KR870000843B1

KR870000843B1 - 피리딘 가용성 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR870000843B1
Application number: KR1019840005821A
Authority: KR
Inventors: 레오나드 칸트렐 죤
Original assignee: 리비 이뮤노켐 리서어치 인코오퍼레이션; 닐스 에이·리비
Priority date: 1983-09-23
Filing date: 1984-09-22
Publication date: 1987-04-25
Also published as: CA1244765A; ZA847405B; ES536167A0; DE3434766C2; DK446684D0; CH664897A5; HUT35521A; NL8402902A; IT1179444B; JPS6254775B2; FI843716A0; DK446684A; FR2552326B1; US4663306A; BE900650A; SE8404707L; AU3340084A; ATA302384A; FI843716L; IN157240B

Abstract

내용 없음.

Description

피리딘 가용성 추출물의 제조방법

본 발명은 미생물의 피리딘 가용성 추출물(PE)의 제조방법에 관한 것이며, 상기 피리딘 가용성 추출물과 조합하여 정제, 해독된 내독소(內毒素)(RDE)를 포함하는 제약조성물에 관한 것이다.

본 조성물에 사용된 RDE는 검출 불가능한 양의 2-케토-3-데옥시옥타노에이트를 함유하며, 약 350 내지 475 n moles/㎎의 인(燐)과 약 1700 내지 2000 nmo les/㎎의 지방산을 갖는 것이 특징이다.

PE는 약 3과 20중량 % 사이의 단백질과 약 10 내지 40중량 %의 설탕, 그리고 약 35 내지 60중랑 %의 지방산을 포함한다. 조성물은 온혈동물의 암성종양의 경감 및/또는 퇴치를 이루는데 효과적이다.

코리네박테리움 파트붐(Corynebacterium parvum)과 같은 박테리아는 종양 성장억제를 유발하는데 유효한 성분을 분리하고 규정하기 위한 실험연구의 과제이었다 [예를 들어서, C. 파르붐으로부터 분리한 분별물의 항-종양 활성 및 림포레티큘러 자극특성 ; Cantrell, et al, Cancer Research 39, pp. 3554-3563 (9월, 1979) 참조]. 항-종양 활성과는 별도로, C. 파르붐은 비장(脾臟)과 간의 바람직하지 못한 비대와 배자발생(胚子發生 : blastogensis)의 결과가 되는 림포레티큘러 시스템의 효능있는 자극제이다. C. 파르붐과 같은 미생물의 피리딘-가용성 추출물은 종전기술의 제품과 관련된 바람직하지 못한 독성의 영향이 없이 효능있는 항-종양 특성을 가짐을 발견하였다.

모(母) 유기체와 돌연변이체를 포함하는 엔테로박테리오시에 (Enterobacteri aciae)로부터 얻은 내독소 추출물이 공지되어 있다.

이들 추출물은 여러가지 면역원성 종양의 면역요법에 사용되었다 [내독소로 기니피그 라인 -10종양의 면역요법에 대한 펩티드 ; Ribi et al., Cancer. Immunol. Immunother. Vol.7, pp 43-58 (1979) 참조]. 그러나 내독소 추출물은 고도의 독성이 있으므로 암성종양의 치료에의 용도가 제한되어 있음이 공지이다. 그의 종양 퇴치력을 보유하면서 내독소를 “해독”하기 위한 많은 연구가 행해져 왔다.

리비(Ribi) 등이 보인 바와 같이 보조약성을 유지하면서 내독소를 해독하기 위한 숙시닐화 및 프탈릴화와 같은 화학적 방법들은 내독성과 종양 퇴치효능 모두의 감소를 가져온다.

그러므로, 종래 기술은 고도의 종양 퇴치효능을 갖는 내독소 제품을 얻기 위한 시도이며 거의 독성이 없는 내독소 제품은 이제까지 성공하지 못하였다.

그러므로, 정제된 해독된 내독소와 조합하여 미생물의 피리딘-가용성 추출물을 포함하는 제약조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미생물의 피리딘-가용성 추출물과 정제, 해독된 내독소를 포함하는 조성물을 사용하여서 온혈동물과 사람의 종양을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

미생물의 피리딘-가용성 추출물(PE)

PE는 약 3 내지 20중량 %의 단백질과 약 10 내지 40중량 %의 설탕, 그리고 약 35 내지 60중량 %의 지방산을 C. 파르붐 전체세포와 조합하어 포함하며 바람직하게는 약 5중량 %의 단백질, 약 35중량 %의 설탕 및 55중량 %의 지방산을 포함한다.

여기서 사용된 바로는 설탕의 사용에 관해서는 제한이 없다. 즉 모든 설탕이 사용될 수 있다. 지방산에 관해서도 마찬가지인데 즉, 사용될 수 있는 지방산에 관하여 제한이 없다.

지방산은 아미노산과 암모니아로 이루어지며 아미노산은 예를 들면 다음의 것들을 포함하고 이들의 결정에는 베크만(Beckman) 아미노산 분석기가 이용되었다.

아스파르기닌 0.273 디아미노 피멜산 0.444

트레오닌 0.108 이소로이신 0.121

세린 0.585 로이신 0.167

뮤람산 0.219 페닐알라닌 0.034

글루탐산 0.267 히스타딘 0.088

글리신 0.39 리신 0.544 및

알라닌 0.173 암모니아 0.524

위에 표시된 양은 중량퍼센트이고 총 단백질은 6.34중량 %이다.

피리딘-가용성 추출물을 얻는데에는 어떠한 미생물도 사용될 수 있는데 예를 들면, M. 보비스(bovis) BCG, M. 플레이(Phlei), M. 스메그마티스(smegmatis), M. 칸사시이(kansassi), 노카르디아 루브라(Nocardia rubra), 노가르디아 아스테로이드 (Nocardia asteroides), 프로프리오니 박테리움 아크네스(Proprioni bacteriuma cnes) 타입 Ⅱ, 및 코리네박테리움 파르붐이다. 코르네박테리움 파르붐과 프로트리오니박테리움 아크네스 타입 Ⅱ가 특히 바람직하다.

바람직하게는 페이스트의 형태로 된 미생물의 전체세포를 피리딘과 혼합한다.

결과된 혼합물을 분리시켜 피리딘-가용성 추출물과 피리딘 잔유물을 포함하는 상징액 분별물을 얻는다. 선택적으로, 피리딘 잔유물은 피리딘을 사용하여 상기와 같은 분리과정을 되풀이하여 원하는 추출물의 더 이상의 양을 제거시킬 수 있다.

다음에 피리딘을 추출물로부터 제거하고 건조된 추출물을 증류수와 같은 알맞는 액체로 투석한다. 전체 세포 또는 세포조각 오염물이 존재하지 않음을 전자현미경으로 확인한다. 다음에 결과되는 정제된 추출물을 공지의 방법으로 동결 건조하여 안정한 제품을 얻을 수 있다.

본 방명에 따라 생성된 피리딘-가용성 추출물은 RDE와 조합하여 비장과 간 확장의 유발을 자극하지 않고 효능있는 항-종양 활성을 갖는 조성물을 생성한다.

만일 피리딘-가용성 추출물을 물에 현탁시킨다면 현탁액을 수용성 분율과 비수용성 분율을 분리할 수 있다. 수용성 추출물은 비경구적 주사가 용이하고 동시에 피리딘 추출물의 항-종양 활성을 보유하기 때문에 가장 바람직하다.

이 조성물에 의해 치료될 수 있는 종양은 소 비늘세포암, 소 선유육종 (線維肉腫), 말 유육종(類肉腫), 말 색소세포종, 말 비늘세포암, 개 유방종양, 개 선종(腺腫) 및 개 색소세포종과 같은 동물 종양들과 사람의 유방종양, 폐종양, 결장종양, 악성유육종, 비늘세포암, 난소종양, 자궁종양, 방광 및 머리와 목종양과 같은 인(人) 종양을 포함한다.

정제, 해독된 내독소(RDE)

RDE를 생성하기 위한 출발물질로서 사용된 형태의 내독소 추출물은 모유기체와 돌연변이체를 포함하는 어떠한 박테리아시에로부터도 얻어질 수 있다.

예를 들자면, 다음의 속(屬)들이 사용될 수 있는 미생물의 타입을 예시한다 : 살모넬라 (Salmonella), 쉬젤라 (Shigella), 에스케리치아 (Escherichia), 브루셀라 (Br ucella), 보르드텔라 (Bordetella), 시트로박테르 (Citrobacter), 슈도모나스 (Pseud omonas), 파스투렐라 (Pasturella), 니이세리아 (Neisseria), 프로티우스 (Proteus), 클렙시엘라 (Klebsiella), 및 세라티아(Serratia).

다음의 종(種)들이 전형적으로 사용된다 : S. 미네소타(minnuesota), S. 티피무리움(typhimurium), B. 페르투씨스(pertussis), B. 아보르투수(abortus), S. 엔테리티디스(enteritidis), E. 콜리(coli), S. 티피(typhi), S. 마르세센스(marcesenes), S. 티포사(typhosa), 쉬젤라 플렉스니(Shigella flexni), 및 S. 아보르투스 에퀴(abortus equi).

출발물질로서 사용되는 내독소 추출물은 여러 공지의 방법 중 한 방법에 의해 제조될 수 있다.

[예를 들어서, 다음을 참조한다.

1) Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M., and Johnson, A.G., J. Immunol. 1955, 744, 55.

2) Westphal, O., Luderitz, O., and Bister, F., Z. Naturforsch, 76 148 (1952)

3) Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (Georgo F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957, 115.

4) Galanons, C., Luderitz, O., Westphal, O., Eur. J. Biochem, 9 245 (1969).

5) Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis 128 543 (1973).

6) Ribi E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961).

7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1965).

8) Ribi, E., Milner, K.C and Perrine, T., J. Immunol. 82 75 (1959)].

내독소 추출물을 얻는 바람직한 방법은 첸(Chen) 등에 의하여 발표된 것, 즉, 메탄올-클로로포름 침전법이다.

메탄올-클로로포름 침전(MCP)은 그때 유기 또는 무기산과 반응한 다음 동결 건조하여 출발 내독소물질과 비교하여 감소된 독성과 발열성(pyrogenicity)을 갖는 가수분해된 미정제 지질(脂質) A를 생성한다. 다음에 이 물질은 미정제 지질 A는 용해하지 않고 지방산과 다른 불순물들을 특이적으로 용해시킬 수 있는 용매로 처리한다. 해독, 정제된 지질 A의 인산염 함량은 인산염 함량이 내독소의 독성효과에 관계되는 것으로 제안하는 독성 내독소에서 관찰된 것의 약 1/2이다.

MCP와 반응하기 위해 사용된 바람직한 무기산은 염사, 황산, 또는 인산이고 바람직한 유기산은 톨루엔술폰산 또는 트리클로로아세트산이다.

반응은 약 90℃와 130℃ 사이의 온도에서, 가수분해를 완결시키기에 충분한, 보통은 약 15분과 60분 사이의 시간동안 알맞게 반응시킬 수 있다.

미정제 해독된 내독소의 제조는 클로로포름, 메탄올, 및 에탄올 또는 그들의 조합물과 같은 유기용매의 존재하에 출발물질을 산과 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 결과되는 미정제 지질 A는 지방산과 다른 불순물들을 용해시키기 위한 바람직한 용매인 아세톤에 현탁시킨다.

다음에 용매를 제거하여 미정제 해독된 내독소를 생산한다. 미정제 해독된 내독소는 다음에 용매에 용해시키고 용액을 분자배제 크로마토그라피 컬럼과 같은 적당한 크로마토그라피 컬럼을 통과시켜 용매의 제거후 조합되어 있는 RDE 분별물을 분리한다.

미정제 해독된 내독소 용액은 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 피리딘, 에테르 또는 아세트산, 또는 그들의 조합물과 같은 용제의 존재하에서 세파덱스 컬럼을 거쳐서 통과된다. 컬럼의 압력은 변화될 수 있으나 일반적으로 약 대기압과 100 1bs/in²사이의 범위내이고 유동속도는 약 0.1에서 10㎖/min 사이이다.

미정제 해독된 내독소 용액은 세파덱스 컬럼용으로 상기 언급된 바와 같은 동일 압력 조건하에서 DEAE-셀룰로오즈 컬럼을 거쳐 통과될 수 있다. 유동속도는 약 2-15㎖/min에서 유지된다.

또한 사용된 용제는 물 및/또는 디에틸아민이 약 1%까지의 농도로 모든 혼합물에 첨가될 수 있으나, 세파덱스 컬럼용으로 사용된 바와 같다.

미정제 해독된 내독소로부터 RDE를 제조하는 다른 방법은 약 25-63미크론의 입도를 지니며 클로로포름, 메탄올, 물 및 수산화암모늄으로 이루어진 용제를 사용하는 낮은 압력의 실리카겔 60컬럼을 거쳐서 용액을 통과시키는 과정을 포함한다. 용제 구성성분의 바람직한 부피비는 약 50 : 25 : 4 : 2이다.

정제되어 해독된 내독소(RDE)는 2-케토-3-데옥시옥타노에이트가 검출되지 않으며 약 350-475 n moles/㎎의 인과 약 1700-2000 n moles/㎎의 지방산을 함유한다.

조성물은 유점적유제 또는 생리식염수와 같은 제약상으로 수용가능한 매제내 용액으로 주사하므로써 투여되며 다음에 특별히 기술되는 조건하에서 종양에 직접적으로 투여되는 것이 바람직하다. 투여는 Ⅳ 주사 또는 Ⅳ 주입으로 될 수 있다.

조성물은 예를 들면 동결건조(凍結乾燥) 공정에 의해 안정화된 다음 효력의 상실없이 환원될 수 있다.

동물의 치료를 위한 1회 주사에서 RDE의 양은 약 25-500 micrograms/㎖, 적정하게는 50-100 micrograms/㎖이며 PE의 양은 약 25-500, 적정하게는 100-250 micrograms/㎖이다.

종양에 주사된 생리학적 제제(製劑)의 ㎖수치는 다음 표에 따르는 종양의 크기에 의해 결정된다.

종양크기에 따른 동물의 투여량

주사당 1회 최대량은 RDE 약 10㎎과 PE 약 25㎎이다.

처리과정은 약 2주일 간격으로 투여되는 4 내지 10회까지의 주사로 이루어진다.

본 조성물은 생리식염수와 같은 적정한 주사 매제에서 인간의 종양에 직접 투여된다.

1회 주사에서 RDE의 양은 약 5-1000 micrograms, 적정하게는 약 25-500 micrograms이다.

PE의 양은 약 50-5000 micrograms, 적정하게는 약 200-3000 micro grams이다.

바람직한 투여량 수준은 RDE가 약 100 micrograms, PE가 1000 microg rams이다.

상술된 모든 투여량의 수준은 대표적으로 70㎏의 성인환자를 기준으로 한다. 주사는 약 총 15회 주사까지 매주 한번씩 투여된다.

온혈동물과 사람의 치료를 위해 상술된 조성물은 유점적유제 또는 식염수의 형태로 사용될 수 있다.

사용된 기름의 양은 조성물의 총부피를 기준으로 한 약 0.5-3.0 용적%의 범위내이다. 기름의 약 0.75-1.5 용적 %를 사용하는 것이 바람직하다.

그러한 기름의 실례에는 경(輕)광유, 스콜란, 7-n-헥실옥타데칸, 코노코 (Con oco) 슈퍼오일 및 드라케올(Drakeol) 6VR 광유(the Pennrew Company, Butler, Pennsylvania에 의해 제조된) 등을 포함한다.

균질화된 오일을 함유하는 혼합물을 혼합하기 전에 식염수에 선택적으로 용해될 수 있는 세정제(洗淨劑)와 조합된다. 세정제의 양은 일반적으로 조성물의 총부피를 기준으로 약 0.02-0.20 용적 %이며 바람직하게는 약 0.10-0.20 용적 %이다. 여느 통상의 세정제 물질도 Tween-80 및 Arlacel(the Atlas Chemical Co.에 의해 제조된)를 함유하여 사용될 수 있다.

세정제를 가하여 생성된 혼합물은 다음에 균질화하여 현탁액을 형성케 하고, 이 현탁액은 현미경하에서 관찰하여 측정했을 때 활성성분으로 피복된 유점적을 높은 백분율로 함유하였다.

다음 실시예들은 단지 설명을 목적으로 하는 것일뿐 제한하도록 의도되거나 여기에 첨부된 특허청구 범위에서 주장된 바와 같은 본 발명을 어느 의미로든 재한정하는 것이 아니다.

[실시예 1]

프로프리온니박테리움 아크네스 타입 Ⅱ(Strain VPI 0204)로부터 수용성 피리딘 추출물의 제법.

프로프리온니박테리움 아크네스 타입 Ⅱ(Strain VPI 0204)를 48-72시간 동안 NIH 티오글리콜레이트 브로스(thioglycolate broth)의 37℃에서 생장시키고 수확하여 완전한 세포 페이스트를 얻었다. 그 다음 페이스트를 증류수 500㎖로 수세하였다.

수세된 페이스트의 90g(습윤중량)을 순수한 피리딘 200㎖와 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 1700×g에서 원심 분리하였다.

피리딘-가용성 추출물을 상징액부분으로서 제거하였다. 남은 잔유물을 상술한 바와 같은 동일 조건하에서 피리딘을 더 가하여 추출하였다.

와트만 No. 1 페이퍼를 사용하여 여과한 다음 피리딘 추출물을 모우고 용제를 부치 로타베이퍼(Buchi Rotavapor)(Brinkmann Instrrument, Westbury, New York)의 50℃에서 증발에 의해 제거하였다. 건조된 피리딘 추출물을 증류된 물에 대해 광범위하게 투석한 다음 동결 건조하였다.

생성된 정제된 피리딘 추출물은 약 5중량 %의 단백질, 약 35중량 %의 설탕과 약 55중량 %의 지방산을 함유하였다. 추출물을 전자현미경으로 시험하였는바, 전세포와 세포벽 조각이 오염되지 않음을 발견하였다.

피리딘-가용성 추출물의 수율은 9%(8.1g)이었다.

[실시예 2]

피리딘-가용성 추출물 M. 보비스(bovis) 스트레인 BCG의 제법.

M. 보비스 스트레인 BCG을 3-4주 사이 동안 37℃의 소통(sautons) 배지에서 생장시키고 수확하여 수세된 완전한 세포 페이스트를 얻었다.

수세된 페이스트의 50g(습윤중량)을 실시예 1에서와 같은 방법으로 처리하여 피리딘-가용성 추출물 7%(3.5g)의 수율을 얻었다.

추출물은 15중량 %의 단백질, 10중량 %의 설탕 및 52중량 %의 지방산을 지녔다.

[실시예 3]

수용성 추출물의 제법.

500㎎의 피리딘 추출물을 15-30분 동안 증류수 100㎖에서 초음파 처리하였다.

생성된 현탁액을 40분 동안 4℃에서 RC2B 원심분리기 12,000rpm으로 원심 분리하였다.

상징액을 가만히 따르고 남겨놓고, 잔유물은 상기에서와 같이 2회 더 추출하였다.

상징액을 동결 건조병에 합치고 외부를 얼려 동결 건조하였다. 수율 230㎎ (46%).

[실시예 4]

미정제 해독된 내독소의 제법.

첸의 방법(Chen, et al, J. Infect. Dis. 128 543, 1973 참조)에 따라 제조된 메탄올-클로로포름 침전물의 650㎎ 시료를 응축기가 달린 3구 환저플라스크에서 0.1 NHCl 150㎖에 현탁하고 초음파 처리기에서 침지하였다.

초음파 처리후 유리기구를 120℃에 유지시킨 유욕내로 낮추어서, 플라스크 내부온도가 용액의 비점에 근접하거나 이를 초과하게 하였다.

용액의 초과가열을 1개의 구를 통하여 질소가스원에 부착된 모관(毛管)과 플라스크를 맞춤으로써 최소화하였다. 전 가수 분해과정 중 질소의 공급을 계속하였다.

가수분해를 30분 동안 계속한 다음 용액을 빙욕에서 냉각하여 초음파 처리하여 고체물질을 분산하고 코렉스관에 분배하였다.

플라스크를 증류수로 수세하여 플라스크 측면에 부착된 모든 고체물질을 제거하고 그 세척물을 코렉스관의 현탁액에 첨가하였다.

원심분리를 80분 동안 12,000rpm에서 실행하였다. 상징액을 따라서 버렸다.

고체잔유물을 증류수로 재현탁하고 현탁액이 잘 분산되고 거듭 원심 분리될 때까지 초음파 처리하였다. 그 다음 원심 분리공정을 재반복하였다.

잔유물을 증류수에 취하여 외부를 얼려 동결 건조하여 미정제 지질 A 382㎎을 얻었다.

이 물질 150㎎을 차거운(0℃) 아세톤으로 처리하여 지방산을 제거하였고 초음파 처리한 다음 5℃에서 와트만 No. 1 중력 여과장치를 통해 여과하였다.

미정제 해독된 내독소 100㎎이 건조 후에 남았다.

[실시예 5]

미정제 해독된 내독소의 제법.

MCP(메탄올-클로로포름 침전물)의 120㎎ 시료를 무수메탄올 12㎖에서 현탁하고 초음파 처리하여 고체물질을 분산하여 6(1×10㎝) 나사 뚜껑을 갖는 바이알에 분배하였다.

0.2N HCl의 2㎖을 각 관에 첨가하였고 생성된 현탁액을 45분 동안 끓는 수욕에서 배양하였다.

가수분해 후 관을 냉수욕에서 냉각하고 2500rpm에서 약 10분 동안 원심 분리하였다.

상징액을 가만히 따르고 2 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물의 5㎖을 잔유물에 첨가하여 용해시켰다. 각 시험관에 2㎖의 물을 가하고, 그 용액을 혼합하였다.

두 상(相)으로 된 용액을 2500rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상층의 수상(水相)을 버리고, 1㎖의 4 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물을 각 시험관에 가하였더니 맑은 용액이 되었다.

용액을 모으고, 용제는 회전증발기에서 증발시켰다. 잔유물을 고진공하에서 건조시키고, 동결 건조하여 45㎎의 조제 지질 A를 얻었다.

이 물질 20㎎을 냉(0℃) 아세톤으로 처리하고, 고주파음 분해를 행한 후 와트만 No. 1 중력 여과장치에 의하여 5℃에서 여과하였다.

건조 후 미정제 해독된 내독소 13㎎이 잔유하였다.

[실시예 6]

정제, 해독된 내독소의 제조.

110g의 LH-20-100(25-100미크론의 입도 : pharmacia)을 30분간 방치하였던 2 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물 60㎖와 합하였다.

생성된 슬러리를 가압장치를 갖는 25×1000㎜ 유리크로마토그라피 컬럼(BRL Laboratories)에 가하였다. 충전이 완료된 후 이 컬럼을 테플론 가압관에 의하여 ISCO 모델 132 펌프에 부착시켰다.

이 컬럼을 통하여 4 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물 400㎖를 3㎖/분의 속도로 펌핑하였다.

실시예 4에 따라 제조된, 미정제 해독된 내독소 100㎎을 4 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물 2.5㎖에 녹여 시료루우프를 통하여 컬럼에 가하였다.

유동은 1㎖/분으로 감소되었으며, 용출제가 150㎖ 수집된 다음 용출액을 분별수집기에 연결시켰다. 4㎖의 분별물을 수집하고, 정제, 해독된 내독소 분별물을 박층 크로마토그라피 분석에 의하여 측정하였다[E. Merck, 0.25㎜ 두께, 클로로포름/ 메탄올/ H₂O/NH₄OH(50 : 25 : 4 : 2)를 용출제로서 사용].

정제, 해독된 내독소 분별물을 합치고, 용제를 증발시켰더니 30㎎의 정제, 해독된 내독소가 백색분말로서 잔유하였다.

[실시예 7]

정제, 해독된 내독소의 제조.

33g의 DEAE-셀루로오즈(Whatman DE-32)를 150㎖의 빙초산에 현탁시키고 10분간 조용히 교반하여 슬러리 분말을 얻었다. 이 혼합물을 하룻밤 방치하였다.

이 슬러리를 25×400㎜ 컬럼에 주가하고, 가끔 흔즐어 주면서 방치하고, 그후 과량의 산을 쏟아 버렸다. 이 컬럼을 2000㎖의 메탄올로 세척하고, 다음에 200㎖의 4 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물로 세척하였다.

실시예 4에 따라 제조된 미정제, 해독된 내독소 시료 100㎎을 4 : 1 클로로포름 /메탄올 혼합물이나 80 : 20 : 1의 클로로포름, 메탄올 및 물의 혼합물에 녹여 컬럼에 가하였다.

이 컬럼을 4 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물 350㎖로 용출하고, 다음에 300㎖의 99 : 1 메탄올/물 혼합물로 용출시켰다.

선형 경사장치를 사용하여, 2000㎖의 100% 메탄올로 선형경사를 시작, 0.2M 아세트산 메탄올 용액으로 끝냄으로써 컬럼을 용출시켰다. 이 컬럼은 6㎖/분의 속도로 용출시키고, 15㎖의 분별물을 수집하였다. 바아트레의 과정(Bartlett, G.R., J. Biol Chem. 234, 466-471, 1959 참조)에 따라 하나 건너씩의 분별물에 대하여 총 인함량을 분석하였다.

분별물을 모아서 회전증발기상에서 거의 건조될 때까지 증발시키고, 분액퍼넬에서 10㎖의 2 : 1 클로로포름/메탄올 혼합물과 40㎖의 0.001M 아세트산에 취하였다. 하층을 분리시켜 와트만 No. 2 여과지로 여과하고 건조될 때까지 증발시켜 19.2㎎의 정제, 해독된 내독소를 얻었다.

[실시예 8]

8 내지 10주 된 C3HeBFeJ 암생쥐 23마리에게 10⁵의 난소 암세포를 복강내 주사하였다.

24시간 후에 5마리 쥐에게는 50 microgram의 RDE를 함유하는 등 침투성 염수용액 0.2-0.5㎖를 1회 주사하고, 6마리 쥐에게는 300 microgram의 PE와 50 microgram RDE를 함유하는 염수용액 0.2-0.5㎖를 1회 주사하였다.

맨 마지막으로 12마리 쥐에게는 대조표준으로서 0.2-0.5㎖의 염수용액을 1회 주사하였다. 21일 후 RDE를 주사한 5마리 쥐 중 4마리는 중앙의 완전한 퇴행을 나타내었고, RDE와 PE를 주사한 6마리 전부도 이와 유사한 결과를 나타내었다.

한편 대조표준군의 12마리 중 10마리는 21일 내에 죽었으며, 나머지 2마리는 계속 암세포의 증상을 나타내었다.

[실시예 9]

8내지 10주 된 암생쥐 C3HEJ 45마리에게 10⁵의 난소암세포를 주사하였다.

24시간 후 15마리의 쥐에게는 1400 microgram의 PE를 함유하는 등 침투성 염수용액 0.2-0.5㎖를 1회 주사하고, 15마리에게는 300 microgram의 PE와 50 microgram의 RDE를 함유하는 염수용액 0.2-0.5㎖를 주사하였다.

최종적으로 15마리의 쥐에게는 대조표준으로서 0.2-0.5㎖의 염수용액을 1회 주사하였다.

30일 후, PE를 주사한 15마리 쥐 중 5마리는 계속 살아있고, RDE외 PE를 주사한 15마리 중 8마리는 종양의 퇴행을 나타내었고, 계속 살아있었다.

한편, 대조표준인 15마리 쥐 중 14마리는 죽었고, 나머지 1마리는 종양의 퇴행을 나타내었다.

Claims

피리딘을 완전한 세포의 작용을 시킨 다음 결과된 피리딘 가용성 추출물을 분리시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 정제된 피리딘 가용성 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 미생물이 엠 보비스 비씨지(M. bovis BCG), 또는 프로프리오니 박테리움 아크네스 타입 Ⅱ (proprionibacterium acnes Type Ⅱ)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출물이 약 3 내지 20중량 %의 단백질과, 약 10 내지 40중량 %의 설탕과, 약 35 내지 60중량 %의 지방산을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에서 제조된 피리딘 가용성 추출물에 정제 해독된 내독소 및 제약상 허용되는 담체와 조합하여 이루어지는 치료조성물