DE3712768C2

DE3712768C2 -

Info

Publication number: DE3712768C2
Application number: DE3712768A
Authority: DE
Inventors: John L. Corvallis Mont. Us Cantrell; Jon Hamilton Mont. Us Rudbach
Original assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Current assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Priority date: 1986-04-15
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1992-01-16
Also published as: DE3712768A1; BE1001630A4; JP2648305B2; GB8709124D0; IT8747856A0; CA1322333C; US4803070A; JPS6322029A; GB2189143A; CH675076A5; IT1205820B; GB2189143B; NL194603C; NL194603B; NL8700892A

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Adjuvans für Polysaccharid-Impfstoffe.

Die Erfindung betrifft auch den Einsatz des neuen immunologischen Adjuvans in Kombination mit Polysaccharid-Antigen. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Adjuvans wird die immunogene Wirksamkeit der Polysaccharid-Antigene gesteigert.

In der Literatur ist beschrieben, daß Polysaccharid-Antigene vorwiegend IgM-Antikörper stimulierten, wohingegen die IgG- Anwort nur schwach oder gar nicht vorhanden war. Bei Untersuchungen an Mensch und Tieren war es zudem schwierig, mit Polysaccharid-Antigenen eine amnistische Antwort oder ein immunologisches Memory (Gedächtnis) zu erhalten. Die durch die Verwendung von Polysaccharid-Antigenen induzierte Immunität war daher nur sehr kurzlebig. Außerdem hat sich herausgestellt, daß Polysaccharid-Impfstoffe bei kleinen Kindern nur sehr wenig immunogen sind. Es bestand daher ein Bedürfnis, die Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen steigern und somit die Antikörperproduktion einschließlich einer IgG-Antwort und des immunologischen Memorys stimulieren zu können.

Die Erfindung betrifft daher ein neues immunologisches Adjuvans für Polysaccharid-Antigene, Verfahren zur Herstellung dieser Adjuvantien und deren Verwendung zur Steigerung der Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen.

Das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans, das zur Stärkung des Immunansprechens bzw. der Immunantwort auf Polysaccharid- Antigene eingesetzt werden kann, ist ein Adjuvans auf der Basis von einem gereinigten, detoxifizierten Endotoxin (RDE) gewünschtenfalls mit Trehalosedimycolat (TDM) und einer Öl-in-Wasser-Emulsion (O/W), die

a) ein leichtes, nicht-bioabbaubares Kohlenwasserstofföl oder ein bioabbaubares Öl und
b) ein Detergens enthält,

wobei anstelle der Öl-in-Wasser-Emulsion eine Lipidemulsion (LES) eingesetzt wird, die

a) ein metabolisierbares Öl,
b) ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und
c) Lecithin enthält.

Die Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen wird durch die Kombination mit bestimmten biologischen Adjuvantien, die eine bioabbaubare Lipidemulsion oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion enthalten, gesteigert.

Die durch die Polysaccharid-Antigene und das erfindungsgemäße Adjuvans hervorgerufenen Immunantworten unterscheiden sich beträchtlich in vielerlei Hinsicht von den Antworten, die durch das Antigen alleine induziert werden. Es wurde gefunden, daß das im Adjuvans vorliegende Antigen die Antikörperproduktion stärker stimuliert (dies kommt durch höhere Titer zum Ausdruck) als das Antigen allein. Außerdem stimuliert die Mischung aus Adjuvans und Antigen die Produktion des Antikörpers der IgG-Klasse, wobei ein höherer Titer erhalten wird als mit dem Antigen allein. Es wurde ferner gefunden, daß die erfindungsgemäße Mischung aus Adjuvans und Antigen ein "immunologisches Gedächtnis hervorruft", wie dies durch ein höheres Antikörperansprechen nach einer zweiten Injektion des Antigens zum Ausdruck kommt, verglichen mit dem Ansprechen nach der ersten Immunisierung.

Vor der vorliegenden Erfindung existierten keine Adjuvantien irgendeiner Art, von denen berichtet wurde, daß sie wirksame "Immunoverstärker" von reinen Polysaccharid-Antigenen sind.

Zwar sind die Komponenten des erfindungsgemäßen Adjuvans zum Teil aus der Literatur bekannt, allerdings in anderer Verwendung. So wird in DE-PS 34 48 168 und DE-OS 34 31 058 die Verwendung von gereinigtem, detoxifiziertem Endotoxin zur Stimulierung einer Immunreaktion bei warmblütigen Tieren beschrieben. Dabei kann eine Zusammensetzung gemäß DE-PS 34 48 168 oder DE-OS 34 31 058 auch in Form einer Öltröpfchenemulsion verabreicht werden. Die Zusammensetzung dieser Öltröpfchenemulsion stimmt hinsichtlich Öl und Detergens mit der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Öl-in-Wasser-Emulsion überein.

Trehalosedimycolat ist als Bestandteil von Präparationen zur Tumorbekämpfung aus DE-OS 33 23 093 bekannt.

Keine der entgegengehaltenen Druckschriften beschreibt Adjuvantien für Polysaccharid-Impfstoffe oder legt die Verwendung bestimmter Substanzen als Adjuvantien für Polysaccharid- Impfstoffe nahe. Zu dem Zeitpunkt, wo die vorliegende Erfindung ausgearbeitet wurde, war auch aus Veröffentlichungen auf diesem Gebiet nicht zu erkennen, daß es überhaupt möglich sein würde, Polysaccharid-Impfstoffe mit einem Adjuvans in der Wirkung zu verstärken. Die nachfolgend aufgeführten Literaturstellen stellen einen Auszug der zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung relevanten Fachliteratur dar:

1) Davis et al., Microbiology Second Edition 1973 p. 464-
2) Manning et al., J. Immunol. 108, 1470 (1972)
3) Von Eschen and Rudbach, J. Immunol. 116, (1976)
4) Milner et al., Scand. J. Immunol. 18, 21 (1983)
5) Munoz, Adv, Immunol. . . .
6) Hamaoka and Katz, J. Immunol. 111, 1554 919730
7) Von Eschen and Rudbach, J. Expt. Med. 140, 1604 (1974)

In den Literaturstellen 1), 2) und 3) werden T-zell-unabhängige Antigene bestimmt und gezeigt, daß MPP und pneumococcale Polysaccharide - letztere werden in den Beispielen der Erfindung verwendet - T-zell-unabhängige Antigene sind. In der Literaturstelle 4) wird erläutert, daß LPS bei T-zell- abhängigen, nicht aber bei T-zell-unabhängigen Antigenen als Adjuvans wirkt. Auch die Literaturstellen 5), 6) und 7) beschreiben, daß Adjuvantien bei T-zell-abhängigen Antigenen, aber nicht bei T-zell-unabhängigen Antigenen wie MPP und pneumococcalen Polysacchariden wirken.

Demnach war es zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung aufgrund des Standes der Technik nicht möglich, mittels T-zell- unabhängiger Antigene eine starke und anhaltende Immunantwort auf Polysaccharid-Antigene hervorzurufen. Daher war es überraschend und unerwartet, daß gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigtes detoxifiziertes Endotoxin und Trehalosedimycolat die Immunantwort auf Polysaccharid-Antigene verstärken. Die Feststellung, daß Emulsionen, die gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin enthalten, in der Lage sind, eine solche Antwort auf Polysaccharid-Antigene hervorzurufen, steht offensichtlich im Gegensatz zu der auf diesem Fachgebiet vorherrschenden Meinung. Einzelne der vorstehenden Literaturstellen lehren nämlich, daß Lipopolysaccharide (LPS) nicht als Adjuvans für T-zell-unabhängige Gene geeignet sind. Das erfindungsgemäß verwendete gereinigte, detoxifizierte Endotoxin wird durch milde Säurehydrolyse von LPS erhalten. Es war sehr überraschend, daß die Umwandlung von LPS in das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin zu einem Adjuvans führt, das geeignet ist, eine Immunantwort auf Polysaccharid- Antigene hervorzurufen.

Erfindungsgemäß werden Mittel zur Steigerung der Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen bereitgestellt. Derartige Möglichkeiten existierten bis dato nicht. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Adjuvans nützlich zur Stimulierung von sowohl primärem als auch sekundärem (i.e. Gedächtnis) Immunansprechen von Warmblütern auf Impfstoffe, die Polysaccharid- Antigene aus einer Vielzahl von Quellen enthalten. Zu den Polysaccharid-Antigenen, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden können, gehören beispielsweise solche, die gereinigt wurden aus den Kapseln von Bakterien wie Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi oder Hemophilus influenzae. Andere Polysaccharid-Antigene, die aus den Kapseln oder Zellwänden von Pilzen oder den Zellwänden von gram-positiven oder gram-negativen Bakterien gewonnen wurden, können ebenfalls zusammen mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden. Die einzige Anforderung an das Polysaccharid-Antigen besteht darin, daß die durch dieses Antigen hervorgerufene Immunantwort durch die Anwesenheit eines geeigneten biologischen Adjuvans gesteigert werden kann.

Wie bereits oben ausgeführt, sind viele Polysaccharid-Antigene bekannt, welche das Immunsystem stimulieren. Die hervorgerufene Antwort ist jedoch vorwiegend der IgM-Typ des Antikörpers, wobei ein immunologisches Gedächtnis für eine zweite Antwort nicht induziert wird. Erfindungsgemäß wird eine Emulsion bereitgestellt, welche das Polysaccharid-Antigen und ein biologisches Adjuvans enthält. Dies führt dazu, daß das Antigen in einer bestimmten Form den Zellen des Immunsystems präsentiert wird. Dies führt außerdem zu einer langsamen Antigen-Freigabe an das Immunsystem und einer Stimulierung der bei der Immunantwort beteiligten Progenitorzellen.

Das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans enthält gereinigtes, detoxifiziertes Endotoxin (RDE) gewünschtenfalls mit Trehalosedimycolat (TDM) und eine Lipidemulsion (LES). Die Lipidemulsion (LES) enthält ein metabolisierbares Öl, ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und Lecithin.

Das in dem LES eingesetzte metabolisierbare Öl ist vorzugsweise ein fettes Öl, das vorwiegend Diglyceride und Triglyceride von Öl- und Linolsäuren aufweist. Insbesondere bevorzugt sind fette pflanzliche Öle, wie diejenigen, die in Erdnußöl, Sonnenblumensamenöl, Saflorsamenöl, Maisöl und dgl. enthalten sind oder daraus erhalten werden. Auch andere Öle, wie Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen können in den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden. Es ist bevorzugt, daß das Öl metabolisierbar, mit den Bestandteilen der Emulsion und dem bakteriellen Adjuvans als solchem kompatibel und wirksam in Kombination mit den anderen Komponenten zur Stärkung der Immunantwort auf Polysaccharid- Antigene ist.

In der Lipidemulsion kann eine Vielzahl von Polyolen eingesetzt werden. Bei diesen Polyolen handelt es sich um solche mit einem niedrigen Molekulargewicht, die flüssig und mit dem metabolisierbaren Öl mischbar sind und in denen die Lecithinkomponente löslich ist. Geeignete Polyole sind beispielsweise Ethylenglykol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, Glycerin, 1,4-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,2,4-Butantriol und 1,5-Pentandiol.

Die dritte Komponente der Lipidemulsion ist Lecithin. Mit dem Ausdruck "Lecithin" wird im Rahmen der vorliegenden Unterlagen eine Verbindung bezeichnet, daß zu einer Gruppe von Phospholipiden der folgenden allgemeinen Formel

gehört,
worin R₁ und R₂ Fettsäuren bedeuten, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten, und R₃ für Cholin steht. Diese Phospholipide sind gewöhnlich ein Gemisch aus Diglyceriden von Stearin-, Palmitin-, Linol- und Linolen-Fettsäuren, die an den Cholinester der Phosphorsäure gebunden sind.

Es wurde gefunden, daß der nicht-wäßrige Teil der Lipidemulsion vorzugsweise etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% metabolisierbares Öl, etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% Polyol und etwa 1 bis 15 Gew.-% Lecithin enthalten sollte.

Zur Herstellung der Lipidemulsion geht man beispielsweise wie folgt vor. Man löst ein Teil (10 g) des sterilen Lecithins in 10 Teilen (100 g) weißen Glycerins, indem man auf einer Heizplatte unter Rühren mit einem Magnetstäbchen vorsichtig auf 60°C erhitzt. Das Glycerin hat man vor der Verwendung zum Sterilisieren durch ein 0,2 Mikrometerfilter gegeben. Danach gibt man die Mischung aus Glycerin und Lecithin in ein steriles Mischgefäß und versetzt diese Mischung aus Glycerin und Lecithin langsam unter Mischen bei niedriger Geschwindigkeit mit 10 Teilen Erdnußöl (100 g; sterilisiert mit Hilfe eines 0,2 Mikrometerfilters).

Alternativ kann ein immunologisches Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort auf Polysaccharid-Antigene an Stelle der Li pidemulsion eine Öl-in-Wasser-Emulsion enthalten. Die O/W- Emulsion kann ein metabolisierbares Öl, wie Squalan, oder ein nicht-metabolisierbares Öl, wie Squalan, leichtes Mineralöl, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco-Superöl (Conoco superoil) oder Drakeol 6 VR- Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pa.) sein. Die Öl-in-Wasser-Emulsion enthält auch ein Detergens. Die Detergensmenge beträgt normalerweise zwischen etwa 0,02 und 0,20 und vorzugsweise zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, bezogen auf den wäßrigen Teil der Emulsion. Jedes übliche Detergens, einschließlich Tween-80 und Arlacel (hergestellt von der Fa. Atlas Chemical) kann zur Anwendung gebracht werden. Das Öl sollte etwa 0,5 bis 3% des Gesamtvolumens der Emulsion ausmachen. Die in der Lipidemulsion und in der Öl-in-Wasser-Emulsion eingesetzten Komponenten sind natürlich hochgereinigt und von pharmazeutisch annehmbarer Qualität.

Das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin, das hier als RDE bezeichnet ist, wird aus den RE-Mutantenstämmen von Salmo nella erhalten. Das detoxifizierte Endotoxin kann auch aus anderen Enterobakteriaceae gewonnen werden, wie dies in der US-PS 44 36 728 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug ge nommen wird. Das detoxifizierte Endotoxin kann auch synthe tisch oder mit Hilfe genetischer Engineering-Techniken her gestellt werden. Gewünschtenfalls ist Trehalosedimycolat (TDM) Bestandteil des erfindungsgemäßen Adjuvans. TDM kann man aus jedem Mycobakterium erhalten.

Dazu zählen beispielsweise M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stämme H37RD und Ayoma B.), M. bovis-BCG, M. smegatis, M. kansaii oder M. bovinis. TDM kann man auch aus Nocardia rubra und Corynebakterium dipheriae erhalten. TDM kann man auch nach der Lehre der US-PS 45 05 900 herstellen.

Die Polysaccharid-Impfstoffe auf Basis von LES kann man wie folgt herstellen: Man löst RDE und gewünschtenfalls TDM in Choroform : Methanol 4 : 1 und gibt das Ganze in ein steriles Gefäß. Das Lösungsmittel zieht man unter einem Strom sterilen Stickstoffgases ab. Man gibt das Polysaccharid- Antigen in steriler Kochsalzlösung zu der zweiten Komponente und vermischt dann. Zweckmäßigerweise gibt man etwa 3 Volumina der antigenbakteriellen Polysaccharid-Adjuvans- Mischung zu einem Volumen der wie oben beschrieben hergestellten LES-Mischung. Diese wäßrige Ölmischung vermischt man in einer Vortex-Apparatur oder in einer Mischvorrichtung bis man eine weiße, milchige Emulsion erhält. Der Mischvorgang der beiden Komponenten zur Erzielung einer Emulsion ist üblicherweise nach 2 bis 5 Min. beendet. Die Konzentration des Polysaccharid-Antigens in der endgültigen Emulsion beträgt 0,1 bis 1000 µg pro 0,2 ml. Die Konzentration von RDE beträgt etwa 25 bis etwa 200 µg pro 0,2 ml. Die Konzentration von TDM, sofern vorhanden, beträgt etwa 50 bis 400 µg pro 0,2 ml.

Obgleich das optimale Verhältnis der beiden Phasen der LES enthaltenden Form des immonologischen Adjuvans etwa 3 Volumina an Polysaccharid-Antigen/detoxifiziertem bakteriellen Adjuvans/Kochsalzlösung zu etwa 1 Volumen an Lipidemulsion beträgt, kann das Verhältnis der Lipidemulsion zur Adjuvans-Antigenlösung etwa 1 : 1 bis zu etwa 1 : 8 betragen, wobei ein Verhältnis von 1 : 3 bevorzugt ist.

Die Öl-in-Wasser-Emulsion kann man wie folgt herstellen:
5 mg RDE und 10 mg TDM, die jeweils in Chloroform : Methanol (4 : 1) gelöst sind, gibt man in eine 350-ml-Gewebehomogenisiervorrichtung (Bellco). Man zieht das Lösungsmittel von der RDE-TDM-Mischung unter einem Strom von sterilem Stickstoffgas ab. Anschließend gibt man 2 ml steriles Öl (Drakeol 6 VR-Mineralöl (Pennreco Company, Butler, PA), leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan) zu und homogenisiert die Mischung 1 Min. mit Hilfe eines motorgetriebenen Stößels, bis man eine ölige-pastenartige Konsistenz erreicht. Dann gibt man 98 ml von 0,2% Tween-80 in Kochsalzlösung in die Homogenisiervorrichtung. Unter Einsatz eines motorgetriebenen Stößels homogenisiert man die Mischung dann weitere 4 bis 5 Min., bis man eine Emulsion erhält.

Man gibt eine geeignete Menge des Polysaccharid-Antigens in Wasser zu der flüssigen Emulsion, die man dann mit Hilfe einer Spritze mit einer Nadel (20 Gauge) mindestens 2 Min. lang wiederholt ansaugt und wieder ausstößt, bis die erhaltene Emulsion milchig trüb aussieht. Man kann die Öl-in-Wasser-Emulsion gewünschtenfalls lyophilisieren, indem man 5 ml in eine 10-ml-Wheaton-Serumampulle gibt. Die Ampulle kühlt man dann in einer Revco-Kühlvorrichtung auf eine Temperatur von -95°C und lyophilisiert in einem sterilen Behälter auf einem Labconoco-Gefriertrockner. Die Ampulle wird dann bei sterilen Bedingungen mit einer Kappe ausgestattet. Die lyophilisierte RDE-TDM-Emulsion rekonstituiert man durch Injektion von 5 ml sterilem Wasser, das die gewünschte Konzentration des Polysaccharid-Antigens enthält. Man emulgiert durch wiederholtes Ansaugen und wieder Ausstoßens unter Verwendung einer Spritze während eines Zeitraums von mindestens 2 Min., bis die erhaltene Emulsion milchig-trüb aussieht.

Nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhält man Emulsionen, i.e. LES oder O/W, der wäßrigen, das Polysaccharid- Antigen enthaltenen Lösung. Dies bewirkt eine langsame Abgabe des Antigens, eine Verlängerung der antigenischen Stimulierung und eine zelluläre Stimulierung ähnlich der des Antigens, die durch die detoxifizierten bakteriellen Adjuvantien induziert wird. Diese Kombination von Aktivitäten steigert die Antwort bzw. das Ansprechen des Wirts auf das Antigen und wird durch die in den nachfolgenden Tabellen aufgeführten Ergebnisse belegt.

Wie bereits ausgeführt, kann das erfindungsgemäß immunologische Adjuvans gewünschtenfalls Trehalosedimycolat zusätzlich zum gereinigten detoxifizierten Endotoxin enthalten. Trehalosedimycolat (TDM) kann man nach der Lehre der US-PS 45 05 900 erhalten, und zwar aus Organismen wie beispielsweise M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae.

Bakterien wie M. Avium werden gezüchtet, geerntet und dann durch Einwirkung von Hitze getötet. Die Zellmasse wird dann mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert. Dies führt zur Isolierung einer aktiven, Lösungsmittel löslichen Fraktion. Die Fraktion wird dann weiter durch Serien-Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wobei rohes TDM erhalten wird (Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P3; Azuma et al., Journal of National Cancer Institute, Bd. 52, Seiten 95-101, 1974; darauf wird hiermit Bezug genommen). Wie von Azuma et al. offenbart, kann rohes TDM weitergereinigt werden durch Zentrifugen-Chromatographie an mikropartikelförmigem Silikagel, wobei gereinigtes TDM erhalten wird. Die Reinigung von TDM kann man auch nach dem Verfahren durchführen, das in der parallelen Anmeldung mit der Serien-Nr. 372 843, eingereicht am 29. 04. 1982, beschrieben ist.

Wird das Trehalosedimycolat im Adjuvans zur Anwendung gebracht, dann wird es in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 5000 µg/ml, vorzugsweise von etwa 250 bis 2000 µg/ml eingesetzt.

Die erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien in Mischung mit einer Vielzahl von Polysaccharid-Antigenen verstärken die Immunantwort auf Antigene und können daher für eine Vielzahl von Impfstoffen für Mensch und Tier bzw. für veterinäre oder human-medizinische Zwecke eingesetzt werden. Das gereinigte detoxifizierte Endotoxin wird zweckmäßigerweise in einer Konzentration von etwa 25 bis etwa 200 µg pro Dosis eingesetzt, wobei eine besonders verstärkte Immunantwort bei etwa 100 µg pro Dosis hervorgerufen wird. Die Trehalosedimycolate setzt man vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 400 µg pro Dosis ein. Gewünschtenfalls kann man andere Bestandteile oder Additive in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien zur Anwendung bringen.

Die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen passiven Hämagglutinin-Assays wurden unter Verwendung von Dextran und SSS-III-Polysacchariden wie folgt durchgeführt:

Assay auf passives Hämagglutinin (HA) unter Verwendung von Dextran

5 ml von roten Blutkörperchen von Schafen (SRBC) in Alsevers Lösung wurden 5× in Kochsalzlösung gewaschen. Palmitoyl-Dextran wurde in Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und 0,5 ml (500 µg Palmitoyl- Dextran) wurde zu 5 ml einer 10%igen gewaschenen SRBC- Lösung gegeben. Die Mischung wurde gut geschüttelt und 30 Min. bei 37°C inkubiert. Die Dextran-SRBC-Lösung wurde 5× in Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann in einer Konzentration von 10% resuspendiert.

Unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit V-Boden wurden Serumproben in zwei Stufen unter Einsatz eines 0,5% Rinderserumalbumin-(BSA)-Kochsalzpuffers verdünnt. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 50 µl. Zu jeder Vertiefung wurden 50 µl 0,5% Dextran-SRBC gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.

In einen identischen Satz von Mikrotiterplatten wurden 50 µl von 0,1 M 2-Mercaptoethanol gegeben. Anschließend wurden die Serumproben verdünnt. Dann wurden 50 µl der Dextran-überzogenen SRBC zugegeben.

Assay auf passive Hämagglutination (HA) unter Verwendung von SSS-III-Polysaccharid

5 µl von roten Blutkörperchen von Schafen (sheep red blood cells; SRBC) wurden 5× in Kochsalzlösung (0,85%) gewaschen. SSS-III-Polysaccharid wurde in Kochsalzlösung zu 1 mg/ml gelöst. Zu 0,5 ml gepackter SRBC wurden gegeben: 1) 1 ml Kochsalzlösung und 2) 1 ml von SSS-III in Kochsalzlösung (1000 µg). Die Mischung wurde schonend in einer Vortex-Apparatur (Wirbelmischer) behandelt und 1 ml von 0,1% Chromchlorid (CrCl₃ · 6 H₂O) in Kochsalzlösung wurde dabei hinzugetropft. Die Mischung wurde 5 Min. bei Raumtemperatur stehengelassen. Die SSS-III-beschichteten SRBC wurden 5× in Kochsalzlösung gewaschen und als 10%ige Zellsuspension in Kochsalzlösung resuspendiert.

Das Serum der einzelnen Mäuse in jeder Gruppe wurde in zwei Stufen in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit V-Boden verdünnt. Die Ausgangsverdünnung betrug 1 : 10. Das Endvolumen des verdünnten Serums pro Vertiefung betrug 50 µl.

Zu jeder das verdünnte Serum enthaltenden Vertiefung wurden 50 µl von SSS-III-beschichteten SRBC (0,5%ige Zellsuspension) gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Zu einem identischen Satz von Mikrotiterplatten wurden 50 µl von 0,1 M 2-Mercaptoethanol gegeben. Es folgt die Verdünnung der Serumproben. Anschließend wurden 50 µl der beschichteten SRBC hinzugegeben.

Das Dextran, das Palmitoyl-Dextran und das Kapselpolysaccharid (SSS-III) von Streptococcus pneumoniae Typ III für die folgenden Beispiele wurde von Dr. P. J. Baker von N.I.H. Laboratory of Miciobial Immunity, Bethesda, Maryland, bereitgestellt. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

BALB/C-Mäusen (6 Mäusen/Gruppe) wurde eine subkutane Injektion (0,2 ml/Tier) aus folgenden Bestandteilen verabreicht: Gruppe 1, 100 µg Dextran in Kochsalzlösung; Gruppe 2, 100 µg Dextran + 50 µg RDE in Kochsalzlösung; Gruppe 3, 100 µg Dextran + 50 µg RDE in Kochsalzlösung, emulgiert in einem gleichen Volumen von LES-Lipidemulsion; Gruppe 4, 100 µg Dextran, emulgiert in einer Ampulle, die eine lyophilisierte Öl-in-Wasser-Emulsion von 50 µg RDE + 50 µg TDM/Dosis enthält; Gruppe 5 erhielt kein Antigen.

Am Tag 20 nach der ersten Immunisierung erhielten alle Mäuse in jeder Gruppe eine zweite Injektion, die auf die gleiche Weise wie die erste Injektion hergestellt worden war.

Die einzelnen Serumproben wurden durch Serienausblutungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung gesammelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt:

Tabelle I

Passives Hämagglutinin (HA)-Titer der Sera von Mäusen, die mit dem Polysaccharid-Antigen-Dextran alleine oder zusammen mit RDE und anderen Adjuvantien in verschiedenen Lösungen immunisiert wurden

Beispiel 2

BALB/C-Mäuse erhielten eine subkutane Injektion (0,2 ml) mit Polysaccharid-Antigen (0,5 µg/Maus) alleine oder in Kombination mit RDE-Adjuvans wie folgt: Gruppe 1, SSS-III wurde als wäßrige Lösung verabreicht; Gruppe 2, SSS-III- wäßrige Lösung, die in einer eine Öl-in-Wasser-Emulsion von RDE (50 µg/Maus) und TDM (50 µg/Maus) enthaltenden Ampulle emulgiert ist; Gruppe 3, SSS-III-wäßrige Lösung wurde zu RDE (100 µg/Maus) in einer wäßrigen Lösung gegeben, und die Mischung wurde zu einem gleichen Volumen von LES gegeben und emulgiert; Gruppe 4, wäßrige SSS-III wurde zu wäßrigen RDE (50 µg/Maus) gegeben und mit einem gleichen Volumen von Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel) vermischt; Gruppe 5 wurde nicht immunisiert.

Alle Gruppen bestanden aus Mäusen mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen. Den Mäusen in jeder Gruppe wurde eine zweite subkutane Injektion am Tag 21 gegeben, die aus SSS-III (0,5 µg/Maus), emulgiert in RDE-TDM-Öl-in-Wasser- Emulsion bestand. Die Zahlen in den Klammern zeigen den mittleren Titer der gleichen Sera nach Behandlung mit 0,1 M 2-Mercaptoethanol an.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt:

Tabelle II

Titer an passivem Hämagglutinin (HA) der Sera von Mäusen, die mit 0,5 µg pneumococcalem Polysaccharid-Antigen (SSS- III) alleine oder in Kombination mit RDE und anderen Adjuvantien immunisiert wurden

Beispiel 3

BALB/C-Mäusen wurde eine subkutane Injektion (0,2 ml/Maus) von SSS-III-Polysaccharid-Antigen alleine oder in Mischung mit RDE in dem LES-Lipidemulsion-Adjuvanssystem gegeben. Allen Mäusen wurde eine zweite Injektion von SSS-III (0,5 µg) in Mischung mit der RED-TDM-Öl-in-Wasser- Emulsion 21 Tage nach der ersten Immunisierung gegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Titer für passives Hämagglutinin (HA) von Sera von Mäusen, die mit verschiedenen Dosen von pneumococcalem Polysaccharid-Antigen (SSS-III) in Mischung mit RDE in der Lipidemulsion (LES) immunisiert wurden

Claims

1. Immunologisches Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort auf natürliche Antigene oder Polysaccharidantigene auf der Basis von einem gereinigten, detoxifizierten Endotoxin (RDE) gewünschtenfalls mit Trehalosedimycolat (TDM) und einer Öl-in-Wasser-Emulsion (O/W), die

dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Öl-in-Wasser-Emulsion eine Lipidemulsion (LES) eingesetzt wird, die

2. Adjuvans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das metabolisierbare Öl ein Fettöl pflanzlichen Ursprungs ist, das vorwiegend Glyceride und Triglyceride aufweist.

3. Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das metabolisierbare oder bioabbaubare Öl Erdnußöl, Sonnenblumensamenöl, Saflorsamenöl, Maisöl, Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen ist.

4. Adjuvans nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidemulsion etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines metabolisierbaren Öls, etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines Polyols mit einem niedrigen Molekulargewicht von etwa 1 bis 15 Gew.-% Lecithin enthält.

5. Adjuvans nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Polysaccharid-Antigen eingesetzt wird.