CH664897A5

CH664897A5 - Gereinigtes, entgiftetes endotoxin enthaltende pharmazeutische zusammensetzung.

Info

Publication number: CH664897A5
Application number: CH4544/84A
Authority: CH
Inventors: John Leonard Cantrell
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1983-09-23
Filing date: 1984-09-21
Publication date: 1988-04-15
Also published as: FR2552326B1; FI843716L; IT8448894A0; GB2149301A; CA1244765A; KR850002404A; GB2149301B; GB8423993D0; AU566234B2; FR2552326A1; BE900650A; DK446684A; DK446684D0; AT385659B; KR870000843B1; JPS60120817A; FI843716A0; SE8404707D0; DE3434766A1; NL8402902A

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch wirksame Menge an mikrobiellen, pyridinlöslichen Inhaltsstoffen aus Mikroorganismen, gereinigtes entgiftetes Endotoxin sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Das in der erfindungsgemässen Zusammensetzung enthaltene Endotoxin (RDE) enthält kein nachweisbares 2-Ke-to-3-desoxyoctanoat und weist 350 bis 475 nMol/mg Phosphor sowie 1700 bis 2000 nMol/mg Fettsäuren auf. Die in der Zusammensetzung enthaltenen mikrobiellen, pyridinlöslichen Inhaltsstoffe (PE) induzieren die Hemmung des Tumorwachstums, sie sind frei von Mikroorganismenzellen und Fragmenten von Mikroorganismuszellen und enthalten insgesamt 3—20 Gew.-% Protein, 10 — 40 Gew.-% Zucker und 36 — 60 Gew.-% Fettsäuren.

Die erfindungsgemässe Zusammensetzung ist wirksam, um eine Remission und/oder Regression von krebsartigen Geschwüren bei warmblütigen Tieren zu bewirken.

Man hat experimentell versucht, Bakterien, wie z.B. Corynebacterium parvum, zu isolieren und die Komponente, welche für die Induzierung der Hemmung des Tumorwachstums verantwortlich ist, zu charakterisieren (siehe z.B. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum; Cantrell, et al, Cancer Research 39, Seiten 3554—3563 (September, 1979). Abgesehen von der Antitumor-Aktivität ist C. parvum ein wirksames Stimulans des lymphoreticularen Systems, wodurch eine unerwünschte Erhöhung des Milz- und Lebergewichtes sowie eine unerwünschte Blastogenese erzielt wird. Es wurde entdeckt, dass in Pyridin lösliche Inhaltsstoffe eines Mikroorganismus, wie z.B. C. parvum, wirksame Antitumor-Eigenschaften aufweisen, ohne die unerwünschten toxischen Wirkungen zu besitzen, welche die bisher bekannten Verbindungen aufweisen.

Extrakte von Endotoxin, die aus Enterobacteriaciae erhalten wurden und die Eltern-Organismen und -Mutanten umfassen, sind bekannt. Diese Extrakte wurden für die Immunotherapie verschiedener immunogener Tumore verwendet [siehe Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother. Vol. 7, Seiten 43 — 58 (1979)]. Es ist jedoch bekannt, dass die Endotoxin-Extrakte höchst giftig sind und dass daher ihre Verwendung bei der Behandlung von krebsartigen Geschwülsten begrenzt ist. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Endotoxine «zu entgiften», während ihre tumorregressive Kapazität beibehalten werden sollte. Wie von Ribi, et al, gezeigt wurde, trat bei der Verwendung bekannter chemischer Verfahren zur Entgiftung von Endotoxinen unter Beibehaltung ihrer Adjuvansizität, wie z.B. die Veresterung mit Bernsteinsäureoder Phthalsäurederivaten, sowohl der Verlust der Endoto-xizität als auch der regressiven Tumorwirksamkeit auf. Daraus geht hervor, dass die bisher ausgeführten Versuche, ein Endotoxinprodukt zu erhalten, das eine hohe regressive Tumorwirkung aufweist und gleichzeitig nicht oder fast nicht giftig ist, erfolglos waren.

Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine therapeutisch wirksame Menge an

(a) mikrobiellen, pyridinlöslichen Inhaltsstoffen, welche die Hemmung des Tumorwachstums induzieren und welche frei sind von Mikroorganismenzellen und Fragmenten von Mikroorganismenzellen, und die insgesamt 3—20 Gew,-% Protein, 10—40 Gew.-% Zuckerund 35—60 Gew.-% Fettsäuren enthalten,

(b) gereinigtes entgiftetes Endotoxin mit keinem nachweisbaren 2-Keto-3-desoxyoctanoat und mit 350 bis

475 nMol/mg Phosphor und 1700 bis 2000 nMol/mg Fettsäuren und

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(c) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist. Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann dazu verwendet werden, um Tumore in warmblütigen Tieren und Menschen zu behandeln.

Die Komponente PE enthält also 3 bis 20 Gew.-% Protein, 10 bis 40 Gew,-% Zucker und 35 bis 60 Gew.-% Fettsäuren und vorzugsweise sind etwa 5 Gew.-% Protein, etwa 35 Gew.-% Zucker und etwa 55 Gew.-% Fettsäuren enthalten.

In bezug auf die Verwendung von Zucker bestehen keinerlei Begrenzungen, es können alle Zucker eingesetzt werden. Das gleiche gilt auch in bezug auf die Fettsäuren und es besteht keine Begrenzung in bezug auf die Fettsäuren, die eingesetzt werden können.

Das Protein umfasst Aminosäuren und Ammoniak und die Aminosäuren umfassen z.B. die folgend angegeben Säuren; bei diesen Bezeichnungen verwendete man einen Beck-man-Aminosäure-Analysator wie folgt:

Asparginin 0,273

Threonin 0,108

Serin 0,585

Muramsäure 0,219

Glutaminsäure 0,267

Glycin 0,39

Alanin 0,173

Diaminopimelinsäure 0,444

Isoleucin 0,121

Leucin 0,167

Phenylalanin 0,034

Histadin 0,088

Lysin 0,544 und

Ammoniak 0,524

Die weiter oben angegebenen Mengen beziehen sich auf Gew.-% und das Gesamtprotein beträgt 6,34 Gew.-%.

Man kann beliebige Mikroorganismen verwenden, um den in Pyridin löslichen Extrakt herzustellen, so z.B. Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium kansasii, Nocardia rubra, Nocardia Steroides, Propionibacterium acnes Typ II und Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum und Propionibacterium acnes Typ II sind vor allem bevorzugt.

Ganze Zellen der Mikroorganismen, vorzugsweise von einer Paste, werden mit Pyridin vermischt. Man trennt die erhaltene Mischung, um eine überstehende Fraktion zu erhalten, die die in Pyridin löslichen Inhaltsstoffe sowie den Pyridinrest enthält. Vorzugsweise kann man den Pyridinrest wiederholten Abtrennungsverfahren, wie weiter oben beschrieben, unterwerfen, wobei man Pyridin verwendet, um weitere Mengen der gewünschten Inhaltsstoffe zu entfernen.

Dann wird das Pyridin von den Inhaltsstoffen entfernt und die getrockneten Inhaltsstoffe unterwirft man in einer geeigneten Flüssigkeit, wie z.B. destilliertem Wasser, einer Dialyse. Die Abwesenheit von Vergiftungen durch ganze Zellen oder durch Fragmente von Zellen wird durch elektronische Mikroskopie bestätigt. Die erhaltenen, gereinigten Inhaltsstoffe können anschliessend nach bekannten Methoden lyophilisiert werden, wobei man ein stabiles Produkt erhält.

Die in Pyridin löslichen Inhaltsstoffe werden mit RDE vereinigt, um eine Zusammensetzung zu bilden, die eine hohe Anti-Tumor-Aktivität aufweist, ohne die Induktion einer Milz- und Lebervergrösserung zu stimulieren. Falls man die in Pyridin löslichen Inhaltsstoffe in Wasser suspendiert, so kann man die Suspension in eine wässrig-lösliche sowie in eine wässrig-unlösliche Fraktion aufteilen. Die wässriglösli-che Fraktion ist vor allem bevorzugt, da sie sehr leicht parenteral injiziiert werden kann, während gleichzeitig die Anti-Tumor-Aktivität der Pyridin-Irihaltsstoffe zurückbehalten wird. Tumore, die man mit dieser Zusammensetzung behandeln kann, umfassen Tumore von Tieren, wie z.B. ein Bovin-squamöses Zell-Karcinom, ein Bovin-Fibrosarcom, ein Equin-Sarcoid, ein Equin-Melanom, ein Equin-squamöses Zell-Karcinom, Mammäre Tumore bei Hunden, ein Hunde-Adenom und ein Hunde-Melanom sowie menschliche Tumore wie z.B. Brusttumore, Lungentumore, Colon-Tumore, bösartige Melanome, squamose Zell-Karci-nome, Tumore der Eierstöcke, Tumore der Harnblase, der Harnwege und des Kopfes sowie Tumore des Halses.

Endotoxin-Extrakte der Art, wie sie als Ausgangsmaterial zur Herstellung von RDE verwendet werden, können aus beliebigen Enterobacteriaciae erhalten werden, einschliesslich der Eltern-Organismen und der entsprechenden Mutanten. So z.B. kann man die folgenden Gattungen an Mikroorganismen einsetzen: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.

Die folgenden Species werden typischerweise verwendet: S.minnesota, S.typhimurium, B.pertussis, B.abortus, S.ente-ritidis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa, Shigella flexni und S.abortus equi.

Die als Ausgangsmaterial eingesetzten Endotoxin-Extrakte kann man nach einer von verschiedenen bekannten Methoden herstellen (siehe z. B.

1) M.E. Webster, J.F. Sagin, M. Landy und A.G. Johnson, J. Immunol. 1955, 744, 55.

2) O Westphal, O. Luderitz und F. Bister, Z. Naturforsch, 76 148 (1952).

3) O. Westphal, Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), N.J. Madison, Madison printing Co., 1957,115.

4) C. Galanos, O. Luderitz, O. Westphal, Eur. J. Bio-chem, 9 245 (1969).

5) C.H. Chen, A.G. Johnson, N. Kasai, B.A. Key, J. Le-vin, A. Nowotny, J. Infect. Dis 128 543 (1973).

6) E. Ribi, W.T. Haskins, M. Landy, K.C. Milner, The Journal of Expérimental Medicine 114 647 (1961).

7) L. Leive, Biocham. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1965).

8) E. Ribi, K.C. Milner und T. Perrine, J. Immunol. 82 75 (1959)).

Die bevorzugte Methode zur Herstellung des Endotoxin-Extraktes wurde von Chen et al offenbart; bei diesem Verfahren arbeitist man mit einer Methanol-Chloroform-Ausfal-lung.

Anschliessend wird der Methanol-Chloroform-Nieder-schlag (MCP) mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und dann lyophilisiert, wobei man ein hy-drolisiertes rohes Lipid A erhält, dessen Giftigkeit und Pyro-genizität reduziert ist, wenn man es mit dem als Ausgangsmaterial verwendeten Endotoxin vergleicht. Dieses Material wird dann mit einem Lösungsmittel, das fähig ist Fettsäuren und andere Verunreinigungen spezifisch zu lösen, ohne das rohe Lipid A aufzulösen, behandelt. Der Phosphatgehalt des entgifteten, gereinigten Lipids A beträgt etwa die Hälfte des entsprechenden Gehaltes, der für das toxische Endotoxin beobachtet wurde, und man nimmt daher an, dass der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen des Endotoxins verwandt ist.

Die bevorzugten anorganischen Säuren, die verwendet werden, um mit dem MCP umgesetzt zu werden, sind Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure und bevorzugte anorganische Säuren sind Toluolsulfonsäure oder Trichloressigsäure. Die Reaktion kann geeigneterweise bei einer Temperatur zwischen etwa 90 und 130 "C ausgeführt werden, wobei man so lange umsetzt, dass eine vollständige Hydrolyse eintritt, und man arbeitet in der Regel zwischen etwa 15 und 60 Minuten.

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Die Herstellung des rohen, entgifteten Endotoxins kann man herbeiführen, indem man das Ausgangsmaterial mit der Säure in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels umsetzt. wie z. B. Chloroform, Methanol und Ethanol oder Mischungen davon.

Das entstandene, rohe Lipid A wird dann gewöhnlich in Aceton suspendiert, welches ein bevorzugtes Lösungsmittel für die Auflösung von Fettsäuren und anderen Verunreinigungen darstellt. Das Lösungsmittel kann dann entfernt werden, wonach man das rohe, entgiftete Endotoxin erhält.

Das rohe, entgiftete Endotoxin wird dann gewöhnlich in einem Lösungsmittel aufgelöst und man gibt die Lösung durch eine geeignete chromatographische Kolonne, wie z.B. eine molekulare Exklusionschromatographie-Kolonne, um die RDE-Fraktionen abzutrennen, die man dann anschliessend nach der Entfernung des Lösungsmittels wieder vereinigt. Die rohe, entgiftete Endotoxinlösung wird dann durch eine Sephadex-Kolonne in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie z. B. Chloroform, Methanol, Aceton, Pyridin, Ether oder Essigsäure oder Mischungen dieser Lösungsmittel, gegeben. Der Druck der Kolonne kann sich typischerweise in einem Bereich von etwa atmosphärischem Druck und 700 MPa bewegen und die Geschwindigkeit beträgt in der Regel etwa 0,1 bis 10 ml Min.

Man kann die rohe, entgiftete Endotoxin-Lösung unter den gleichen Bedingungen, wie weiter oben für die Sephadex-Kolonne durch eine DEAE-Cellulose-Kolonne geben. Die verwendeten Lösungsmittel sind die gleichen, wie sie für die Sephadex-Kolonne verwendet wurden, obwohl man auch Wasser und, oder Diethylamin zu allen Mischungen bei allen Konzentrationen bis zu etwa 1 % geben kann.

Andere bevorzugte Methoden zur Herstellung von RDE aus rohem, entgifteten Endotoxin umfassen die Hindurchleitungen der Lösung durch eine Silicagel-60-Kolonne mit niedrigem Druck, in welcher Teilchengrössen von etwa 25 bis etwa 63 Mikrometer vorhanden sind und man kann ein Lösungsmittel verwenden, welches aus den folgenden Komponenten besteht: Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniumhydroxid. Das bevorzugte Volumenverhältnis dieser Komponenten des Lösungsmittel beträgt etwa 50:25:4:2.

Der gereinigte, entgiftete Endotoxin-Extrakt (RDE)

weist kein erkennbares 2-Keto-3-desoxyoctanoat auf und der Gehalt an Phosphor liegt in einem Bereich von 350 bis 475 nMol mg und der Extrakt enthält 1700 bis 2000 nMol/ mg Fettsäure.

Die erfmdungsgemässe Zusammensetzung kann durch Injektion in einem pharmazeutisch annehmbaren Medium verabreicht werden, wobei dieses Medium z.B. eine Öl-Tröpfchen-Emulsion oder eine physiologische Kochsalzlösung ist und vorzugsweise verabreicht man die Zusammensetzung direkt in den Tumor unter Bedingungen, die nachfolgend näher beschrieben werden. Man kann die Zusammensetzung durch vier Injektionen oder durch vier Infusionen verabreichen.

Es besteht die Möglichkeit, die Zusammensetzung zu stabilisieren. indem man z. B. ein Lyophilisierungsverfahren durchführt und dann ohne Verlust an der Wirksamkeit die Zusammensetzung wieder aufbaut.

Die Menge an RDE in einer einzigen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt im allgemeinen in einem Bereich von etwa 25 — 500 Mikrogramm/ml, vorzugsweise einem Bereich zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml und die Menge an PE liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 25 — 500 Mikrogramm/ml und insbesondere in einem Bereich von etwa 100—250 Mikrogramm/ml.

Die Anzahl der Milliliter, die auf biologischem Weg in den Tumor injiziert werden, hängt von der Grösse des Tumors in Übereinstimmung mit der folgenden Tabelle ab:

Dosierung bei Tieren, abhängig von der Tumor-Grösse

Durchmesser des Tumors (cm) Menge der biologisch injizierten Zusammensetzung (ml)

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1-2 0,5 bis 2,5

2-3 2,5 bis 5

3-5 5 bis 10 5-8 10 bis 15 grösser als 8 15 bis 20

Die maximale Dosis pro Injektion beträgt im allgemeinen etwa 10 Milligramm RDE und etwa 25 mg PE. Der Verlauf der Behandlung umfasst bis zu 4—10 Injektionen, die in einem Intervall von etwa 2 Wochen verabreicht werden.

Die erfindungsgemässe Zusammensetzung, die sich in einem geeigneten Injektionsmedium, wie z.B. in einer physiologischen Kochsalzlösung, befindet, kann man direkt in menschliche Geschwüre verabreichen. Die Menge an RDE in einer einzelnen Injektion liegt gewöhnlich in einem Bereich von etwa 5 —1000 Mikrogramm, bevorzugt in einem -Bereich von etwa 25 — 500 Mikrogramm. Die Menge an PE beträgt vorzugsweise etwa 50 — 5000 Mikrogramm und insbesondere etwa 200 — 3000 Mikrogramm. Das bevorzugte Dosierungsniveau für RDE beträgt etwa 100 Mikrogramm und das entsprechende Niveau für PE ist etwa 1000 Mikrogramm. Alle diese weiter oben erwähnten Dosierungsnive-aux beziehen sich auf einen typischen erwachsenen Patienten, welcher etwa 70 kg wiegt. Die Injektionen werden gewöhnlich etwa einmal pro Woche verabreicht, wobei die Gesamtmenge der zu verabreichenden Injektionen etwa 15 Injektionen ausmacht.

Wie schon weiter oben erwähnt, kann man die Zusammensetzung für die Behandlung von warmblütigen Tieren und Menschen in Form einer physiologischen Kochsalzlösung oder in Form einer Öl-Tröpfchen-Emulsion einsetzen. Die Menge an verwendetem Öl liegt gewöhnlich in einem Bereich von etwa 0,5 bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Es wird bevorzugt, etwa 0,75 bis 1,5 Vol.-% des Öls zu verwenden. Beispiele solcher Öle sind leichte Mineralöle, Squalan, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco-Superöl« und Drakeöl 6 VR Mineralöl (hergestellt von Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

Die homogenisierte, Öl enthaltende Mischung kann dann mit einem Detergens vereinigt werden, das vorzugsweise vor dem Mischen in der physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst wurde. Die Menge an Detergens beträgt typischerweise etwa 0,02 bis 0,20 Vol.-% und insbesondere etwa 0,10 bis 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Man kann beliebige übliche Detergensmateria-lien verwenden, einschliesslich von Tween-80 und Arlacel (hergestellt von Atlas Chemical Company).

Die Mischung, die durch die Zugabe des Detergens entsteht, wird dann vorzugsweise homogenisiert, um eine Suspension zu bilden, welche einen hohen Prozentsatz an Öl-tröpfchen enthält, die mit den aktiven Komponenten überzogen sind, wie unter Beobachtung mit einem Mikroskop festgestellt werden konnte.

In den nachfolgenden Beispielen, die nicht einschränkend wirken sollen, werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung des in Pyridin löslichen Extraktes aus Propionibacterium acnes Typ II (Gattung VPI0204)

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Propionibacterium acnes Typ II (Gattung VPI0204) wurde in einer NIH-thioglycolat-Brühe in einem Zeitraum von 48 — 72 Stunden gezüchtet und geerntet und man erhielt eine aus ganzen Zellen bestehende Paste. Diese Paste wurde dann mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 g (nasses Gewicht) der Paste wurden mit 200 ml reinem Pyridin gewaschen und bei 1700 U/Min. eine Stunde lang bei einer Temperatur von 4 "C zentrifugiert. Als eine überstehende Fraktion entfernte man die in Pyridin löslichen Inhaltsstoffe. Der zurückbleibende Rest wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen, wie sie weiter oben beschrieben sind, extrahiert. Nach der Filtration, wobei man Whatman Nr. 1 Papier verwendete, wurden die Pyridin-Inhaltsstoffe vereinigt und man entfernte das Lösungsmittel durch Verdampfung bei einer Temperatur von 50 °C in einem Buchi Rotavapor (Brinkmann Instruments, Westbury, New York). Die getrockneten Pyridin-Inhaltsstoffe wurden ausführlich gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschliessend lyopholisiert. Die erhaltenen gereinigten Pyridin-Inhaltsstoffe enthielten etwa 5 Gew.-% Protein, etwa 35 Gew.-% Zucker und etwa 55 Gew.-% Fettsäuren. Diese Inhaltsstoffe wurden unter dem Elektronenmikroskop untersucht und man konnte feststellen, dass sie von verunreinigt wirkenden ganzen Zellen sowie von Fragmenten von Zellwänden frei waren. Die Ausbeute an den in Pyridin löslichen Inhaltsstoffen betrug 9% (8,1 g).

Beispiel 2

Herstellung von in Pyridin löslichen Inhaltsstoffen von M.bovis Gattung BCG

In einem Sautons-Medium züchtete und erntete man M.bovis Gattung BCG bei einer Temperatur von 37 °C während einem Zeitraum von 3 — 4 Wochen, wobei man eine gewaschene, aus ganzen Zellen bestehende Paste erhielt. 50 g (nasses Gewicht) der gewaschenen Paste wurde dann auf die gleiche Weise behandelt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, um in Pyridin lösliche Inhaltsstoffe zu bilden, wobei die Ausbeute 7% (3,5 g) betrug. Die Inhaltsstoffe enthielten 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew.-% Fettsäuren.

Beispiel 3

Herstellung von wässrigen Inhaltsstoffen 500 mg Pyridin-Inhaltsstoffe wurden in 100 ml destilliertem Wasser während eines Zeitraumes von 15—30 Minuten einer Schallbehandlung unterworfen. Die erhaltene Suspension wurde dann bei 12 000 U/Min. in einer RC2B-Zentrifu-ge zentrifugiert, wobei man bei einer Temperatur von 4 °C 40 Minuten lang arbeitete. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und aufgehoben. Man extrahierte den Rückstand zweimal, wie weiter oben beschrieben ist. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden in einem Lyophilisie-rungsgefäss vereinigt, eingefroren (shell frozen) und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 230 mg (46%).

Beispiel 4

Herstellung von rohem, entgifteten Endotoxin Eine Probe von 650 mg eines Methanol-Chloroform-Niederschlages, der in Übereinstimmung nach dem Verfahren von Chen, et al J. Infect. Dis. 128 543 (1973) hergestellt worden ist, wurden in 150 ml 0,1 normaler Chlorwasserstoffsäure, die sich in einem Dreihalskolben, der mit einem Kühler versehen war, befanden, suspendiert und in ein Gerät für eine Schallbehandlung eingetaucht. Nach der Schallbehandlung senkte man die Glasvorrichtung anschliessend in ein Ölbad und erhielt eine Temperatur von 120 °C aufrecht, dadurch wurde bewirkt, dass die innere Temperatur des Ge-fässes sich dem Siedepunkt der Lösung näherte bzw. den Siedepunkt der Lösung überschritt. Die Überhitzung der Lösung wurde auf ein Minimum herabgesetzt, indem man das Gefäss mit einer Kapillarröhre versah, die mit einer Stickstoffquelle durch einen der drei Hälse verbunden war. Während der gesamten Zeitdauer der Hydrolyse erhielt man einen gleichmässigen Durchfluss von Stickstoff aufrecht.

Man setzte die Hydrolyse 30 Minuten lang fort und dann wurde die Lösung in einem Eisbad abgekühlt, einer Schallbehandlung unterworfen, um das feste Material zu dispergie-ren und schliesslich verteilte man in Corex-Röhren. Das Gefäss wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Gesamtmenge des festen Materials, das an den Seitenwänden des Gefässes haftete, zu entfernen und schliesslich gab man die Waschflüssigkeit zu der Suspension in den Corex-Röhren. Man zentrifugierte 80 Minuten lang bei 12 000 U/ Min. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen. Man suspendierte den festen Rückstand abermals in destilliertem Wasser und unterwarf so lange einer Behandlung mit Schall, bis dieser Niederschlag gut disper-giert war und dann wurde abermals zentrifugiert. Das Zen-trifugierverfahren wurde dann wiederholt. Man nahm den Niederschlag in destilliertem Wasser auf, es wurde eingefroren (shell frozen) und man lyophilisierte, wobei man 382 mg des Rohen Lipids A erhielt. Man behandelte 150 mg dieses Materials mit kaltem Aceton, das eine Temperatur von 0 ~C aufwies, um die Fettsäuren zu entfernen, es wurde einer Schallbehandlung unterworfen und man filtrierte durch eine Whatman Nr. 1 Gravitations-Filtrationsvorrichtung bei einer Temperatur von 5 °C. Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.

Beispiel 5

Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin

Eine Probe von 120 mg eines MCP (Methanol-Chloroform-Niederschlags) wurde in 12 ml absolutem Methanol suspendiert, man behandelte in Schall, um die festen Materialien zu dispergieren und verteilte in 6 (1 x 10 cm) Ampullen, die mit einem Schraubverschluss versehen waren. Man gab zu jeder Ampulle zwei ml 0,2 normaler Chlorwasserstoffsäure und die entstandene Suspension wurde in einem Wasserbad mit siedendem Wasser 45 Minuten lang inkubiert. Nach der Hydrolyse wurden diese Röhren in einem aus Eis bestehenden Bad abgekühlt und etwa 10 Minuten lang mit 2500 U/Min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und man gab 5 ml einer 2:1 Chloroform/Methanol-Mischung zu dem Rückstand, um eine Auflösung zu bewirken. Man gab 2 ml Wasser zu jeder Röhre hinzu und die Lösung wurde gemischt. Die biphasische Lösung wurde 10 Minuten lang bei 2500 U/Min. abermals zentrifugiert. Man verwarf die wässrige Phase und 1 ml einer 4:1 Chloroform/Methanol-Mischung wurde zu jeder Röhre hinzugegeben, wodurch man eine klare Lösung erhielt. Die Lösungen wurden vereinigt und man verdampfte das Lösungsmittel auf einer Dreh-Verdampfungsvorrichtung. Man trocknete den Rückstand im Hochvakuum und lyophilisierte, wobei man 45 mg des rohen Lipids A erhielt. 20 mg dieses Materials wurden mit kaltem Aceton (0 :C) behandelt, einer Schallbehandlung unterworfen und durch eine Whatman Nr. 1 Gravitations-Filtrationsvorrichtung bei einer Temperatur von 5 :C filtriert. Nach dem Trocknen blieben 13 mg des rohen, entgifteten Endotoxins zurück.

Beispiel 6

Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin

110 g LH-20-100 (25 — 100 Micronteilchengrösse: Pharmacia) wurden mit 600 ml einer 2:1 Chloroform/Methanol-Mischung vereinigt, und man liess 30 Minuten lang stehen. Die erhaltene Aufschlämmung wurde auf eine

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25 x 1000 mm Glaschromatographie-Kolonne (BRL Laboratories) gegeben, die mit Druckvorrichtungen versehen war. Nachdem die Kolonne vollständig gefüllt war, wurde sie durch eine Teflon-Druckvorrichtung an eine ISCO-Modell 132 Pumpe angeschlossen. Man pumpte 400 ml einer 4:1 Chloroform, Methanol-Mischung durch die Kolonne, wobei die Geschwindigkeit 3 ml/Min. betrug. 100 mg des rohen, entgifteten Endotoxins, das nach dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellt worden war, wurde für die Kolonne angewendet und zwar setzte man 2,5 ml einer 4:1 Chloroform/ Methanol-Mischung über eine Auffangvorrichtung für Proben ein. Man reduzierte die Geschwindigkeit auf 1 ml/Min. und nachdem man 150 ml des Eluantes gesammelt hatte, verband man den Abfluss mit einem Sammelgefäss für Fraktionen. Man sammelte Fraktionen von 4 ml und man bestimmte die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen durch Dünnschichtchromatographie-Analyse der Fraktionen [E. Merck, 0,25 mm dick, Chloroform/Methanol/LbO/ NH4OH (50:25:4:2)alsEluiermittel],

Man vereinigte die gereinigtes, entgiftetes Endotoxin enthaltenen Fraktionen und man verdampfte das Lösungsmittel, wobei 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weissen Pulvers zurückblieben.

Beispiel 7

Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin

Man suspendierte 33 g DEAE-Cellulose (Whatman DE-32) in 150 ml Eisessig und rührte vorsichtig 10 Minuten lang, um eine Aufschlämmung des Pulvers zu erhalten. Man stellte diese Mischung über Nacht beiseite.

Man gab die Aufschlämmung in eine 25 x 400 mm-Kolonne, man liess den Niederschlag absetzen, indem man die Flüssigkeit abfliessen liess und überschüssige Säure wurde anschliessend abgesaugt. Die Kolonne wurde mit 2000 ml Methanol gewaschen, gefolgt von Waschen mit 200 ml einer 4:1 Chloroform/Methanol-Mischung. Man gab eine Probe von 100 mg von rohem, entgiftetem Endotoxin, welches nach dem Verfahren gemäss Beispiel 4 hergestellt worden war, zu der Kolonne in 3 ml einer 4:1 Chloroform/Metha-nol-Mischung oder einer 80:20:1 Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser. Man eluierte die Kolonne mit 350 ml einer 4 :1 Chloroform/Methanol-Mischung, gefolgt von 300 ml einer 99:1 Methanol/Wasser-Mischung. Unter Verwendung einer linearen Gradienten-Vorrichtung eluierte man die Kolonne mit 2000 ml eines linearen Gradienten, wobei man mit 100%igem Methanol begann und mit 0,2 molarer Essigsäure in Methanol beendete. Die Kolonne wurde mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Min. eluiert und man sammelte 15 ml Fraktionen. Jede einzelne Fraktion wurde nach dem Verfahren von G.R. Bartlett, J. Biol. Chem. 234 466—471 (1959) auf den Gesamtphosphorgehalt analysiert. Man vereinigte die Fraktionen und dampfte in einem Drehverdampfer fast bis zur Trockne ein und nahm in 10 ml einer 2:1 Chloroform/Methanol-Mischung auf und 40 ml 0,001 molarer Essigsäure in einem Scheidetrichter. Die untere Schicht wurde abgetrennt, durch ein Whatman Nr. 2 Filterpapier filtriert und zur Trockne eingedampft, wobei man 19,2 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin erhielt.

Beispiel 8

8 — 10 Wochen alten C3HeBFeJ-Mäusen wurden auf in-traperitonealem Wege 105 Ovarien-Tetratocarcinoma-Zellen injiziert. Nach 24 Stunden injizierte man an 5 Mäuse einmalig 0,2 — 0,5 ml einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung, die 50 Mikrogramm RDE enthielt und an 6 Mäuse verabreichte man einmalig durch Injektion 0,2—0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, die 300 Mikrogramm PE und 50 Mikrogramm RDE enthielt. Schliesslich verabreichte man an 12 Mäuse einmalig durch Injektion 0,2—0,5 ml der physiologischen Kochsalzlösung als Kontrollprobe. Nach 21 Tagen, wiesen 4 von den 5 Mäusen, an welche RDE durch Injektion verabreicht wurde, eine vollständige Regression des Tumors auf und 6 der 6 Mäuse, an die RDE und PE verabreicht wurde, wiesen ähnliche Resultate auf. Andererseits starben 10 der 12 Mäuse der Kontrollgruppe am 21. Tag und die restlichen Mäuse zeigten immer noch das Vorhandensein von Krebszellen auf.

Beispiel 9.

An 48 8 —10 Wochen alte weibliche C3HEJ-Mäuse verabreichte man durch Injektion 105 Ovarien-Tetratocarcino-ma. Nach 24 Stunden verabreichte man an 15 Mäuse durch Injektion einmalig 0,2—0,5 ml einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung, die 1400 Mikrogramm PE enthielt und an 15 der Mäuse verabreichte man einmalig durch Injektion 0,2—0,5 ml der physiologischen Kochsalzlösung, die 300 Mikrogramm PE und 50 Mikrogramm RDE enthielt. Schliesslich verabreichte man an 15 Mäuse einmalig durch Injektion 0,2—0,5 ml der physiologischen Kochsalzlösung als Kontrolle. Nach 30 Tagen waren immer noch 5 der 15 Mäuse, die Injektionen mit PE erhalten hatten und 8 der 15 Mäuse, denen man eine Injektion mit RDE und PE verabreicht hatte wiesen eine Tumorregression auf und waren immer noch lebendig. Andererseits, 14 der 15 Mäuse der Kontrollgruppe starben und die übergebliebene Maus wies eine Tumorregression auf.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

S

Claims

664 897

PATENTANSPRÜCHE

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine therapeutisch wirksame Menge an

(a) mikrobiellen, pyridinlöslichen Inhaltsstoffen, welche die Hemmung des Tumorwachstums induzieren und welche frei sind von Mikroorganismenzellen und Fragmenten von Mikroorganismenzellen, und die insgesamt 3—20 Gew.-% Protein, 10 — 40 Gew.-% Zucker und 35—60 Gew.-% Fettsäuren enthalten,

(b) gereinigtes entgiftetes Endotoxin mit keinem nachweisbaren 2-Keto-3-desoxyoctanoat und mit 350 bis

475 nMol/mg Phosphor und 1700 bis 2000 nMol/mg Fettsäuren und

(c) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhaltsstoffe diejenigen des Mikroorganismus Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Propionibacterium acnes Typ II und Corynebacterium parvum sind.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhaltsstoffe diejenigen des Mikroorganismus Corynebacterium parvum sind.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhaltsstoffe diejenigen des Mikroorganismus Propionibacterium acnes Typ II sind.
5. Zusammensetzung nach einem der Anspräche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhaltsstoffe insgesamt etwa 12 Gew.-% Protein und Zucker sowie etwa 45 Gew.-% Fettsäuren enthalten.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Inhaltsstoffe zum gereinigten, entgifteten Endotoxin im Bereich von 1:1 bis 100:1 liegt.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Inhaltsstoffe zwischen 50 und 5000 Mikrogramm liegt und das gereinigte, entgiftete Endotoxin in einer Menge von 5 bis 5000 Mikrogramm vorhanden ist.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Inhaltsstoffe etwa 5000 Mikrogramm und die Menge des gereinigten, entgifteten Endoto-xins etwa 100 Mikrogramm beträgt.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie in lyophilisierter Form vorliegt.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial eine physiologische Kochsalzlösung ist.
11. Zusammensetzung nach einem der Anspräche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Öl-Tröpfchen-Emulsion vorliegt.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl ein leichtes Mineralöl, Squalen oder 7-n-Hexyl-octadecan ist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Öl in einer Menge von etwa 0,5 bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung, vorhanden ist.
14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Deter-gens in einer Menge von etwa 0,02 bis 0,25 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung, enthält.