DE3712768C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein immunologisches Adjuvans für
Polysaccharid-Impfstoffe.
Die Erfindung betrifft auch den Einsatz des neuen immunologischen
Adjuvans in Kombination mit Polysaccharid-Antigen.
Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Adjuvans wird die
immunogene Wirksamkeit der Polysaccharid-Antigene
gesteigert.
In der Literatur ist beschrieben, daß Polysaccharid-Antigene
vorwiegend IgM-Antikörper stimulierten, wohingegen die IgG-
Anwort nur schwach oder gar nicht vorhanden war. Bei Untersuchungen
an Mensch und Tieren war es zudem schwierig, mit
Polysaccharid-Antigenen eine amnistische Antwort oder ein
immunologisches Memory (Gedächtnis) zu erhalten. Die durch
die Verwendung von Polysaccharid-Antigenen induzierte Immunität
war daher nur sehr kurzlebig. Außerdem hat sich herausgestellt,
daß Polysaccharid-Impfstoffe bei kleinen Kindern
nur sehr wenig immunogen sind. Es bestand daher ein Bedürfnis,
die Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen steigern
und somit die Antikörperproduktion einschließlich einer
IgG-Antwort und des immunologischen Memorys stimulieren zu
können.
Die Erfindung betrifft daher ein neues immunologisches Adjuvans
für Polysaccharid-Antigene, Verfahren zur Herstellung
dieser Adjuvantien und deren Verwendung zur Steigerung der
Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen.
Das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans, das zur Stärkung
des Immunansprechens bzw. der Immunantwort auf Polysaccharid-
Antigene eingesetzt werden kann, ist ein Adjuvans auf
der Basis von einem gereinigten, detoxifizierten Endotoxin
(RDE) gewünschtenfalls mit Trehalosedimycolat (TDM) und einer
Öl-in-Wasser-Emulsion (O/W), die
- a) ein leichtes, nicht-bioabbaubares Kohlenwasserstofföl oder ein bioabbaubares Öl und
- b) ein Detergens enthält,
wobei anstelle der Öl-in-Wasser-Emulsion eine Lipidemulsion
(LES) eingesetzt wird, die
- a) ein metabolisierbares Öl,
- b) ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und
- c) Lecithin enthält.
Die Immunogenität von Polysaccharid-Antigenen wird durch die
Kombination mit bestimmten biologischen Adjuvantien, die
eine bioabbaubare Lipidemulsion oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion
enthalten, gesteigert.
Die durch die Polysaccharid-Antigene und das erfindungsgemäße
Adjuvans hervorgerufenen Immunantworten unterscheiden
sich beträchtlich in vielerlei Hinsicht von den Antworten,
die durch das Antigen alleine induziert werden. Es wurde gefunden,
daß das im Adjuvans vorliegende Antigen die Antikörperproduktion
stärker stimuliert (dies kommt durch höhere
Titer zum Ausdruck) als das Antigen allein. Außerdem stimuliert
die Mischung aus Adjuvans und Antigen die Produktion
des Antikörpers der IgG-Klasse, wobei ein höherer Titer erhalten
wird als mit dem Antigen allein. Es wurde ferner gefunden,
daß die erfindungsgemäße Mischung aus Adjuvans und
Antigen ein "immunologisches Gedächtnis hervorruft", wie
dies durch ein höheres Antikörperansprechen nach einer zweiten
Injektion des Antigens zum Ausdruck kommt, verglichen
mit dem Ansprechen nach der ersten Immunisierung.
Vor der vorliegenden Erfindung existierten keine Adjuvantien
irgendeiner Art, von denen berichtet wurde, daß sie wirksame
"Immunoverstärker" von reinen Polysaccharid-Antigenen sind.
Zwar sind die Komponenten des erfindungsgemäßen Adjuvans zum
Teil aus der Literatur bekannt, allerdings in anderer Verwendung.
So wird in DE-PS 34 48 168 und DE-OS 34 31 058 die
Verwendung von gereinigtem, detoxifiziertem Endotoxin zur
Stimulierung einer Immunreaktion bei warmblütigen Tieren beschrieben.
Dabei kann eine Zusammensetzung gemäß DE-PS 34 48
168 oder DE-OS 34 31 058 auch in Form einer Öltröpfchenemulsion
verabreicht werden. Die Zusammensetzung dieser Öltröpfchenemulsion
stimmt hinsichtlich Öl und Detergens mit der in
der vorliegenden Erfindung beschriebenen Öl-in-Wasser-Emulsion
überein.
Trehalosedimycolat ist als Bestandteil von Präparationen zur
Tumorbekämpfung aus DE-OS 33 23 093 bekannt.
Keine der entgegengehaltenen Druckschriften beschreibt Adjuvantien
für Polysaccharid-Impfstoffe oder legt die Verwendung
bestimmter Substanzen als Adjuvantien für Polysaccharid-
Impfstoffe nahe. Zu dem Zeitpunkt, wo die vorliegende
Erfindung ausgearbeitet wurde, war auch aus Veröffentlichungen
auf diesem Gebiet nicht zu erkennen, daß es überhaupt
möglich sein würde, Polysaccharid-Impfstoffe mit einem Adjuvans
in der Wirkung zu verstärken. Die nachfolgend aufgeführten
Literaturstellen stellen einen Auszug der zum Zeitpunkt
der vorliegenden Erfindung relevanten Fachliteratur
dar:
- 1) Davis et al., Microbiology Second Edition 1973 p. 464-
- 2) Manning et al., J. Immunol. 108, 1470 (1972)
- 3) Von Eschen and Rudbach, J. Immunol. 116, (1976)
- 4) Milner et al., Scand. J. Immunol. 18, 21 (1983)
- 5) Munoz, Adv, Immunol. . . .
- 6) Hamaoka and Katz, J. Immunol. 111, 1554 919730
- 7) Von Eschen and Rudbach, J. Expt. Med. 140, 1604 (1974)
In den Literaturstellen 1), 2) und 3) werden T-zell-unabhängige
Antigene bestimmt und gezeigt, daß MPP und pneumococcale
Polysaccharide - letztere werden in den Beispielen der
Erfindung verwendet - T-zell-unabhängige Antigene sind. In
der Literaturstelle 4) wird erläutert, daß LPS bei T-zell-
abhängigen, nicht aber bei T-zell-unabhängigen Antigenen als
Adjuvans wirkt. Auch die Literaturstellen 5), 6) und 7) beschreiben,
daß Adjuvantien bei T-zell-abhängigen Antigenen,
aber nicht bei T-zell-unabhängigen Antigenen wie MPP und
pneumococcalen Polysacchariden wirken.
Demnach war es zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung aufgrund
des Standes der Technik nicht möglich, mittels T-zell-
unabhängiger Antigene eine starke und anhaltende Immunantwort
auf Polysaccharid-Antigene hervorzurufen. Daher war es
überraschend und unerwartet, daß gemäß der vorliegenden Erfindung
gereinigtes detoxifiziertes Endotoxin und Trehalosedimycolat
die Immunantwort auf Polysaccharid-Antigene verstärken.
Die Feststellung, daß Emulsionen, die gereinigtes,
detoxifiziertes Endotoxin enthalten, in der Lage sind, eine
solche Antwort auf Polysaccharid-Antigene hervorzurufen,
steht offensichtlich im Gegensatz zu der auf diesem Fachgebiet
vorherrschenden Meinung. Einzelne der vorstehenden Literaturstellen
lehren nämlich, daß Lipopolysaccharide (LPS)
nicht als Adjuvans für T-zell-unabhängige Gene geeignet
sind. Das erfindungsgemäß verwendete gereinigte, detoxifizierte
Endotoxin wird durch milde Säurehydrolyse von LPS erhalten.
Es war sehr überraschend, daß die Umwandlung von LPS
in das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin zu einem Adjuvans
führt, das geeignet ist, eine Immunantwort auf Polysaccharid-
Antigene hervorzurufen.
Erfindungsgemäß werden Mittel zur Steigerung der Immunogenität
von Polysaccharid-Antigenen bereitgestellt. Derartige
Möglichkeiten existierten bis dato nicht. Demgemäß ist das
erfindungsgemäße Adjuvans nützlich zur Stimulierung von
sowohl primärem als auch sekundärem (i.e. Gedächtnis) Immunansprechen
von Warmblütern auf Impfstoffe, die Polysaccharid-
Antigene aus einer Vielzahl von Quellen enthalten.
Zu den Polysaccharid-Antigenen, die zusammen mit den erfindungsgemäßen
Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden können,
gehören beispielsweise solche, die gereinigt wurden aus
den Kapseln von Bakterien wie Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella
typhi oder Hemophilus influenzae. Andere Polysaccharid-Antigene,
die aus den Kapseln oder Zellwänden von Pilzen oder
den Zellwänden von gram-positiven oder gram-negativen Bakterien
gewonnen wurden, können ebenfalls zusammen mit den erfindungsgemäßen
Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden.
Die einzige Anforderung an das Polysaccharid-Antigen besteht
darin, daß die durch dieses Antigen hervorgerufene Immunantwort
durch die Anwesenheit eines geeigneten biologischen Adjuvans
gesteigert werden kann.
Wie bereits oben ausgeführt, sind viele Polysaccharid-Antigene
bekannt, welche das Immunsystem stimulieren. Die hervorgerufene
Antwort ist jedoch vorwiegend der IgM-Typ des
Antikörpers, wobei ein immunologisches Gedächtnis für eine
zweite Antwort nicht induziert wird. Erfindungsgemäß wird
eine Emulsion bereitgestellt, welche das Polysaccharid-Antigen
und ein biologisches Adjuvans enthält. Dies führt dazu,
daß das Antigen in einer bestimmten Form den Zellen des Immunsystems
präsentiert wird. Dies führt außerdem zu einer
langsamen Antigen-Freigabe an das Immunsystem und einer Stimulierung
der bei der Immunantwort beteiligten Progenitorzellen.
Das erfindungsgemäße immunologische Adjuvans enthält gereinigtes,
detoxifiziertes Endotoxin (RDE) gewünschtenfalls mit
Trehalosedimycolat (TDM) und eine Lipidemulsion (LES). Die
Lipidemulsion (LES) enthält ein metabolisierbares Öl, ein
Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und Lecithin.
Das in dem LES eingesetzte metabolisierbare Öl ist vorzugsweise
ein fettes Öl, das vorwiegend Diglyceride und Triglyceride
von Öl- und Linolsäuren aufweist. Insbesondere bevorzugt
sind fette pflanzliche Öle, wie diejenigen, die in Erdnußöl,
Sonnenblumensamenöl, Saflorsamenöl, Maisöl und dgl.
enthalten sind oder daraus erhalten werden. Auch andere Öle,
wie Olivenöl, Baumwollsamenöl oder Squalen können in den erfindungsgemäßen
Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden.
Es ist bevorzugt, daß das Öl metabolisierbar, mit den Bestandteilen
der Emulsion und dem bakteriellen Adjuvans als
solchem kompatibel und wirksam in Kombination mit den anderen
Komponenten zur Stärkung der Immunantwort auf Polysaccharid-
Antigene ist.
In der Lipidemulsion kann eine Vielzahl von Polyolen eingesetzt
werden. Bei diesen Polyolen handelt es sich um solche
mit einem niedrigen Molekulargewicht, die flüssig und mit
dem metabolisierbaren Öl mischbar sind und in denen die
Lecithinkomponente löslich ist. Geeignete Polyole sind beispielsweise
Ethylenglykol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol,
Glycerin, 1,4-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,2,4-Butantriol
und 1,5-Pentandiol.
Die dritte Komponente der Lipidemulsion ist Lecithin. Mit
dem Ausdruck "Lecithin" wird im Rahmen der vorliegenden
Unterlagen eine Verbindung bezeichnet, daß zu einer Gruppe
von Phospholipiden der folgenden allgemeinen Formel
gehört,
worin R₁ und R₂ Fettsäuren bedeuten, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten, und R₃ für Cholin steht. Diese Phospholipide sind gewöhnlich ein Gemisch aus Diglyceriden von Stearin-, Palmitin-, Linol- und Linolen-Fettsäuren, die an den Cholinester der Phosphorsäure gebunden sind.
worin R₁ und R₂ Fettsäuren bedeuten, die bis zu 22 Kohlenstoffatome enthalten, und R₃ für Cholin steht. Diese Phospholipide sind gewöhnlich ein Gemisch aus Diglyceriden von Stearin-, Palmitin-, Linol- und Linolen-Fettsäuren, die an den Cholinester der Phosphorsäure gebunden sind.
Es wurde gefunden, daß der nicht-wäßrige Teil der Lipidemulsion
vorzugsweise etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% metabolisierbares
Öl, etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% Polyol und
etwa 1 bis 15 Gew.-% Lecithin enthalten sollte.
Zur Herstellung der Lipidemulsion geht man beispielsweise
wie folgt vor. Man löst ein Teil (10 g) des sterilen
Lecithins in 10 Teilen (100 g) weißen Glycerins, indem man
auf einer Heizplatte unter Rühren mit einem Magnetstäbchen
vorsichtig auf 60°C erhitzt. Das Glycerin hat
man vor der Verwendung zum Sterilisieren durch ein 0,2
Mikrometerfilter gegeben. Danach gibt man die Mischung aus
Glycerin und Lecithin in ein steriles Mischgefäß und versetzt
diese Mischung aus Glycerin und Lecithin langsam
unter Mischen bei niedriger Geschwindigkeit mit 10 Teilen
Erdnußöl (100 g; sterilisiert mit Hilfe eines 0,2 Mikrometerfilters).
Alternativ kann ein immunologisches Adjuvans zur Verstärkung
der Immunantwort auf Polysaccharid-Antigene an Stelle der Li
pidemulsion eine Öl-in-Wasser-Emulsion enthalten. Die O/W-
Emulsion kann ein metabolisierbares
Öl, wie Squalan, oder
ein nicht-metabolisierbares
Öl, wie Squalan, leichtes Mineralöl, 7-n-Hexyloctadecan,
Conoco-Superöl (Conoco superoil) oder Drakeol 6 VR-
Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler,
Pa.) sein. Die Öl-in-Wasser-Emulsion enthält auch ein
Detergens. Die Detergensmenge beträgt normalerweise zwischen
etwa 0,02 und 0,20 und vorzugsweise zwischen etwa 0,10 und
0,20 Vol.-%, bezogen auf den wäßrigen Teil der Emulsion.
Jedes übliche Detergens, einschließlich Tween-80 und
Arlacel (hergestellt von der Fa. Atlas Chemical) kann zur
Anwendung gebracht werden. Das Öl sollte etwa 0,5 bis 3%
des Gesamtvolumens der Emulsion ausmachen. Die in der Lipidemulsion
und in der Öl-in-Wasser-Emulsion eingesetzten
Komponenten sind natürlich hochgereinigt und von pharmazeutisch
annehmbarer Qualität.
Das gereinigte, detoxifizierte Endotoxin, das hier als RDE
bezeichnet ist, wird aus den RE-Mutantenstämmen von Salmo
nella erhalten. Das detoxifizierte Endotoxin kann auch aus
anderen Enterobakteriaceae gewonnen werden, wie dies in der
US-PS 44 36 728 beschrieben ist, auf die hiermit Bezug ge
nommen wird. Das detoxifizierte Endotoxin kann auch synthe
tisch oder mit Hilfe genetischer Engineering-Techniken her
gestellt werden. Gewünschtenfalls ist Trehalosedimycolat
(TDM) Bestandteil des erfindungsgemäßen Adjuvans. TDM kann
man aus jedem Mycobakterium erhalten.
Dazu zählen beispielsweise M. avium, M. phlei, M.
tuberculosis (Stämme H37RD und Ayoma B.), M. bovis-BCG,
M. smegatis, M. kansaii oder M. bovinis. TDM kann man auch
aus Nocardia rubra und Corynebakterium dipheriae erhalten.
TDM kann man auch nach der Lehre der US-PS 45 05 900 herstellen.
Die Polysaccharid-Impfstoffe auf Basis von LES kann man
wie folgt herstellen: Man löst
RDE und gewünschtenfalls
TDM in Choroform : Methanol 4 : 1 und gibt das Ganze in ein
steriles Gefäß. Das Lösungsmittel zieht man unter einem Strom
sterilen Stickstoffgases ab. Man gibt das Polysaccharid-
Antigen in steriler Kochsalzlösung zu der zweiten Komponente
und vermischt dann. Zweckmäßigerweise gibt man etwa
3 Volumina der antigenbakteriellen Polysaccharid-Adjuvans-
Mischung zu einem Volumen der wie oben beschrieben hergestellten
LES-Mischung. Diese wäßrige Ölmischung vermischt
man in einer Vortex-Apparatur oder in einer Mischvorrichtung
bis man eine weiße, milchige Emulsion erhält. Der
Mischvorgang der beiden Komponenten zur Erzielung einer
Emulsion ist üblicherweise nach 2 bis 5 Min. beendet. Die
Konzentration des Polysaccharid-Antigens in der endgültigen
Emulsion beträgt 0,1 bis 1000 µg pro 0,2 ml. Die Konzentration
von RDE beträgt etwa 25 bis etwa 200 µg pro 0,2 ml. Die
Konzentration von TDM, sofern vorhanden, beträgt etwa 50
bis 400 µg pro 0,2 ml.
Obgleich das optimale Verhältnis der beiden Phasen der
LES enthaltenden Form des immonologischen Adjuvans etwa
3 Volumina an Polysaccharid-Antigen/detoxifiziertem
bakteriellen Adjuvans/Kochsalzlösung zu etwa 1 Volumen
an Lipidemulsion beträgt, kann das Verhältnis der Lipidemulsion
zur Adjuvans-Antigenlösung etwa 1 : 1 bis zu etwa
1 : 8 betragen, wobei ein Verhältnis von 1 : 3 bevorzugt ist.
Die Öl-in-Wasser-Emulsion kann man wie folgt herstellen:
5 mg RDE und 10 mg TDM, die jeweils in Chloroform : Methanol (4 : 1) gelöst sind, gibt man in eine 350-ml-Gewebehomogenisiervorrichtung (Bellco). Man zieht das Lösungsmittel von der RDE-TDM-Mischung unter einem Strom von sterilem Stickstoffgas ab. Anschließend gibt man 2 ml steriles Öl (Drakeol 6 VR-Mineralöl (Pennreco Company, Butler, PA), leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan) zu und homogenisiert die Mischung 1 Min. mit Hilfe eines motorgetriebenen Stößels, bis man eine ölige-pastenartige Konsistenz erreicht. Dann gibt man 98 ml von 0,2% Tween-80 in Kochsalzlösung in die Homogenisiervorrichtung. Unter Einsatz eines motorgetriebenen Stößels homogenisiert man die Mischung dann weitere 4 bis 5 Min., bis man eine Emulsion erhält.
5 mg RDE und 10 mg TDM, die jeweils in Chloroform : Methanol (4 : 1) gelöst sind, gibt man in eine 350-ml-Gewebehomogenisiervorrichtung (Bellco). Man zieht das Lösungsmittel von der RDE-TDM-Mischung unter einem Strom von sterilem Stickstoffgas ab. Anschließend gibt man 2 ml steriles Öl (Drakeol 6 VR-Mineralöl (Pennreco Company, Butler, PA), leichtes Mineralöl, Squalan, Squalen, 7-n-Hexyloctadecan) zu und homogenisiert die Mischung 1 Min. mit Hilfe eines motorgetriebenen Stößels, bis man eine ölige-pastenartige Konsistenz erreicht. Dann gibt man 98 ml von 0,2% Tween-80 in Kochsalzlösung in die Homogenisiervorrichtung. Unter Einsatz eines motorgetriebenen Stößels homogenisiert man die Mischung dann weitere 4 bis 5 Min., bis man eine Emulsion erhält.
Man gibt eine geeignete Menge des Polysaccharid-Antigens in
Wasser zu der flüssigen Emulsion, die man dann mit Hilfe
einer Spritze mit einer Nadel (20 Gauge) mindestens 2 Min. lang wiederholt
ansaugt und wieder ausstößt, bis die erhaltene Emulsion
milchig trüb aussieht. Man kann die Öl-in-Wasser-Emulsion
gewünschtenfalls lyophilisieren, indem man 5 ml in eine
10-ml-Wheaton-Serumampulle gibt. Die Ampulle kühlt man dann
in einer Revco-Kühlvorrichtung auf eine Temperatur von
-95°C und lyophilisiert in einem sterilen Behälter auf
einem Labconoco-Gefriertrockner. Die Ampulle wird dann
bei sterilen Bedingungen mit einer Kappe ausgestattet. Die
lyophilisierte RDE-TDM-Emulsion rekonstituiert man durch
Injektion von 5 ml sterilem Wasser, das die gewünschte
Konzentration des Polysaccharid-Antigens enthält. Man
emulgiert durch wiederholtes Ansaugen und wieder Ausstoßens
unter Verwendung einer Spritze während eines Zeitraums von
mindestens 2 Min., bis die erhaltene Emulsion milchig-trüb
aussieht.
Nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhält man
Emulsionen, i.e. LES oder O/W, der wäßrigen, das Polysaccharid-
Antigen enthaltenen Lösung. Dies bewirkt eine
langsame Abgabe des Antigens, eine Verlängerung der antigenischen
Stimulierung und eine zelluläre Stimulierung
ähnlich der des Antigens, die durch die detoxifizierten
bakteriellen Adjuvantien induziert wird. Diese Kombination
von Aktivitäten steigert die Antwort bzw. das Ansprechen des
Wirts auf das Antigen und wird durch die in den nachfolgenden
Tabellen aufgeführten Ergebnisse belegt.
Wie bereits ausgeführt, kann das erfindungsgemäß immunologische
Adjuvans gewünschtenfalls Trehalosedimycolat zusätzlich
zum gereinigten detoxifizierten Endotoxin enthalten.
Trehalosedimycolat (TDM) kann man nach der Lehre der
US-PS 45 05 900 erhalten, und zwar aus Organismen wie
beispielsweise M. avium, M. phlei, M. tuberculosis
(Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis,
M. kansasii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium
diphtheriae.
Bakterien wie M. Avium werden gezüchtet, geerntet und dann
durch Einwirkung von Hitze getötet. Die Zellmasse wird dann
mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert. Dies führt zur
Isolierung einer aktiven, Lösungsmittel löslichen Fraktion.
Die Fraktion wird dann weiter durch Serien-Lösungsmittelextraktionen
gereinigt, wobei rohes TDM erhalten wird
(Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls
I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and
Component P3; Azuma et al., Journal of National Cancer
Institute, Bd. 52, Seiten 95-101, 1974; darauf wird hiermit
Bezug genommen). Wie von Azuma et al. offenbart, kann rohes
TDM weitergereinigt werden durch Zentrifugen-Chromatographie
an mikropartikelförmigem Silikagel, wobei gereinigtes TDM
erhalten wird. Die Reinigung von TDM kann man auch nach dem
Verfahren durchführen, das in der parallelen Anmeldung mit
der Serien-Nr. 372 843, eingereicht am 29. 04. 1982, beschrieben
ist.
Wird das Trehalosedimycolat im Adjuvans zur Anwendung gebracht,
dann wird es in einer Konzentration von etwa
50 bis etwa 5000 µg/ml, vorzugsweise von etwa 250 bis
2000 µg/ml eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien in
Mischung mit einer Vielzahl von Polysaccharid-Antigenen
verstärken die Immunantwort auf Antigene und können daher
für eine Vielzahl von Impfstoffen für Mensch und Tier bzw.
für veterinäre oder human-medizinische Zwecke eingesetzt
werden. Das gereinigte detoxifizierte Endotoxin wird
zweckmäßigerweise in einer Konzentration von etwa 25 bis
etwa 200 µg pro Dosis eingesetzt, wobei eine besonders verstärkte
Immunantwort bei etwa 100 µg pro Dosis hervorgerufen
wird. Die Trehalosedimycolate setzt man vorzugsweise
in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 400 µg pro
Dosis ein. Gewünschtenfalls kann man andere Bestandteile
oder Additive in Verbindung mit den erfindungsgemäßen
Adjuvantien zur Anwendung bringen.
Die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen passiven
Hämagglutinin-Assays wurden unter Verwendung von Dextran
und SSS-III-Polysacchariden wie folgt durchgeführt:
5 ml von roten Blutkörperchen von Schafen (SRBC) in
Alsevers Lösung wurden 5× in Kochsalzlösung gewaschen.
Palmitoyl-Dextran wurde in Kochsalzlösung in einer
Konzentration von 1 mg/ml gelöst und 0,5 ml (500 µg Palmitoyl-
Dextran) wurde zu 5 ml einer 10%igen gewaschenen SRBC-
Lösung gegeben. Die Mischung wurde gut geschüttelt und
30 Min. bei 37°C inkubiert. Die Dextran-SRBC-Lösung wurde
5× in Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann
in einer Konzentration von 10% resuspendiert.
Unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
mit V-Boden wurden Serumproben in zwei Stufen unter Einsatz
eines 0,5% Rinderserumalbumin-(BSA)-Kochsalzpuffers
verdünnt. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 50 µl.
Zu jeder Vertiefung wurden 50 µl 0,5% Dextran-SRBC gegeben.
Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert.
In einen identischen Satz von Mikrotiterplatten wurden
50 µl von 0,1 M 2-Mercaptoethanol gegeben. Anschließend
wurden die Serumproben verdünnt. Dann wurden 50 µl der
Dextran-überzogenen SRBC zugegeben.
5 µl von roten Blutkörperchen von Schafen (sheep red
blood cells; SRBC) wurden 5× in Kochsalzlösung (0,85%)
gewaschen. SSS-III-Polysaccharid wurde in Kochsalzlösung
zu 1 mg/ml gelöst. Zu 0,5 ml gepackter SRBC wurden gegeben:
1) 1 ml Kochsalzlösung und 2) 1 ml von SSS-III in
Kochsalzlösung (1000 µg). Die Mischung wurde schonend in
einer Vortex-Apparatur (Wirbelmischer) behandelt und 1 ml
von 0,1% Chromchlorid (CrCl₃ · 6 H₂O) in Kochsalzlösung
wurde dabei hinzugetropft. Die Mischung wurde 5 Min. bei
Raumtemperatur stehengelassen. Die SSS-III-beschichteten
SRBC wurden 5× in Kochsalzlösung gewaschen und als
10%ige Zellsuspension in Kochsalzlösung resuspendiert.
Das Serum der einzelnen Mäuse in jeder Gruppe wurde in
zwei Stufen in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen mit V-Boden verdünnt. Die Ausgangsverdünnung
betrug 1 : 10. Das Endvolumen des verdünnten Serums
pro Vertiefung betrug 50 µl.
Zu jeder das verdünnte Serum enthaltenden Vertiefung wurden
50 µl von SSS-III-beschichteten SRBC (0,5%ige Zellsuspension)
gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Zu einem identischen Satz von
Mikrotiterplatten wurden 50 µl von 0,1 M 2-Mercaptoethanol
gegeben. Es folgt die Verdünnung der Serumproben.
Anschließend wurden 50 µl der beschichteten SRBC hinzugegeben.
Das Dextran, das Palmitoyl-Dextran und das Kapselpolysaccharid
(SSS-III) von Streptococcus pneumoniae Typ III
für die folgenden Beispiele wurde von Dr. P. J. Baker von
N.I.H. Laboratory of Miciobial Immunity, Bethesda,
Maryland, bereitgestellt. Die folgenden Beispiele dienen
zur Erläuterung der Erfindung.
BALB/C-Mäusen (6 Mäusen/Gruppe) wurde eine subkutane
Injektion (0,2 ml/Tier) aus folgenden Bestandteilen verabreicht:
Gruppe 1, 100 µg Dextran in Kochsalzlösung;
Gruppe 2, 100 µg Dextran + 50 µg RDE in Kochsalzlösung;
Gruppe 3, 100 µg Dextran + 50 µg RDE in Kochsalzlösung,
emulgiert in einem gleichen Volumen von LES-Lipidemulsion;
Gruppe 4, 100 µg Dextran, emulgiert in einer Ampulle, die
eine lyophilisierte Öl-in-Wasser-Emulsion von 50 µg RDE
+ 50 µg TDM/Dosis enthält; Gruppe 5 erhielt kein Antigen.
Am Tag 20 nach der ersten Immunisierung erhielten alle
Mäuse in jeder Gruppe eine zweite Injektion, die auf die
gleiche Weise wie die erste Injektion hergestellt worden
war.
Die einzelnen Serumproben wurden durch Serienausblutungen
zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung gesammelt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I
zusammengefaßt:
BALB/C-Mäuse erhielten eine subkutane Injektion (0,2 ml)
mit Polysaccharid-Antigen (0,5 µg/Maus) alleine oder
in Kombination mit RDE-Adjuvans wie folgt: Gruppe 1, SSS-III
wurde als wäßrige Lösung verabreicht; Gruppe 2, SSS-III-
wäßrige Lösung, die in einer eine Öl-in-Wasser-Emulsion
von RDE (50 µg/Maus) und TDM (50 µg/Maus) enthaltenden Ampulle
emulgiert ist; Gruppe 3, SSS-III-wäßrige Lösung wurde
zu RDE (100 µg/Maus) in einer wäßrigen Lösung gegeben, und
die Mischung wurde zu einem gleichen Volumen von LES
gegeben und emulgiert; Gruppe 4, wäßrige SSS-III wurde
zu wäßrigen RDE (50 µg/Maus) gegeben und mit einem
gleichen Volumen von Aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel)
vermischt; Gruppe 5 wurde nicht immunisiert.
Alle Gruppen bestanden aus Mäusen mit einem Alter von
6 bis 8 Wochen. Den Mäusen in jeder Gruppe wurde eine
zweite subkutane Injektion am Tag 21 gegeben, die aus
SSS-III (0,5 µg/Maus), emulgiert in RDE-TDM-Öl-in-Wasser-
Emulsion bestand. Die Zahlen in den Klammern zeigen den
mittleren Titer der gleichen Sera nach Behandlung mit
0,1 M 2-Mercaptoethanol an.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt:
BALB/C-Mäusen wurde eine subkutane Injektion (0,2 ml/Maus)
von SSS-III-Polysaccharid-Antigen alleine oder in
Mischung mit RDE in dem LES-Lipidemulsion-Adjuvanssystem
gegeben. Allen Mäusen wurde eine zweite Injektion von
SSS-III (0,5 µg) in Mischung mit der RED-TDM-Öl-in-Wasser-
Emulsion 21 Tage nach der ersten Immunisierung gegeben.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle III zusammengefaßt.
Claims (6)
1. Immunologisches Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort
auf natürliche Antigene oder Polysaccharidantigene
auf der Basis von einem gereinigten, detoxifizierten
Endotoxin (RDE) gewünschtenfalls mit Trehalosedimycolat
(TDM) und einer Öl-in-Wasser-Emulsion (O/W), die
- a) ein leichtes, nicht-bioabbaubares Kohlenwasserstofföl oder ein bioabbaubares Öl und
- b) ein Detergens enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß anstelle der Öl-in-Wasser-Emulsion eine Lipidemulsion
(LES) eingesetzt wird, die
- a) ein metabolisierbares Öl,
- b) ein Polyol mit einem niedrigen Molekulargewicht und
- c) Lecithin enthält.
2. Adjuvans nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das metabolisierbare Öl ein Fettöl pflanzlichen Ursprungs
ist, das vorwiegend Glyceride und Triglyceride
aufweist.
3. Adjuvans nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das metabolisierbare oder bioabbaubare Öl Erdnußöl,
Sonnenblumensamenöl, Saflorsamenöl, Maisöl, Olivenöl,
Baumwollsamenöl oder Squalen ist.
4. Adjuvans nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Lipidemulsion etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines
metabolisierbaren Öls, etwa 30 bis etwa 60 Gew.-% eines
Polyols mit einem niedrigen Molekulargewicht von etwa 1
bis 15 Gew.-% Lecithin enthält.
5. Adjuvans nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß es mit einem Polysaccharid-Antigen eingesetzt wird.
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