NL8402902A - In pyridine oplosbaar extrakt - geraffineerd ontgift endotoxinesamenstelling en gebruik ervan. - Google Patents

Description

- 1 - «Sr. »

In pyridine oplosbaar extrakt - geraffineerd ontgift endotoxine— samenstelling en gebruik ervan.

De uitvinding beeft betrekking op een farmaceutische 5 samenstelling, die geraffineerd ontgift endotoxine (KDE). in combinatie met een in pyridine oplosbaar extrakt van een micro-organisme (PE) bevat. Het SDE gebruikt bij de onderhavige samenstelling wordt gekenmerkt doordat het geen opspoorbaar 2-keto 3-desoxyoctanaat heeft, tussen ongeveer 350-475 nmol per 10 mg fosfor en tussen ongeveer 1700-2000 nmol per mg vetzuren. Het PE bevat tussen ongeveer 3-20 gew.% proteïne, ongeveer 10-40 gev.% suiker, en ongeveer 35-60 gew.% vetzuren. De samenstelling is effektief voor het tegengaan en/of onderdrukken van kankerachtige tumoren in warmbloedige dieren.

15 Bacteriën zoals Corynebacterium parvum zijn het onderwerp geweest van experimenteel werk om de component, die verantwoordelijk is voor het induceren van de inhibitie van tumorgroei te isoleren en te karakteriseren (zie bijvoorbeeld Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties 20 of Fractions Isolated from C. parvum; Cantrell, c.s., Cancer Research 39, biz. 3554-3563 (september, 1979)). Afgezien van de antitumoraktiviteit is C. parvum een potente stimulator van het lymforeticulaire systeem leidende tot ongewenste toenames in milt en lever gewichten en blastogenese. Gevonden werd, 25 dat een in pyridine oplosbaar extrakt van een microorganism®, zoals C. parvum., potente antitumoreigenschappen bezit zonder de ongewenste toxische effekten die samengaan met de tot nog gebruikte produkten.

Endotoxische extrakten verkregen uit Enterobacteriaceae 30 waaronder moederorganismen en mutanten zijn bekend. Deze extrakten zijn gebruikt voor immunotherapie van verschillende immunogene tumoren (zie Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi, c.s., Cancer Immunol. Immunother. deel 7, biz. 43-58 (1979)). Het is echter I

35 bekend dat de endotoxineextrakten zeer giftig zijn en daarom van 84 0 2 9 0 2 l . if - 2 - beperkte toepassing bij de behandeling van kankerachtige tumoren. Er zijn pogingen gedaan om de endotoxines te "ontgiften", onder behoud van het tumorterugdrukkend vermogen daarvan. Zoals blijkt uit bovengenoemde literatuur hebben chemische procedures, die 5 bekend zijn ter ontgifting van endotoxines, onder behoud van.het aanhechtingsvermogen van groepen, zoals succinylering en ftaly-lering, geleid tot zowel, verlies van endotoxiciteit als tumor-terugdringvermogen. De tot nog toe gedane pogingen om een endo-toxineprodukt te verkrijgen met een hoog tumorterugdrukkend 10 vermogen en weinig of geen giftigheid zijn tot nog niet niet met succes bekroond.

Het is daarom een doel van de uitvinding te voorzien in een farmaceutische samenstelling, die een in pyridine oplosbaar extrakt bevat van een microorganisme in combinatie met 15 een geraffineerd ontgift endotoxine.

Het is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een werkwijze voor het behandelen van tumoren in warmbloedige dieren en mensen onder toepassing van het preparaat, dat het 4 in pyridine oplosbare extrakt bevat van een microorganisme en 20 het geraffineerde ontgifte endotoxine.

Het in pyridine oplosbare extrakt van een microorganisme (PE).

Het PE bevat tussen ongeveer 3-20 gew.% proteïne, 25 ongeveer 10-40 gew.% suiker, en ongeveer 35-60 gew.% vetzuren in combinatie met C. parvum hele cellen, en bevat bij voorkeur ongeveer 5 gew.% proteïne, ongeveer 35 gew.% suiker en ongeveer 55 gew.% vetzuren.

Zoals hier gebruikt, is er geen beperking met betrek-30 king tot het gebruik van een suiker; alle suikers kunnen worden gebruikt. Hetzelfde geldt met betrekking tot vetzuren; er is geen beperking met betrekking tot de vetzuren, die kunnen worden gebruikt.

Het proteïne bevat aminozuren en ammoniak en onder 35 de aminozuren vallen bijvoorbeeld de volgende; er werd bij deze Λ 8402902 ' ψ· -¾ - 3 - bepalingen een Beekman aminozuuranalysator gebruikt:

Asparginine 0,273

Threonine 0,108 5 Serine 0,585

Muraminezuur 0,219

Glutaminezuur 0,267

Glycine 0,39

Alanine 0,173 10 D iaminop ime linezuur 0,444

Isoleucine 0,121

Leucine 0,167

Fenylalanine 0,034

Histadine 0,088 15 Lysine 0,544 en

Ammoniak 0,524

De hoeveelheden zijn uitgedrukt in gew.% en het to tale proteine is 6,34 gew.%.

20 Men kan elk microorganisme gebruiken om het in pyridine oplosbare extrakt te vormen, waaronder bijvoorbeeld M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium acnes Type II, en Gorynebacterium parvum. Corynebacterium parvum en Proprioni-25 bacterium acnes Type II verdienen in het bijzonder de voorkeur.

Hele cellen van het microorganisme, in het bijzonder in de vorm van een pasta, worden gemengd met pyridine. Het verkregen mengsel wordt gescheiden ter verkrijging van een bovenstaande fraktie, die het in pyridine oplosbare extrakt bevat 30 en een pyridineresidu. Eventueel kan men het pyridineresidu onderwerpen aan herhaalde scheidingsprocedures als boven beschreven onder toepassing van pyridine om verdere hoeveelheden van het gewenste extrakt te verwijderen.

Men verwijdert het pyridine dan uit het extrakt en 35 dialyseert het gedroogde extrakt tegen een geschikte vloeistof, \ 84 0 2 902

Sr Φ - 4 - zoals gedestilleerd water. De afwezigheid, van hele cellen of celfragmentverontreinigingen wordt bevestigd door elektronen-microscopie. Het verkregen gezuiverde extrakt kan dan worden ge-lyofiliseerd op bekende wijzen ter verkrijging van een stabiel produkt.

Het in pyridine oplosbare extrakt geproduceerd volgens de uitvinding wordt gecombineerd met EDE om een samenstelling te verkrijgen met een krachtige anti tumor aktivit ei t zonder stimulering van de inductie van milt- en leververgro-tingen. Wanneer men het in pyridine oplosbare extrakt suspendeert in water, kan de suspensie worden gescheiden in een water oplosbare en een niet in water oplosbare fraktie. Het in water oplosbare extrakt is zeer gewenst, daar het gemakkelijk parenteraal kan worden geinjekteerd, terwijl tegelijkertijd de antitumotaktiviteit van het pyridineextrakt behouden blijft.

De tumoren die behandeld kunnen worden met deze samenstelling zijn onder andere dierlijke tumoren, zoals geschubde celcarcinoom bij vee, veefibrosarcoom, paardsarcóide, paardmelanoom, geschubde celcarcinoom bij paard, melkkliertumoren bij de hond, hondadenoom en hondmelanoom en menselijke tumoren, zoals borstkanker, longkanker, ruggemergkanker, kwaadaardige melanoom, geschubde cel-carcinomen, eileidertumoren, baarmoedertumoren, blaas- en hoofden nektumoren.

Het geraffineerde ontgifte endotoxine (EDE)

Endotoxineextrakten van het type gebruikt als uitgangsmateriaal om EDE te produceren, kunnen worden verkregen uit elke enterobacteriacae, waaronder moederorganismen en mutanten. Bij wijze van voorbeeld zijn de volgende stammen illustratief voor het type mieroorganisme, dat kan worden gebruikt: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella en Serratia.

De volgende species worden typisch gebruikt: 8402902 ψ ^....

- 5 - S. Ttiirmesota, S. typhiimirium, B. pertussis, B. abortus, S^. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marceseens, S. typhosa,

Shigella flexni, en S. abortus eqttx.

De endotoxische extrakten gebruikt als uitgangs-5 materiaal kunnen worden bereid op elk van de verscheidene bekende methodes (zie bijvoorbeeld) 1) Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M., en Johnson, A.G., J. Immunol. 1955, 744, 55.

2) Westphal, 0., Luderitz, 0., en Bister, F., Z.

1Ö Naturforsch, 76 148 (1952).

3) Westphal, 0., Fyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F.

Springer, ed.), Madison, N.J. Madison printing Co., 1957, 115.

15 4) Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur

Biochem, 9 245 (1969) 5) Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A.,

Levin, J.» Nowotny, A., J. Infect. Dis 128 543 (1973) 20 6) Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961) 7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1965) 25 8) Ribi, E., Milner, K.C., and Perrine, T., J.

Tmmunol. 82 75 (1959).

De voorkeursmethode ter verkrijging van het endo-toxineextrakt is die geopenbaard door Chen c.s., namelijk neer-30 slaan met methanol-chloroform.

Het methanol-chloroformneerslag (MCP) laat men dan reageren met een organisch of anorganisch zuur en lyofiliseert dan ter verkrijging van een gehydrolyseerd ruw lipide A met afgenomen giftigheid en pyrogeniteit in vergelijking met het 35 uitgangsendotoxinemateriaal. Men behandelt dit materiaal dan met 34 0 2 S 0 2 - 6 - een oplosmiddel, dat in staat is om specifiek vetzuren en andere verontreinigingen op te lossen zonder het ruwe lipide A op te lossen. Het fosfaatgëhalte van het ontgifte, geraffineerde lipide Δ is ongeveer de helft van dat waargenomen voor toxisch 5 endotoxine, hetgeen suggereert dat het sulfaatgehalte verband houdt met de giftigheidseffekten van. endotoxines.

De voorkeurs anorganische zuren gebruikt om te reageren met MCP zijn zoutzuur, zwavelzuur of fosforzuur en de voorkeurs organische zuren zijn tolueensulfonzuur of trichloor-10 azijnzuur. De reaktie kan geschikt worden uitgevoerd bij een temperatuur tussen ongeveer 90-130° G gedurende voldoende tijd om de hydrolyse te voltooien, gewoonlijk tussen ongeveer 15-60 minuten.

De bereiding van ruw ontgift endotoxine kan geschie-15 den door het uitgangsmateriaal te laten reageren met het zuur in aanwezigheid van een organisch oplosmiddel, zoals- chloroform, methanol en ethanol of combinaties ervan.

Men suspendeert het verkregen ruwe lipide A in aceton, wat het voorkeursoplosmiddel is voor het oplossen van 20 de vetzuren en andere verontreinigingen. Men verwijdert het oplosmiddel dan om ruw ontgift endotoxine te verkrijgen.

Het ruwe ontgifte endotoxine lost men dan op in een oplosmiddel en voert de oplossing door een geschikte chroma-tografiekolom, zoals een molekulaire exclusie ehromatografiekolom 25 om de RDE frakties af te scheiden, die dan worden gecombineerd na verwijdering van het oplosmiddel, De ruwe ontgifte endo-toxineoplossing wordt door een Sephadex kolom gevoerd in aanwezigheid van een oplosmiddel , zoals chloroform, methanol, aceton, pyridine, ether of azijnzuur of combinaties daarvan.

30 De druk van de kolom kan variëren, maar ligt typisch in het trajekt tussen ongeveer atmosferische druk en 0,7 MPa en de stroomsnelheid tussen 0,1-10 ml/min.

De ruwe ontgifte endotoxineoplossing kan worden gevoerd door een DEAE-cellulosekolom onder dezelfde drukomstandig-35 heden als boven vermeld voor de Sephadex kolom. De stroomsnelheid 8402902 ε ν - 7 - wordt gehandhaafd tussen 2-15 ml/min. De gebruikte oplosmiddelen zijn ook dezelfde als gebruikt voor de Sephadex kolom, hoewel water en/of diethylamine kunnen worden toegevoegd aan alle mengsels in een concentratie tot maximaal ongeveer 1 %.

5 Andere methodes ter bereiding van EDE uit ruw ontgift endotoxine zijn onder andere het roeren van de oplossing door een lagedruk silicagel 60 kolom met een deeltjesaf meting tussen ongeveer 25-63 micron en onder toepassing van een oplosmiddel, bestaande uit chloroform, methanol, water en ammonium-10 hydroxyde. De voorkeursvolumeverhouding van de componenten van het oplosmiddel is ongeveer 50:25:4:2.

Het geraffineerde ontgifte endotoxine (EDE) heeft . geen opspoorbaar 2-keto 3-desoxyoctanoaat, tussen ongeveer 350-475 nmol/mg fosfor en tussen ongeveer 1700-2000 nmol/mg vetzuur.

15 De samenstelling wordt toegediend door injektie in een farmaceutisch aanvaardbaar medium, zoals een oliedruppel-tjesemulsie of een fysiologische zoutoplossing en wordt bij voorkeur toegediend direkt in de tumor onder omstandigheden, die meer in het bijzonder hieronder worden beschreven. De toe-20 diening kan zijn door IV-injektie of door IV-infusie.

De samenstelling kan worden gestabiliseerd, zo'als bijvoorbeeld door een lyofiliseringsprocedure en daarna gere-constitueerd zonder verlies van potentie.

De hoeveelheid EDE in een enkelvoudige injektie 25 voor behandeling van dieren ligt tussen ongeveer 25-500 micro- j gram/ml, geschikt tussen 50-100 microgram/ml en de hoeveelheid j i PE tussen ongeveer 25-500 en geschikt tussen ongeveer 100-250 microgram/ml.

Het aantal milliliters van de biologische stof 30 geinjekteerd in de tumor wordt bepaald door de afmeting van de tumor in overeenstemming met de volgende tabel: dosering aan dieren naar de tumorafmeting 35 * 8402902 i·.. κ - 8 -

Diameter van de tumor Hoeveelheid geinjekteerde biolo- _(cm)_gische stof_(ml)_ 0- 1 tot 0,5 1- 2 0,5 tot 2,5 2- 3 2,5 tot 5 3- 5 5 tot 10 5-8 10 tot 15 >8 15 tot 20 10

De maximumdosis per injektie is ongeveer 10 ml EDE en ongeveer 25 van PE. De loop van de behandeling bestaat uit 4-10 injekties toegediend met tussenpozen van ongeveer 2 weken.

De onderhavige samenstelling in een geschikt injektie-^ medium, zoals fysiologische zoutoplossing wordt direkt toegediend aan menselijke tumoren. De hoeveelheid RDE in een enkelvoudige injektie ligtrtussen 5-1000 microgram, geschikt tussen 25-500 microgram.' De hoeveelheid PE ligt tussen 50-5000 microgram, geschikt tussen ongeveer 700-3000 microgram. Het voorkeurs-2Q doseringsniveau voor RDE is ongeveer 100 microgram en voor PE ongeveer 1000 microgram. Alle bovengenoemde doseringsniveau's zijn gebaseerd op een typische volwassen patient van 70 kg. De injekties worden toegediend ongeveer eenmaal per week tot in totaal 15 injekties.

22 Zoals boven vermeld kan men de samenstelling ter behandeling van warmbloedige dieren en mensen gebruiken in de vorm van een zoutoplossing of een oliedruppeltjesemulsie. De hoeveelheid gebruikte olie ligt in een trajekt tussen ongeveer 0,5-10,0 vol.% op basis van het totale volume van de samenstel-2Q ling. Het verdient de voorkeur tussen ongeveer 0,75-1,5 vol.% van de olie te gebruiken. Voorbeelden van dergelijke oliën zijn onder andere lichte minerale olie, squalaan, 7-n-hexyloctadecaan, Conoco superolie en Drakeol 6 VE minerale olie (geproduceerd door de Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

22 Het gehomogeniseerde oliebevattende mengsel wordt * 8402902 - 9 - dan gecombineerd met een detergent, dat eventueel kan worden opgelost in een zoutoplossing alvorens te mengen. De hoeveelheid detergent ligt typisch tussen 0,02-0,20 vol.Z en bij voorkeur tussen ongeveer 0,10-0,20 vol.% op basis van het totale voltime 5 van de samenstelling. Men kan elk gewoon detergentmateriaal gebruiken waaronder Tween-80 en Arlacel (geproduceerd door de Atlas Chemical Company).

Het mengsel dat men krijgt na toevoeging van detergent homogeniseert men dan om een suspensie te vormen, die 10 een hoog percentage oliedruppeltjes heeft, bekleed met de aktie-ve componenten zoals bepaald door observatie onder een microscoop.

De volgende voorbeelden dienen slechts ter illustratie en zijn niet bedoeld om de uitvinding op enige wijze 15 te beperken.

Voorbeeld I - Bereiding van in pyridine oplosbaar extrakt uit Proprioxfeacterium acnes Type TI (stam VPI 0204)

20 , Men laat Proprionibacterium acnes Type II (stam VPI

0204) groeien en oogst bij 37° C in NIH thioglycolaat kweek-vloeistof gedurende 48-72 uur ter verkrijging van een pasta met hele cellen. Men wast de pasta dan met 500 ml gedestilleerd water. Men mengt 90 g (nat gewicht) van de gewassen pasta met 25 200 ml zuivere pyridine en centrifugeert bij 1700 g gedurende 1 uur bij 4° C. Men verwijdert een in pyridine oplosbaar extrakt als een bovendrijvende fraktie. Men extraheert het resterende residu met verdere pyridine onder identieke omstandigheden als hierboven beschreven. Na filtratie over Whatman no. 1 30 papier voegt men de pyridineextrakten samen en verwijdert het oplosmiddel door verdamping bij 50° C in een Buchi Rotavapor (Brinkmann Instruments, Westbury, New York). Het gedroogde pyridineextrakt wordt extensief gedialyseerd tegen gedestilleerd water en daarna gelyofiliseerd. Het verkregen gezuiverde pyridine-35 extrakt bevat ongeveer 5 gew.% proteïne, ongeveer 35 gew.% suiker 84 0 29 02 i

J *- 'V

-10- en ongeveer 55 gew.% vetzuren. Men onderzoekt het extrakt onder een elektronenmicroscoop en het blijkt vrij te zijn van verontreinigende hele cellen en celwandfragmenten. De opbrengst aan in pyridine oplosbaar extrakt is 9 % (8,1 g).

5

Voorbeeld ΊΙ - Bereiding van in pyridine oplosbaar extrakt 'uit M. bovis. Stam B.CG

Met laat M. bovis stam BCG groeien en oogst in 10 Sautons medium hij 37° C tussen 3-4 weken ter verkrijging van een gewassen hele celpasta. Men behandelt 50 g (nat gewicht) van de gewassen pasta dan op dezelfde wijze als in voorbeeld I ter verkrijging van een opbrengst aan in pyridine oplosbaar extrakt van 7 % (3,5 g). Het extrakt bevat 15 gew.% proteïne, 15 10 gew.% suiker en 52 gew.% vetzuren.

Voorbeeld III - Bereiding van waterig extrakt

Men soniceert 500 mg pyridineextrakt in 100 ml 20 gedestilleerd water gedurende 15-30 minuten. Men centrifugeert de verkregen suspensie bij 12000 omw/min in een RC2B centrifuge bij 4° C gedurende 40 minuten. Men decanteert de bovenstaande vloeistof af en bewaart deze. Men extraheert het residu nog tweemaal als hierboven. Men combineert de bovenstaande vloei-25 stoffen in een lyofiliseringsfles, schaalvriest en lyofiliseert. Opbrengst 230 mg (46 %).

Voorbeeld IV - Bereiding van ruw ontgift endotoxine 30 Men suspendeert een monster van 650 mg van een methanol-chloroformneerslag verkregen volgens de werkwijze van Chen, e.s., J. Infect. Dis. 128 543 (1973) in 150 ml 0,1 N HC1 in een driehalsrondkolf voorzien van een condensor en ondergedompeld in een soniceerapparaat. Na sonicering laat men de glas-35 apparatuur dan zakken in een oliebad, dat op 120° C wordt gehouden, ï 84 0 2 9 0 2 -11- waardoor de inwendige temperatuur van de kolf het kookpunt van de oplossing benadert of overschrijdt. Oververhitting van de oplossing wordt geminiseerd door de kolf te voorzien van een capillaire buis, die verbonden is met een stikstofgasbron via 5 een van de halzen. Men handhaaft een continue stroom stikstof gedurende de hydrolyseprocedure..

Men zet de hydrolyse nog gedurende 30 minuten voort en koelt de oplossing dan in een ijsbad, soniceert om het vaste materiaal te dispergeren en verdeelt in corex buizen. Men wast 10 de kolf met gedestilleerd water om alle vaste materiaal te verwijderen, dat aan de zijkanten van de kolf kleeft, en voegt de wasvloeistof toe aan de suspensie in de corex buizen. Men voert het centrifugeren uit bij 12000 omw/min gedurende 80 minuten. Men decanteert de bovenstaande vloeistof af en werpt deze 15 weg. Men suspendeert het vaste residu weer in gedestilleerd water, soniceert totdat de suspensie goed gedispergeerd is en centrifugeert weer. Men herhaalt het centrifugeringsproces dan.

Men neemt het residu op in gedestilleerd water, sehaalvri.es !

en lyofiliseert en verkrijgt 382 mg ruw lipide A. Men behandelt I

20 150 mg van dit materiaal met koude (0° C) ace ton om vetzuren j te verwijderen, soniceert en filtreert door een Whatman no. 1 zwaartekrachtsfiltratieapparaat bij 5° C. Er blijven 100 11¾ ruw ontgift endotoxine achter na droging.

25 Voorbeeld V - Bereiding van ruw ontgift endotoxine

Men suspendeert een monster van I2Q mg MCP (methanol-chloroformneerslag) in 12 ml absolute methanol, soniceert om vaste materialen te dispergeren en verdeelt in zes buizen van 30 1 x 10 cm met schroef dop. Men voegt 2 ml 0,2 N zoutzuur toe aan elke buis en incubeert de verkregen suspensie in een kokend waterbad gedurende 45 minuten. Na hydrolyse koelt men de buizen in een ijswaterbad en centrifugeert gedurende ongeveer 10 minuten bij 2500 omw/min. Men decanteert de bovenstaande vloeistof af 35 en voegt 5 ml van een 2:1 chloroform/methanolmengsel toe aan het 84 0 2 902 ·-*· -12- residu om oplossing te bewerkstelligen. Men voegt 2 ml water toe per buis en mengt de oplossing. Men centrifugeert de twee-fasige oplossing weer bij 2500 omw/min gedurende 10 minuten.

Men werpt de bovenstaande waterfase weg en voegt 1 ml toe van 5 een 4:1 chloroform/methanolmengsel aan elke buis, hetgeen leidt tot een heldere oplossing. Men voegt de oplossingen samen en verdampt het oplosmiddel op een roterende verdamper. Men droogt het residu in hoog vacuum en lyofiliseert ter verkrijging van 45 mg ruw lipide Δ. Men behandelt 20 mg. van dit materiaal met 10 koude (0° C) aceton, soniceert en filtreert door een Whatman no.

3 zwaartekrachtsfiltratieapparaat bij 5° C. Er blijven 13 mg ruw ontgift endotoxine achter na droging.

Voorbeeld VI - Bereiding van geraffineerd ontgift endotoxine 15

Men combineert 110 g LH-20-100 (25-100 micron deeltjes-afmeting Pharmacia) met 600 ml van een 2:1 chloroform/methanolmengsel, en laat 30 minuten staan. Men voegt, de verkregen brij toe aan een 25 x 1000 mm glazen chromatografiekolom (BEL 20 Laboratories) voorzien van drukfittingen. Nadat de pakking voltooid is, verbindt men de kolom door middel van Teflon druk-huizen aan een ISCO Model 230 pomp. Men pompt 400 ml van een 4:1 chloroform/methanolmengsel door de kolom met een snelheid van 3 ml/min. Men brengt 100 mg ruw ontgift endotoxine, bereid 25 volgens voorbeeld IV, in de kolom in 2,5 ml van een 4:1 chloroform/ methanolmengsel via een monsterlus. Men laat de stroom afnemen tot 1 ml/min en nadat men 150 ml elutie heeft verzameld, verbindt men de uitstromende vloeistof met een fraktieverzamelaar. Men verzamelt 4 ml frakties en de geraffineerde ontgifte endotoxine-30 frakties worden bepaald door dunne laag chromotagrafische analyse van de frakties (E. Merck, 0,25 mm dik, chloroform/methanol/ H2Q/NH40H (50:25:4:2) als elutiemiddel).

Men combineert de geraffineerde ontgifte endotoxine-frakties en verdampt het oplosmiddel, waarbij 30 mg geraffineerd 35 ontgift endotoxine achterblijft als een wit poeder.

8402902 -13-

Voorbeeld VIX - Bereiding van geraffineerd ontgift endotoxine

Men suspendeert 33 g DEAE-cellulose (Whatman DE-32) in 150 ml ijsazijn en roert zachtjes gedurende 10 minuten ter 5 verkrijging van een poederbrij. Men zet het mengsel opzij gedurende de nacht.

Men giet de brij in een 25 x 400 ml kolom, laat af zetten onder aftapping, en laat de overmaat zuur daarna uitdruipen. Men wast de kolom met 2000 ml methanol gevolgd door 10 200 ml van een 4:1 chloroform/methanolmengsel. Men voegt een 100 mg monster ruw ontgift endotoxine, verkregen volgens voorbeeld IV, toe aan de kolom in 3 ml van een 4:1 chlorof orm/methanolmengsel of een 80:20:1 mengsel van chloroform, methanol en water. Men elueert de kolom met 350 ml van een 4:1 chloroform/ 15 methanolmengsel gevolgd door 300 ml van een 9S:I methanol/water-mengsel. Onder toepassing van een lineaire gradient inrichting, elueert men de kolom met 2000 ml van een lineaire gradient uitgaande van 100 Z methanol en eindigende met 0,2 N azijnzuur in methanol. Men elueert de kolom met een snelheid van 6 ml/min 20 en verzamelt 15 ml frakties. Elke andere fraktie wordt geanalyseerd op totaal fosforgehalte volgens de procedure van Bartlett, G.R., £. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959). De frakties worden samengevoegd en verdampt op een roterende verdamper tot praktisch droog en opgenomen in 10 ml van een 2:1 chloroform/ 25 methanolmengsel en 40 ml 0,001 N azijnzuur in een schei trechter.

Men scheidt de onderste laag af, filtreert door Whatman no.

2 filter papier en dampt droog ter verkrijging van 19,2 mg geraffineerd ontgift endotoxine.

30 Voorbeeld VIII

Men injekteert 23 8—10 weken oude vrouwelijke 5 C3HeBFeJ muizen intraperitoneaal met 10 eileider teratocarcinoom-cellen. Na 24 uur injekteert men 5 muizen eenmaal met 0,2-0,5 ml 35 van een isotonische zoutoplossing, die 50 microgram KDE bevat en Λ 8402902 -14- injekteert 6 muizen eenmaal met 0,2-0,5 ml van dezelfde oplossing, die 300 microgram PE en 50 microgram RDE bevat. Tenslotte injekteert men 12 muizen eenmaal met 0,2-0,.5 ml van de zoutoplossing als een blanco. Na 21 dagen vertonen 4 van de 5 met 5 RDE geinjekteerde muizen volledige terugdringing van de tumor en 6 uit 6 van de met RDE en PE geinjekteerde muizen vertonen dergelijke resultaten. Anderzijds stierven 10-12 muizen van Q.

de blanco groep op de 21 dag en de resterende 2 vertoonden nog steeds bewijs van de kankercellen.

10

Voorbeeld IX

weken

Men injekteert 45 8-10/oude vrouwelijke C3HEJ

muizen met 10^ eileider teratocarcinoom. Na 24 uur injekteert 15 men 15 van de muizen eenmaal met 0,2-0,5 ml van een isotonische zoutoplossing, die 1400 microgram PE bevat en injekteert 15 van de muizen eenmaal met 0,2-0,5 ml van de zoutoplossing, die 300 microgram PE en 50 microgram RDE bevat. Tenslotte injekteert men 15.,muizen eenmaal met 0,2-0,5 ml van de zoutoplossing als

20 een blanco. Na 30 dagen leven nog steeds 5 van de 15 met PE

geinjekteerde muizen en 8 van de 15 met RDE en PE geinjekteerde vertoonden muizen/tumoronderdrukking en leefden nog steeds. Anderzijds stierven 14 van de 15 muizen van de blanco groep terwijl de resterende muis tumorteruggang vertoonde.

25 84 0 2 9 0 2 \

Claims (14)

1. Preparaat, met het kenmerk, dat dit een therapeutisch effektieve hoeveelheid bevat van (a) een gezuiverd in pyridine oplosbaar extrakt verkregen uit een mieroorganisme, welk extrakt tussen ongeveer 5 7-20 gew.% proteïne, tussen ongeveer 10-16 gew.% suiker en tussen ongeveer 35-55 gew.% vetzuren bevat, (b) geraffineerd ontgift endotoxine met geen opspoorbaar 2-keto 3-desoxyoctanoaat erin en met tussen 375-475 nmol/mg fosfor en tussen 1700-2000 nmol/mg vetzuren; en 10 (c) een farmaceutisch aanvaardbare drager. j

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, j j dat het microorganisme M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, ! M. kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium ! acnes Type II, en Corynebacterium parvum is.

3. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat genoemd microorganisme Corynebacterium parvum is.

4. Preparaat volgens conclusie I of 2, met het kenmerk, dat genoemd microorganisme Proprionibacterium 20 acnes Type II is.

5. Preparaat volgens conclusie 1-4, met het kenmerk, dat genoemd extrakt ongeveer 12 gew.% bevat van zowel proteine als suiker en ongeveer 45 gew.% vetzuren.

6. Preparaat volgens conclusie 1-5, 25 met het kenmerk, dat de verhouding van genoemd extrakt tot genoemd geraffineerd ontgift endotoxine van 1:1 tot 100:1 bedraagt.

7. Preparaat volgens conclusie 1-6, met het kenmerk, dat de hoeveelheid van genoemd extrakt tussen ongeveer 50-500 microgram ligt en de hoeveelheid van genoemd ge-30 raffineerd ontgift endotoxine tussen ongeveer 5-1000 microgram.

8. Preparaat volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de hoeveelheid van genoemd extrakt ongeveer 500 microgram is en de hoeveelheid van genoemd geraffineerd ontgift endotoxine 84 02 9 0 2 -16- ί ongeveer 100 microgram.

9. Preparaat volgens conclusie 1-8» met het kenmerk» dat dit in gelyofiliseerde vorm is.

10. Preparaat volgens conclusie 1-8, 5 met het kenmerk, dat genoemde drager een fysiologische zoutoplossing is.

11. Preparaat volgens conclusie 1-9, met het kenmerk, dat dit in de vorm van een oliedruppeltjes-emulsie is.

12. Preparaat volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat genoemde olie een lichte minerale olie, squalaan of 7-n-hexyloctadecaan is.

13. Preparaat volgens conclusie 11 of 12, met het kenmerk, dat genoemde olie aanwezig is in een hoeveel-15 heid tussen ongeveer 0,5-3,0 vol.% op basis van het totale volume van het preparaat.

14. Preparaat volgens conclusie 11-13, met het kenmerk, dat dit verder nog een detergent bevat in een hoeveelheid tussen 0,02-0,25 vol.% op basis van het totale volume 20 van het preparaat. * I 8402902