HU192585B

HU192585B - Process for preparing pharmaceutical compositions containing purified, detoxycated endotoxine and a pyridine-soluble extract of a microorganism

Info

Publication number: HU192585B
Application number: HU843585A
Authority: HU
Inventors: John L Cantrell
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1983-09-23
Filing date: 1984-09-21
Publication date: 1987-06-29
Also published as: SE8404707D0; CH664897A5; SE8404707L; IN157240B; BE900650A; IT1179444B; ATA302384A; JPS6254775B2; ZA847405B; AU3340084A; ES536167A0; DK446684D0; HUT35521A; AU566234B2; FI843716L; NO843776L; DE3434766A1; DK446684A; IL73034A; DE3434766C2

Description

A jelen találmány tárgya eljárás tisztított, detoxikált endotoxint (TDE) valamely mikroorganizmus piridin-oldható kivonatával (PK) együtt tartalmazó gyógyászati kompozíció előállítására. A jelen kompozícióban használt TDE azzal jellemezhető, hogy nem tartalmaz kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanoátort, míg foszfort 350 és 475 nmól/mg közötti mennyiségben, zsírsavakat 1700 és 2000 nmól/mg közötti mennyiségben tartalmaz. A PK

3—20 tömeg % fehéijét, 10—40 tömeg % cukrot és 35-60 tömeg % zsírsavat tartalmaz. A kompozíció hatásos a rákos tumorok csökkentésének és/vagy visszafejlesztésének elérésére melegvérű állatokban.

Bizonyos baktériumok, mint pl. a Corynebacterium parvum, voltak már tárgyai olyan kísérleti munkának, amelyek célja az volt, hogy Izolálják a tumor növekedés gátlásának indukálásáért felelős komponenst (lásd pl. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum (A C. parvumból izolált frakciók tumor-ellenes aktivitása és limforetikuláris stimulálási tulajdonságai), Cantrell és munkatársai: Cancer Research, 39, 3554-3563, 1979 szeptember). A tumor-ellenes aktivitásán kívül a C. parvum a limforetikuláris rendszer hatásos stimulátora, és így nem kívánatos növekedést okoz a lép és a máj súlyában, valamint blasztogenezisben. Felfedezték, hogy valamely mikroorganizmus, mint pl. a C. parvum piridinoldható extraktuma rendelkezik hatásos tumor-ellenes tulajdonságokkal a nélkül, hogy rendelkezne azzal a nem-kívánatos toxikus hatással, amely a korábbi ismeretek szerinti készítményekhez társult.

Az, Enterobacteriaceae családból, akár szülő, akár mutáns törzsből nyert endotoxikus extraktumok ismertek. Ezeket az extraktumokat különböző Immunogén tumorok immunteráplájához használják (lásd Peptides as Requirement fór Immunotherapy of the Guinea—Pig Line-iO Tumor with Endotoxins [A tengerimalac-10 tumor endotoxinokkai történő immunterápiájához szükséges peptidek), Ribi és munkatársat: Cancer Immunoi, hnmunother. 7. kötet, 43-58 (1979)]. Az endotoxinextraktumokról azonban ismeretes, hogy nagyon toxikusak és ezért csak korlátozottan használhatók rákos tumorok kezelésében. Erőfeszítéseket tettek arra, hogy az endotoxinokat úgy detoxikálják, hogy tumor-visszafejlesztő képességük megmaradjon. Amint Ribi és munkatársai kimutatták, az endotoxinok detoxikálására ismert oiyan kémiai eljárások, amelyek azért megőrzik az adjuváns hatást, mint pl. a szukcinilezés és ftálilezés, ebben az esetben csökkenést váltanak ki mind az endotoxicitásban, mind a tumor visszafejlesztő képességben. Ezért az eddig végzett kísérletek olyan endotoxin-termék nyerésére, amelynek tumor-visszafejlesztő képessége nagy, de toxicitása kicsiny vagy nincs is, nem voltak sikeresek.

Λ jelen találmány tárgya egy olyan gyógyászati kompozíció előállítása, amely valamely mikroorganizmus piridin-oldható kivonatát egy tisztított, detoxikált endotoxinnal együtt tartalmazza.

A jelen találmány másik tárgya eljárást szolgáltatni melegvérű állatokban és emberekben levő tumorok kezelésére valamely mikroorganizmus piridin-oldható kivonatát és egy tisztított, detoxikált endotoxint tartalmazó kompozíciót alkalmazva.

Egy mikroorganizmus piridin-oldható kivonata (PK).

A PK 3-20 tömeg % fehérjét, 10-40 tömeg % cukrot, és 35-60 tömeg % zsírsavat tartalmaz a C. parvum teljes sejttel kapcsolatban, és előnyösen 5 tömeg % fehérjét, 35 tömeg % cukrot és 55 tömeg % zsírsavat tartalmaz.

Ahogyan itt alkalmazzuk, nincs korlátozás a cukrok alkalmazásával kapcsolatban: minden cukor használható. Ugyanez vonatkozik a zsírsavakra is: nincs korlátozás a zsírsavakkal kapcsolatban, amelyeket alkalmazhatunk.

A fehérje amínosavakból és ammóniából áll, és az aminosavak pl. a következőket foglalják magukban, Beckman aminosav-analizátort használva fel a meghatározásokhoz

Aszparagin	0,273
Treonin	0,108
Szerin	0,585
Muraminsav	0,219
Glutaminsav	0,267
Glicin	0,39
Alanin	0,173
Diamin o-pimelinsav	0,444
Izoleucin	0,121
Leucin	0,167
Fenilalanin	0,034
Hisztidin	. 0,088
Lizin	0,544
Ammónia	0,524

A megadott mennyiségek tömeg %-ban vannak kifejezve, a teljes fehérje mennyiség 6,34 tömeg %-nak adódik.

Bármely mikroorganizmus alkalmazható alrhoz, hogy piridin-oldható extraktumot nyerjünk, ilyenek pl. a M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansasíi, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Propionibacterium acnes II. típus, és Corynebacterium parvum. A Corynebacterium parvum és a Propionibacterium acnes II. típus különösen előnyösek.

A mikroorganizmus teljes sejtjeit, előnyösen paszta formájában, piridinnel összekeverjük, Az így nyert keveréket szeparáljuk, hogy egy olyan felülúszó frakciót nyerjünk, amely a piridin-oldható kivonatot és a maradék piridint tartalmazza. A maradék piridint előnyösen ismét szeparálási eljáráshoz használjuk fel a fentebb leírtak szerint, hogy a kívánt kivonat további mennyiségét nyerhessük.

A piridint a kivonatból eltávolítjuk és a szárított kivonatot megfelelő folyadékkal, pl. desztillált vízzel szemben dializáljuk. A teljes sejtek vagy sejt-fragmens szenynyezések távollétét elektronmikroszkóppal igazoljuk. Az így nyert tisztított kivonatot ezután Éofilezzük az ismert módszerrel, így stabil terméket nyerünk.

A jelen találmánnyal összhangban előállított piridinoldható kivonatot TDE-vel kombináljuk, így olyan kompozícióhoz jutunk, amelynek jelentős tumor-ellenes aktivitása van a nélkül, hogy stimulálná a lép és a máj megnagyobbodásának indukcióját. Ha a piridin-oldható kivonatot vízben szuszpendáljuk, a szuszpenziót szeparálni lehet egy vízben oldható és egy vízben nem oldható frakcióra. A vízben oldható frakció a legkívánatosabb, mivel ezt könnyen lehet parenteralisan injektálni, ugyanakkor ez a készítmény megtartja a piridin-kivonat tumor-elleres aktivitását. Azok a tumorok, amelyeket ezekkel a készítményekkel kezelni lehet, magukban foglalják az állati tumorokat, mint pl. marha pikkelyes sejt karcinoma, marha fibroszarkóma, ló-szarkoid, ló-melanoma, ló pikkelyes sejt karcinoma, kutya emlő-tumorok, kutya-adenoma, kutya-melanoma, emberi tumorok, mint pl. melltumorok, tüdő-tumorok, végbél-tumorok, rosszindulatú

192 585 melanómák, pikkelyes sejt karcinómák,petefészek-tumorok, méh-tumorok, húgyhólyag-, fej- és nyak-tumorok. Λ finomított, detoxikált endotoxin (FDE).

Az FDE előállításához szükséges kiindulási anyagként használt típusú endotoxin-extraktumot nyerhetünk bármelyik Enterobacterioceae családba tartozó mikroorganizmusból, szülő-törzsekből és mutánsokból egyaránt. A példa kedvéért a következő nemzetségeket adjuk meg illusztrációként az olyan mikroorganizmus-típusokra, amelyeket jól alkalmazhatunk: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Paterurella, Neisseria, Proteus, KJebsiella és Serratia.

Leginkább a következő fajokat használjuk: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni és S. abortus equi.

A kiindulási anyagként alkalmazott endotoxikus extraktumot a számos ismert módszer valamelyikével állíthatjuk elő (lásd pl.

1. Webster, Μ. E., Sagin, J. F., Landy, M., és Johnson, A.G.:J. Immunoi:, 1955 , 744, 55

2. Westphal, 0., Luderitz, 0., és Bister, F.: Z. Naturforsch., 76,148 (1952)

3. Westphal, O.: Pyrogens. Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (kiadó:GeorgeF.Springer), Madison, New Jersey, Madison Printing Co., 1957,115

4. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O.: Eur. J. Biochem., 9, 245 (1969)

5. Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N.,Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A.:7. Infect. Dis. 128, 543, (1973)

6. Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M., Milner, K. C. The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961)

7. Leive, L.: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 21, 290 (1965)

8. Ribi, E., Milner, K. C. ésPerrine,T.:/./mm»nofogy 82, 75 (1959)

Az előnyös módszert, amellyel endotoxikus kivonatot lehet nyerni, Chen és munkatársai hozták nyilvánosságra, nevezetesen a metanol-kloroformos kicsapást.

A metanol-kloroformos csapadékot (MKCs) ezután egy szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk, majd liofllezzük, hogy hidrolizált nyers A lipidet állítsunk elő csökkentett toxicitással és pirogén-hatással, ha a kiindulási endotoxin anyaghoz hasonlítjuk. Ezt az anyagot azután egy olyan oldószerrel kezeljük, amely képes fajlagosan feloldani a zsírsavakat és tisztátalanságokat a nélkül, hogy feloldaná a nyers A lipidet. A detoxikált, finomított A lipid foszfát-tartalma mintegy fele annak, amelyet a toxikus endotoxinoknál figyeltek meg, azt sugallva, hogy a foszfát-tartalom kapcsolatban van az endotoxinok toxikus hatásával.

Az MKCs-vel való reakcióhoz használt előnyös szerves savak a sósav, kénsav és foszforsav, és az előnyös szerves savak a toluolszulfonsav vagy a triklór-ecetsav. A reakciót megfelelően 90 °C és 130 °C között célszerű végezni annyi ideig, amely elegendő a teljes hidrolízishez.

A nyers, detoxikált endotoxin készítését véghez lehet vinni oly módon, hogy a kiindulási anyagot a savval reagáltatjuk egy szerves oldószer jelenlétében, ilyen pl. a kloroform, metanol, etanol és ezek kombinációi.

Az. így nyert nyers A lipidet acetonban felszuszpendáljuk, az aceton előnyös oldószer a zsírsavak és egyéb tisztátalanságok feloldásához. Az oldószert ezután eltávolítjuk, így nyers detoxikált endotoxint nyerünk.

A nyert detoxikált endotoxint ezután valamely oldószerben feloldjuk és az oldatot megfelelő kromatográfiás oszlopon engedjük át, hogy elkülönítsük a TDE frakciókat, amelyeket azután az oldószer eltávolítása után egyesítünk. A nyers, detoxikált endotoxint Sephadex oszlopon engedjük át olyan oldószerben, mint pl. kloroform, metanol, aceton, piridin, éter vagy ecetsav, vagy ezek kombinációi. Az oszlop nyomása változó lehet, de általában az atmoszférikus nyomás és 6,8 ' 10⁵ Pa között van, és az átfolyási sebesség 0,1-10 ml/pere között.

A nyers, detoxikált endotoxin oldatot DEAE cellulóz oszlopon is lehet átengedni azonos nyomás-viszonyok között, amelyet a Sephadex oszlopnál említettünk. Az átfolyási sebességet 2-15 ml/perc között tartjuk. Az alkalmazott oldószerek azonosak azzal, amelyet a Sephadex-oszlopnál alkalmazunk, bár víz és/vagy dietil-amin minden keverékhez adható kb. 1 % koncentrációig.

Más módszer, amely alkalmas TDE előállítására nyers, detoxikált endotoxinból, lehet pl. az oldat átengedése kis nyomáson szilikagél—60 oszlopon, amelynek részecske-mérete 25 és 63 mikron között van, és amelyhez kloroformból, metanolból, vízből és ammónium-hidroxidból álló oldószert ajkabnazunk. Az előnyös térfogat-arány ezekből a komponensekből az oldószerhez kb.50:25:4:2.

A tisztított, detoxikált endotoxinban (TDE) nincs kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanoát, és foszfor-tartalma 350 és 475 nmól/mg, míg zsírsav-tartalma 1700 és 2000 nmól/mg között van.

A jelen kompozíciót injekció formájában lehet beadni gyógyászatilag elfogadható közegben, mint pl. olaj-cseppes emulzióban, vagy fiziológiás konyhasó oldatban, és előnyösen közvetlenül a tumorba is be lehet adni az alábbiakban részletesen ismertetett körülmények között. A beadást el lehet végezni intravénás injekció, vagy intravénás infúzió formájában.

A kompozíciót pl. liofilezési eljárás segítségével lehet stabilizálni, majd ebből az állapotból megfelelően visszanyerni a gyógyító képesség elvesztése nélkül.

A TDE mennyisége állatok kezelésénél egy injekcióban 25-500 mikrogramm/ml között lehet, célszerűen 50 és 100 mikrogramm/ml között, és a PK mennyisége 25-500 mikrogramm/ml között lehet, célszerűen 25 és 500 mikrogramm/ml között.

A biológiailag a tumorba injektált milliliterek számát a tumor mérete határozza meg a következő táblázattal összhangban:

Az állatoknak beadott dózis a tumor mérete alapján

Biológiailag injektált

A tumor átmérője mennyiség (cm) (ml)

0-1 0,5-ig

1- 2 0,5-2,5

2- 3 2,5-5

3- 5 5-10

5-8 - 10 — 15,

8-nál nagyobb · 15—20

Az injekciónként! maximális dózis kb. 10 milligramm IDE és kb. 25 milligramm PK, A kezelés menete 4—10 injekciót foglal magában, kb. két hetes intervallumokban beadva.

A jelen kompozíciót megfelelő injekciós közegben, pl. fiziológiás konyhasó-oldatban közvetlenül adjuk be az

-3192 585 emberi tumorokba. A TDE mennyisége egyszeri injekcióban 5 és 1000 mikrogramm között van, célszerűen 25 és 500 mikrogramm között. A PK mennyisége ugyanitt 50 és 5000 mikrogramm között van, előnyösen 200 és 3000 mikrogramm között. A legelőnyösebb dózis-szint TDE-ből 100 mikrogramm és PK-ból 1000 mikrogramm. Mindezek az itt említett dózis-szintek átlagos, 70 kg-os felnőtt páciensre vonatkoznak. Az injekciókat minden héten egyszer adjuk be, összesen kb. 15 injekcióig.

Amint korábban említettük, a melegvérű állatok és az ember kezeléséhez alkalmas kompozíciókat fiziológiás sóoldatos vagy olaj-cseppecskés emulzió formájában alkalmazhatjuk. Az alkalmazott olaj mennyiésge 0,5 és 3 térfogat % között van a kompozíció teljes térfogatára vonatkoztatva. Előnyös 0,75 és 1,5 térfogat százalék között alkalmazni az olajat. Az ilyen, itt alkalmazható olajokra példák: könnyű ásványolaj, szkvalén, 7-n-hexil-oktadekán, Conoco-Superoil és Drakeol 6-VR ásványolaj (a Pennreco Company, Butler, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, gyártmányai).

A keveréket tartalmazó homogenizált olajat azután valamely detergenssel kombináljuk, amelyet előnyösen az összekeverés előtt só-oldatban oldottunk. A detergens mennyisége általában 0,02 és 0,20 térfogat % között van, előnyösen 0,10 és 0,20 térfogat % között a kompozíció teljes térfogatára vonatkoztatva. Bármilyen közismert detergens-anyag alkalmazható, beleértve pl. a Tween—80-at, és az. Arlacclt (az Atlas Chemical Company gyártmánya).

A detergens hozzáadásával keletkezett keveréket azután szuszpenzió-formájúvá homogenizáljuk, amelyben nagy százalékban vannak jelen olyan olaj-cseppecskék, amelyek az aktív komponensekkel vannak befedve, amint ez mikroszkópos megfigyeléssel meghatározható.

Az itt következő példák azt a célt szolgálják, hogy részleíesebben mutassák be az eljárást, de nem az a céljuk, hogy korlátozzák,vagy bármilyen formában túlszűkítsék a találmány oltalmi körét, amelyet a leírás végén található igénypontokban igényelünk.

1. PÉLDA — Piridin-oldható kivonat készítése Propionibactcriuin acnes II. típus-ból (VPI 0204 törzs) i’ropionibacterium acnes II. típusú törzset (VPI 0204 törzs) növesztünk 37 °C hőmérsékleten NIH tioglikolát tápközegben 48 és 72 óra közti időtartamig, majd a sejteket kinyerjük, teljes sejtek pasztáját kapva. A pasztát azután 500 ml desztillált vízzel mossuk. 90 gramm (nedves súly) mosott pasztát keverünk össze 200 ml hígítatlan piridinnel és a keveréket 1700 g-nél egy órán át 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A piridin-oldható kivonatot, mint felülúszót elkülönítjük. Az ott maradt üledéket további piridin-mennyiséggel extraháljuk az előbbiekben leírtaknak megfelelő körülmények között. A szűrést követően (Whatman 1. papíron) a piridines kivonatokat egyesítjük és az oldószert 50 ^ÖC hőmérsékleten Buchi Rotavaporban (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) bepárlással eltávolítjuk. A száraz piridines kivonatot desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk, majd liofilezzük. Az. így készített tisztított piridines kivonat kb. 5 tömeg % fehérjét, kb. 35 tömeg % cukrot és kb. 55 tömeg % zsírsavat tartalmaz. A kivonatot elektronmikroszkóp alatt tanulmányozzuk, és úgy találjuk, hogy mentes a teljes sejt. vagy sejtfal-törmelék szennyeződésektől. A piridin-oldható kivonat kitermelése 9 % (8,1 g).

2. PÉLDA - Piridin-oldható kivonat készítése M. bovis BCG törzsből.

M. bovis törzset növesztünk Sauton-tápközegen 37 °C hőmérsékleten 3-4 héten át, majd a sejteket kinyerjük mosott, teljes sejt pasztát kapva. 50 gramm (nedves súly) mosott pasztát az 1. példában leírtakkal azonos módon' kezelünk, így 7 % kitermeléssel (3,5 g) piridin-oldható kivonatot nyerünk. A kivonat 15 tömeg % fehérjét, 10 tömeg % cukrot és 52 tömeg % zsírsavat tartalmaz.

3. PÉLDA — Vizes kivonat készítése

500 mg piridines kivonatot kezelünk ultrahanggal 100 ml desztillált vízben 15-30 percen át. Az így nyert : szuszpenziót 12000 fordulat/perccel centrifugáljuk RC2B centrifugában 4 °C hőmérsékleten 40 percen át. A felülúszót dekantáljuk és megőrizzük. Az üledéket még kétszer extraháljuk a fentiek szerint. A felülúszókat liofilező palackban egyesítjük, rétegben lefagyasztjuk és liofilezzük. Kiteimelés: 230 mg (46 %).

4. PÉLDA — Jíyers, detoxikált endotoxin készítése.

A Chen éj^-munkatársai eljárásával [./. Infect. Dis. 128,

543, (1973)] összhangban készült metanol-kloroformos csapadék 650 mg-os mintáját 150 ml 0,1 n sósav-oldatban szuszpendáljuk egy kondenzátorral összeillesztett, háromnyakú, kerekfenekű lombikban, és ultrahangos készülékbe (szonikátorba) merítjük. Az ultrahangos kezelés után az üvegkészüléket 120 ^ÖC hőmérsékletet fenntartó olajfürdőbe merítjük, amely lehetővé teszi, hogy a lombik belső hőmérséklete elérje vagy meghaladja az oldat forráspontját. Az oldat túlhevítését minimálisra lehet csökkenteni olyan módon, hogy egy nitrogéngáz forráshoz kapcsolt kapilláris csövet illesztünk a lombikhoz az egyik nyakon keresztül. Folytonos nitrogén-áramlást tartunk fenn végig a hidrolizálási eljárás folyamán.

A hidrolízist 30 percen át folytatjuk, majd az oldatot jégfürdőben lehűtjük, ultrahanggal kezeljük a szilárd anyag szétoszlatása érdekében, majd az anyagot Corexcsövekbá szétosztjuk. A lombikot desztillált vízzel kimossuk, hogy minden, a lombik oldalára tapadó szilárd anyagot eltávolítsunk, és a mosófolyadékot a Corexcsövekben levő szuszpenziókhoz töltjük. A centrifugálást 12000 fordulat/perccel hajtjuk végre 80 percen át. A felülúszót dekantáljuk és elöntjük. A szilárd maradékot desztillált vízben újra szuszpendáljuk, és addig kezeljük ultrahanggal, amíg a szuszpenzió jól elosztott lesz, majd újra centrifugáljuk. A centrifugálási folyamatot még egyszer megismételjük. Az üledéket desztillált vízben felvesszük, rétegben lefagyasztjuk és liofilezzük, 382 mg nyers A lipidet nyerve. 150 mg-ot ebből az anyagból hideg (0 °C) acetonnal kezelünk, hogy a zsírsavakat eltávolítsuk, ultrahanggal kezeljük, majd Whatman 1. gravitációs szűrő berendezésen átszűrjük 5 °C hőmérsékleten. 100 mg nyers, detoxikált endotoxin marad a szárítás végén.

5. PÉLDA — Nyers detoxikált endotoxin készítése.

120 mgMKCs-t(metanol-klorofonnos csapadék) szuszpendálunk 12 ml abszolút metanolban, ultrahanggal kezeljük, hogy a szilárd anyagok eloszoljanak és 6 csavaros kupakkal ellátott (1 x 10 cm) üvegcsébe osztjuk szét. Minden üvegcsébe 2 ml 0,2 n HCl-t adunk és a keletkező szuszpenziót forró vízben inkubáljuk 45 percen át. A hidrolízis után a csöveket jégfiirdőben lehűtjük és kb. 10 percen át 2500 fordulat/perccel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és az üledékhez 5 ml kloroform-metanol 2 : 1 keveréket adunk, feloldódást érve el ilyen módon. 2 ml vizet adunk csövenként és az oldatot összekeverjük. A kétfázisú oldatot újra centrifugáljuk 2500 fordulat/perccel 10 percen át. A felső, vizes fázist eldobjuk

192 585 és 1 ml kloroform-metanol 4 : 1 keveréket adunk minden csőhöz, amely művelet tiszta oldatot eredményez. Az oldatokat egyesítjük, és az oldószert forgó bepárlóban lepároljuk. A maradékot nagyvákuumban szárítjuk és liofilezzük, 45 mg nyers A lipidet nyerve. Ebből az anyagból 20 mg-ot hideg (0 °C) acetonnal kezelünk, ultrahanggal kezelünk, és az oldatot Whatman 1. gravitációs szűrőberendezéssel szűrjük 5 °C hőmérsékleten, mg nyers, detoxikált endotoxin marad szárítás után.

6. PÉLDA — Tisztított, detoxikált endotoxin előállí- 1 tása.

110 g LH-20-100-at (Pharmacia, 25-100 mikron részecskeméret) keverünk össze 600 ml kloroform-metanol 2 : 1 keverékkel, majd az egészet 30 percig állni hagyjuk. Az így nyert zagyot 25 x 1000 mm-es üveg 1 kromatográfiás oszlopba (BRL Laboratories) helyezzük, amelyen nyomáshoz illeszkedő szerelvény található. Amikor az oszlop töltése befejeződött, az oszlopot Teflon nyomásálló csővezeték segítségével ISCO 132 Model szivattyúval kötjük össze. 400 ml kloroform-metanol 4 :1 arányú keveréket szivattyúzunk át az oszlopon 3 ml/perc sebességgel. 100 mg nyers, detoxikált endotoxint, amelyet a 4. példával összhangban állítottunk elő, viszünk fel az oszlopra 2,5 ml kloroform-metanol keverékben, mintavevő hurok segítségével. Az áramlást 1 ml/percre csökkentjük és miutánL 50 ml eluátumot összegyűjtöttünk, a kimenő folyadékáramot frakciógyűjtővel kapcsoljuk össze. 4 ml-cs frakciókat szedünk és a tisztított, detoxikált endotoxin frakciókat a frakciók vékonyréteg-kromatográfiás analízisével határozzuk meg (E.Merck,0,25 mm / vastag, futtató: kloroform-metanol-víz-ammónium-hidroxid 50 :25 :4:2).

A tisztított, detoxikált endotoxin frakciókat egyesítjük és az oldószert bepárlással eltávolítjuk, így 30 mg tisztított, detoxikált endotoxin marad fehér porként. í

7. PÉLDA - Tisztított, detoxikált endotoxin előállítása.

g DEAE-cellulózt (Whatman DE—32) szuszpendálunk 150 ml jégecetben és csendesen rázzuk 10 percen át, zagy-szerű port nyerve. A keveréket egy éjszakára félretesszük.

A zagyot ezután 25 x 400 mm-es oszlopba öntjük, a csap nyltogatásával hagyjuk ülepedni, és a felesleges savat ezután lecsapoljuk. Az oszlopot 2000 ml metanollal, majd 200 ml kloroform-metanol 4 :1 keverékkel mossuk. 100 mg nyers, detoxikált endotoxint, amelyet a 4. példával összhangban állítottunk elő, viszünk rá az oszlopra 3 ml kloroform-metanol 4 :1 keverékben vagy kloroform-metanol-víz 80 :20 :1 keverékben. Az oszlopot 350 klorofonn-metanol 4 :1 keverékkel, majd 300 mlmetanol-víz 99 :1 keverékkel eluáljuk. Lineáris grádienst létrehozó készüléket használva az oszlopot 2000 ml lineáris gradienssel eluáljuk, 100 % metanollal kezdve,és 0,2 mól/liter metanolos ecetsav oldattal fejezve be. Az oszlopot 6 ml/perc sebességgel eluáljuk és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk. Minden második frakciót analizálunk teljes foszfor-tartalomra Bartlett, G. R. eljárása szerint [Bioi. Chem. 234, 466-471 (1959)]. A frakciókat összegyűjtjük és forgó bepárlóban bepároljuk közel száraz állapotig, majd 10 ml kloroform-metanol 2 :1 keverékben és 40 ml 0,001 mólos ecetsav-oldatban felvesszük választó tölcsérben. Az alsó réteget elkülönítjük, Whatman 2. szűrőpapíron átszűrjük és szárazra pároljuk, 19,2 mg tisztított, detoxikált endotoxint nyerve.

8. PÉLDA db 8-10 hetes nőstény C3HeBFeJ egeret injekciózunk intraperitoneálisan 10⁵ petefészek teratokarcinoma sejttel. 24 óra múlva 5 egeret injekciózunk egyszer 5 0,2-0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 50 mikrogramm TDE-t tartalmaz, és 6 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 300 mikrogramm PK-t és 50 mikrogramm TDE-t tartalmaz. Végül 12 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml só-oldatq tál, ez a kontrol-csoport. 21 nap után az 5 db TDE-vel injekciózott egérből 4 a tumor teljes visszafejlődését mutatja, és a 6 db TDE-vel és PK-val injekciózott egérből 6 db mutatja ugyanezt az eredményt. Másrészt viszont a kontrol-csoport 12 egeréből 10 elpusztul a 21. napig, 5 és a maradék kettő is a rákos sejtek jelenlétének bizonyítékait mutatja.

9. PÉLDA db 8—10 hetes nőstény C3HEJ egeret injekciózunk q 10⁵ petefészek teratokarcinoma sejttel. 24 óra múlva 15 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 1400 mikrogramm PK-t tartalrraz, és 15 egeret injeksiózunk egyszer 0,2-X),5 ml izotóniás só-oldattal, amely 300 mikrogramm PK-t és 50 5 mikrogramm TDE-t tartalmaz. Végül 15 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml izotóniás só-oldattal, ez a kontrol-csoport. 30 nap után 5 db egér a PK-val injekciózott 15 egérből a tumor visszafejlődését mutatja, és még él. Másrészt 14 db egér a kontrol-csoport 15 ege) réből elpusztul, a megmaradt 1 egér viszont a tumor vi iszafejlődését mutatja.

Claims

1. Eljárás tumor-gátló hatású gyógyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy

- valamely mikroorganizmusból piridinnel kivonatot készítünk,

- valamely bakteriális endotoxinból extraktumot készítünk, — előnyösen metanol-kloroform-eleggyel -,az extraktumot savval kezeljük, majd a zsírsavakat egy, a zsírsavakat oldó, de az endotoxint nem oldó oldószerrel előnyösen acetonnal — kivonjuk, és a maradékot kromatográfiásan tisztítjuk, így tisztított, kimutatható mennyiségű 2-keto-3-dezoxi-oktanoátot nem tartalmazó, 375-475 runól/mg foszfort és 1700-2000 nmól/ ing zsírsavat tartalmazó, detoxikált endotoxint kapunk,

- a piridin-oldható kivonatot' és a tisztított·, detoxikált endotoxin hatásos mennyiségét 1 :1 és 100 :1 közötti arányban összekeverjük, és gyógyászatilag alkalmas hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati kompozícióvá alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztított piridin-oldható kivonatként M. bovis BCG-ből, M. phlei-ből, M. smegmafisból, M. kansasii-ból, Nocardia rubra-ból, Nocardia asteroidesből, Propionibacterium acnes II. típusból vagy Corynebacterium parvumból nyert kivonatot alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tisztított piridin-oldható kivonatként olyan kivonatot alkalmazunk, amely 3-20 tömeg % fehérjét

-5192 585

10—40 tömeg % cukrot és 35—60 tömeg % zsírsavat tartalmaz.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piridin-oldható kivonat 50-5000 jug-jával a tisztított, detoxikált endotoxin 5—1000 pg-ját keverjük.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gyógyhatású kompozíció egyes alkotórészeit liofrlezett formában keverjük össze.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóként fiziológiás só-oldatot alkalmazunk.

7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóként olajcseppecske-emulzió formát alkalmazunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az olajcseppecske-enrulzióban könnyű ásványolajat, szkvalént vagy 7-n-hexil-oktadekánt alkalmazunk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, 5 hogy az olajcseppecske-emulzióban a kompozíció teljes térfogatára számítva 0,5-3,0 térfogat % olajat alkalmazunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóként olyan hor10 dozót alkalmazunk, amely az olajcseppecske-emulzió mellett a kompozíció teljes térfogatára számítva 0,02-0,25 térfogat % detergenst is tartalmaz.