JPS60120817A - 医療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、精製無毒化エンドトキシン（ＲＤＩ１３）
を微生物のピリジン可溶性抽出物（Ｐ　、Ｅ　）と共に
含む医療用組成物に向けられる。この組成物において使
用されるＲＤＥは、約３５０〜４７５ｎモｈ句の燐及び
約１７００〜２０００ｎモル／Ｉｎ９の脂肪酸を有し、
検出し得る２−ケト−３−デオキシオクタノエートを有
しないものとして特徴付けられる。

ＰＥは、約３〜２０重骨幅の蛋白質、約１０〜４０重骨
幅の糖、及び約３５〜６０重骨幅の脂肪酸を含有する。

この組成物は、温血動物における癌性腫瘍の軽減及び／
又は退化を得るために効果的である。

（従来の技術） コリネバクテリウム・ａ４’ルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｌｕｍｐａｒｖｕｍ　）のごとき細菌が、腫瘍
増殖の阻害を誘導する成分を単離し、そして特徴付ける
ための実験に使用された〔例えば、Ａｎｔｉ　Ｔｕｍｏ
ｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｌｃ
ｕｌａｒ　ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＰｒｏｐｅｒｔｉｅ
ｓ　ｏｆ　Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　ｆ
ｒｏｍＣ，ｐａｒｖｕｍ；Ｃａｎｔｒｅｌｌ等、　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ３９．３５５４−３５６３
頁（１９７９年９月）を参照のこと〕。抗腫瘍活性とは
別に、Ｃ６・やルブムはリンパ網状系の有効な刺激物質
であって牌臓及び肝臓の重量及び胚子発生の不所望の増
加をもたらす。Ｃ０Ａ？ルブムのごとき微生物のピリジ
ン可溶性抽出物が、従来技術の生成物に随伴する不所望
の毒性効果を伴わないで強力な抗腫瘍性を有することが
発見された。

親生物及び変異株を包含するエンテロバクチリアセ−（
Ｅｎｔｅｒｏｂａａｔｅｒｌａｃｉａｅ　）力＼ら得ら
れるエンドトキシン抽出物が知られている。これらの抽
出物は、種々の免疫性腫瘍の免疫療法のために使用され
てきた［　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　、ａｓ　Ｐｅｑｕｉｒｅ
ｍｅｎｔｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈ　ｏｆ　
ｔｈｅ　Ｇｕｌｎｅａ−ＰｉｇＬｉｎｅ　−１０Ｔｕｍ
ｏｒ　ｗｉｔｈ　Ｆｉ：ｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　；Ｒｉｂ
ｉ等。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ、　Ｖｏｌ　７　ｅ　４３−５８頁（１９７９）を参
照のこと）。しかしながら、エンドトキシン抽出物は毒
性が強く、そしてそれ故に癌性腫瘍の治療における使用
が限定されることが知られている。腫瘍退化能を維持し
ながらエンドトキシンを無毒化する努力が行われてきた
。Ｒｉｂｉ等に示されているように、アジュバント性を
維持しながらエンドトキシンを無毒化するために知られ
ている化学的方法、例えばサクシニル化及びフタリル化
は、エンドトキシン活性及び腫瘍退化能の両者を喪失せ
しめる。従って、高い癌退化能を有しそして毒性を全く
又はほとんど有しないエンドトキシン生成物を得るため
の従来技術の試みは、全く成功していない。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、この発明は、微生物のピリジン可溶性抽出物を
精製無毒性エンドトキシンと共に含有する医薬組成物を
提供することを目的とする。

この発明の他の目的は、微生物のピリジン可溶性抽出物
及び精製無害化エンドトキシンを含有する組成物全使用
する温血動物及びヒトにおける腫瘍の治療方法全提供す
ることである。

（問題点を解決するための手段） ＰＥは、約３〜２０重骨幅の蛋白質、約１０〜４０重ｉ
％の糖、及び約３５〜６０重１の脂肪酸′ｆ：ｃ、・ぐ
ルブムの全細胞と共に含有し、そして好ましくは約５重
骨幅の蛋白質、約３５重骨幅の糖、及び約５５重骨幅の
脂肪ｅを含有する。

ここで、糖の使用に関して限定は存在せず、すＳべての
糖を使用することができる。このことは脂肪酸について
も真実であム使用し得る脂肪酸についての限定は存在し
ない。

蛋白質はアミノ酸及びアンモニアを含んで成９、そして
このアミノ酸には例えば次のものが含まれる（この測定
のためにペックヤンアミノ酸分析器を使用した）。

アス／そラギン　、０．２７３ スルオニン　０．１０８ セリン　０．５８５ ムラミン酸　０１２１９ グルタミン酸　０．２６７ グリシン　ｏ、３９ アラニン　０．１７３ ノアミノピメリン酸　０．４４４ イソロイシン　０．１２１ ０イシン　０．１６７ フェニルアラニン　０．０３４ ヒスタジン　０．０８８ リジン　０．５４４ アンモニア　０．５２４ 上記の量はｉｔ係であり、そして全蛋白質は６．３４重
量骨幅ある。

ピリジン可溶性抽出物を得るために任意の微生物を使用
することができ、これには例えばＭ、　ｙｊ？ビア　（
Ｍ、　ｂｏｖｌｓ　）　ＢＣＧ、　Ｍ、フレイ（Ｍ、　
ｐｈｉａｌ）、しい。

微生物の全細胞、好ましくはペースト状のものをピリジ
ンと混合する。得られた混合物を分離して、ピリジン可
溶性抽出物を含有する両分とピリジン残渣とを得る。場
合によっては、ビリシンを用いて上記のようにしてピリ
ジン残渣を再分離操作にかけて、追加量の目的抽出物を
取り出す。

次に、抽出物からピリシンを除却し、そして乾燥した抽
出物を、蒸留水のごとき適当な液に対して透析する。全
細胞及び細胞断片汚染物が存在しないことを電子顕微鏡
により確認する。次に、得られた精製抽出物を公知の方
法に従って凍結乾燥することによって安定な生成物を得
る。

この発明に従って製造したピリジン可溶性抽出物’１Ｒ
ＤＩＤと混合して、膵臓及び肝臓の拡大を刺激すること
なく高い抗腫瘍活性を有する組成物を製造する。ピリジ
ン可溶性抽出物を水に懸濁すれば、この懸濁液を水可溶
画分と水不溶画分に分離することができる。水可溶性抽
出物は、非経腸的に容易に注射することができ、同時に
ビリシン抽出物の抗腫瘍活性を保持している必ら、水可
溶性抽出物が最も好ましい。この組成物によって治療す
ることができる腫瘍には、動物腫瘍、例えばウシ扁平細
胞癌、ウシ線維肉腫、ウマ肉腫、ウマ黒色腫、ウマ扁平
細胞癌、イヌ乳癌、イヌ腺腫、及びイヌ黒色腫、並びに
ヒト腫瘍、例えば乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、悪性黒
色腫、扁平細胞癌、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、膀光腫瘍、頭
部腫瘍及び頚部腫瘍が含まれる。

精製無毒化エンドトキシン（ＲＤＥ　）ＲＤｇ　’ｉ製
造するための出発材料として使用されるタイプのエンド
トキシン抽出物は、親生物及び変異株を包含する任意の
エンテロバクチリアセ−春ら得ることができる。例えば
使用し得るタイプの微生物の代表的な属として、サルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）、シダラ（Ｓｈｉｇｅ
ｌｌａ　）、アセ（Ｓｅｒｒａｔｉｍ　）を挙げること
ができる。

（ルツシス（Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｇ　）、Ｂ、アｙ
ｆｋタス（Ｂ、　ａｂｏｒｔｕａ　）、Ｓ、エンテリチ
ディス（ｓ。

ｅｎｔｅｒｉｔｌｄｉｓ　）、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｉｌ
　）、Ｓ。

が典型的に使用される。

出発材料として使用されるエンドトキシン抽出物け、幾
つかの公知の方法の１つにょシ調製することができる。

公知の方法は、例えば次の文献に記載されている。

１）　Ｗｅｂｓｔｅｒｅ　Ｍ＊Ｅ、ｅ　Ｓａｇｉｎ、Ｊ
＊Ｆ、、　Ｌａｎｄｙ。

Ｍ、、及びＪｏｈｎｓｏｎ、　Ａ−Ｇａ５　Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　１９５５＊７４４．５５゜ ２）　Ｗｅｓｔｐｈａｌ、　ｏ、、　Ｌｕｄｅｒｉｔｚ
、　（Ｌ＠及びＢ１５ｔｅｒ、　Ｆ＊、　Ｚ、　Ｎａｔ
ｕｒｆｏｒｓｃｈｔ　７６１４８（１９５２）。

３）　Ｗｅａｔｐｈａｌ、　Ｏ，、Ｐｙｒｏｇｅｎｓ。

Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ、
ｇｙ、　Ｔｒ拳５ｅｃｏｎｄ―■■■■時−−−一−−
−−−−−−−−−―−−嗜一一−−ｍ−■■■−−Ｍ
ａｃｙ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　（Ｇｅｏｒｇｅ　Ｆ、
　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ。

ａｄｓ　）　、　Ｍａｄｌｓｏｎ、　Ｎ、Ｊ、　Ｍａｄ
ｉｓｏｎ　ＰｒｉｎｔｉｎｇＣｏ、、１９５７，１１５
゜ ４）　Ｇａ１ａｎｏｓ、　Ｃ，、Ｌｕｄｅｒｉｔｚ＊　
Ｏ，。

Ｗｅｓｔｐｈａｌ、Ｏ，、ｇｕｒ、Ｊ、ＢＩｏｃｈｅｍ
＋　９２４５（１９６９）。

５）　Ｃｈｅｎ、　Ｃ，Ｈ，、Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ａ、
Ｇ、、　Ｋａｓａｉ。

Ｎ、、　Ｋｅｙ、　Ｂ、Ａ、、　Ｌｅｖｉｎ、　Ｊ、、
　Ｎｏｗｏｔｎｙｐ　Ａ、＊Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ、　１２８５４３　（１９７３）。

６）　Ｒｌｂｉｌ　Ｅａｐ　Ｈａｓｋ＋ｎｓ＠　Ｗ−Ｔ
−ｐ　Ｌａｎｄｙ。

Ｍ、、Ｍｉｌｎｅｒ、に、Ｃ，、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
　１１４６４７　（１９６１）。

７）　Ｌｅｌｖ、ｅ、Ｌ、、Ｂｌｏｃｈｅｍ、旧ｏｐｈ
ｙｓ、Ｒｅｓ。

９偲ｍ、　２１２９０　（１９６５）。

８）　Ｒｌｂｉｅ　Ｐ２．、　Ｍｉｌｎｅｒ、　Ｋ、Ｃ
，、及びＰｅｒｒｌｎｅｔＴ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　８２７５　（１９５９）。

エンドトキシン抽出物を得るだめの好ましい方法は、Ｃ
ｈｅｍ等にょシ開示された方法、すなわちメタノール／
クロロホルム沈澱法である。

次にメタノール／クロロホルム沈澱物（ＭＣＰ　）を、
有機酸又は無機酸と反応せしめ、そして次に凍結乾燥し
て、出発エンドトキシン材料より低い毒性反び発熱件を
有する加水分解された粗脂質Ａを製造する。次に、この
材料を、粗脂質Ａを溶解することなく脂肪酸及び他の不
純物を特異的に溶解することができる溶剤で処理する。

無毒化され精製された脂質Ａの燐酸含量は毒性エンドト
キシンについて観察された量の約半分であり、燐酸含量
カエンドトキシンの毒性効果と関連することが示唆され
る。

ＭＣＰどの反応に使用する好ましい無機酸は塩酸、硫酸
、又は燐酸であゃ、そして好ましい有機酸はトルエンス
ルホン酸又はトリクロロ酢酸である。

反応は、約９０℃〜１３０℃の温度において、完全な加
水分解のために十分な時間、通常は約１５〜６０分間に
わたって適切に行うことができる。

粗無毒化エンドトキシンの調製は、有機溶剤、例えばク
ロロホルム、メタノール、及びエタノール、又はこれら
の混合物の存在下で、出発材料と酸とを反応せしめるこ
とによ多構成することができる。

得られた粗脂質へを、脂肪酸及び他の不純物を溶解する
ために好ましい溶剤であるアセトン中に懸濁する。次に
溶剤を除去して粗無毒化エンドトキシンを得る。

粗無毒化エンドトキシンを次に溶剤に溶解し、そしてこ
の溶液を適当なりロマトグラフカラム、例えば分子排除
（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　）クロマトグラフカラムに通し
てＲＤｇ画分を分離し、次にこの両分を、溶剤を除去し
た後に一緒にする。この粗無毒化エンドトキシン溶液を
、溶剤、例えばクロロホルム、メタノール、アセトン、
ピリジン、エーテルもしくは酢酸、又はこれらの混合物
の存在下でセファデックスカラムに通す。カラムの圧力
は変えることができるが、典型的にはおよそ大気圧〜１
００１ｂｉ／ｉｎ２の範囲であり、そして流速は約０．
１〜１０虎ｌ／分である。

粗無毒化エンドトキシン溶液は、セファデックスカラム
につＶρて上記したのと同じ圧力条件下でＤｇＡＦＪ−
セルロースカラムに通す。流速は約２〜１５ｍ１／分に
保持する。使用する溶剤もまたセファデックスカラムに
ついて使するのと同じであるが、すべての混合物に水及
び／又はジエチルアミンを約１係までの濃度で加えるこ
とができる。

粗無毒化エンドトキシンからＲＤｇを製造するための他
の方法には、約２０〜６３ミクロンの粒子サイズを有す
る低圧シリカゲル６０カラムに溶液’ｋ　通し、そして
クロロホルム、メタノール、水及び水酸化アンモニウム
から成る溶剤を用いる方法が含まれる。溶剤成分の好ま
しい体積比は５０：２５：４：２である。

精製無毒化エンドトキクン（ＲＤＩ８　）は、検出し得
る２−ケト−３−デオキシオクタノエートを有さ一１’
、約３５０〜４７５ｎモル／■の燐及び約１７００〜２
０００ｎモル／１ｎｇの脂肪酸を有する。

組成物は、医薬として許容される媒体、例えば油滴乳剤
又は生理的塩溶液中で注射によシ投与され、そして好ま
しくは、さらに具体的に下記する条件下で腫瘍に直接投
与される。投与は■注射又は■注入により行うことがで
きる。

組成物は、例えば凍結乾燥法により安定化し、そして力
価を喪失することなく再構成することができる。

動物を治療するための１回の注射におけるＲＤｇＯ量は
約２５〜５００　ｐ９／ｍｌ、適切には５０〜１００μ
Ｌろｌであり、そしてＰＥの量は約２５〜５００μｌ／
／ｍｌ　、適切には約１００〜２５０μＬろｌである。

腫瘍に注射する生物学的製剤のｍｌ数は次の表に従って
腫瘍の大きさにより決定する。

注射当りの最大投与量はＲＤｌｌ：が約１０ｒＩＱ、そ
してＰＥが約２５１ｖである。治療過程は約２週間の間
隔で投与される４〜１０回までの注射ムら成る。

適当な注射媒体、例えば生理的塩溶液中のこの発明の組
成物は、ヒト腫瘍に直接投与される。１回の注射中のＲ
ＤＥの量は約５〜１０００μ１１適切には約２５〜５０
０μｙである。ＰＥの一＃は約５０〜５．０００μｙ１
適切には約２００〜３，０００μｇである。

ＲＤＥの好ましい投与量レベルは約１００μｇであシ、
そしてＰＥについては約１０００μｇである。上記の投
与量レベルはすべて典型的な７０に９の成人患者を基礎
にしたものである。注射はおよそ１週間に１回行い、合
計注射回数が約１５回までとする。

上記のように、温血動物又はヒトの治療のための組成物
は、塩溶液又は油滴乳剤の形で使用することができる。

使用する油の量は、組成物の全容量を基礎にして約０．
５〜３．０容量係の範囲である。

約０，７５〜１．５容量係の油を使用するのが好ましい
。このような油の例には、軽鉱油、スクワラン、７−ｎ
−へキシルオクタデカン、コノコスーパーオイル（Ｃｏ
ｎｏｃｏ　ｇｕｐｅｒｏｉｌ、及びドラケオール（Ｄｒ
ａｋｓｏｌ　）　６　ＶＲ鉱油〔ペンレコ社（Ｐｓｎｎ
ｒｓｃ。

Ｃｏｍｐａｎｙ　）　ｅパトラ−１にンシル・ぐニア〕
が含まれる。

次に、ホモジナイズされた油含混合物を洗剤と混合する
。場合によってはこの洗剤は混合前に塩溶液に溶解する
。洗剤の量は典型的には組成物の全容積を基礎にして約
０．０２〜０，２０容１１チ、そして好ましくけ約０．
１０〜０．２０容量係である。

トウィーンＳＯ，アルラセル（Ａｒ１ａｃｅｌ　）　（
アトラスケミカル社製〕のごとき任意の一般的な洗剤を
使用することができる。

次に、洗剤の添加によって得られる混合物をホモジナイ
ズして、顕微鏡観察により測定した場合に高・平−セン
テージの油滴が活性成分によって被覆されている懸濁液
を形成せしめる。

次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但し
、これによってこの発明の範囲を限定するものではない
。

抽出物の調製 グロビオニバクテリウム・アクネスタイプ■（ＶＰＩ０
２０４株）を、３７℃にテＮ１ｔ（ｆ　オフＩＪ　ニル
−ドブロス中で４８〜７２時間培養し、そして集菌して
全細胞ペーストを得た。次に、この（−スｔ’ｃ５００
ｍ６の蒸留水により洗浄した。９０ｇ（湿重量）の洗浄
ペーストを２００ｍ１の純ビレッジと混合し、そして４
℃にて１７００　ｘｇにて１時間遠心分離した。ピリジ
ン可溶剤抽出物を上清液として取り出した。残った残渣
を、上記と同じ条件下で追加のピリジンを用いて抽出し
た。ワットマンＡＩＦ紙を用いて濾過した後、ぎリジン
抽出物をプールし、そしてプチローターベーノ！−（Ｂ
ｕｃｈｉ　Ｒｏｔａｖａｐｏｒ　）　Ｃプリンクマンイ
ンスツルメンツ（Ｂｒ１ｎ’ｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ　）　ｐウェストバレー、ニューヨーク〕中
で５０℃にて蒸発せしめることにより溶剤を除去した。

乾燥したピ１」ジン抽出物を、蒸留水に対して十分に透
析し、そして次に凍結乾燥した。得られた精製ピリジン
抽出物は力５重骨幅の蛋白質、約３５重量％の糖、及び
約５５重骨幅の脂肪酸を含有していた。抽出物を、電子
顕微鏡のもとで試験し、そして汚染全細胞及び細胞壁断
片を含有しないことを見出した。

ピリジン可溶性抽出物の収率は９％（８，１ｍ）であっ
た。

例２．Ｍ、＆＄スＢＣＧ株からのピリジン可溶性抽出物
の調製 Ｍ、＆ビスＢＯＧ株をサートン（５ａｕｔｏｎｓ　）培
地中で３７℃にて３〜４週間増殖せしめ、そして収菌す
ることにより洗浄全細胞ペースｉ得た。次に、５０ｇ（
製型！Ａ−）の洗浄ペース）ｋ例１と同様にして処理し
、７４（ｓ、ｓｌのピリジン可溶性抽出物を得た。抽出
物は、１５重量骨幅蛋白質、１０重量骨幅糖、及び５２
重量骨幅脂肪［を含有していた。

例３．水抽出物の調製 ５００７＃のピリジン抽出物を１００＋＋／の蒸留水中
で１５〜３０分間超音波処理した。得られた懸濁液を、
ＲＣ２Ｂ遠心分離機中、４℃、１２．００Ｏｒｐｍにて
４０分間遠心分離した。上清液をデカントシ、そして貯
蔵した。残渣を上記のようにしてさらに２回抽出した。

上清液を凍結乾燥ビン中で一緒にし、凍結し、そして凍
結乾燥した。収量２３０ｍ９（４６係）。

（１９７３）の方法に従って調製されたメタノール／ク
ロロホルム沈澱物のサンプル６５０ｍ９’ｋ、９ｍ器を
装着しそして超音波処理器に浸漬された３つロ丸底フラ
スコ中で、１５０ｍ／の０．　Ｉ　Ｎ　ＨＣｌ中に懸濁
した。超音波処理の後、ガラス装置ｉ、１２０℃に保持
された油浴に浸けた。この温度は、フラスコの内部温度
を溶液の沸点に到達させ又はそれより高くすることがで
きる。フラスコに、その１つの口を通して窒素ガス源に
連結された毛細管を設けることにより、溶液の過加熱全
最小にした。

加水分解全３０分間継続し、そして溶液を水浴中で冷却
し、超音波処理することによって固形物を分散せしめ、
そしてコレツクスチューブに分配した。フラスコを蒸留
水で洗浄してフラスコの側部に付着しているすべての物
質を取り出し、そして洗液をコレツクスチューブ中の懸
濁液に加えた。

１２．００　Ｏｒｐｍてて８０分間遠心分離を行った。

上清液をデカントし、そして廃棄した。固体残渣を蒸留
水に再懸濁し、懸濁液が十分に分散するまで超音波処理
し、そして再度遠心分離した。次に、遠心分離を反復し
た。残渣を蒸留水に入れ、凍結し、そして凍結乾燥して
３８２ｍ９の粗脂質Ａｉ得た。１５０１ｎ９のこの物質
を冷（０℃）アセトンで処理して脂肪酸を除去し、超音
波処理し、そしてワットマン屋１重力濾過装置を通して
５℃にて濾過した。乾燥後、１００■の粗無毒化エント
ドキシ゛ンが残留した。

ＭＣＰ　（メタノール／クロロホルム沈澱物）のサンプ
ル１２０■に１２ｍ１の純メタノールに懸濁し、超音波
処理して固形物を分散せしめ、そして６本のネジ蓋バイ
アルに分配した。各チューブに２ｍｌの０．２　Ｎ　ｌ
ＩＣ１ｆ加え、そして得られた懸濁液を沸騰水浴中で４
５分間インキュベートした。加水分解後、チューブを氷
水浴中で冷却し、そして２５００ｒｐｍにて約１０分間
遠心分離した。上清液をデカントし、そして５ｄのクロ
ロホルム／メタノール（２：１）混合物を残渣に加えて
溶解せしめた。チューブ当り２ｍｌの水を加え、そして
溶液を混合した。２相溶液を２５０Ｏｒｐｍにて１０分
間再遠心分離した。上部水相を廃棄し、そしてＩＷＬｌ
のクロロホルム／メタノール（４：１）混合物金各チュ
ーブに加えて透明な溶液を得た。溶液を一緒にし、そし
て溶剤をロータリーエバポレーター上で蒸発せしめた。

残渣を高真空下で乾燥し、そして４５ｍ９の粗脂質Ａを
得た。２０即のこの物質を冷（０℃）アセトンで処理し
、超音波処理し、そしてワットマン屋１重力濾過装置を
通して５℃にて沖過した。乾燥した後、１３ダの粗無毒
化エンドトキシンが残留した。

例６．精製無毒化エンドトキシンの調製１１０．９のＬ
Ｈ−２０−１００（２５−１００ミクロンの粒子サイズ
；ファルマシア）を６００ｍ／のクロロホルム／メタノ
ール（２：　１　）混合物と混合し、３０分間放置した
。得られたスラリーを、圧力設定器を有する２０Ｘ１０
００ｍｍガラス製クロマトグラフィーカラム（ＢＲＬラ
ゲラトリーズ）に加えた。充填が完了した後、カラムを
、テフロン製圧力チューブにより　ｒｓｃｏモデル１３
２ポングに連結した。４００ｍ１のクロロホルム／メタ
ノール（４：１）混合物をポンプにより３ｍ１１分の流
速でカラムに通した。例４に従って調製した１００ηノ
粗無毒化エンドトキシンｋ　、２．５　ｍｌのクロロホ
ルム／メタノール（４：１）混合物と共に、ザンプルル
ープを介してカラムに適用した。流速を１１１ＬｌＺ分
に下げ、１５０７ｄの溶出液を集めた後、溶出液をフラ
クションコレクターに連結した。４プずつの画分を集め
、そしてこの両分を薄層クロマトグラフィー〔Ｅ、メル
ク、厚さ０．２５ｍ／、溶離剤としてクロロホルム／メ
タノール／Ｈ２ｏ／ＮＨ４ｏＨ（５０：２５：４：２）
を使用〕により分析することによって、精製無毒化エン
ドトキシン画分を決定した。

精製無毒化エンドトキシン画分を一緒にし、そして溶剤
を蒸発せしめて、３ｏｒｖの精製無毒化工ンドトキシン
を白色粉末として得た。

例７．精製無毒化エンドトキシンの調製３３ｇのＤＥ入
Ｅ−セルロース（ワットマンＤＦＪ−３２）’ｅｌ　５
０ｄの氷酢酸に懸濁し、そして１０分間ゆっくり攪拌し
てスラリー粉末を得た。混合物を一夜放置した。

スラリー’ｅ　２５　Ｘ　４００　＋ｍのカラムに注入
し、かるくたたいて沈降せしめ、この後過剰の酸を流去
せしめた。カラム’ｅ２０００ｍ／のメタノールで洗浄
し、次に２ｏｏｍｔのクロロホルム／メタノール（４：
１　）混合物で洗浄した。例４に従って調製された粗無
毒化エンドトキシンのサンプル１００ｍｐｌ、３ｍｌの
クロロホルム／メタノール（４：１）混合物、又はクロ
ロホルム／メタノール／水（８０：２０：１）混合物と
共にカラムに加えた。

カラムｆ、３５０１ｒＬｌのクロロホルム／メタノール
（４：１）混合物により溶出し、次に３００ｍ／のメタ
ノール／水（９９：１）混合物により溶出した。直線グ
ラジェント装置を用いて、１００％メタノールから出発
しそしてメタノール９０．２Ｍ酢酸で終る２０００ｍＡ
！の直線グラジェントによりカラムを溶出した。カラム
の溶出は６　ｍｅ　７分の流速で行い、そして１５ｍ／
の画分を集めた。各画分全、Ｂａｒｔｌｅｔｔ　Ｇ、Ｒ
，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２３４゜４６６−
４７１　（１９５９）の方法に従って全燐含量について
分析した。画分をプールし、そしてロータリーエバポレ
ーター上でほとんど乾燥するまで蒸発せしめ、そして分
液漏斗中の１０ｍ１のクロロホルム／メタノール（２：
１）混合物及び４０ｍ１の０．００１Ｍ酢酸中に入れた
。下相を分離し、ワットマンＡ２Ｆ紙を通して濾過し、
そして蒸発乾燥して、１９．２■の精製無毒化エンドト
キシンを得た。

例８゜ 生後８〜１０週間の老雄性Ｃ３ＨｅＢＦｅＪマウス２３
匹に、１０個の卵巣奇形癌細胞を腹腔内注射した。２４
時間後、５匹のマウスに、５０／ｊｇのＲＤＩを含有す
る等張塩溶液０．２〜０．５　ｍｌを１回注射し、そし
て６匹のマウスに、３００μＩのＰＥ及び５０μＩのＲ
ＩＥ　ｉ含有する塩溶液０．２〜０．５ｄを１回注射し
た。最後に、１２匹のマウスに対照として０．２〜Ｑ、
５ｍ／の塩溶液を１回注射した。２１日後、ＲＤＥ’ｊ
ｊ注射された５匹のマウスの内４匹が腫瘍の完全な退化
を示し、そしてＲＤＥ及びＰＩＪ−注射された６匹のマ
ウス中６匹が同様の結果を示した。他方、対照群の１２
匹のマウス中１０匹が２１日０までに死き、そして残９
２匹は、癌細胞の証拠を示した。

例９゜ 生後８〜１０週間の老雄性Ｃ３ＨＥＪマウス４５匹に、
１０個の卵巣奇形癌細胞を注射した。２４時間後、１５
匹のマウスに、１４００μｙのＰＩＪ−含有する等張塩
溶液０．２〜Ｑ、５１ｍ’ｉ１回注射し、そして１５匹
のマウスに、３００μｙのＰＥ及び５０μｓのＲＤｇ　
’ｉ金含有る塩溶液０．２〜Ｑ、５ｍＡ！１ｉ１回注射
した。最後に、１５匹のマウスに、対照として０．２〜
０．５−の塩溶液を注射した。３０日後、ＰＥを注射さ
れた１５匹のマウス中５匹はなお生存しており、そして
ＲＤＩ及びＰＥｉ注射された１５匹のマウス中８匹が腫
瘍の退化を示し、そしてなお生存した。他方、対照群の
１５匹のマウス中１４匹が死に、残り１匹のマウスは腫
瘍の退化を示した◎ 特許出願人 リビ　イミュノケム　リサーチ。

インコーホレイティド 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西山雅也 手続補正書（方式） 昭和５９年１２月１８日 特許庁長官　志　賀　学殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１９８７６４号２、発明の名称 医療用組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　リビ　イミュノヶム　リサーチ。

インコーホレイティド ４、代理人 （外　４　名） 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、医療用組成物であって、医療的に有効量の、（ａ）
   　約７〜２０重骨幅の蛋白質、約１０〜１６重骨幅の糖
   、及び約３５〜５５重骨幅の脂肪酸を含んで成る、微生
   物から得られた精製されたピリジン可溶性抽出物； （ｂ）　３７５〜４７５　ｎ−Ｅニル／ｒｎｇノ燐及ヒ
   約１７００−２０００ｎモル／ＴＲｇの脂肪酸を有し、
   そしテ検出し得る２−ケト−３−デオキシオクタノニー
   トラ有しない精製無毒化エンドトキシン；及び（Ｃ）医
   薬として許容される担体； を含んで成る組成物。 ２、微生物が、Ｍ、ｖ、？ビス（Ｍ、ｂｏｖｌｓ　）　
   ＢＣＧ。 Ｍ、フレイ（Ｍ、ｐｈｌｅｉ　）、Ｍ、スメグマチス（
   Ｍ。 ｓｍｅｇｍａｔｊｓ　）、Ｍ、カンサシ−（Ｍ、　ｋａ
   ｎｓａｓｉ　ｉ　）、ノカルディア・ルブラ（Ｎｏｃａ
   ｒｄｌａ　ｒｕｂｒａ　）、ノカルディア・アステロイ
   デス（Ｎｏｃａｒｄｉｍａａｔｅｒｏｌｄｅａ　）、プ
   ロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂ
   ａｃｔｅｒｌｕｍ　ａｃｎｅｓ　）タイプ■、及びコリ
   ネバクテリウム・パルブム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒｔｕｍ　ｐａｒｖｕｍ　）
   から成る群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ３、前記微生物がコリネバクテリウム・ノｆルプムであ
   る特許請求の範囲第２項記載の組成物。 ４、前記微生物がプロピオニバクテリウム・アクネスタ
   イプ■である特許請求の範囲第２項記載の組成物。 ５、前記抽出物が約１２重骨幅の蛋白質、及び約４５重
   骨幅の脂肪酸を含有する特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ６、前記抽出物と前記精製熱化エンドトキシンとの比率
   が１：１〜１００：１である特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ７、前記抽出物の量が約５０〜５０００μｇであり、そ
   して前記精製無毒化エンドトキシンの量が約５〜１００
   ０μｇである特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記抽出物の量が約５００μｇであ勺、そして前記
   精製無毒化エンドトキシンの量が約１００μｇである特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前１己組成物が凍結乾燥形である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 １０、前記担体が生理的塩溶液である特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 １１、前記組成物が涛滴乳剤形である特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 １２、前記油が軟鉱油、スクワレン、スクワラン、及び
   ７−ｎ−へキシルオクタデカンから成る群から選択され
   る特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 １３、前記油が、組成物の全体積を基礎にして約０．５
   〜３．０容量係の量で存在する特許請求の範囲第１１項
   記載の組成物０ １４、組成物の全体積を基礎にして約０．０２〜０．２
   ５容量係の量の洗剤をさらに含んで成る特許請求の範囲
   第１項記載の゛組成物。 １５、％許請求範囲第１項に記載の組成物を温血動物に
   投与することから成る瀉血動物に免疫応答を発生せしめ
   る方法において使用するための特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 １６、前記組成物を１５回まで非経腸的又は直接的に腫
   瘍細胞に注射すること乃１ら成る温血動物において免疫
   応答を発生せしめるための方法において使用するための
   特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １７、少なくとも１週間の間隔で注射することから成る
   温血動物において免疫応答を発生せしめるための方法に
   おいて使用するための特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。 １８、特許請求の範囲第１項記載の組成物をヒトに投与
   することから成るヒトにおいて免疫応答を発生せしめる
   方法において使用するための特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 １９、前記組成物を１５回まで非経腸的又は直接的に腫
   瘍細胞に注射することから成るヒトにおいて免疫応答を
   発生せしめるための方法において使用するための特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ２０．１週間の間隔で注射することから成るヒトにおけ
   る免疫応答を発生せしめるための方法において使用する
   ための特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ２、特許請求の範囲第１項記載の組成物を瀉血動物に投
   与することおら成る温血動物における腫瘍の治療方法に
   おいて使用するための特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。 ２２、明細書に後記する医薬用組成物。 ２３、温血動物、特にヒトにおいて免疫応答を発生せし
   めるための方法において使用するための特許請求の範囲
   第１項記載の組成物。