DE3434766A1 - Einen pyridinloeslichen extrakt und gereinigtes entgiftetes endotoxin enthaltendes pharmazeutisches praeparat - Google Patents
Einen pyridinloeslichen extrakt und gereinigtes entgiftetes endotoxin enthaltendes pharmazeutisches praeparatInfo
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Description
EINEN PYRIDINLÖSLICHEN EXTRAKT UND GEREINIGTES
ENTGIFTETES ENDOTOXIN ENTHALTENDES PHARMAZEUTISCHES PRÄPARAT
Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat,
das gereinigtes entgiftetes Endotoxin (RDE) in Kombination mit einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus
(PE) enthält. Das im erfindungsgemäßen Präparat verwendete RDE ist dadurch gekennzeichnet, daß
es kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, zwischen etwa 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa
1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren enthält. Der PE enthält zwischen etwa 3 und 20 Gew.-% Protein, etwa 10 bis 40
Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 60 Gew.-% Fettsäuren. Das Präparat kann bei der Remission und/oder Rückbildung
von Krebstumoren an Warmblütern wirksam verwendet werden.
Bakterien, wie Corynebacterium parvum waren bereits Gegenstand experimenteller Untersuchungen zur Isolierung
und Kennzeichnung der für die Induzierung der Inhibierung des Tumorwachstums verantwortlichen Komponente
(s. z.B. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C.
parvum; Cantrell, et al, Cancer Research 39, pgs. 3554-3563 (September 1979)). Abgesehen von seiner
Antitumoraktivität ist C. parvum ein starker Stimulator des lymphoretikulären Systems, was zu einem unerwünschten
Anstieg des Gewichts der Milz und der Leber sowie zu Blastogenese führt. Es wurde nun gefunden,
daß ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus wie C. parvum starke Antitumoreigenschaften
ohne die unerwünschten toxischen Wirkungen, wie sie
mit den Produkten gemäß dem Stand der Technik verbunden sind, aufweist.
Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaceae, einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten
werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immunotherapie bei verschiedenen immunogenen Tumoren (siehe
Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, et al., Cancer
Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen
hochtoxisch, weshalb ihre Verwendung bei der Behandlung von Krebstumoren beschränkt ist. Es sind Versuche
unternommen worden, die Endotoxine zu "entgiften", ohne deren tumorrückbildende Eigenschaft zu beeinträchtigen.
Wie in Ribi et al., aufgezeigt, führten die zur Entgiftung von Endotoxinen bei gleichzeitiger
Aufrechterhaltung ihres Adjuvanscharakters bekannten chemischen Verfahren, wie z.B. Succinylierung und
Phthalylierung, zum Verlust sowohl der Endotoxizität als auch der tumorrückbildenden Wirksamkeit.!Folglich
blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eines Endotoxinproduktes mit hoher tumorrückbildender
Wirkung und geringer oder fehlender Toxizität ohne Erfolg.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstel-.
lung eines pharmazeutischen Präparats, das einen pyridinlösliehen
Extrakt eines Mikroorganismus in Kombination mit einem gereinigten entgifteten Endotoxin
enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von Tumoren
an Warmblütern und an Menschen unter Verwendung des einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus
und gereinigtes entgiftetes Endotoxin enthaltenden Präparats.
Der pyridinlösliche Extrakt eines Mikroorganismus (PE) enthält zwischen etwa 3 und 20 Gew.-% Protein, etwa
10 bis 40 Gew.-% Zucker und etwa 35 bis 60 Gew.-% Fettsäuren in Kombination mit ganzen Zellen von C. parvum,
vorzugsweise etwa 5 Gew.-% Protein, etwa 35 Gew.-% Zucker und etwa 55 Gew.-% Fettsäuren.
Bezüglich der Verwendung eines Zuckers besteht erfindungsgemäß keine Beschränkung, d.h. es können sämtliche
Zucker verwendet werden. Dasselbe gilt auch im Hinblick auf die Fettsäuren, d.h. bezüglich der verwendbaren
Fettsäuren besteht keine Beschränkung.
Das Protein enthält Aminosäuren und Ammoniak, wobei die Aminosäuren z.B. die nachfolgend aufgeführten umfassen.
Zu ihrer Bestimmung wurde ein Beckman-Aminosäureanalysator
verwendet:
Asparagin | 0,273 |
Threonin | 0,108 |
Serin/ | 0,585 |
Muraminsäure | 0,219 |
Glutaminsäure | 0,267 |
Glycin | 0,39 |
Alanin | 0,173 |
Diaminopimelinsäure | 0,444 |
Isoleucin | 0,121 |
Leucin | 0,167 |
Phenylalanin | 0,034 |
Histadin 0,088
Lysin 0,544
Ammoniak 0,524
Die oben angeführten Mengen sind in Gew.-% angegeben,.
wobei das Gesamtprotein 6,34 Gew.-% beträgt.
Zur Erzeugung des pyridinlösl±chen Extrakts kann jeder
Mikroorganismus verwendet werden, einschließlich z.B. M. bovis BCG, M.phlei, M. smegmatis, M. kansasii,
Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium acnes - Typ II und Corynebacterium parvum. Besonders
bevorzugt sind dabei Corynebacterium parvum und Proprionibacterium acnes - Typ II.
Ganze Zellen des Mikroorganismus, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin gemischt. Das erhaltene
Gemisch wird abgetrennt, um eine Überstandsfraktion,enthaltend
den pyridinlöslichen Extrakt und einen Pyridinrückstand,zu erhalten. Der Pyridinrückstand kann fakultativ
wiederholt dem oben beschriebenen Abtrennungsverfahren unter Verwendung von Pyridin zur Entfernung
von weiteren Mengen des gewünschten Extraktes unterzogen werden.
Nachfolgend wird das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete
Flüssigkeit, wie z.B. destilliertes Wasser, dialysiert. Das Fehlen von ganzen Zellen oder Zellfragmentverunreinigungen
wird elektronenmikroskopisch festgestellt. Der erhaltene gereinigte Extrakt kann anschließend nach
bekannten Verfahren lyophilisiert werden, um ein be-' ständiges Produkt zu erhalten.
Der erfindungsgemäß hergestellte pyridinlösliche Extrakt
wird mit RDE kombiniert, wodurch man ein Präparat mit hoher antitumoraler Wirkung erhält, das keine Milz- und
Lebervergroßerungen verursacht. Wird der pyridinlösliche Extrakt in Wasser suspendiert, kann die Suspension
in eine wasserlösliche und eine wasserunlösiche Fraktion aufgetrennt werden. Der wasserlösliche Extrakt
wird besonders bevorzugt, da er leicht parenteral injiziert werden kann, wobei die antitumorale Aktivität
des Pyridinextrakts erhalten bleibt. Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können unter anderem Tumore wie
die folgenden tierischen Tumore, z.B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom,
Rinder-Fibrosarkom, Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-Karzinom, Hunde-Mamma-Tumore,
Hunde-Adenom und Hunde-Melanom, sowie menschliche Tumore, wie z.B. Brusttumore, Lungentumore,
Colon-Tumore, malignes Melanom, Schuppenzeil-Karzinome und Ovarial-Tumore, Uterus-Tumore, Blasen-, Kopf- und
Hals-Tumore behandelt werden.
Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten RDE verwendeten
Typs können aus sämtlichen Enterobacerxaceae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten erhalten
werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen: Salmonella, shigella,
Escherichia, Bruceila, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und
Serratia.
Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung: S. minnesota, S. typhimuriura,
β. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli,
S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni und S. abortus equi.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte
können z.B. durch eines der folgenden bekannten · Verfahren hergestellt werden:
1) Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M., and Johnson,
A.G., J. Immunol. 1955, 744, 55.
2) Westphal, 0., Luderitz, 0., and Bister, F., Z. Naturforsch.,
76.', 148 (1952).
3) Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.),
Madison, N.J. Madison printing Co., 1957, 115.
4) Galanos, C, Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur. J.
Biochem., 9., 245 (1969).
5) Chen, CH., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A.,
Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis, 128, 543 (1973).
6) Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C,
The Journal of Experimental Medicine, 114, 647 (1961).
7) Leive, L., Biochem.. Biophys. Res. Comm., 2J^, 290
(1965).
8) Ribi, E., Milner, K.C, and Perrine, T., J. Immunol.,
8,2, 75 (1959).
Das von Chen et al. beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, ist die am besten
geeignete Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extrakts . /
Das Methanol-Chloroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und
anschließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid A mit verringerter Toxizität und Pyrogenizität,
verglichen mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin zu erhalten. Das erhaltene Material wird daraufhin mit einem
Lösungsmittel behandelt, welches fähig ist, besonders
Fettsäuren und andere Verunreinigungen zu lösen, ohne daß das Roh-Lipid A gelöst wird.Der Phosphatgehalt im
entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen Gegenstück festgestellten Konzentration,
was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen Wirkungen von Endotoxinen in
Beziehung steht.
Die für die Reaktion mit MCP bevorzugten anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure,
während die Toluolsulfonsäure und Trichloressigsäure bevorzugte organische Säuren sind. Die Reaktion kann
bei jeder beliebigen Temperatur zwischen etwa 90 und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse
ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen etwa 15 und 60 Minuten, zweckmäßig durchgeführt werden.
Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann
auch durch Reaktion des Ausgangsmaterials mit der ausgewählten Säure in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels
wie z.B. Chloroform, Methanol, Ethanol oder Gemischen davon, erfolgen.
Das erhaltene Roh-Lipid A wird in Aceton, das das bevorzugte Lösungsmittel zum Lösen der Fettsäuren und
anderer Verunreinigungen ist, gelöst. Das Lösungsmittel wird daraufhin entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin
zu erhalten.
Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und durch eine geeignete
Chromatographiesäule, wie z.B. eine Molekularausschluß-Chromatographiesäule, geschickt, um die RDE-Fraktionen
abzutrennen, welche nach der Entfernung
des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung
in Anwesenheit eines Lösungsmittels, wie z.B. Chloroform, Methanol, Aceton, Pyridin, Ether, Essigsäure
oder Gemische davon, durch eine Sephadexsäule geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt jedoch
gewöhnlich ungefähr im Bereich zwischen Atmosphä-
2
rendruck und 70 N/cm , während die Fließgeschwindigkeil etwa zwischen 0,1 und 10 ml/mi«, beträgt.
rendruck und 70 N/cm , während die Fließgeschwindigkeil etwa zwischen 0,1 und 10 ml/mi«, beträgt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann auch die rohe,
entgiftete Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule
durch eine DEAE-ZeIlulosesäule geschickt werden. Die
Fließgeschwindigkeit wird zwischen etwa 2 und 15 ml/min.
gehalten. Die Lösungsmittel sind ebenfalls dieselben,
wie sie bei der Sephadexsäule verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diethylamin
in einer Konzentration bis zu etwa 1 % zugegeben werden kann.
Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die Lösung
durch eine Niederdruck-Silikagel-60-Säule mit einer
Teilchengröße von zwischen ungefähr 25 und 63 lim unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels wie z.B.
Chloroform, Methanol, Wasser oder Ammoniumhydroxid geschickt.
Das bevorzugte Volumenverhältnis des obigen Lösungsmittelsgemisches beträgt etwa 50:25:4:2.
Das gereinigte entgiftete Endotoxin (RDE), das kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat aufweist, enthält
zwischen etwa 350 und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 20 00 nM/mg Fettsäuren.
Das Präparat wird durch Injektion in einem pharmazeutisch geeigneten Medium, wie z.B. in einer Öltröpfchenemulsion
oder einer physiologischen Kochsalzlösung, vorzugsweise direkt in den Tumor unter den nachfolgend näher
beschriebenen Bedingungen verabreicht. Die Verabreichung kann durch Injektion oder Infusion erfolgen.
Das Präparat kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens,
stabilisiert und nachfolgend ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand
zurückversetzt werden.
Die Menge an RDE liegt in einer einzigen Injektion für die Behandlung von Tieren zwischen etwa 25 und 500 ug/ml,
bevorzugt zwischen 50 und 100 üg/ml. Die Menge PE beträgt
etwa 25 bis 500, bevorzugt etwa 100 bis 250 ug/ml.
Die Anzahl an Millilitern des biologisch in den Tumor zu injizierenden Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt,
wobei im einzelnen auf die Werte in der nachstehenden Tabelle verwiesen wird.
Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden . biologischen Präparats (ml)
0-1 | bis zu 0,5 ml |
1-2 | 0,5 bis 2,5 ml |
2-3 | 2,5 bis 5 ml |
3-5 | 5 bis 10 ml |
5-8 | 10 bis 15 ml |
größer als 8 | 15 bis 20 ml |
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 10 mg RDE und etwa 25 PE. Die Behandlung umfaßt 4 bis 10, in etwa
zweiwöchigen Intervallen zu verabreichende Injektionen.
Das erfindungsgemäße Präparat wird in einem geeigneten
injizierbaren Mittel, wie z.B. physiologischer Kochsalzlösung, direkt in den menschlichen Tumor verabreicht.
Die Menge an RDE in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 5 und 1000 Ug, vorzugsweise 25 und 500 iig.
Die Menge an PE liegt zwischen etwa 50 und 5000 ug, vorzugsweise zwischen etwa 200 und 3000 ug. Die bevorzugte
Dosismenge für RDE beträgt etwa 100 ug und für PE etwa 1000 tig. Bei sämtlichen oben genannten Dosierungsmengen
wird von der Verabreichung an einen Durchschnittserwachsenen mit einem Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen
werden höchstens etwa 15 mal einmal wöchentlich verabreicht.
Wie oben beschrieben, kann das Präparat bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form einer Salzlösung
oder einer Öltröpfchenemulsion verwendet werden.
Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0
VdI.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats. Die
bevorzugte Menge des zu verwendenden Öls beträgt zwischen 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle
sind leichtes ,Mineralöl, Squalan, 7-n-Hexyloctadecan,
Conoco Superöl und Dradeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).
Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend
mit einem Detergens, das vorher gegebenenfalls in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die
durchschnittliche Menge des Detergens "beträgt zwischen etwa 0,02 und 0,20 Vol.-%, und die bevorzugte Menge
liegt zwischen etwa 0,10 und 0,20 Vol.-%, jeweils bezogen
auf das Gesamtvolumen des Präparats. Es können alle üblichen Detergentien, wie z.B. Tween-80 und Arlacel
(hergestellt von der Atlas Chemical Company), verwendet werden.
Das nach dem Zusatz des Detergens erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension
mit einem hohen Prozentsatz an mit Wirkstoffen überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop
nachweisen läßt.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte
Erfindung nicht ein.
Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus Proprionibacterium
acnes - Typ II ( Stamm VPI 0204)
Proprxonibacterium acnes - Typ II (Stamm VPI 0204) wurde bei 37°C während 48 bis 72 Stunden in NIH-Thioglykolatbrühe
gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine Vollzellpaste erhalten wurde. Die Paste wurde anschließend
mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 90 g (Feuchtgewicht) der gewascheneji Paste wurden mit 200 ml
reinem Pyridin gemischt und bei 4°C während einer Stunde
mit der 1700-fachen Erdbeschleunigung g (9,81 m/s ) zentrifugiert. Ein pyridinlöslicher Extrakt wurde als
Überstandsfraktion entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde mit zusätzlichem Pyridin unter den gleichen Bedingungen,
wie oben beschrieben, extrahiert. Nach erfolgter Filtrierung unter Verwendung von Whatman No. 1-Papier
wurden die Pyridinextrakte vereinigt und das
Lösungsmittel durch Verdampfung bei 5O0C in einem Buchi-Rotationsverdampfer
(Brinkmann Instruments, Westbury, New York) entfernt. Der getrocknete Pyridin-Extrakt wurde
eingehend gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der erhaltene gereinigte Pyridin-Extrakt
enthielt etwa 5 Gew.-% Protein, etwa 35 Gew.-% Zucker und etwa 55 Gew.-% Fettsäuren. Der Extrakt
wurde elektronenmikroskopisch untersucht, und es wurde festgestellt, daß er frei von Verunreinigungen in Form
von ganzen Zellen und Zellwandfragmenten war. Die Ausbeute an pyridinlöslichem Extrakt betrug 9 % (8,1 g).
Herstellung von pyridinlöslichem Extrakt aus M. bovis, Stamm BCG.
M. bovis Stamm BCG wurde in Sautons-Medium bei 37?C
während etwa 3 bis 4 Wochen gezüchtet und abgeerntet, woraufhin eine gewaschene Vollzellpaste erhalten wurde.
50 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Paste wurden anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt,
woraufhin ein pyridinlöslicher Extrakt in einer Ausbeute von 7 % (3,5 g) erhalten wurde. Der Extrakt
enthielt 15 Gew.-% Protein, 10 Gew.-% Zucker und 52 Gew.-% Fettsäuren.
Beispiel 3
Herstellung von wässerigem Extrakt
Herstellung von wässerigem Extrakt
500 mg Pyridinextrakt wurden in 100 ml Aqua dest. 15 bis 30 Minuten lang beschallt. Die erhaltene Suspension
wurde bei 12.000 Upm in einer RC2B-Zentrifuge bei 4°C 40 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand
dekantiert und zurückbehalten. Der Rückstand wurde, wie oben angegeben,zweimal extrahiert. Danach wurden die
343476G
Überstände in einer Lyophilisierungsflasche vereinigt,
gefriergetrocknet und lyophilisiert. Die Ausbeute be- < trug.· 230 mg (46 %) .
Beispiel 4
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.
Eine 650 mg-Probe eines gemäß dem Verfahren von Chen, et al., J. Infect. Dis. 128, 543 (1973) hergestellten
Methanol-Chloroform-Präzipitats wurde in 150 ml 0,1N HCl in einem mit einem Kondensator versehenen Dreihals-Rundboden-Kolben
suspendiert und in ein Beschallungsgerät getaucht. Nach der Beschallung wurde die Glasvorrichtung
in ein Ölbad, dessen Temperatur bei 1200C gehalten wurde, versenkt, wodurch die Innentemperatur des
Kolbens sich dem Siedepunkt der Lösung näherte oder ihn überschritt,. Durch Anbringen eines mit einer Stickstof
fgasquel Ie verbundenen Kapillarröhrchens am Kolben durch einen der Hälse wurde die Überhitzungsgefahr so
gering wie möglich gehalten. Während des Hydrolyseverfahrens erfolgte ein kontinuierlicher Stickstofffluß.
Die Hydrolyse dauerte 30 Minuten. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, schallbehandelt, um die Feststoffe
zu dispergieren, und in Corex-Röhrchen verteilt. Der Kolben wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um
alle den S.eitenwänden des Kolbens anhaftenden Feststoffe zu beseitigen, und die Waschflüssigkeit der Suspension
in den Corex-Röhrchen zugegeben. Anschließend wurde bei 12.000 üpm während 80 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wurde abdekantiert und verworfen. Der Feststoff
rückstand wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert, schallbehandelt, bis eine gute Verteilung
der Suspension erreicht war, und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugierung wurde daraufhin wiederholt. Der
Rückstand wurde in destilliertem Wasser aufgenommen, gefriergetrocknet
und lyophilisert, wodurch 382 mg rohes Lipid A erhalten wurden. 150 mg dieser Substanz wurden
zwecks Entfernung der Fettsäuren mit kaltem (0°C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine Whatman
Nr.l-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5°C abfiltriert.
Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.
Beispiel 5
Herstellung von rohem , entgiftetem Endotoxin
Herstellung von rohem , entgiftetem Endotoxin
Eine 120 mg-Probe eines MCP (Methanol-Chloroform-Präzipitats)
wurde in 12 m 1 absolutem Methanol suspendiert, zwecks Dispersion der Feststoffe schallbehandelt und
in 6 1x10 cm große Schraubverschlußampullen verteilt.
Jeder Ampulle wurden 2 ml 0,2 N HCl zugegeben, und die
erhaltene Suspension wurde während 45 Minuten in einem Bad mit kochendem Wasser bebrütet. Nach der Hydrolyse
wurden die Ampullen in einem Eiswasserbad gekühlt und bei 2500 Upm während etwa 10 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand wurde abdekantiert, und dem Rückstand wurden
5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) zugegeben, um die Auflösung zu bewerkstelligen. Jeder Ampulle
wurden 2 ml Wasser zugegeben, und die Lösung wurde vermischt.,Die Zweiphasen-Lösung wurde erneut bei
2500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wässerige Phase wurde verworfen, und jeder Ampulle wurde
1 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) zugegeben, woraufhin klare Lösungen erhalten wurden. Die
Lösungen wurden anschließend vereinigt, und das LÖ-sungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer eingedampft.
Der Rückstand wurde unter Hochvakuumbedingungen getrocknet und lyophilisiert, worauf man 45 mg
rohes Lipid A erhielt. 20 mg davon wurden mit kaltem
(O0C) Aceton behandelt, schallbehandelt und durch eine
Whatman Nr.l-Gravitationsfiltriervorrichtung bei 5 C
abfiltiert. Nach dem Trocknen blieben 13 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.
Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin
110 g LH-20-100 (Teilchengröße 25-100 um nach Pharmacia)
wurden mit 600 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) vermischt und anschließend 30 Minuten stehengelassen.
Die dadurch erhaltene Aufschlämmung wurde in eine
25 x 1000 mm große, mit Druckfittings ausgestattete Glaschromatographiesäule (BRL Laboratories) gegeben.
Nach erfolgter Beschickung wurde die Säule durch ein Teflon-Druckrohr an eine Pumpe (ISCO Model 132) angeschlossen.
400 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) wurden mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min
durch die Säule gepumpt. 100 mg des nach Beispiel 4 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurden über
ein Rohr zur Probenvolumenbestimmung in 2,5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) auf die Säule aufgegeben. Der Zufluß wurde auf 1 ml/min reduziert, und,
nachdem eine Menge von 150 ml Eluierungsmittel erhalten worden war, wurde der Abfluß mit einem Fraktionssammler
verbunden.. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und
gereinigte, entgiftete Endotoxinfraktionen durch Dünnschicht-Chromatographie-Analyse
ermittelt (E. Merck, Dicke: 0,25 mm, Chloroform/Methanol/H20/NH4OH (50:25/
4:2) als Elurierungsmittel).
Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weißen Pulvers zurückblieben.
Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines weißen Pulvers zurückblieben.
Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin
33 g DEAE-ZeIlulose (Whatman DE-32) wurden in 150 ml
Eisessig suspendiert und während 10 Minuten schwach gerührt, woraufhin eine pulverige Aufschlämmung erhalten
wurde. Das Gemisch wurde über Nacht beiseite gestellt. Die Aufschlämmung wurde in eine 25 χ 400 mm große Säule
gegossen, wo sie sich unter Beklopfen absetzte, und anschließend der Säureüberschuß abgezogen. Die Säule
wurde zuerst mit 2000 ml Methanol und dann mit 200 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) gewaschen.
Eine 100 mg-Probe des gemäß Beispiel 4 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurde in 3 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches
(4:1) oder eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (80:20:1) in die Säule gegeben.
Die Säule wurde zuerst mit 350 ml eines Chloroform-Methanol -Gemisches (4:1) und dann mit 300 ml eines Methanol-Wasser-Gemisches
(99:1) eluiert. Unter Verwendung eines Apparats mit linearem Gradienten wurde die Säule
mit 2000 ml eines linearen Gradienten, beginnend mit 100%-igem Methanol und schließlich mit 0,2 M Essigsäure
in Methanol, eluiert. Die Säule wurde bei einer Geschwindigkeit von 5 ml/min eluiert, und es wurden 15 ml an
Fraktionen gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde gemäß dem Verfahren ,von Bartlett, G.R., J. Biol. Chem., 234,
466-471 (1959) auf ihren Gesamtgehalt an Phosphor untersucht. Die Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer
fast bis zur Trockenheit abgedampft und in 10 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1)
und 40 ml einer 0,001 M Essigsäure in einen Scheidetrichter aufgenommen. Die untere Schicht wurde abgetrennt,
durch ein Whatman Nr. 2-Filterpapier abfiltriert und bis zur Trockenheit abgedampft, wonach 19,2 mg gerei-
■ - 20 -
nigtes, entgiftetes Endotoxin erhalten wurden. Beispiel 8
23 acht bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen C3HeBFeJ wurden intraperitoneal 10 Ovarialteratocarcinomzellen
injiziert. Nach 24 Stunden wurden 5 Mäusen auf einmal 0,2 bis Or5 ml einer isotonischen Salzlösung, die 50 lüg
RDE enthielt und 6 Mäusen auf einmal 0,2 bis 0,5 ml einer Salzlösung, die 300 ug PE und 50 ug RDE enthielt,
injiziert. Schließlich wurden auf einmal 12 Mäusen 0,2 bis 0,5 ml Salzlösung als Kontrolle injiziert. Nach 21
Tagen zeigten 4 von 5 Mäusen, denen RDE injiziert worden war, eine vollständige Rückbildung des Tumors, und
6 von 6 Mäusen, denen RDE und PE injiziert worden war, zeigten ähnliche Ergebnisse. Andererseits starben 10
χ5 von 12 Mäusen der Kontrollgruppe am 21. Tag, und die
übrigen 2 Mäuse zeigten noch Krebszellen.
45 acht bis zehn Wochen alten weiblichen Mäusen C3HEJ wurden 10 Ovarialteratocarcinomzellen injiziert. Nach
24 Stunden wurden 15 Mäusen auf einmal 0,2 bis 0,5 ml
einer isotonischen Salzlösung, die 1400 ug PE enthielt, und 15 Mäusen 0,2 bis 0,5 ml einer Salzlösung, die 300 ug
PE und 50 ug RDE enthielt, injiziert. Schließlich wurden auf einmal 15 Mäusen 0,2 bis 0,5 ml Salzlösung als Kontrolle
injiziert. Nach 30 Tagen waren 5 der 15 Mäuse, der nen PE injiziert worden war, noch am Leben, und 8 der
15 Mäuse, denen RDE und PE injiziert worden war, zeigten eine Tumorrückbildung und waren noch am Leben. Andererseits
waren 14 der 15 Mäuse der Kontrollgruppe eingegangen.
Eine der 15 Mäuse zeigte Tumorrückbildung.
Claims (14)
1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet , daß es eine therapeutisch wirksame
Menge an
a) gereinigtem, aus einem Mikroorganismus erhaltenen
pyridinlöslichen Extrakt mit zwischen
etwa 7 und 20 Gew.-% Protein, zwischen etwa
10 und 16 Gew.-% Zucker und zwischen etwa 35 und 55 Gew.-% Fettsäuren,
b) gereinigtem, entgiftetem Endotoxin ohne nach-
weisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat und mit 375-475 nM/mg Phosphor und etwa 1700 bis 2000 M/mg
Fettsäuren und
c) einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus M. bovis BCG,
M. p/hlei, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra,
Nocardia asteroides, Propionxbacterium acnes-Typ II
5 oder Corynebacterium parvum ist.
3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus
Corynebacterium parvum ist.
4. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus
Proprionibacterium acnes-Typ II ist.
5. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß der Extrakt etwa 12 Gew.-%
von jedem Protein und Zucker und etwa 45 Gew.-% Fettsäuren enthält.
6. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß das Verhältnis des Extrakts
zum gereinigten entgifteten Endotoxin 1:1 bis 100:1 beträgt.
7. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Extrakt
zwischen etwa 50 und 5.000 ug und die Menge an gereinigtem entgiftetem Endotoxin zwischen etwa 5 und 1.000 ug
beträgt.
8. Präparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge an Extrakt etwa 500 ug
und die Menge an gereinigtem entgiftetem Endotoxin etwa 100 ug betragen.
9. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß es in lyophxlisierter
Form vorliegt.
10. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Träger physiologische
Kochsalzlösung ist.
11. Präparat nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß es in Form einer Öltröpfchenemulsion
vorliegt.
12. Präparat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß das Öl ein leichtes Mineralöl,
Squalan oder 7-n-Hexyloctadecan ist.
13. Präparat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl in einer Menge
zwischen etwa 0,5 und 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen
des Präparats, vorliegt.
14. Präparat nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß es ferner ein Detergens
in einer Menge zwischen etwa 0,02 und 0,2.5 Vo 1.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Präparats, enthält.
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