NO843776L - Fremgangsmaate ved fremstilling av et terapeutisk virksomt ekstrakt. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk blanding bestående av renset, detoksifisert endotoksin (RDE) i kombinasjon med et pyridinløselig ekstrakt av en mikroorganisme (PE). RDE som benyttes i foreliggende blanding erkarakterisert vedat ingen påviselig 2-keto-3-deoksyoktano-at forefinnes, og at den har mellom 350 og 475 nmol/mg fosfor og mellom 1700 og 2000 nmol/mg fettsyrer. PE inneholder mellom ca. 3 og 20 vekt-% protein, ca. 10-40 vekt-% sukker og ca. 35-60 vekt-% fettsyrer. Blandingen er virksom for å oppnå remisjon og/eller regresjon av krefttumorer i varmblodige dyr.

Bakterier, såsom Corynebacterium parvum har vært tema for eksperimentelt arbeid for å isolere og karakterisere bestanddelen som fremkaller en hemming av tumorveksten (se f.eks. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated form C. parvum; Cantrell, et al. Cancer Research 39, sidene 3554-3563 (September 1979)). Bortsett fra antitumoraktiviteten er C. parvum en kraftig stimulator av lymfenettsystemet, noe som resulterer i uønskede økninger i milt- og levervekt og blastogenese. Man har oppdaget at et pyridinløselig ekstrakt av en mikroorganisme, såsom C. parvum, har sterke antitumoregenskaper uten de uønskede giftige effekter tilknyttet utgangspro-duktene.

Endotoksiske ekstrakter fra Enterobacteriaciae som inneholder foreldreorganismer og mutanter, er kjente. Disse ekstraktene har vært benyttet til immunoterapi av forskjel-lige immunogeniske tumorer (se Peptides as Reguirement for Immunotherapy of the Guinea- Pig Line- 10 Tumor with Endo-toxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother. bind 7, sidene 43-58 (1979)). Det er likevel kjent at endotoksin-ekstraktene er sterkt giftige og derfor til begrenset benyttelse i behandling av cancerøse tumorer. Det er forsøkt å fjerne giftvirkningen til endotoksinene mens den tumor-regressive virkning bibeholdes. Som vist av Ribi, et al, resulterer kjente kjemiske fremgangsmåter, såsom succinyl- ering og ftalylering, for å fjerne giftvirkning til endotoksiner mens hjelpestoffene bibeholdes, både i tap av endotoksisitet og tumorregressiv kraft. Derfor har til nå, tidligere forsøk på å oppnå et endotoksinprodukt som har en sterk tumorregressiv kraft og liten eller ingen giftvirkning, ikke vært suksessfullt.

Foreliggende oppfinnelses hensikt er derfor å frembringe en farmasøytisk blanding bestående av et pyridinløselig ekstrakt av en mikroorganisme kombinert med et renset, detoksifisert endotoksin.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å frembringe en metode til behandling av tumorer i varmblodige dyr og mennesker ved benyttelse av blandingen bestående av det pyridinløse-lige ekstrakt av en mikroorganisme og det rensede, giftfrie endotoksin.

PE består av ca. 3-20 vekt-% protein, ca. 10-40 vekt-% sukker og ca. 35-60 vekt-% fettsyrer kombinert med C. parvum-celler, og inneholder fortrinnsvis ca. 5 vekt-% protein, ca. 35 vekt-% sukker og ca. 55 vekt-% fettsyrer.

Ved foreliggende benyttelse finnes ingen begrensning med hensyn til bruk av sukker; alle sukkere kan benyttes. Det samme gjelder for fettsyrer; det finnes ingen begrensning med hensyn til hvilke fettsyrer som kan benyttes.

Proteinet består av aminosyrer og ammoniakk, og aminosyrene inkluderer f.eks. de følgende, bestemt av en Beckman amino-syreanalysator:

Mengdene er uttrykt i vekt-% og det samlede protein utgjør 6,34 vekt-%.

Enhver mikroorganisme kan benyttes for å oppnå de pyridin-løselige ekstrakter, innbefattende f.eks. M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Proprionibacterium acnes Type II, og Corynebacterium parvum. Corynebacterium parvum og Proprionibacterium acnes Type II er spesielt foretrukne.

Hele celler av mikroorganismen, fortrinnsvis i deigform, blandes med pyridin. Den resulterende blanding skilles fra for å oppnå en supernatantfraksjon som inneholder det pyri-dinløselige ekstraktet og pyridinbunnfallet. Hvis ønsket kan pyridinbunnfallet utsettes for gjentatte separasjons-prosedyrer som beskrevet ovenfor ved bruk av pyridin for å fjerne ytterligere mengder av det ønskede ekstrakt.

Pyridinet fjernes deretter fra ekstraktet og det tørkede ekstrakt dialyseres mot en egnet væske, såsom destillert vann. Fravær av hele celler eller celledeler som forurens-ning kan bekreftes ved elektronmikroskopi. Det resulterende rensede ekstrakt kan deretter lyofiliseres ved kjente metoder for å oppnå et stabilt produkt.

Det pyridinløselige ekstrakt fremstilt i henhold til denne oppfinnelse kombineres med RDE for å danne en blanding som har en kraftig antitumoraktivitet uten å stimulere at en forstørret milt og lever bevirkes. Hvis det pyridinløselige ekstrakt suspenderes i vann, kan suspensjonen separeres i en vandig løselig og en ikke-løselig fraksjon. Det vannopp- løselige ekstrakt er mest ønskelig, da det med letthet kan injiseres parenteralt, mens det samtidig bibeholder pyri-dinekstraktets antitumoraktivitet. Tumorarter som kan behandles med denne blanding innbefatter dyretumorer, såsom storfe skjell-lignende cellekreft, storfe fibrosarcom, hestesarcoid, hestemelanom, heste skjell-lignende cellekreft, kanin brystkreft, kaninadenom og kaninmelanom, og menneskelige tumorer, såsom brysttumorer, lungetumorer, tykktarmtumor, ondartet melanom, skjell-lignende cellekreft, ovarietumor, tumor i livmoren, blære, og hode- og nakketumorer.

Endotoksinekstrakter av den type som benyttes som utgangs-materiale for å fremstille RDE kan oppnås fra enhver Enterobacteriaciae, som inneholder opprinnelsesorganismene, og mutanter. Som eksempler er de følgende arter illustrative for type mikroorganismer som kan benyttes: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseri a, Proteus, Klebsiella og Serratia.

De følgende arter blir typisk benyttet: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni og S. abortus egui.

De endotoksiske ekstrakter som benyttes som et utgangsmat-eriale kan fremstilles ved en av flere kjente metoder (se f.eks.: 1. Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M. og Johnson, A.G., J. Immunol. 1955, 744, 55. 2. Westphal, 0., Luderitz, 0. og Bister, F., Z. Natur-forsch, 76 148 (1952). 3. Westphal, 0., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference, (George F. Springer, ed.), Madison N.J. Madison Printing Co., 1957, 115. 4. Galanos, C, Luderitz, O., Westphal, O. , Eur. J. Biochem, 9_ 245 (1969 ) . 5. Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A., Levin, J., Nowotny A., J. Infect. Dis. 128 543 (1973). 6. Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental medicine, 114 647 (1961). 7. Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm., 21 290 (1965). 8. Ribi, E., Milner, K.C. og Perrine, T., J. Immunol., 82 75 (1959)).

Den foretrukne metode for å oppnå det endotoksiske ekstrakt er som beskrevet av Chen et al; nemlig metanolkloroform-utfelling.

Metanolkloroformbunnfallet (MCP) reagerer deretter med en organisk eller uorganisk syre og lyofiliseres til å danne et hydrolysert rålipid A med redusert toksisitet og pyro-genisitet, sammenlignet med utgangsendotoksinmaterialet. Dette materiale behandles deretter med et løsningsmiddel som er i stand til spesifikt å oppløse fettsyrer og andre urenheter uten å oppløse rålipidet A. Fosfatinnholdet av det detoksifiserte, rensede lipid A er ca. halvparten av det som kan observeres for toksisk endotoksin, noe som an-tyder at fosfatinnholdene står i relasjon til de toksiske effekter av endotoksiner.

De fortrinnsvis benyttede uorganiske syrer for reaksjonen med MCP er saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre, og de fortrinnsvis benyttede organiske syrer er toluolsulfonsyre eller trikloreddiksyre. Det er egnet å føre reaksjonen ved en temperatur mellom ca. 90 og 130°C, i et tidsrom som er tilstrekkelig til fullstendig hydrolyse, vanligvis mellom ca. 15 og 60 minutter.

Fremstilling av det rå, detoksifiserte endotoksin kan ut- føres ved å reagere utgangsmaterialet med syren i nærvær av et organisk løsningsmiddel, såsom kloroform, metanol og etanol, eller blandinger av disse.

Det resulterende rålipid A suspenderes i aceton som er det foretrukne løsningsmiddel for oppløsning av fettsyrer og andre urenheter. Ved fjerning av løsningsmiddelet oppstår det rå, detoksifiserte endotoksin.

Det rå, detoksifiserte endotoksin oppløses deretter i et løsningsmiddel, og oppløsningen føres gjennom en egnet kromatografikolonne, såsom en molekylsikt-kromatografikolonne, for å skille RDE-fraksjonene, som etter fjerning av løsningsmiddelet, kombineres. Den rå, detoksifiserte endotoksinoppløsning føres over en "Sephadex"-kolonne i nærvær av et løsningsmiddel, såsom kloroform, metanol, aceton, pyridin, eter eller eddiksyre, eller kombinasjoner av disse. Trykket på kolonnen kan varieres, men holdes vanligvis i området mellom atmosfæretrykk og 7 kp/cm2 , og strøm-ningshastigheten holdes mellom 0,1 og 10 ml/minutt.

Den rå, detoksifiserte endotoksinoppløsning kan føres over en DEAE-cellulosekolonne under de samme trykkforhold som tidligere nevnt for "Sephadex"-kolonnen. Strømningshastig-heten holdes mellom ca. 2 og 15 ml/minutt. Benyttede løs-ningsmidler er de samme som benyttes for "Sephadex"-kolonnen, selv om vann og/eller dietylamin kan tilsettes til alle blandinger i en konsentrasjon opptil ca. 1 %.

Andre metoder til fremstilling av RDE fra rått, detoksifisert endotoksin, innbefatter å føre oppløsningen over en lavtrykk-kiselgel 60 kolonne som har en partikkelstørrelse mellom ca. 25 og 63 pm og ved benyttelse av et løsnings-middel bestående av kloroform, metanol, vann og ammonium-hydroksyd. Det benyttes fortrinnsvis et volumforhold av komponentene i løsningsmiddelet som er ca. 50:25:4:2.

Det rensede, detoksifiserte endotoksin (RDE) inneholder ikke påviselig 2-keto-3-deoksyoktanoat, derimot mellom ca.

350 og 375 nmol/mg fosfor og mellom ca. 1700 og 2000 nmol/- mg fettsyre.

Blandingen administreres ved injeksjon i et farmasøytisk akseptabelt medium, såsom en oljedråpe-emulsjon eller en fysiologisk saltoppløsning, og administreres fortrinnsvis direkte inn i tumoren under forhold som er nærmere beskrevet nedenfor. Administrering kan utføres ved IV-injeksjon eller ved IV-infusjon.

Blandingen kan stabiliseres, f.eks. ved en lyofiliserings-prosedyre, og deretter rekonstitueres uten tap av kraft.

Mengde av RDE i en enkelt injeksjon til behandling av dyr, ligger mellom ca. 25-500 mikrogram/ml, fortrinnsvis mellom 50 og 100 mikrogram/ml, og mengden av PE ligger mellom ca. 25-500 og fortrinnsvis mellom ca. 100 og 250 mikrogram/ml.

Antall ml som injiseres i tumoren bestemmes av størrelsen på tumoren i henhold til følgende tabell:

Dosering for dyr i henhold til tumorstørrelse

Maksimale dose pr. injeksjon er ca. 10 mg RDE og ca. 25 mg PE. Behandlingsforløpet består av opptil 4-10 injeksjoner administrert ved ca. 2 ukers intervaller.

Den foreliggende blanding i et egnet injeksjonsmedium, såsom en fysiologisk saltoppløsning, administreres direkte inn i tumorer hos mennesker. Mengden RDE i en enkelt injek sjon ligger mellom ca. 5 og 1000 mikrogram, fortrinnsvis mellom 25 og 500 mikrogram. Mengde PE ligger mellom ca. 50 og 5000 mikrogram, fortrinnsvis mellom 200 og 3000 mikrogram. Foretrukket doseringsnivå for RDE er ca. 100 mikrogram og for PE ca. 1000 mikrogram. Alle de ovenfor nevnte doseringsnivåer er beregnet på en gjennomsnittlig voksen pasient på 70 kg. Injeksjonene administreres én gang i uken i totalt ca. 15 uker.

Som beskrevet ovenfor kan blandingen for behandling av varmblodige dyr og mennesker benyttes i form av en saltopp-løsning eller en oljedråpe-emulsjon. Mengde olje som benyttes ligger i området mellom ca. 0,5 og 3,0 volum-%, relativt til blandingens totale volum. Det benyttes fortrinnsvis mellom 0,75 og 1,5 volum-"/ av oljen. Eksempler på slike oljer innbefatter lett mineralolje, sgualan, 7-n-heksyl-oktadekan, "Conoco superoil" og "Drakeol 6 VR mineralolje".

Den homogeniserte oljeholdige blanding kombineres deretter med en detergent som eventuelt kan oppløses i en saltopp-løsning før blanding. Mengde detergnet ligger typisk mellom ca. 0,02 og 0,20 volum-%, og fortrinnsvis mellom ca. 0,1 og 0,2 volum-%, relativt til blandingens totale volum. Ethvert vanlig detergentmateriale kan benyttes, innbefattende

"Tween-80" og "Arlacel".

Den resulterende blanding som oppstår ved tilsetning av detergent, homogeniseres deretter til å danne en suspensjon som har en høy prosentdel oljedråper dekket med de aktive komponenter som bestemmes ved observasjon under et mikro-skop.

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen, og skal på ingen måte begrense eller redefinere oppfinnelsen som fast-lagt i de vedlagte krav.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av et pyridinoppløselig ekstrakt fra Proprionibacterium acnes Type II (stamme VPI 0204)

Proprionibacterium acnes Type II (stamme VPI 0204) ble dyrket ved 37°C i NIH tioglykolat næringsmedium i mellom 48 og 72 timer for å oppnå en hel cellekoloni. Kolonien ble deretter vasket med 500 ml destillert vann. 90 g (våt vekt) av den vaskede koloni ble deretter blandet med 200 ml ren pyridin og sentrifugert ved 1700 gil time ved 4°C. Et pyridinløselig ekstrakt ble fjernet som en supernatantfraksjon. Det resterende bunnfall ble ekstrahert med ytterligere pyridin under de samme forhold som beskrevet ovenfor. Ved påfølgende filtrering, under benyttelse av "Whatman" nr. 1 papir, ble pyridinekstraktene samlet og løsningsmid-delet fjernet ved fordamping ved 50°C i en "Buchi Rota-vapor". De tørkede pyridinekstrakter ble ekstensivt dialys-ert mot destillert vann og deretter lyofilisert. Det resulterende, rensede pyridinekstrakt inneholdt ca. 5 vekt-% protein, ca. 35 vekt-% sukker og ca. 55 vekt-% fettsyrer. Ekstraktet ble undersøkt under et elektronmikroskop og det ble funnet å være fritt for forurensende hele celler og celleveggfragmenter. Utbyttet av det pyridinløselige ekstrakt var 9 % (8,1 g) .

EKSEMPEL 2

Fremstilling av pyridinløselig ekstrakt fra " M. bovis stamme

BCG" M. bovis stamme BCG ble dyrket og høstet i "Sautons" medium ved 37°C i mellom 3-4 uker for å oppnå en vasket hel cellekoloni. 50 g (våt vekt) av den vaskede koloni ble deretter behandlet på samme måte som i Eksempel 1 for å danne et utbytte av det pyridinløselige ekstrakt på 7 % (3,5 g). Ekstraktet inneholdt 15 vekt-% protein, 10 vekt-% sukker og 52 vekt-% fettsyrer.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av et vandig ekstrakt

500 mg av et pyridinekstrakt ble ultralydbehandlet i 100 ml destillert vann i 15-30 minutter. Den resulterende suspensjon ble sentrifugert ved 12000 opm i en RC2B-sentrifuge ved 4°C i 40 minutter. Supernatanten ble avdekantert og oppbevart. Bunnfallet ble ekstrahert ytterligere to ganger, som ovenfor. Supernatantene ble kombinert i en lyofiliser-ingsflaske, nedfrosset og lyofilisert. Utbytte 230 mg (46

EKSEMPEL 4

Fremstilling av rått, detoksifisert endotoksin

En prøve på 650 mg av et metanol-kloroformbunnfall fremstilt i henhold til fremgangsmåten til Chen, et al, J. Infect. Dis., 128 543 (1973) ble suspendert i 150 ml 0,1N HC1 i en trehalskolbe utstyrt med en kondensator, og neddyppet i et ultralydbehandlingsapparat. Etter ultralydbehandling ble glassapparaturen senket inn i et oljebad holdt ved 120°C, noe som tillot flaskens indre temperatur å nærme seg eller overstige kokepunktet til oppløsningen. Overopp-heting av oppløsningen ble minimalisert ved å utstyre kolben med et kapilarrør festet til en nitrogengasskilde gjennom én av kolbens halser. En kontinuerlig strøm av nitrogen ble opprettholdt gjennom hele hydrolyseprosedyren.

Hydrolyseringen ble fortsatt i 30 minutter og deretter ble oppløsningen avkjølt i et isbad, ultralydbehandlet for å dispergere faststoff og fordelt i "corex"-rør. Kolben ble vasket med destillert vann for å fjerne alt faststoff festet til kolbens glassvegger, og vaskevannet ble tilsatt suspensjonen i "corex"-rørene. Sentrifugering ble utført ved 12000 opm i 80 minutter. Supernatantene ble avdekantert og kastet. Det faste bunnfall ble resuspendert i destillert vann, ultralydbehandlet inntil suspensjonen var godt dis- pergert og resentrifugert. Fremgangsmåten ved sentrifugering ble deretter gjentatt. Bunnfallet ble tatt opp i destillert vann, frosset ned og lyofilisert. Utbyttet av rått lipid A var 382 mg. 150 mg av dette materialet ble behandlet med kald (0°C) aceton for å fjerne fettsyrer, ultralydbehandlet og filtrert gjennom en "Whatman" nr. 1 gravi-tetsfiltrasjonsapparatur ved 5°C. Det gjensto 100 mg av rått, detoksifisert endotoksin etter tørking.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av rått, detoksifisert endotoksin

En prøve på 120 mg av MCP (metanol-kloroformbunnfall) ble suspendert i 12 ml absolutt metanol, ultralydbehandlet for å dispergere faststoff og fordelt i 6 (1 x 10 cm) ampuller med skrukork. 2 ml 0,2N HC1 ble tilsatt til hvert rør og den resulterende suspensjon ble satt i et kokende vannbad i 45 minutter. Etter hydrolyse ble rørene avkjølt i et isbad og sentrifugert i ca. 10 minutter ved 2500 opm. Supernatanten ble avdekantert og 5 ml av en 2:1 kloroform/metanol-blanding ble satt til bunnfallet for å oppnå oppløsning. 2 ml vann ble tilsatt hvert rør og oppløsningen ble blandet. Den tofasede oppløsning ble resentrifugert ved 2500 opm i 10 minutter. Den øvre vannfase ble kastet og 1 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding ble tilsatt hvert rør, noe som førte til en klar oppløsning. Oppløsningene ble samlet, og løsningsmiddelet ble avdampet på en rotasjonsfordamper. Bunnfallet ble tørket i høyvakuum og lyofilisert med et utbytte på 45 mg av rålipid A. 20 mg av dette materiale ble behandlet med kald (0°C) aceton, ultralydbehandlet og filtrert gjennom en "Whatman" nr. 1 gravitetsfi1trerings-apparatur ved 5°C. 13 mg rått, detoksifisert endotoksin gjensto etter tørking.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av renset, detoksifisert endotoksin

110 g LH-20-100 (25-100 pm partikkelstørrelse: Pharmacia) ble kombinert med 600 ml av en 2:1 kloroform/metanolbland-ing som ble tillatt å stå i 30 minutter. Den resulterende oppslamming ble tilsatt en 25 x 1000 mm glasskromatografi-kolonne (BRL Laboratorier) utstyrt med trykkanordninger. Etter at pakkingen var fullført, ble kolonnen festet ved hjelp av et "Teflon" trykkrørsystem til en " ISCO"-rnodell 132 pumpe. 400 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding ble pumpet gjennom kolonnen med en hastighet på 3 ml/minutt. 100 mg rått, detoksifisert endotoksin fremstilt i henhold til Eksempel 4 ble tilført kolonnen i 2,5 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding via et prøvetakningsrør. Strøm-ningshastigheten ble redusert til 1 ml/minutt, og etter 150 ml elueringsmiddel var samlet, ble avløpet satt i forbind-else med en fraksjonssamler. 4 ml 1 s fraksjoner ble samlet og de rensede, detoksifiserte endotoksinfraksjoner ble bestemt ved tynnsjiktkromatografiske analyser av fraksjonene (E. Merck, 0,25 mm tykk, kloroform/metanol/H20/NH4OH (50:25:4:2:) som elueringsmiddel).

De rensede, detoksifiserte endotoksinfraksjoner ble kombinert og løsningsmiddelet avdampet med 30 mg renset, detoksifisert endotoksin som et hvitt pulver som utbytte.

EKSEMPEL 7

Fremstilling av renset, detoksifisert endotoksin

33 g "DEAE"-cellulose (Whatman DE-32) ble suspendert i 150 ml iseddiksyre og rørt forsiktig i 10 minutter for å oppnå en oppslamming. Blandingen ble satt til side over natten.

Oppslammingen ble helt i en 25 x 400 mm kolonne, fikk satt seg under avtapping, og overskudd av syre ble deretter tappet av. Kolonnen ble vasket med 2000 ml metanol, etter fulgt av 200 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding. En 100 mg prøve av rått, detoksifisert endotoksin fremstilt i henhold til Eksempel 4 ble tilsatt kolonnen i 3 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding eller en 80:20:1 blanding av kloroform, metanol og vann. Kolonnen ble eluert med 350 ml av en 4:1 kloroform/metanolblanding, etterfulgt av 300 ml av en 99:1 metanol/vannblanding. Under benyttelse av en lineær gradientapparatur, ble kolonnen eluert med 2000 ml av en lineær gradient som startet med 100 % metanol og endte med 0,2 M eddiksyre i metanol. Kolonnen ble eluert med en hastighet på 6 ml/minutt, og fraksjoner på 15 ml ble samlet. Annenhver fraksjon ble analysert for totalt fosforinnhold i henhold til fremgangsmåten til Bartlett, G.R., J. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959 ). Fraksjonene ble samlet og inndampet på en rotasjonsfordamper til nesten tørrhet og tatt opp i 10 ml av en 2:1 kloroform/metanolblanding og 40 ml av 0,001 M eddiksyre i en skilletrakt. Det lavere lag ble ad-skilt, filtrert gjennom et "Whatman" nr. 2 filterpapir og inndampet til tørrhet med et utbytte av 19,2 mg renset, detoksifisert endotoksin.

EKSEMPEL 8

23 8-10 uker gamle hunnmus C3HeBFeJ ble injisert intraperi-tonealt med 10^ ovarie teratocarcinome celler. Etter 24 timer ble 5 mus injisert én gang med 0,2-0,5 ml av en isotonisk saltoppløsning inneholdende 50 mikrogram RDE og 6 mus ble injisert én gang med 0,2-0,5 ml av saltoppløsningen som inneholdt 300 mikrogram PE og 50 mikrogram RDE. Til slutt ble 12 mus injisert én gang med 0,2-0,5 ml av salt-oppløsningen som kontroll. Etter 21 dager viste 4 av de 5 mus injisert med RDE, komplett regresjon av tumoren, og 6 av 6 mus injisert med RDE og PE viste lignende resultater. I motsetning til dette, døde 10 av 12 mus i kontrollgruppen i løpet av 21 dager, og de resterende 2 viste fremdeles tegn til cancerceller.

EKSEMPEL 9

45 8-10 uker gamle hunnmus C3HEJ ble injisert med 10^ ovarie teratocarcinom. Etter 24 timer ble 15 av musene injisert én gang med 0,2-0,5 ml av en isotonisk saltopp-løsning inneholdende 1400 mikrogram PE, og 15 av musene ble injisert én gang med 0,2-0,5 ml av saltoppløsningen inneholdende 300 mikrogram PE og 50 mikrogram RDE. Til slutt ble 15 av musene injisert med 0,2-0,5 ml av saltoppløs-ningen som en kontroll. Etter 30 dager, levde fremdeles 5 av 15 injisert med PE, og 8 av 15 mus injisert med RDE og PE hadde vist tumorregressjon og var fremdeles i live. I motsetning til dette døde 14 av 15 mus i kontrollgruppen, hvori den siste mus viste tegn på tumorregresjon.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en terapeutisk blanding, karakterisert ved å kombinere en terapeutisk virksom mengde av: (a) et renset pyridinoppløselig ekstrakt fra en mikroorganisme , (b) et renset, detoksifisert endotoksin som ikke inneholder påviselig 2-keto-3-deoksyoktanoat og som har mellom 375 og 475 nmol/mg fosfor og mellom 1700 og 2000 nmol/mg fettsyrer, og (c) en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er M. bovis BCG, M. ph1ei, M. smegmatis, M. kansasii, Nocardia rubra, Nocardia asteroides , Proprionibacterium acnes Type II og Corynebacterium parvum.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at blandingen foreligger i lyofilisert form.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at bæreren er en fysiologisk saltoppløs-ning.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at blandingen foreligger i en oljedråpe-emulsjon, hvorved oljen kan være en lett mineralolje, sgualan eller 7-n-heksyloktadecan.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det benyttes en mengde av oljen mellom 0,5 og 3,0 volum-%, basert på det totale volum av blandingen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det ytterligere tilsettes en detergent i en mengde mellom 0,02 og 0,25 volum-% av det totale volum av bl åndingen.