Verwendung für die Herstellung von insbesondere auf der Stelle zubereiteten injizierbaren Lösungen geeignete Lösungen. Sie betrifft im besonderen wäßrige physiologische Lösungen, besonders isotonische Lösungen die-
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ser Verbindung von der Art isotonischer Salz- oder Glukoselösungen. Es ist klar, daß diese Beispiele in keiner Weise begrenzenden Charakter haben, was die Erläuterung der physiologisch verträglichen Produkte betrifft, die zur Herstellung injizierbarer isotonischer Lösungen verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft indessen auch Lösungen von N-Acetylmur.amyl-L~alanyl-D-isoglut.amin in destilliertem Wasser und, anders ausgedrückt, in Wasser, das im wesentlichen frei von Produkten wie mineralischen Salzen ist, die beim Verdampfen des Wassers einen festen Rückstand hinterlassen, wobei solche"Lösungen zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden können.
Die Erfindung hat weiter Zusammensetzungen oder Lösungen der oben genannten Art zum Ziel, in denen das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin mit einem als Impfstoff wirksamen Antigen, insbesondere einem schwachen Immunogen, vereinigt ist, welches geeignet ist, die Fähigkeit des Organismus zu verstärken, Antikörper - gegen dieses Antigen zu bilden.
Die Erfindung betrifft auch N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin in lyophilisiertem Zustand, wobei das Lyophilisat ggf. eine Mischung aus einem als Impfstoff wirksamen Antigen und N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthält.
Die Erfindung betrifft außerdem ölfreie pharmazeutische, ein Adjuvans enthaltende Zusammensetzungen, insbesondere wäßrige, injizierbare Impfzusammensetzungen, die außer dem Adjuvans noch einen aktiven Hauptimpfstoff enthalten, wobei diese pharmazeutischen Zusammensetzungen so beschaffen sind, daß sie durch intramuskuläre oder subkutane
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Injektionen, durch Injektionen in die Haut oder mit Hilfe der Impflanzette verabreicht werden können.
Sie bezieht sich gleichermaßen auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die auf andere Weise verabreicht werden können, insbesondere auf oralem oder rektalem Wege oder in Form von Aerosolen, welch letztere dazu bestimmt sind, die Zusammensetzungen mit Schleimhäuten, insbesondere mit den Augen-, Nasen- oder Vaginalschleimhäuten in Berührung zu bringen.
Hieraus folgt, daß die Erfindung ebenfalls pharmazeutische. Zusammensetzungen betrifft, in denen das N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin mit verträglichen festen oder flüssigen pharmazeutischen Trägerstoffen vereinigt ist, deren Art jeweils an die orale, okuläre oder nasale Anwendungsform angepaßt ist,oder Zusammensetzungen mit gelatineartigen Trägerstoffen zur vaginalen Anwendung. Sie betrifft auch flüssige isotonische N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthaltende Zusammensetzungen, die der Anwendung auf die Augen- oder Nasenschleimhäute angepaßt sind. Sie betrifft endlich Zusammensetzungen, die aus pharmazeutisch verträglichen verflüssigten . Treibgasen bestehen, . in denen das N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin gelöst oder suspendiert ist und deren Entspannung die Verteilung zu einem Aerosol verursacht.
Die Erfindung hat auch eine pharmazeutische Zubereitung zum Ziel, die zum einen eine oder mehrere einheitliche Dosis-Einheiten von N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthält, und zwar Einheiten von 10 - 100 mg, insbesondere von 30 mg, in lyophilisierter Form, und die zum anderen Ampullen in entsprechender Zahl
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enthält, welche je einen ml einer isotonischen, z.B. chloridhaltigen Lösung zur sofortigen"Herstellung einer dosierten Lösung enthalten, insbesondere für die Anwendung durch Injektion.
Bei pharmazeutischen Zubereitungen für orale Applikation beträgt die Dosis-Einheit etwa zwischen 10 und 200 mg N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.
Weitere Merkmale der Erfindung gehen aus der folgenden Versuchsbeschreibung hervor, in der die pharmakologisehen Eigenschaften wäßriger ölfreier N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin enthaltender Lösungen klar zu Tage treten.
I. Pharmakologische Eigenschaften
1. Bestimmung der Toxizität
Bei diesem Versuch wird die letale Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung mit derjenigen von Lipopolysaccharid (LPS), das aus S. Enteriditis-Zellen durch Extraktion mit einer Wasser-Phenol-Mischung gewonnen wird, verglichen. Bei diesem Vergleich stellt das LPS eine Verbindung dar, die für seine Adjuvans-Aktivität bei Verabreichung in wäßriger Lösung bekannt ist, die aber wegen ihrer sehr hohen Toxizität nicht in einem solchen Umfang wie jene verwendet werden kann.
Die Versuche wurden nach der Methode von L. Chedid et al, Ann. N. Y. Acad. Sei. 1J53, 712 (1966), durchgeführt. Die Versuche wurden an 2 Monate alten Swiss-Mäusen durchgeführt. Die untersuchten Produkte wurden durch intravenöse Injektion appliziert.
Auf diese Weise wurde festgestellt, daß die DLc0 des LPS etwa 300 ftg beträgt.Wenn den untersuchten Mäusen vorher die Nebenniere entfernt wird, um sie besonders empfindlich
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zu machen, beträgt die DLc0 nicht mehr als 0,02 /-<g.
Das Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-c<-NH2 wurde deshalb Mäusen, denen die Nebenniere entfernt worden war, in Dosen von 300 Mg verabreicht. Alle Mäuse überlebten diese Injektion.
In Dosen, bei denen.die Verbindung gemäß der Erfindung eine gute Wirksamkeit als Adjuvans aufweist (die Dosen sind gemäß den folgenden Versuchen bestimmt), ist sie nicht toxisch.
2. Ad.juvans-Eigenschaft in wäßriger Lösung
Bei den Versuchen wird der Antikörperspiegel bestimmt, der im Gefolge von Injektionen verschiedener Verbindungen gebildet wurde. Die den Mäusen injizierten Verbindungen enthalten ein aus Rinderserumalbumin (RSA) und der Adjuvans-Verbindung gemäß der Erfindung bestehendes Antigen. Anderen Mäusen wird ein Vergleichstiter an RSA mit Lipopolysacchariden eingespritzt. Die Injektionen erfolgen in Form isotonischer Salzlösungen. Die Dosis an injiziertem RSA beträgt 0,5 mg je Maus, die Auffrischungsdosis (30 Tage nach der ersten Injektion) beträgt 0,1 mg. Jede untersuchte Verbindung wird einer Gruppe von 8 Mäusen verabreicht, denen nach verschieden langen Zeiträumen nach der Injektion Blut entnommen wird, um die Entwicklung des Antikörperspiegels zu verfolgen.
Der Antikörperspiegel wird entweder durch indirekte
Hämagglutination (PHA) bestimmt, wobei Schaf-Hämatien verwendet werden, die mit Formalin behandelt und mit dem untersuchten Antigen bedeckt wurden, oder er wird nach der Methode von A. A. Hirata und MW. Brandiss, J. Immunol., 100, 641 - 648,(1968), bestimmt, oder nach der genannten Methode der Fixierung des Antigens durch das Serum (ABC),
*)bei Mäusen
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wie sie von P. Minden und S. Farr beschrieben wird (Handbook of Exp. Immunology, S. 463, Weir 'D. M. ed Blackwell Scientific Pub, Oxford and Edinburgh, 1967).
Die Ergebnisse dieser ersten Versuche sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Sie zeigen,daß das Mur-NAc-L-Ala-D-GIuo( -NH2 bei Applikation in isotonischer Salzlösung ein Ansteigen des Antikörperspiegels hervorruft, das mit dem durch die Injektion von LPS hervorgerufenen vergleichbar ist. Im Falle der Primärreaktion ist dieser Spiegel sogar höher.
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Tabelle
Primärre aktion Tag 28. Tag Sekundärreaktion Tag ABC 36. Tag ABC
Verbindung
Dosis/Maus		 14. ABC PHA ABC 34. < 20 PHA < 20
PHA <20 < 3 < 20 PHA 120 12 530
Vergleich RSA < 3 < 20 6 < 20 < 3 110 715 1600
LPS 30/<g + RSA < 3 < 20 6 <· 20 100 " 210 1300 400
LPS 100 /^g + RSA < 3 < 20 25 75 50 230 800 550
Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-*-NH 30 /Ug
+ RSA ά ' 		3 < 20 25 50 200 975
Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-oC-NH^ 300 /Ug
+RSA ά ι 		<3 200
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Die Ergebnisse werden bestätigt beim Vergleich der Verbindung gemäß der Erfindung mit den WSA-Aüjuvanzien, die ausgehen von M. Smegmatis-Zellen nach der Methode von A. Adam et al, Infec. Immun., 7, 855 - 861, (1973), oder nach der in der franz. Patentanmeldung Nr. 71 4161O vom 19. 11. 1971 beschriebenen Methode erhalten werden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt. Sie zeigen, daß das WSA in wäßriger Lösung praktisch inaktiv ist, während man mit der erfindungsgemäßen Verbindung erhöhte Antikörperspiegel erhält.
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Tabelle 2
σ> σ to op
co
ο co
Verbindung
Dosis/Maus		 14. Tag ABC 28. Tag ABC 34. Tag ABC 36. Tag 3 ABC
Vergleich RSA PHA < 20 PHA < 20 PHA < 20 PHA 6 < 20
WSA 300 /Ug + RSA <3 < 20 < 3 < 20 3 <20 2150 65
MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-(TC-NHp 100/Ug
+ RSA '		 < 3 < 20 < 3 82 6 270 520
<3 25 400
VJl I
Ol
in
3. Induzierte Hypersensibilität gegenüber verschiedenen Antigenen vom Tuberkel- oder MycobaRterien-Typ.
Das Mur-NAc-L-AIa-D-GIu- oi-NHp wurde auch auf seine Fähigkeit hin untersucht, Hypersensibilitätsreaktionen gegenüber verschiedenen zusammen mit dem unvollständigen Freund'sehen Adjuvans (FIA) injizierten Verbindungen zu induzieren. Gleichzeitig wurden Versuche mit Vergleichstitern des vollständigen Freund1sehen Adjuvans (FCA) durchgeführt.
Der Hautversuch wird an Meerschweinchen (Hartley) mit einem Gewicht von 350 g durchgeführt. In die Hinterpfote wird entweder Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-CK-NH2 zusammen mit FIA oder FCA injiziert. 18 Tage nach dieser ersten Injektion werden die in Tabelle 3 genannten Antigene injiziert. 48 Stunden nach dieser zweiten Injektion wird der Durchmesser der Induration (in mm) am Einstichspunkt der zweiten Injektion gemessen.
Die in Tabelle 3 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß Behandlung mit FIA und mit MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-(X-NH2 keine Hypersensibilitätsreaktion gegenüber den untersuchten Verbindungen, insbesondere keine gegenüber sich selbst, induziert. Es ist also kein Immunogen.
4. Reaktion auf Grippeviren
Die Adjuvans-Aktivität des Mur-NAc-L-Ala-D-Glu- 0(-NH2 wurde auch gegenüber einem Grippeimpfstoff an der Maus untersucht. Die Tiere erhalten eine erste Injektion von Impfstoff zusammen mit dem Adjuvans und 30 Tage später eine Auffrischung mit Impfstoff allein. Vergleichstiere werden nur mit Impfstoff behandelt.
Es wird ein starker Anstieg des Antikörperspiegels bei den Tieren festgestellt, die das Adjuvans und dazu noch den Impf-
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stoff erhielten, gegenüber den Spiegeln, die bei den Vergleichstieren gemessen wurden (durch Inhibierung der Hämagglutination von Hühner-Erythrozyten nach der Methode, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) 1953 vorgeschlagen wurde)
II. Beispiel einer pharmazeutischen Zubereitung
Diese ' Zubereitung ist für die sofortige Herstellung einer dosierten injizierbaren Adjuvans-Lösung bestimmt und enthält:
- Dosis-Einheiten von 30 mg 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamin in lyophilisierter Form,
- pro Dosis-Einheit eine Ampulle, die 1 ml injizierbare isotonische natriumchloridhaltige Lösung enthält.
Man erhält ölfreie Adjuvans-Zusammensetzungen ohne Toxizität und ohne unheilvolle Sekundärwirkungen, so daß sie ganz besonders zur Therapie geeignet sind.
Man erhält Adjuvans-Zusammensetzungen, die die Wirksamkeit van Impfstoffen bakteriellen oder viralen Ursprungs zu steigern vermögen, insbesondere wenn es sich um schwache Immunogene handelt. Sie können insbesondere dazu benutzt werden, die Immunisierung von Lebewesen (Mensch oder Tier) gegenüber Infektionen bakteriellen oder viralen Ursprungs, gegenüber Tumor-Antigenen, Protozoen-Antigenen usw. zu begünstigen. Sie sind in gleicher Weise wirksam zur Herstellung von Seren, die gegenüber diesen Antigenen aktive Antikörper enthalten.
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Tabelle
σ co ο
Verbindung Hautversuch Tuberkulin
gereinigt, 50 IE		 Tuberkulin
älter Art 50 IE		 WSA
5/Ug		 Mur-NAc-L-Ala-
D-iso-Glu
5/Ug
Dosis/Meerschweinchen 10,7,10,7,10,7
0,0,0,0,0,0		 14,10,13,12,13,5
0,0,0,0,0,0		 6,7,0,
6,3,5.
0,0,0,
0,0,0		 0,0,0,0,0,0
0,0,0,0,0,0
FCA
FIA + Mur-NAc-L-Ala-
D-GIu-UC-KH2
50/Ug

Claims (16)

Patentansprüche
1. Ölfreie Adjuvans-Zusammensetzung, enthaltend N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin als Wirkstoff.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wäßrigen Lösung des Wirkstoffs besteht.
3. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel destilliertes V/asser oder Wasser ist, das nach seiner Verdampfung im wesentlichen keinen mineralischen Rückstand hinterläßt.
4. Lösung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine wäßrige isotonische Lösung ist.
5. Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie steril ist.
6. Lösung nach Anspruch 4 oder nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie injizierbar ist.
7. Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein als Impfstoff wirkendes Antigen enthält.
8. Lyophilisiertes N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin in für die sofortige Herstellung einer injizierbaren wäßrigen Lösung geeigneter Form.
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2 5 4 7 1 Π
9. Lyophilisat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein mit dem N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin vermischtes, als Impfstoff wirkendes Antigen enthält.
10. Eine Immuno-Adjuvans-Wirkung ausübendes Heilmittel, welches keine Hypersensibilisierungsreaktion bei Behandelten induziert, die bereits mit N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin oder mit Mycobakterien oder Extrakten von Mycobakterien oder mit Adjuvanzien von der Art, die aus Mycobakterien oder Nocardia extrahierbar sind, in Berührung gekommen sind, und das in der Lage ist, in vivo eine Erhöhung des Spiegels zirkulierender Antikörper hinsichtlich eines gegebenen Antigens zu begünstigen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer ölfreien N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-Zusammensetzung besteht und ausgehend von einer Zusammensetzung oder Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder ausgehend von einem Lyophilisat nach einem der Ansprüche 8 bis 9, hergestellt ist.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zum N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und dem ggf. zugefügten als Impfstoff wirkenden Antigen einen Trägerstoff von der Art enthält, die zur rektalen Verabreichung einer solchen Zusammensetzung geeignet ist.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zum N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und dem ggf. zugefügten als Impfstoff wirkenden Antigen einen pharmazeutisch verträglichen, insbesondere festen Trägerstoff enthält, der die orale Applikation dieser Zusammensetzung gestattet.
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-21- 2 5 4 7 1 Π S
13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zu dem N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und dem ggf. zugefügten als Impfstoff wirkenden Antigen verflüssigte Treibgase enthält, in denen ihre Wirkstoffe gelöst oder suspendiert sind und deren Entspannung die Verteilung zu einem Aerosol hervorruft.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zu dem N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und dem ggf. zugefügten als Impfstoff wirkenden Antigen einen Trägerstoff von der Art enthält, die zur vaginalen Verabreichung solcher Zusammensetzungen geeignet ist, insbesondere von der Art, die aus gelatineartigen Trägerstoffen besteht.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Sie zusätzlich zu dem N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und dem ggf. zugefügten als Impfstoff wirkenden Antigen eine wäßrige isotone Lösung enthält, die für die lokale nasale, okuläre oder vaginale Applikation geeignet ist.
16. Pharmazeutische Zubereitung, zum einen bestehend aus einer oder mehreren Dosis-Einheiten von 10 - 100 mg, insbesondere von 30 mg N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin in lyophilisierter.Form, und zum anderen aus Ampullen in entsprechender Zahl, die je 1 ml einer isotonen, z.B. chloridhaltigen Lösung enthalten, zur sofortigen Herstellung dosierter Lösungen, insbesondere zur Injektion.
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