DE3833319C2

DE3833319C2 -

Info

Publication number: DE3833319C2
Application number: DE3833319A
Authority: DE
Inventors: John Leonhard Hamilton Mont. Us Cantrell
Original assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Current assignee: RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH Inc HAMILTON MONT US
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1992-06-11
Also published as: JPH0575731B2; CH678492A5; GB2210557A; GB8822749D0; FR2620941A1; IT8822145A0; GB2210557B; BE1001634A4; US4877611A; NL8802393A; CA1333152C; JPH01163130A; IT1226861B; FR2620941B1; DE3833319A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff zur Behandlung und Verhütung von Tumoren und ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes.

Während der letzten neunzig Jahre wurde Endotoxin als wirksamer Immunoaktivator angesehen. So beschrieb W. B. Coley in Ann. Surg. 14 199 (1981) den Einsatz "Bakterieller Toxine" bei der Krebsbehandlung. Ferner wurde in JAMA 54 250 (1919) berichtet, daß die Heilungsrate inoperabler Patienten bei der Verwendung einer derartigen gemischten mikrobiellen Vakzine 4 bis 7% betrug. Endotoxinextrakte wurden anschließend in verschiedenen Tiermodellen untersucht. So beschrieben Gratia und Linz in Corp. Rend. Soc. de Biol. 108: 427 (1931) die hämorrhagische Nekrose und eine gleichzeitig stattfindende Tumorregression in einem transplantablen Liposarkommodell bei Meerschweinchen. Weitere Tumormodelle unter Verwendung von Nagetieren folgten: Sarkom 180 bei Mäusen (G. Shwartzman und N. Michailovsky, Proc., Soc. Exp. Biol. Med. 29: 737 (1932)), Ehrlichkarzinome bei Mäusen (M. J. Berendt und R. J. North, Exp. Med., 151: 69 (1980)), und transplantierbare Tumore bei Ratten (M. J. Berendt und R. J. North, private Mitteilung).

In letzter Zeit angestellte Beobachtungen der Tumornekrose bei mit Endotoxin behandelten Tieren zeigten, daß die endotoxische Fraktion selbst nicht direkt für die Nekrose verantwortlich ist (E. A. Carswell, L. J. Old, R. L. Kassel, S. Green, N. Liore und B. Williamson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3666 (1975)). Die Nekrosebildung kann in der Tat durch einen Faktor vermittelt werden, welcher als Tumornekrosefaktor (TNF) bezeichnet wird und welcher aus Mäusen isoliert wurde, die zuvor durch Makrophagenaktivatoren, wie BCG, C. parvum oder zymosan, stimuliert wurden. Außerdem hat sich herausgestellt, daß TNF gegen bestimmte Tumorlinien in vitro cytotoxisch ist. Dieser Substanz wird in vivo eine Antitumoraktivität zugeordnet.

Vor dem Entstehen der vorliegenden Erfindung und während der Suche nach mikrobiellen Komponenten mit Antitumoraktivität wurde gefunden, daß, falls bestimmte Endotoxin-Präparate mit Trehalosedimycolat (TDM) und Öltröpfchen kombiniert und in etablierte maligne Linie-10-Tumore bei Stamm-2-Meerschweinchen injiziert wurden, die Heilungsraten hoch waren und sich eine systemische Tumorimmunität entwickelte. Daraufhin wurde Endotoxin erneut auf seine Bedeutung als ein immunotherapeutisches Agens untersucht. Die wirksamsten Endotoxinadjuvantien waren Phenol/Wasser-(PW) oder Chloroform/Methanol-(CM)-Extrakte aus Re-mutante (ohne Heptose), gram-negative Bakterien. Diese Extrakte enthielten endotoxische Lipopolysaccharide (LPS), welche Phenol/Wasserextrakte aus wild-type-Bakterien ergaben. Sowohl ReGl als auch Lipipolysaccharid verursachten nach Injektion in Kombination mit TDM und Öltröpfchen eine sich schnell entwickelnde Shwartzman-ähnliche nekrotische Reaktion in den Tumoren. Gemäß dieser Reaktion führte die LPS-Kombination nur zu einer partiellen Regression der injizierten Tumore; ihr Wachstum hielt noch nach zwei Wochen an. Im Gegensatz dazu führte die Injektion der ReGl-TDM-Kombination zu hohen Raten einer permanenten Regression und zu einer Entwicklung einer systemischen Immunität gegen eine Challenge mit Linie-10-Tumoren. Eine Tumorregression mit ReGl+TDM oder CWS+TDM und weiter fortgeschrittene Tumore konnten mit größerem Erfolg behandelt werden.

In einer in Cancer Research 39, 1159-1167, April 1979, erschienenen Veröffentlichung von Dr. J. L. Cantrell wurde beschrieben, daß eine Kombination aus Chemotherapie und Immunotherapie sehr wirksam dazu eingesetzt werden konnte, eine Regression eines etablierten Tumors bei Mäusen hervorzurufen, während jede der beiden Behandlungsarten allein angewandt unwirksam war. Bei dieser Untersuchung umfaßte die zur Anwendung gebrachte Immunotherapie die Injektion von KCl-extrahierten Tumorantigenen in Öl-in-Wasser-Emulsionen mit oder ohne Trehalosedimycolat.

Ferner wurden in den amerikanischen Patentschriften US-A 44 36 727 und 45 05 903 verschiedene Kombinationen aus raffiniertem detoxifiziertem Endotoxin und gereinigten pyridinlöslichen Extrakten von Mikroorganismen mit Zellwandskelett und/oder Trehalosedimycolat als nützlich bei der Behandlung von Krebstumoren beschrieben. Früher, vor der vorliegenden Erfindung, wurde die Immunotherapie jedoch mit biologischen Ansprechmodifizierern (biological response modifiers) als nicht-spezifische Immunotherapie oder mit Tumorantigenen alleine durchgeführt. Die nicht-spezifische Immunotherapie hatte jedoch auf Tumore nur eine kurze Wirkung. Tumorantigene besaßen nur eine niedrige Immunogenizität. Zudem hatten die früher für die Anwendung in einer Humanvakzine verfügbaren Adjuvantien eine niedrige Aktivität, so daß eine Immunotherapie nicht vollständig befriedigend war. Obgleich es somit einen beträchtlichen Stand der Technik über Adjuvantien und Tumorantigene gibt, gibt es keinen Stand der Technik über die Anwendung nicht-toxischer biologischer Adjuvantien zur Unterstützung der protektiven Immunität beim Einsatz in Kombination mit Tumorantigenen. Es bestand daher ein Bedürfnis nach einem wirksamen, jedoch nicht-toxischen Immunostimulanz, das zusammen mit tumor-assoziierten Antigenen eingesetzt werden konnte, um eine protektive und anhaltende Tumorimmunität zu erzielen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ausgehend von den bekannten Kombinationen umfassend

a) ein raffiniertes detoxifiziertes Endotoxinimmunostimulanz, welches kein detektierbares 2-Keto-3-deoxyoctonat, etwa 350 bis etwa 475 nmol/mg Phosphor und etwa 1700 bis 2000 nmol/mg Fettsäuren aufweist;
b) mindestens ein biologisches Immunostimulanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- 1) mycobakteriellem Zellwandskelett;
- 2) Trehalosedimycolat und
c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger

einen hochwirksamen, nicht-toxischen Impfstoff bereitzustellen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffs zur Behandlung und Verhütung von Tumoren bereitzustellen.

Die Lösung der gestellten Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Kennzeichen der Patentansprüche 1 bzw. 4 erreicht.

Der erfindungsgemäße Impfstoff umfaßt gemäß Patentanspruch 1

a) ein raffiniertes detoxifiziertes Endotoxinimmunostimulanz, welches kein detektierbares 2-Keto-3-deoxyoctonat, etwa 350 bis etwa 475 nmol/mg Phosphor und etwa 1700 bis 2000 nmol/mg Fettsäuren aufweist;
b) mindestens ein biologisches Immunostimulanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- 1) mycobakteriellem Zellwandskelett;
- 2) Trehalosedimycolat und
c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger,

zusätzlich mindestens ein tumor-assoziiertes Antigen, das aus Tumoren von Warmblütern erhalten wird, und
in der Gruppe gemäß b) als weiteres Immunstimulanz einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus, wobei dieser Extrakt etwa 7 bis 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 16 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 55 Gew.-% Fettsäuren enthält.

Die in den erfindungsgemäßen Impfstoffen eingesetzten tumor-assoziierten Antigene können ganze Zellen, Zellfraktionen oder Extrakte von Tumorzellen sein, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehr Antigene in demselben Impfstoff zum Einsatz zu bringen.

Die tumor-assoziierten Antigene (im folgenden als (TAA) bezeichnet) werden aus Tumoren von Warmblütern, beispielsweise aus Okularkarzinomen, Sarcoid, Eierstockkrebs, Mammatumoren, Pankreaskarzinomen, renalen Karzinomen, Lungenkarzinomen und dergleichen erhalten.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Impfstoffes werden gemäß Anspruch 4

a) ein raffiniertes detoxifiziertes Endotoxin
b) mindestens ein biologisches Immunostimulanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- 1) mycobakteriellem Zellwandskelett
- 2) Trehalosedimycolat und
- 3) pyridinlöslichem Extrakt eines Mikroorganismus;
c) ein pharmazeutisch verträglicher Träger und

mindestens ein tumor-assoziiertes Antigen miteinander vermischt.

Das erfindungsgemäß zum Einsatz gebrachte raffinierte detoxifizierte Endotoxinimmunostimulanz wurde identifiziert als Monophosphoryllipid A (MPL) und wurde nach den in den US-Patentschriften US-A 44 36 727 und 44 36 728 hergestellt. Auf diese Patentschriften wird hiermit Bezug genommen. Endotoxinextrakte dieses Typs, die als Ausgangsmaterial zur Herstellung von MPL eingesetzt werden, können von allen Enterobacteriaciae einschließlich der Stammorganismen und Mutanten erhalten werden. Die zuvor genannten Patentschriften beschreiben denjenigen Typ von Mikroorganismen, der zur Bereitstellung des Ausgangsmaterials eingesetzt werden kann. Es werden dort auch verschiedene Verfahren zur Herstellung des Ausgangsmaterials beschrieben. Das detoxifizierte Endotoxin kann auch synthetisch sowie nach den Techniken des Genetic Engineerings hergestellt werden. Das derzeit bevorzugte Verfahren, um den endotoxischen Extrakt zu erhalten, ist das von Chen et al., J. Infect. Dis. 128 543 (1973) beschriebene Verfahren.

Monophosphoryllipid A (MPL) ist eine Zusammensetzung, die sich dadurch auszeichnet, daß sie kein 2-Keto-3-deoxyoctonat, etwa 350 bis etwa 475 nmol/mg Phosphor und etwa 1700 bis etwa 2000 nmol/mg Fettsäuren enthält. Die vollständige Struktur von Monophosphoryllipid A, erhalten aus Lipopolysacchariden von Salmonella minnesota R595, ist nachstehend gezeigt:

MPL stellt eine signifikante Verbesserung dar, verglichen mit endotoxischen Extrakten, die aus Enterobacteriaciae erhalten wurden, da MPL detoxifiziert ist und somit keine hochtoxischen Komponenten enthält, aufgrund welcher die endotoxischen Extrakte für die therapeutische Anwendung ungeeignet waren (man vergleiche: Peptides as Requirements for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10-Tumor with Endotoxins; Ribi et al., Cancer. Immunol. Immunother., Bd. 7, S. 43-58: 1979; auf die entsprechende Offenbarung wird hiermit Bezug genommen. Die besseren und vorteilhafteren Wirkungen von MPL, verglichen mit anderen endotoxischen Extrakten, ist beispielsweise beschrieben in US-A 44 36 727 und 44 36 728 und im Journal of Biological Response Modifiers, Bd. 3, S. 1-9: 1984 von E. Ribi; auf die entsprechende Offenbarung wird hiermit Bezug genommen).

Das in den erfindungsgemäßen Impfstoffen zum Einsatz gebrachte Endotoxinimmunostimulanz wurde - wie bereits ausgeführt - entsprechend den in den US-Patentschriften US-A 44 36 727 und 44 36 728 beschriebenen Verfahren detoxifiziert. Unter detoxifiziert wird im Rahmen der vorliegenden Unterlagen verstanden, daß die Toxizität (LD₅₀-Wert) des Endotoxins, bezogen auf den Lethalitätsassay mit Hühnerembryos, mindestens 20 µg beträgt. Im Vergleich dazu beträgt der LD₅₀-Wert von toxischem Endotoxin etwa 0,001 µg.

Neben dem eingesetzten Monophosphoryllipid A-Immunostimulanz ist in den erfindungsgemäßen Impfstoffen mindestens ein weiteres bakterielles Adjuvans vorhanden. Wie bereits oben ausgeführt, zählen zu derartigen Adjuvantien (a) mycobakterielles Zellwandskelett, (b) Trehalosedimycolat und (c) ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus.

Das erste bakterielle Adjuvans, das mit dem Antigen und MPL zum Einsatz gebracht werden kann, ist das Zellwandskelett, bei dem es sich im wesentlichen um Zellwand handelt, aus der das normalerweise in der Zellwand vorhandene Protein und Lipide zum größten Teil entfernt worden sind. Es handelt sich um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmukopeptid, das Reste von Trehalosemycolaten ("P3") und unverdauten Tuberkuloproteinen enthält. Das Zellwandskelett kann von beliebigen Mikroorganismen erhalten werden, wozu beispielsweise zählen M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium parvum, M. kansaii, M. tuberculosis (Stamm H 37 und RV und Ayoma B) und M. bovis Stamm BCG. Zellwandskelett kann auch aus anderen Organismen erhalten werden, wie aus E. coli, B. abortus und Coxiella burnettii.

Zellwandskelett kann man gewinnen, indem man Bakterien, wie M. bovis Stamm BCG (Bacillus Calmette-Guerin) wachsen läßt und dann erntet. Der erhaltene Gesamtzellenrückstand wird mit einem Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator (Sorvall. Model RF-1)) verarbeitet, der die Zellen aufbricht und die äußere Hülle oder Zellwand von den protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die resultierenden Zellwände werden dann einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzymatischen Behandlungen (z. B. Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, so daß man gereinigtes Zellwandskelett erhält.

Ein zweites bakterielles Adjuvans, das man in den erfindungsgemäßen Impfstoffen einsetzen kann, sind Trehalosedimycolate (TDM), die man aus Organismen, wie beispielsweise M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Axoma B), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansaii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae erhalten kann.

Bakterien, wie M. avium, läßt man wachsen, erntet sie und tötet sie dann unter Anwendung von Hitze. Die Zellmasse extrahiert man dann mit verschiedenen Lösungsmitteln und extrahiert dann eine aktive lösungsmittellösliche Fraktion. Den Extrakt reinigt man weiter mit Hilfe einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen, um rohes TDM zu erhalten (man vergleiche: Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. 1. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component, S. 3, Azuma et al., Journal of the National Cancer Institute, Bd. 52, Seiten 95-101, 1974). Auf diese Offenbarung wird hiermit Bezug genommen. Wie von Azuma et al beschrieben, können rohe TDM dann durch Zentrifugenchromatographie unter Anwendung mikropartikulärem Silikagels weiter gereinigt werden, so daß man gereinigte TDM erhält. TDM kann man auch gemäß dem im amerikanischen Patent US-A 45 05 900 beschriebenen Verfahren herstellen.

Das dritte bakterielle Adjuvans, das in den erfindungsgemäßen Vakzinen enthalten sein kann, ist ein pyridinlöslicher Extrakt von Mikroorganismen, der etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 40 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis etwa 60 Gew.-% Fettsäuren enthält. Der Extrakt enthält vorzugsweise etwa 5 Gew.-% Protein, jeweils etwa 35 Gew.-% Zucker und etwa 5 Gew.-% Fettsäure.

Das Protein enthält Aminosäuren und Ammoniak; zu den Aminosäuren zählen beispielsweise die folgenden:

Asparginin
0,273
Threonin	0,108
Serin	0,585
Muraminsäure	0,219
Glutaminsäure	0,267
Glycin	0,39
Alanin	0,173

Die oben aufgeführten Angaben stellen Gew.-% dar. Der Gesamtproteingehalt beträgt 6,34 Gew.-%.

Der nach der Lehre der vorliegenden Erfindung hergestellte pyridinlösliche Extrakt besitzt folgende Elementaranalyse:

Element
Gewichtsprozent
Kohlenstoff
60,35
Wasserstoff	9,47
Sauerstoff	23,91

Der Extrakt besitzt zudem ein IR-Spektrum, dessen zur Identifizierung nützlichen und wichtigen Peaks in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt sind:

Jeder Mikroorganismus kann eingesetzt werden, um den pyridinlöslichen Extrakt zu erhalten. Dazu zählen beispielsweise M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansaii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum ist insbesondere bevorzugt.

Ganze Zellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, mixt man mit Pyridin. Die erhaltene Mischung wird getrennt, um eine überstehende Fraktion, welche den pyridinlöslichen Extrakt enthält, und einen pyridinlöslichen Rückstand zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann gewünschtenfalls wiederholten Trennverfahren der oben beschriebenen Art unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung weiterer Mengen des gewünschten Extraktes unterworfen werden.

Man entfernt dann das Pyridin aus dem Extrakt und dialysiert den getrockneten Extrakt gegen eine geeignete Flüssigkeit, beispielsweise destilliertes Wasser. Die Abwesenheit ganzer Zellen und Zellfragmentverunreinigungen wird elektronenmikroskopisch bestätigt. Den erhaltenen gereinigten Extrakt kann man dann nach bekannten Verfahren lyophilisieren, wobei man ein stabiles Produkt erhält.

Die erfindungsgemäßen immunologischen Adjuvantien zusammen mit den tumor-assoziierten Antigenen stärken das Immunansprechen auf derartige Antigene und können somit in einer Vielzahl von Tumorvakzinen sowohl für Tierwirte als auch für Humanwirte Anwendung finden. In der Praxis wird das raffinierte detoxifizierte Endotoxin (MPL) in einer Konzentration von etwa 10 bis 500 µg pro Dosis eingesetzt, wobei ein insbesonders verstärktes Immunansprechen bei einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 µg pro Dosis festgestellt werden konnte. Das Zellwandskelett wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 275 bis etwa 325 µg pro Dosis zur Anwendung gebracht. Die Trehalosedimycolate werden vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 300 µg pro Dosis und insbesonders bevorzugt von etwa 125 bis 175 µg pro Dosis eingesetzt. Der pyridinlösliche Extrakt kann in einer Konzentration von etwa 500 bis etwa 2400 µg pro Dosis und insbesonders bevorzugt von etwa 750 bis etwa 1200 µg pro Dosis eingesetzt werden. Gewünschtenfalls können weitere Komponenten oder Additive zusammen mit den erfindungsgemäßen Adjuvantien eingesetzt werden (µg=microgram).

Werden nur eine oder zwei der drei Klassen von Adjuvantien zusammen mit dem Antigen und MPL eingesetzt, dann können höhere Konzentrationen derartiger Adjuvantien zur Anwendung gebracht werden. Erforderlich ist jedoch nur eine ein Immunansprechen verstärkende Menge des oder der Adjuvantien, das oder die das Immunansprechen der Vakzine auf das tumor-assoziierte Antigen oder die tumor-assoziierten Antigene verstärkt.

Die optimale Menge an Antigen, die in den erfindungsgemäßen Vakzinen zum Einsatz gebracht wird, hängt natürlich von jedem speziellen Tumor ab. In der Praxis hat sich jedenfalls herausgestellt, daß das Antigen im allgemeinen in der Vakzine in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 mg pro Dosis und insbesondere bevorzugt in einer Menge von etwa 2 bis 10 mg pro Dosis vorhanden ist.

Die Tumor-assoziierten Antigene und die Adjuvantien setzt man vorzugsweise in einem pharmazeutisch verträglichen Träger ein, um die erfindungsgemäße Vakzine bereitzustellen. Zu den einsetzbaren Trägern zählen beispielsweise physiologische Kochsalzlösung oder Öltröpfchenemulsionen. Die eingesetzte Ölmenge liegt im Bereich von etwa 0,5 bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung.

Die erfindungsgemäßen Vakzinen kann man herstellen, indem man TAA, MPL und biologische Adjuvantien gemäß allgemein praktizierter Vorgehensweisen vermischt.

Wie bereits oben ausgeführt wurde, kann man die Zusammensetzung zur Behandlung von warmblütigen Tieren und von Menschen in Form einer Öltröpfchenemulsion einsetzen. Die zur Anwendung gebrachte Ölmenge liegt im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Vorzugsweise setzt man etwa 0,75 bis 1,5 Vol.-% Öl ein. Beispiele derartiger Öle sind leichtes Mineralöl, Squalan, 7-n-Hexyloctadecan, Conocosuperöl (Conoco superoil) und Drakeol 6 VR-Mineralöl (Drakeol 6 VR mineral oil) (hergestellt von Pennreco Company, Butler, Pa.).

Die ölhaltige homogenisierte Mischung kombiniert man dann mit einem Detergenz, das man gewünschtenfalls vor dem Vermischen in einer Kochsalzlösung löst. Die Detergenzmenge beträgt typischerweise etwa 0,02 bis 0,20 Vol.-% und vorzugsweise 0,10 bis 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Jedes übliche Detergenzmaterial kann Anwendung finden, einschließlich Tween 80 und Arlacel (hergestellt von Atlas Chemical Company).

Die nach Zugabe des Detergenz erhaltene Mischung homogenisiert man dann, um eine Suspension herzustellen, welche einen hohen Prozentsatz an Öltröpfchen besitzt, die mit MPL und CWS beschichtet sind (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung).

In alternativer Weise kann man wäßrige Suspensionen von TAA zu lyophilisierten Emulsionen geben, welche die biologischen Adjuvantien enthalten. Anschließend mischt und emulgiert man unter Anwendung eines Vortex-Rührers, bis man eine leicht milchige Suspension erhält. Man stellt dann wie oben beschrieben (man vergleiche US-A 45 20 019) lyophilisierte Emulsionen her.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe verabreicht man an warmblütige Tiere gewöhnlich mit Hilfe intramuskulärer, intraperitonealer oder subkutaner Injektionen einmal wöchentlich bis zu einer Gesamtzahl von 15 Injektionen in den oben aufgeführten Dosen.

Es hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe das Immunansprechen auf eine Vielzahl von natürlichen tumor-assoziierten Antigenen stark fördert, wobei es sich sowohl um natürliche als auch um synthetische und virale, bakterielle, pilzartige oder protozoische Antigene handelt. Die einzige Anforderung, die an das an den erfindungsgemäßen Impfstoffen eingesetzte Antigen gestellt wird, ist, daß es in der Lage sein muß, ein Immunansprechen in einem Wirt hervorzurufen, und daß das Ansprechen durch die damit kombinierten erfindungsgemäßen Adjuvantien verstärkt wird. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe besitzen somit eine wirksame Antitumoraktivität und sind demgemäß zur Behandlung und Verhütung einer Vielzahl von Tumoren sowohl bei Tieren als auch bei Menschen nützlich. Durch diese Impfstoffe können Tumore einschließlich Krebstumore behandelt werden. Dazu zählen Tiertumore, wie squamöse Rinderzellkarzinome, Rinderfibrosarkome, Pferdesarkoid, Pferdemelanom, squamöses Pferdezellkarzinom, Mammatumore bei Hunden, Hundeadenom und Hundemelanom. Auch Humantumore zählen dazu, wie ovariale Karzinome, Melanome, colorektale Karzinome, pankreatische Karzinome, renales Karzinom und dergleichen.

Obwohl der eine Tumorregression herbeiführende Wirkungsmechanismus der erfindungsgemäßen Impfstoffe noch nicht vollständig geklärt ist, wird angenommen, ohne daß diese Erklärung verbindlich ist, daß die Kombination aus den tumor-assoziierten Antigenen und dem Adjuvans sowohl ein nicht-spezifisches als auch ein spezifisches Immunansprechen stimulieren.

Obwohl die erfindungsgemäßen Impfstoffe bei der Behandlung von Tumoren wirksam sind, können diese Anti-Tumorvakzine bei der klinischen Anwendung auch eine begleitende Behandlung für andere Therapieformen darstellen. Dies hat seine Ursache darin, daß die Immunotherapie äußerst wirksam sein kann, wenn die Tumorbelastung so klein ist, daß sie durch das Immunsystem des Patienten bewältigt werden kann. Ein Patient mit einer fortgeschrittenen Krankheit würde somit einer Art von Behandlung unterzogen werden, um die Tumorbelastung zu reduzieren, und würde anschließend die Anti-Tumorvakzine erhalten, um die restlichen Tumorzellen zu eliminieren. Bei der begleitenden Behandlung kann es sich um chirurgische Maßnahmen, Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie oder jede andere Behandlungsart zur wirksamen Reduzierung der Tumorbelastung handeln. Die begleitende Behandlung kann auch eine weitere Form einer Immunotherapie sein, beispielsweise die Verabreichung von Interleukin-2.

In den nachfolgenden Beispielen wurden die bakteriellen Komponenten, die Tumore und die Tumorzellen und die Tumorzellvakzinen unter Anwendung aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt und bewertet.

Beispiel 1 Herstellung der bakteriellen Komponenten 1. Herstellung von detoxifiziertem Endotoxin oder Monophosphoryllipid A (MPL)

Man isoliert rohes Endotoxin durch organische Lösungsmittelextraktion aus der polysaccharid-defizitären heptoselosen Re-Mutante von Salmonella minnesota (Stamm R595). Dieser Stamm wurde von NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana, erhalten. Dieses Endotoxin, das nur aus KDO und Lipid A besteht, ist eher ein Glykolipid als ein typisches endotoxisches Lipopolysaccharid und wird durch fraktionelle Präzipitation mit organischen Lösungsmitteln geeigneter Polaritäten gereinigt. Man behandelt es dann mit siedender 0,1 N Salzsäure und erhält eine Komplexmischung, die aus freien Fettsäuren und strukturellen Homologen von nicht-toxischem Monophosphoryllipid A (MPL) besteht. Man trennt diese Komponenten durch Druckelutionssäulenchromatographie. Man vereinigt die den strukturellen Homologen von MPL, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie, eluierten Fraktionen und untersucht auf Toxizität. Sie sind für Tieruntersuchungen geeignet, wenn die 50%ige letale Dosis bei intravenös inokulierten Kükenembryos (chicken embryos, CELD₅₀) größer als 10 µg ist. (Die letale Dosis des am Anfang eingesetzten Endotoxins beträgt weniger als 0,001 µg.)

2. Herstellung des mycobakteriellen Zellwandskeletts (Cell wall Skeleton; CWS)

Man stellt Zellwände von Mycobacterium bovies, Stamm BCG, erhalten von NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana, mit Hilfe des Sorvall-Ribi-Zellfraktionators (Sorvall-Ribi Cell Fractionator; Model-RF-1) her. Bei einem Druck von 35 000 psi bei einer Temperatur von 10 bis 15°C crackt man bzw. spaltet man die mikrobakteriellen Zellwände auf. Das Protoplasma extrudiert man in einen löslichen Zustand. Man erntet dann die Zellwandhüllen durch Zentrifugieren und reinigt durch wiederholtes Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser. Man behandelt dann die Zellwände mit RNA-Ase und DNA-Ase, um Nukleinsäuren zu entfernen. Anschließend behandelt man mit einer Reihe von proteolytischen Enzymen und führt eine Detergenzbehandlung durch, um Proteine bzw. Peptide zu entfernen. Schließlich extrahiert man das Präparat extensiv mit organischen Lösungsmitteln, um "freies Lipid" zu entfernen. Das erhaltene CWS ist aus einem polymeren (Mykolsäure-) Arabinogalactanmucopeptid-Komplex zusammengesetzt.

3. Isolierung und Reinigung von Trehalosedimycolat (TDM)

Man extrahiert ganze Zellen von Mycobakterien zuerst mit Ethanol und anschließend mit Aceton und zum Schluß mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (CM 2 : 1). Der CM-Extrakt enthält das TDM zusammen mit verunreinigenden Lipiden mit geringerer oder höherer Polarität als TDM. Diese Lipide trennt man selektiv ab, indem man sie mit Zusammensetzungen aus organischen Lösungsmitteln präzipitiert, in denen sie unlöslich sind, während das TDM in der löslichen Phase verbleibt. Das erhaltene rohe TDM reinigt man durch Druckelutionschromatographie. Eluierte Fraktionen, welche eine einzelne Komponente von TDM enthalten (dünnschichtchromatographisch bestimmt), vereinigt man und setzt sie für die Untersuchungen ein.

4. Pyridinextraktion von Corynebacterium Parvum (PE)

Durch Hitze getötete ganze Zellen von C. parvum VPI (erhalten von Dr. C. Cummings, Virginia Polytechnic Institute), extrahiert man dreimal bei 37°C mit Pyridin. Man konzentriert dann die vereinigten pyridinlöslichen Extrakte durch Sprühverdampfen, dialysiert und lyophilisiert. Man erhält eine Substanz mit verstärkter Antitumoraktivität und stark reduzierter Toxizität.

Beispiel 2 Aufstellen von zu bewertenden Tumormodellen bei Mäusen 1. Tiere

Alle Tumorexperimente wurden mit sechs bis acht Wochen alten C3HB/FeJ-Mäusen (weiblich) oder mit C57BL/10- und DBA/2-Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt. Die Mäuse wurden von Farmen von Ribi ImmunoChem. Research, Inc., Hamilton, Montana, erhalten. Die Elternstämme der DBA/2- und C3HB/FeJ-Mäuse wurden von Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) bezogen.

Sewell-Wright-Meerschweinchen des intern gezogenen Stammes-2 wurden von der Farm von Ribi ImmunoChem Research bezogen. Meerschweinchen beiderlei Geschlechts wogen bei Beginn der Experimente 350 bis 500 g.

2. Tumore

Leukemia EL-4 (bereitgestellt von Dr. Bruce Chesebro, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana), ovariale MOT (von Dr. J. Berek, UCLA, Los Angeles, Ca.) und Lymphoma B388-Zellen (erhalten von ATCC) hält man in der ascitischen Form durch Serientransfers in C57BL/10-, C3HB/FeJ- bzw. DBA/2-Mäusen am Leben. Man erntet die Tumorzellen aus der Peritonealhöhle und wäscht mit 20 ml Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered sailine (PBS)). Man lysiert die roten Blutzellen (RBC) mit 10 ml 1%igem Ammoniumoxalat. Nach 30 Sek. stellt man durch Zugabe von 40 ml PBS die physiologische Osmolarität wieder her. Man pelletiert die Zellen durch Zentrifugieren und stellt die Zelldosis derart ein, daß man ein Inokulum von 2 bis 5×10⁴ Zellen in 0,1 ml PBS verabreicht.

Man hält Linie-10-Hepatomazellen in ascitischer Form in syngenetischen Stamm-2-Meerschweinchen durch i.p. Serientransfers "am Leben". Man erntet die Tumorzellen aus den ascitestragenden Spendern, wäscht 3× in steriler Kochsalzlösung und stellt auf 20×10⁶-Tumorzellen/ml ein.

3. Design des Immunotherapieexperiments

EL-4, MOT oder P388-Tumorzellen, die aus derselben Quelle wie oben erläutert erhalten wurden, stellt man wie oben beschrieben her und inokuliert 0,2 ml der Tumorzellsuspension i.p. am Tag 0 in den geeigneten syngenetischen Stamm der Mäuse. Tumorkontrollen erhalten keine weitere Behandlung. Zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 1 bis Tag 6) nach der Tumortransplantation gibt man den Mäusen eine einzelne i.p. Injektion des Immuntherapeutikums. Man beobachtet die Tiere jeder Gruppe täglich, um die prozentuale Überlebensrate und/oder die Reduktion an Tumormasse zu bestimmen. Den Linie-10-Tumor etabliert man bei Meerschweinchen durch intradermale Injektion durch 10⁶-ascitesgewachsenen Tumorzellen. Die Immunotherapeutika verabreicht man in einem Volumen von 0,4 ml durch intraläsionale Inokulation nach 6 Tagen; zu diesem Zeitpunkt besaßen die Tumore einen Durchmesser von 9-11 mm.

Beispiel 3 Formulierungsverfahren zur Herstellung der Tumorzellvakzinen 1. Herstellung der solubilisierten tumor-assoziierten Antigene

Tumorantigene stellt man mit Hilfe eines modifizierten Verfahrens unter Anwendung einer 3M KCl-Extraktion her. Dies sei in kurzen Worten erläutert. 3M KCl in PBS gibt man zu einem Zellpellet lebender Tumorzellen bei einer Konzentration von 5 ml/3×10⁸-Zellen. Man rührt die Suspension 18 bis 24 h bei 4° und verwirft dann die Pellets. Man dialysiert die überstehende Flüssigkeit bzw. das überstehende Fluid 24 h bei 4° gegen destilliertes Wasser und zentrifugiert dann 2 h bei 4° und 100 000 g. Man zentrifugiert das Dialysat schließlich 2 h bei 4° und bei 100 000 g, um das feine gelatinartige Präzipitat zu entfernen, das sich nach der Dialyse bildet. Das lösliche Material lyophilisiert man dann.

Der Linie-10-Meerschweinchentumor; EL-4, MOT und P388 bei Mäusen sowie okulares squamöses Rinderzellkarzinom (bovine ocular squamous cell carcinoma; BOSCC) und Pferdesarkoid (equine sarcoid; ES), erhalten von tumortragenden Wirten, extrahiert man auf diese Weise. Außerdem extrahiert man Kochsalzsuspensionen von homogenisiertem BOSCC und ES nach einem modifizierten Phenolverfahren.

2. Herstellung der Öltröpfchenemulsion

Öltröpfchenemulsionen, welche lösliche Extrakte der Tumore enthalten, stellt man her, wobei die Kombinationen von CWS, TDM und MPL wie zuvor beschrieben (US-A 45 20 019) variieren.

3. Vorläufige Tests der Impfstoffe

Die Therapieverfahren sind im wesentlichen die zuvor beschriebenen. Somit etabliert man Tumore durch s.c.-Injektion von Mäusen oder Meerschweinchen mit 2 bis 5×10⁴ ascites-gewachsenen Tumorzellen. Man verabreicht 25 oder 100 µg Mengen Mitomycin C intraläsional 7 Tage nach der Implantation, wenn die Tumore einen Durchmesser von etwa 4 mm besitzen. 2 Tage später injiziert man die Impfstoffe mittels verschiedener Verabreichungswege. Die Heilungsraten vergleicht man mit der Überlebensrate der unbehandelten Tiere. Geheilte Tiere untersucht man auf ihre Fähigkeit, einer nachfolgenden Challenge mit homologen Tumorzellen zu widerstehen.

4. Spezifische Immunotherapie spontaner Tumore bei Rindern und Pferden

Okulares squamöses Rinderzellkarzinom (BOSCC) ist ein potentiell metastatisches autochthones Karzinom, das bei etwa 4,7% der Herford-Rinder und bei 0,8 bis 1,6% einer üblichen Rinderpopulation natürlich vorkommt. Pferdesarkoid (ES) ist ein lokal aggressiver Hauttumor und ist der am meisten übliche spontane Tumor bei Pferden. Diese Tumore metastasieren nicht schnell, sind aber lokal invasiv und nicht-aggressiv.

Beispiel 4 Isolation der tumor-assoziierten Antigene

Zwei experimentelle Tumormodelle, (a) Linie-10-hepatocellulares Karzinom in inbred-Stamm-2-Meerschweinchen und (b) ovarialer Tumor bei Mäusen (Murine ovarian tumor; MCT) in inbred-C3HB/FeJ-Mäusen wurden von existierenden Brutkolonien dieser Empfängertiere bei Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana, erhalten.

Die drei folgenden weiteren Tumore bei Mäusen von Zellinien wurden erhalten: L-1210-Leukemia wurde von Dr. Jerry Killion, Oral Roberts University, Tulsa, OK, erhalten; EL-4-Lymphomtumorzellen wurden von Dr. Bruce Chesebro, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana, erhalten; und P-388-Lymphomtumorzellen wurden von ATCC erworben. B₆D₂F₁- und C3HB/FeJ-Mäuse wurden für die Aufrechterhaltung dieser Tumorzellinien und für Tumorregressionsuntersuchungen von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, erworben.

Tumor-assoziierte Antigene (TAA) zur Anwendung in Kombination mit MPL und anderen bakteriellen Antitumorkomponenten der vorliegenden Erfindung wurden aus MOT ovarialen Tumorzellen, EL-4-Lymphom, P-388-Lymphom und L-1210-Leukämie mit Hilfe der 3M KCl-Extraktionsmethode isoliert. In kurzen Worten, Gruppen des geeigneten Mäusestammes wurden als i.p.-Injektion von 0,5 bis 1×10⁵ lebende Tumorzellen verabreicht. Ascitesflüssigkeit wurde 8 bis 10 Tage später gesammelt, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt. Markierte Tumorzellen wurden über Nacht mit 3M KCl extrahiert. Der wäßrige lösliche Extrakt wurde durch Zentrifugieren, Dialysieren und Lyophilisieren erhalten. Außerdem wurde TAA von ascites-gewachsenen Linie-10-Tumorzellen in Stamm-2-Meerschweinchen gemäß dem obigen Verfahren erhalten.

TAA-Extrakte wurden auch aus zwei spontan sich entfaltenden Sarkoidtumoren bei Pferden erhalten. Die festen Sarkoidtumore wurden in 3M KCl homogenisiert und bei 4°C über Nacht extrahiert. Der wäßrige Extrakt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, dialysiert und lyophilisiert.

Beispiel 5 Antitumoraktivität von detoxifiziertem Endotoxin (MPL) alleine oder in Kombination mit Pyridinextrakt von P. acnes (PA-PE)

Man führt die Experimente durch, um zu zeigen, daß PA-PE und Mycobakteria-Trehalosedimycolat (TDM) als Zellwandskelett (CWS) wirksam ist bei der Regression von Linie-10-Tumoren in Stamm-2-Meerschweinchen, wenn in Kombination mit MPL eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt:

Tabelle 1

Antitumoraktivität von Ölemulsionen, die MPL alleine oder in Kombination mit PA-PE+TDM enthalten, im Linie-10-Tumormodella)

Beispiel 6

Die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen dienten dazu, die Fähigkeit von wäßrigen Lösungen, die MPL alleine oder in Kombination mit PA-PE enthalten, dahingehend zu untersuchen, inwieweit sie zu einer Regression von MOT ovarialen Zellen bei C3HB/FeJ-Mäusen führen. Man inokuliert weibliche Mäuse mit 2×10⁴ MOT-Zellen am Tag 0 und verabreicht die Immunotherapie 24 h später.

Wie aus der Tabelle 2 hervorgeht, beobachtet man nur eine geringe oder keine Antitumoraktivität bei Mäusen, denen man entweder 1200 µg PA-PE oder 240 µg MPL verabreicht. Man beobachtet jedoch eine signifikante Antitumoraktivität (88% tumorfrei) bei Mäusen, die man mit einer Kombination von PA-PE+MPL behandelt. Zudem ist das Ansprechen insofern dosisabhängig, als weniger tumorfreie Tiere bei abnehmenden Dosen der Immunostimulantien zu beobachten sind. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben:

Tabelle 2

Antitumoraktivität detoxifizierten Endotoxins (MPL) alleine oder in Kombination mit Pyridinextrakt von P. acnes (PA-PE)a)

Beispiel 7

Zur Bestimmung, ob solubilisierte Tumorantigene (TAA) die Antitumoraktivität von PA-PE+MPL verstärken, gibt man MOT-Tumore tragenden Mäusen MOT-TAA alleine oder in Kombination mit einer nicht-wirksamen Dosis von PA-PE+MPL (Tabelle 3). Man beobachtet bei Mäusen, die man mit 500 oder 350 mg TAA alleine behandelt, keine Antitumoraktivität. Kombiniert man jedoch 500 µg TAA mit PA-PE+MPL, dann sind 100% der Mäuse 60 Tage nach der Tumortransplantation tumorfrei. Die mittlere Überlebenszeit für die nicht-behandelte Tumorkontrollgruppe beträgt 21 Tage. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Wirksamkeit tumor-assoziierter Antigene (TAA) alleine oder in Kombination mit PA-PE+MPL bei der Regression von MOT-Tumoren in C3HB/FeJ-Mäusena)

Beispiel 8

Obgleich man mit TAA in Kombination mit PA-PE+MPL eine signifikante Antitumoraktivität beobachtet, ist es von Interesse, dessen Antitumorwirkung bei Verabreichung in zunehmenden Zeitintervallen nach der Tumortransplantation zu untersuchen. Man gibt Mäusen 2×10⁴ MOT-Zellen am Tag 0 und therapiert dann (PA-PE+MPL oder TAA+PA-PE+MPL) am Tag 1, 2, 3 oder 4. Man beobachtet eine wirksame Therapie mit PA-PE+MPL alleine oder in Kombination mit TAA, wenn man eine Verabreichung am Tag 1 oder 2 nach der Tumorzellinokulation gibt. Die Größe der Antitumoraktivität war jedoch an den Tagen 3 und 4 signifikant verringert, gemessen mit tumorfreien Tieren. Diese Abnahme der Antitumoraktivität scheint auf einer Zunahme der Tumorbelastung zu beruhen. Es werden daher Studien unternommen, um die Tumorbelastung mit Hilfe der Chemotherapie unter Verwendung von Mitomycin C zu reduzieren. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Antitumoraktivität von MPL+PA-PE oder TAA+MPL+PA-PE, verabreicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tumortransplantationa)

Beispiel 9

Zur Untersuchung der Wirkung der Chemoimmunotherapiekombination gibt man Mäusen MOT-Tumorzellen am Tag 0 und i.p. Mitomycin C an den Tagen 2 bis 6. Die Immunotherapie verabreicht man 30 bis 36 h nach der Verabreichung des Arzneimittels. Die zur Anwendung gebrachte Dosierung von Mitomycin C bestimmt man zuvor dadurch, daß man tumortragende Mäuse am Tag 6 mit verschiedenen Dosierungen des Arzneimittels i.p. behandelt. Man wählt eine Dosis von 100 µg aus, da bei dieser Dosis keine Toxizität und minimale therapeutische Effekte (20% Regressionsrate) beobachtet wurde.

Die Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung, bei der man tumortragenden Mäusen mit Mitomycin C am Tag 6 und mit Hilfe der Immunotherapie 31 h später behandelt. Alle mit der Immunotherapie behandelten Mäuse, die zuvor nicht chemotherapeutisch behandelt worden waren, sterben an zunehmendem Tumorwachstum (Daten nicht aufgeführt). Jedoch beobachtet man eine 50%ige Ansprechrate in der Gruppe, welche das Arzneimittel und TAA+PA-PE+MPL in hoher Dosis erhält, wobei man bei einer niedrigeren Dosis nur geringe Aktivitäten beobachtet.

Tabelle 5

Wirkung der Chemotherapie und anschließende Behandlung mit PA-PE+MPL+MOT-TAA bei MOT an C3HB/FeJ-Mäusena)

Beispiel 10

Das Verfahren des Beispiels 9 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Zeit zwischen der Tumortransplantation und der Chemotherapie variiert wurde. Immunotherapeutische Maßnahmen wurden 33 h nach dem Arzneimittel Mitomycin C vorgenommen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt:

Tabelle 6

Wirkung der Chemotherapie an den Tagen 2, 4 oder 6 und anschließender Behandlung mit PA-PE+MPL+MOT-TAA am MOT bei C3HB/FeJ-Mäusena)

Verabreicht man Mitomycin C am Tag 2, dann beobachtet man keine signifikante Differenz bei solchen Gruppen, welche Chemoimmunotherapie oder Chemotherapie alleine erhalten. Die Chemotherapie führt somit zu einem dramatischen Effekt, wenn sie früh eingeleitet wird. Im Gegensatz dazu beobachtet man keine chemotherapeutische Wirkung bei Tieren, denen man nur das Arzneimittel am Tag 4 oder 6 verabreicht. Kombiniert man dies jedoch mit der Immunotherapie, dann beobachtet man einen ausgeprägten Antitumoreffekt. Diese Antitumoraktivität beobachtet man bei Mäusen, denen man PA-PE+MPL alleine oder in Kombination mit TAA verabreicht.

Beispiel 11 Antitumoraktivität von TAA in Kombination mit anderen mikrobiellen Antitumorkomponenten bei der Regression von Linie-10-Tumoren in Stamm-2-Meerschweinchen

Vorherige Studien haben gezeigt, daß die Kombination von MPL und Zellwandskelett (CWS) eine signifikante Antitumoraktivität besitzt, bestimmt durch die Regression etablierter Linie-10-Tumoren in Stamm-2-Meerschweinchen. Die folgende Untersuchung wurde vorgenommen, um zu bestimmen, ob die Zugabe von solubilisiertem TAA zu MPL+CWS dessen Antitumoraktivität steigern würde. Mittels Inzucht gezogener Stamm-2-Meerschweinchen inokuliert man dazu mit 2×10⁶ lebenden Linie-10-Tumorzellen am Tag 0. Man gibt die Immunotherapie direkt in die Tumore als Öl-in-Wasser-Emulsionen am Tag 6, wenn die Tumore einen Durchmesser von 8 bis 10 mm besitzen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 wiedergegeben.

Tabelle 7

Antitumoraktivität von tumor-assoziiertem Antigen in Kombination mit verschiedenen BRM-Formulierungen auf Linie-10-Hepatokarzinom bei Stamm-2-Meerschweinchen

Claims

1. Impfstoff zur Behandlung und Verhütung von Tumoren in einem Wirt umfassend

dadurch gekennzeichnet, daß

- er zusätzlich mindestens ein tumor-assoziiertes Antigen, das aus Tumoren von Warmblütern erhalten wird enthält und daß
- die Gruppe gemäß b) als weiteres Immunstimulanz einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus aufweist wobei dieser Extrakt etwa 7 bis 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 16 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 55 Gew.-% Fettsäuren enthält.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, die Monophosphoryllipid A als raffiniertes detoxifiziertes Endotoxin enthält.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Komponente (b) mycobakterielles Zellwandskelett, Trehalosedimycolat, ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus, eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett und Trehalosedimycolat, eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus, eine Kombination aus Trehalosedimycolat und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus oder eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett, Trehalosedimycolat und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man

(a) ein raffiniertes detoxifiziertes Endotoxin,
(b) mindestens ein biologisches Immunostimulanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- 1) mycobakteriellem Zellwandskelett,
- 2) Trehalosedimycolat und
- 3) pyridinlöslichem Extrakt eines Mikroorganismus;
(c) einem pharmazeutisch verträglichen Träger
und mindestens ein tumor-assoziiertes Antigen miteinander vermischt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein raffiniertes detoxifiziertes Endotoxin, das kein detektierbares 2-Keto-3-deoxyoctonat, etwa 350 bis 475 nmol/mg Phosphor und etwa 1700 bis 2000 nmol/mg Fettsäuren enthält, einsetzt, daß man als raffiniertes detoxifiziertes Endotoxin Monophosphoryllipid A einsetzt und daß es sich bei der Komponente (b) um mycobakterielles Zellwandskelett oder Trehalosedimycolat oder einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus oder um eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett und Trehalosedimycolat oder um eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett und einem Pyridinextrakt eines Mikroorganismus oder um eine Kombination aus Trehalosedimycolat und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus oder um eine Kombination aus mycobakteriellem Zellwandskelett, Trehalosedimycolat und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus handelt.