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UTILISATION D'UNE COMPOSITION COMPRENANT AU MOINS UN
ANTIGÈNE ET/OU UN OU PLUSIEURS FRAGMENTS DE CET ANTIGÈNE
POUR L'OBTENTION D'UN MÉDICAMENT DESTINÉ AU TRAITEMENT
ET/OU À LA PRÉVENTION DU CANCER Objet de l'invention
La présente invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant au moins un antigène et/ou un ou plusieurs fragments de cet antigène pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention du cancer.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention
Parmi les traitements du cancer, la chimiothérapie et la radiothérapie sont des procédés extrêmement efficaces pour l'élimination primaire des leucémies, néoplasmes et tumeurs, tandis que la chirurgie permet l'excision des tumeurs solides. Cependant, la prolongation de l'espérance de vie des malades cancéreux traités avec succès est souvent peu satisfaisante en raison des rechutes.
L'immunothérapie utilisée comme une arme antitumorale découle du besoin de modalités de traitement complémentaires à la chimiothérapie qui, si la cinétique de premier ordre est suivie, est en théorie incapable d'éradiquer, la dernière cellule tumorale subsistante". Les rémissions d'un carcinome du sein, de la prostate, des poumons après chirurgie, irradiation ou chimiothérapie peuvent durer de 5 à 25 ans, suivis d'une récurrence. Aussi longtemps que le système immunitaire du malade en rémission fonctionne convenablement et n'est pas sollicité de façon excessive, les reliquats de tumeur subsistant dans l'organisme du malade
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après une intervention primaire resteront sous contrôle et ne parviendront pas à provoquer une rechute.
Les cellules tumorales échappent à la surveillance immunologique de l'hôte par divers mécanismes, dont les plus connus sont d'une part la paucité des antigènes tumoraux qui permettraient la reconnaissance du néoplasme par le système immunitaire de l'hôte et d'autre part, la capacité des cancers de réduire de façon drastique les défenses immunologiques de cet hôte. Lorsque la balance peut être penchée en faveur de l'hôte et au détriment de la tumeur, les mécanismes de défense immunologique redeviennent très efficaces.
Une intervention immunothérapeutique ne peut raisonnablement trouver sa place dans un schéma de traitement qu'en cas des tumeurs récemment implantées (M. McKneally et al. : The Lancet, Mai 7 (1977), page 1003), des tumeurs diagnostiquées tôt et donc de petite taille ou de nombre réduit de cellules, ou après qu'une intervention (chirurgie, chimiothérapie, irradiations) ait réduit la taille de la tumeur ou le nombre des cellules leucémiques, dans une proportion qui permette au système immunitaire de reprendre le contrôle (N.
Gross et A. Eddie : Am. Rev. Resp. Dis., 113, p. 457-464 (1976) ; G. Mathé et al. : Nat. Cancer. Inst. Monograph No. 39, p. 165-175, 1973).
La réjection de néoplasmes par des moyens immunologiques peut être basée d'une part sur la reconnaissance immunologique de ce néoplasme. Cette approche immunothérapeutique spécifique exploite l'existence d'antigènes tumoraux cellulaires de surface reconnaissables par le système immunitaire du malade. Dans la pratique, cette méthode peut être appliquée par une isolation des cellules cancéreuses de l'hôte suivie de leur inactivation, l'élimination de la tumeur (chirurgie, radiation, chimiothérapie) puis ré-inoculation dans le malade des cellules tumorales inactivées dans la but de provoquer une réaction immunologique contre les antigènes de surface de la tumeur.
Une immunothérapie basée sur un tel système de reconnaissance spécifique n'est que très peu efficace lorsqu'elle est appliquée seule. Il peut y avoir production
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d'anticorps contre le néoplasme mais l'apparition d'une hypersensibilité retardée, qui est sensée être le principal agent immunologique de l'élimination des cellules tumorales résiduelles, n'est que rarement observée (J. Sokal et al. : Nat. Cancer Inst. Monograph nO 39, p. 195-198 (1973).
En outre, cette technique est assez difficile à mettre en oeuvre, parce qu'elle nécessite la collecte de cellules cancéreuses du patient (souvent sous la forme d'une tumeur solide ou d'une suspension) et la présentation de ces cellules qui doivent être aisément inactivables par irradiation et injectables au patient. De plus, le risque que peut courir un malade de se voir inoculer des cellules cancéreuses incomplètement inactivées n'est jamais totalement exclu.
En raison de ces difficultés, l'immunothérapie spécifique est soit complétée par une immunothérapie aspécifique, soit abandonnée en faveur de celle-ci (G. Mathé et al. : Nat. Cancer Inst. Monograph. n 39, p 165-175 (1973)).
Une immunothérapie non-spécifique est réalisée depuis plus de vingt ans par le vaccin antituberculeux constitué de cellules vivantes d'une souche atténuée du bacille tuberculeux bovin Mycobacterium bovis (Bacille CalmetteGuerin ou BCG). L'administration du BCG, soit de façon systémique soit de façon topicale, a de remarquables effets sur la rémission de cancers humains de toutes sortes, pourvu que le système immunitaire du malade ne soit pas épuisé et que la masse cancéreuse à traiter ne soit pas trop importante.
Après traitement primaire d'un malade par chimiothérapie, irradiation ou chirurgie, le maintien du malade en rémission est favorisé par l'administration de BCG qui stimule les défenses immunitaires aspécifiques du patient et favorise l'élimination des cellules cancéreuses résiduelles ou, à défaut, les maintient sous contrôle. Un effet similaire a été observé avec Corynebacterium et Nocordia, qui font partie du même groupe bactérien que les mycobactéries. Par facilité, l'essentiel des applications est faite avec le BCG.
Les effets secondaires du vaccin ne sont pas négligeables : hyperthermie, frissons, nausées, faiblesse, douleurs articulaires, gonflement des poignets et
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articulations, vomissements et diarrhées. Les effets secondaires sont combattus soit par des salycilates, soit plus fréquemment, par un traitement du malade incommodé au moyen d'un médicament antituberculeux, normalement l'isoniazide.
Une autre grave objection à l'utilisation de bacilles vivants est la possibilité d'infecter le malade par le bacille et de provoquer une tuberculose bovine disséminée, qui n'est parfois pas susceptible de guérison (M. McKneally et al. : The Lancet, Mai 7, (1977), p. 1003).
De plus, il a été observé de très grandes divergences entre le pouvoir immunothérapeutique du BCG en fonction de sa source, de son mode de stockage et de sa fabrication (J. Bennett et al. : Cancer Res., 43, p. 4183-4190 (1983)).
L'utilisation de tuberculine (PPD, Purified Protein Derivative) dans le même but immunothérapeutique a été essayée mais n'a pas fait l'objet de recherches très poussées. Le motif de cet abandon était d'une part la grande variation observée dans les effets produits en fonction de la source de PPD utilisée, de la facilité d'obtention du BCG et, surtout de la croyance que l'efficacité du traitement dépendait de la viabilité du matériel inoculé (un matériel inerte (PPD) était supposé être moins efficace que les bacilles vivants (BCG) (J. Bennett et al. : Cancer Res 43, p. 4183- 4190, 1983)).
En outre, l'hypothèse a été récemment émise que les mycobactéries possèdent la propriété d'induire une immunodépression chez les organismes qu'ils infectent (Gevaudant et al. : Rev. Française Lab., 258, p. 1-8 (1993)). Leur utilisation sous forme vivante pour potentialiser la réponse immunitaire de cancéreux peut, si les défenses immunologiques du récipient cancéreux sont faibles, se révéler vaine parce que les bacilles peuvent accentuer l'immunodépression causée par la tumeur et même dangereuse parce que les bacilles peuvent provoquer une infection généralisée.
Par ailleurs, la capacité que possèdent pour le moins certaines souches bacillaires de réduire l'immunité de l'hôte expliquerait la variation observée dans les effets immunopotentiateurs attendus, lorsque des souches
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mycobactériennes différentes, de virulence variable, sont utilisées.
De plus, l'observation que des médicaments antituberculeux sont parfois appliqués lorsque le BCG est injecté à des cancéreux (M. McKneally et al. : The Lancet, Mai 7 (1977), p. 1003) pouvait donner à penser que l'assertion très généralement admise par tous les cliniciens actuellement impliqués dans ce type de traitement, que des particules viables sont nécessaires pour obtenir les effets immunopotentiateurs escomptés, pouvait ne pas être correcte.
Etat de la technique
Les microorganismes de groupe MNC (Mycobactéries, Nocordia et Corynebactéries) auquel appartient le BCG sont des microorganismes complexes constitués de nombreuses structures antigéniques.
Ainsi, pour M. tuberculosis, qui était à l'aube de la recherche dans ce domaine, supposé constitué de 11 antigènes majeurs, il est maintenant reconnu que le nombre de ses antigènes est beaucoup plus élevé.
Certains de ces antigènes sont communs à plusieurs genres, c'est-à-dire qu'ils montrent une réactivité immunologique croisée entre des organismes appartenant au groupe Corynobacterium, Mycobacterium et Nocordia (MNC).
Parmi ces antigènes, l'antigène A60 présente un intérêt particulier parce qu'il est thermostable, il est un puissant immunogène et est commun (sans être identique) à tous les microorganismes appartenant au groupe MNC. En particulier, l'antigène A60 de M. bovis et A7 de M. leprae sont identiques (Harboe et al., (1979), Scand. J. Immunol.
EMI5.1
8, 115-124).
L'antigène A60 est connu pour être un antigène immunodominant durant les infections mycobactériennes naturelles. Il provoque la création d'anticorps circulant humoraux et peut être utilisé de façon efficace comme tuberculine et comme vaccin anti-tuberculeux (brevet EP-184 511, US-4,965, 192 et BE-089, 00456).
Buts de l'invention
La présente invention a pour but de présenter un
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nouveau traitement immunothérapeutique des cancers qui ne présente pas les inconvénients de l'état de la technique, qui n'occasionne pas ou peu d'effets secondaires et qui soit reproductible.
Un autre but de la présente invention est d'obtenir un traitement qui provoque une réaction immunitaire contre le cancer équivalente ou supérieure à celle observée par l'administration vaccinale du BCG.
Eléments caractéristiques de l'invention
La présente invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant au moins un antigène et/ou un ou plusieurs fragments de cet antigène, interspécifique des microorganismes appartenant au groupe MNC, et montrant après électrophorèse un mode de précipitation immunoélectrophoréti- que correspondant à l'antigène A60 de la souche du Bacille de Calmette-Guerin de Mycobacterium bovis, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention du cancer.
Avantageusement, ladite composition comprend également des agents thérapeuthiques spéficiques du cancer, de préférence des cellules tumorales non prolifératives (rendues non prolifératives par des procédés connus de l'homme de l'art) et/ou des antigènes tumoraux (obtenus par exemple par génie génétique ou par isolation d'antigènes à partir de cellules tumorales). Ladite composition peut également comprendre des agents thérapeutiques aspécifiques du cancer, choisis parmi le groupe constitué par de l'acide nucléique bicaténaire, de préférence compléxé à la protamine, de la vitamine C, une émulsion aqueuse dans de l'huile et/ou un mélange d'entre eux.
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
La présente invention repose sur le fait inattendu qu'un antigène (et/ou un ou plusieurs fragments de celui-ci), interspécifique des microorganismes appartenant au groupe MNC (espèces du genre Mycobactéries, Nocordia et Corynobactéries) montrant après une contre-électrophorèse un mode de précipitation immunoélectrophorétique correspondant à l'antigène A60 de la souche du Bacille de Calmette-Guerin de
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Mycobacterium Bovis, présente une remarquable capacité à contrôler l'évolution de cancers.
L'antigène mycobactériel A60, son procédé d'isolement ainsi que le procédé d'obtention de fragments de cet antigène A60 ont été décrits dans la demande de brevet EP-184 511.
L'antigène A60 de M. bovis (souche atténuée du Bacille de Calmette-Guerin) est le composant du cytoplasme bactérien migrant le plus lentement dans un champ électrophorétique (1% d'agarose dans le tampon Tris-barbital 0,02 M à pH 8, 6) ; 8 volts/cm durant 1 heure à 150C dans la première dimension et 3 volts/cm durant 18 heures à 150C dans la deuxième dimension ; détection des composants protéiniques par bleu de Coomassie).
Cet antigène A60 peut être notamment obtenu par le procédé dans lequel on réalise une destruction des parois cellulaires dudit microorganisme ; on sépare les débris cellulaires, par exemple par centrifugation, et on récolte le surnageant contenant le cytoplasme ; on réalise ensuite une chromatographie d'exclusion en faisant passer le surnageant (éventuellement traité par une RNase ou une DNase) contenant le cytoplasme sur un gel d'exclusion et on récolte le pic d'exclusion contenant l'antigène A60 substantiellement pur.
Les fragments de cet antigène A60 peuvent être notamment obtenus en mettant en contact l'antigène A60 avec une protéase ou un agent chimique ayant la fonction d'une protéase, tel que le bromure de cyanogène ; et en séparant par exemple les fragments immunologiquement actifs des autres fragments, par contact avec un agent adsorbant sensibilisé par un anticorps contre l'antigène A60 de manière à former un complexe fragments immunologiquement actifs-anticorps anti-A60 que l'on récolte.
Une constante dans l'évaluation du pouvoir immunopotentiateur des antigènes mycobactériens pour le contrôle des cancers en régression est le parallélisme étroit existant entre les effets observés dans des études expérimentales chez l'animal et les effets observés par les mêmes préparations dans le traitement des cancers humains (G. Mathé et al. : Nat.
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Cancer Inst. Monograph No 39, p. 165-175 (1973) ; J. Sokal et al. : Nat. Cancer Inst. Monograph No 39 ; p. 195-199 (1973) ; J. Bennett et al., Cancer Res. 43, p. 4183-4190 (1983).
Les modèles expérimentaux murins utilisés dans la présente invention et représentatifs des cancers humains, sont les suivants : - Un carcinome hépatique, la tumeur du foie de Taper (TLT).
EMI8.1
Cette lignée néoplas'mique murine est maintenue in vitro dans un milieu de culture constitué de RPMI à 370C sous 5% de C02 et est maintenu in vivo par passages dans des souris
NMRI.
- Un carcinome mammaire, souche EMT 6. Les cellules sont maintenues in vitro dans un milieu McCoy à 37 C sous 5% de
C02 et sont propagées in vivo dans des souris Balb/c.
- Un carcinome du poumon de Lewis (3 Lewis-Lung : 3LL). Cette souche néoplasmigueest propagée in vitro dans un milieu
MEM à 37 C sous 5% de C02 et propagée in vivo dans des souris C57B1/6.
Les suspensions de cellules tumorales sont inoculées à différentes concentrations, par voie soit intrapérito- néale soit intramusculaire. Le traitement immunothérapeutique prophylactique a consisté dans les applications suivantes : 1. Les cellules tumorales isologues cultivées in vitro sont inactivées par irradiations gamma dans un émetteur gamma 60Co (Atomic Energy of Canada) avec des doses d'irradia- tion suffisantes pour induire une chute de viabilité de
107. Les cellules irradiées sont inoculées par voie intra- péritonéale ou intramusculaire à une dose de 103¯107 cel- lules dans un tampon salin phosphate. Les cellules irra- diées sont inoculées en une ou plusieurs doses, la der- nière dose étant administrée 15 jours avant l'inoculation des cellules néoplasiques vivantes isologues.
Une expé- rience est réalisée où la suspension saline de cellules irradiées a été émulsionnée dans l'huile.
2. L'antigène A60 obtenu de différentes espèces bactériennes appartenant au groupe MNC a été inoculé à la dose de 30 pg/100 pl/animal dans une émulsion d'eau dans l'huile.
L'inoculation a eu lieu 23 jours et 8 jours avant
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l'introduction des cellules néoplasmiques. Parfois, une troisième inoculation d'antigène A60 a eu lieu le jour précédant l'inoculation des cellules tumorales.
3. M. bovis, souche BCG, a été inoculé à la dose 105 cellules viables en suspension dans un tampon salin phosphate, par voie sous-cutanée, 23 jours et 8 jours avant l'injection de cellules cancéreuses.
4. Une solution d'acide nucléique bicaténaire protégé par une protamine a été préparée selon des techniques connues (brevet français 2.093. 875) et utilisée à la dose de 40 g/animal. L'inoculation intrapéritonéale a lieu soit en même temps que l'inoculation par les cellules irradiées isologues soit en même temps que l'inoculation de l'anti- gène A60.
5. L'acide ascorbique (vitamine C) a été administrée dans l'eau de boisson des animaux traités pendant à peu près un mois avant l'inoculation de cellules tumorales et tant que les animaux développant une tumeur étaient en vie.
6. Le temps moyen de survie des animaux (T. M. S. ) correspon- dant au nombre de jours où le nombre d'animaux morts devient supérieur à la moitié du nombre total d'animaux inclus dans le groupe expérimental analysé, l'augmentation de l'espérance de vie en pourcentage par rapport aux contrôles (AEV) et l'incidence des cancers expérimentaux induits, c'est-à-dire l'incidence cancéreuse à long terme (ILT) sont calculés avec une moyenne de 17 animaux par chaque groupe expérimental analysé. Les divers agents prophylactiques appliqués seuls aux doses indiquées n'ont aucun effet sur la mortalité des animaux dont l'espérance de vie est identique aux contrôles non-traités.
L'invention sera décrite de manière plus détaillée dans les exemples suivants qui ne limitent en aucune façon la portée de l'invention.
Exemple 1
Le tableau I présente les index oncologiques qui sont trouvés pour le carcinome TLT, tumeur hépatique de Taper. La cancérisation des animaux a lieu par une inoculation soit intrapéritonéale, soit intramusculaire de 1000 ou
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de 100.000 cellules cancéreuses vivantes. La prophylaxie est réalisée par des cellules cancéreuses irradiées, par l'antigène A60 extrait du BCG ou par les deux agents en même temps.
Les cellules TLT sont très cancéreuses : toutes les souris inoculées meurent, dont plus de la moitié en un peu plus d'un mois, dépendant de la dose et de la route d'inoculation. Un examen attentif de l'augmentation des espérances de vie après traitement prophylactique montre que la prophylaxie est la plus efficace lorsqu'une dose réduite de cellules cancéreuses est inoculée par voie intermusculaire (IM). Lorsqu'une dose élevée est inoculée, la prophylaxie parait plus efficace lorsque ce challenge s'effectue par voie intrapéritonéale (IP) parce que la mort des animaux contrôlés se produit en moins d'un mois.
Tableau I
EMI10.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Ugnée <SEP> tumorale <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Inc. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> 1. <SEP> TLT <SEP> Challenge <SEP> : <SEP> 1000 <SEP> cellules <SEP> viables
<tb> aucun <SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 32,5 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> cellules <SEP> lrradlées <SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 49 <SEP> 50,7 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 47 <SEP> 38,2 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60) <SEP> TLTtM45 <SEP> 38, <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> 'P <SEP> 46, <SEP> 5 <SEP> 36, <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 43,5 <SEP> 33,8 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 40,5 <SEP> 19,1 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 49,5 <SEP> 52,
3 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 47 <SEP> 38, <SEP> 2 <SEP> 100
<tb> 2. <SEP> TLT <SEP> Challenge <SEP> : <SEP> 100,000 <SEP> cellules <SEP> viables
<tb> aucun <SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 35 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 29 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> cellules <SEP> irradiées <SEP> TLT <SEP> le <SEP> 45 <SEP> 28, <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 44, <SEP> 5 <SEP> 53, <SEP> 4 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60) <SEP> TLT <SEP> lM39, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 43, <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> TLT <SEP> lM <SEP> 40 <SEP> 14 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 42 <SEP> 45 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules)
<SEP> TLT <SEP> IM <SEP> 50 <SEP> 43 <SEP> 100
<tb> IP <SEP> 52 <SEP> 79 <SEP> 100
<tb>
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Les traitements prophylactiques prolongent le temps moyen de survie des animaux et leur espérance de vie est augmentée mais ils meurent tous. Les cellules irradiées (immunothérapie spécifique) ont un effet protecteur légèrement supérieur à l'antigène A60 (immunothérapie aspécifique). Le meilleur effet protecteur semble s'observer lorsque les deux traitements sont administrés en même temps.
Exemple 2
Le tableau II donne les index oncologiques observés avec le carcinome mammaire EMT6. Une dose de 100.000 cellules vivantes est inoculée par voie intramusculaire. Le traitement prophylactique consiste en un traitement spécifique par des cellules irradiées et un traitement aspécifique induit soit par l'antigène A60 du BCG inoculé 2 fois ou 3 fois, en suivant le protocole décrit dans l'exemple 1, soit par des cellules vivantes de BCG (100.000 cellules vivantes dans 100 pl, inoculées 2 fois par voie sous-cutanée avant le challenge tumoral). Une prophylaxie utilisant les deux approches en même temps a été également testée.
Tableau II
EMI11.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Lignée <SEP> tumorale <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Inc. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> aucun <SEP> EMT6 <SEP> 73 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> cellules <SEP> Irradiées <SEP> EMT6 <SEP> 78 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60) <SEP> EMT6 <SEP> 86, <SEP> 5 <SEP> 19, <SEP> 5 <SEP> 40
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> EMT6 <SEP> 84, <SEP> 5 <SEP> 18 <SEP> 20
<tb> 3 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> EMT6I1000
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (BCG) <SEP> EMT6 <SEP> 57,55-21 <SEP> 60
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (BCG <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> EMT6 <SEP> 71,
<SEP> 5-3 <SEP> 40
<tb>
Les valeurs rapportées dans les index oncologiques sont bien entendu calculées uniquement sur les souris qui ont développé une tumeur.
La tumeur est très efficace et la totalité des souris inoculées et non traitées prophylactiquement meurent.
Le temps moyen de survie des animaux témoins est de deux mois et dix jours (73 jours), ce qui est nettement meilleur qu'avec la tumeur du foie utilisée dans le premier exemple.
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Le traitement aspécifique par l'antigène A60 est très supérieur au traitement spécifique par cellules irradiées : toutes les souris traitées par des cellules irradiées meurent alors que deux inoculations de l'antigène A60 ont permis la survie de 60% des souris inoculées avec des cellules cancéreuses. Un traitement prophylactique basé sur les deux méthodes de protection appliquées en même temps est efficace à 100% lorsque trois inoculations d'antigène A60 sont utilisées : plus aucune souris ne meurt du cancer.
Le BCG est clairement inférieur à l'antigène A60 pour la prophylaxie, avec ou sans addition de cellules irradiées. Il faut noter le phénomène suivant : le traitement au BCG est efficace dans certains cas et une certaine proportion de souris (40% dans cette expérience) ne meurent plus ; par contre, lorsque le traitement n'est pas efficace et ne parvient pas à stopper le développement du cancer, l'augmentation de l'espérance de vie est réduite et les souris cancéreuses traitées par le BCG meurent plus rapidement que les contrôles (diminution de l'espérance de vie de 21,2 jours).
Il semble que le BCG possède un effet immunologique inverse de celui attendu : il semble favoriser dans certains cas la progression de la tumeur au lieu la freiner.
Exemple 3
Dans cet exemple sur l'effet prophylactique de l'antigène A60 extrait du BCG sur le carcinome (du poumon de Lewis) (3LL), les protocoles expérimentaux appliqués dans les exemples précédents sont reconduits.
Tableau III
EMI12.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Lignée <SEP> tumorale <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Inc. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> aucun <SEP> 3LL <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 80
<tb> cellules <SEP> Irradiées <SEP> 3LL <SEP> 39 <SEP> 4 <SEP> 90
<tb> 2 <SEP> x <SEP> (A60) <SEP> 3LL <SEP> 44211 <SEP> 30
<tb> 12 <SEP> x <SEP> (A60 <SEP> + <SEP> cellules) <SEP> 1 <SEP> 3LL <SEP> 1 <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> 1 <SEP> 20 <SEP> 1
<tb>
Les valeurs renseignées dans les index oncologiques sont bien entendu calculées uniquement sur les souris qui ont développé une tumeur.
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La tumeur n'est pas très efficace et 20% des animaux inoculés par 100.000 cellules vivantes survivent. Par contre, le temps moyen de survie des animaux cancéreux n'est que d'un peu plus d'un mois. L'antigène A60 utilisé en prophylaxie est très supérieur au traitement spécifique par cellules isologues irradiées (70% de survie versus 10%) et un traitement double améliore encore de façon très nette l'augmentation de l'espérance de vie (67 jours versus 12) ainsi que le temps moyen de survie.
Ces divers exemples montrent clairement que l'antigène A60 présente un effet supérieur à celui du BCG dans le traitement immunoprophylactique aspécifique des cancers, que le nombre de doses d'antigène A60 administrées importe, que l'effet est observable sur des tumeurs diverses (foie, glande mammaire et poumon) et que l'adjonction d'une prophylaxie spécifique améliore encore les performances du traitement.
Exemple 4
La tumeur EMT6 est un outil de choix pour l'étude de l'effet d'agents prophylactiques parce que l'incidence est 100% alors que l'efficacité de la tumeur est suffisamment faible (temps moyen de survie des animaux cancéreux d'environ 75 jours) pour observer des activités liminaires.
On extrait l'antigène A60 de diverses espèces de mycobac- téries de Nocordia et de Corynobacteria parvum et on applique ces extraits de façon prophylactique en deux doses de 30 pg/100 pl/ animal, administrées en une émulsion aqueuse dans l'huile par voie
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sous-cutanée 15 jours et 1 jour avant le challenge tumoral EMT6 (100. 000 cellules vivantes/100 pl/animal ; IM). Chaque groupe expéri- mental est constitué de 20 animaux.
Les index oncologiques obtenus sont assemblés dans le tableau IV.
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TABLEAU IV
EMI14.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur. <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Ine. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> aucun <SEP> 77 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> de <SEP> BCG <SEP> 83 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 40
<tb> M. <SEP> vaccae <SEP> 91 <SEP> 18,2 <SEP> 35
<tb> M. <SEP> smegmatis <SEP> 86 <SEP> 11, <SEP> 7 <SEP> 40
<tb> M. <SEP> paratuberculosis <SEP> 81 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 40
<tb> M. <SEP> tuberculosis <SEP> 84 <SEP> 9,i45
<tb> M. <SEP> xenopi <SEP> 83 <SEP> 840
<tb> Nocordia812 <SEP> 45
<tb> C. <SEP> parvum <SEP> 83 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> 40
<tb>
Les antigènes A60 extraits des différentes espèces appartenant au groupe MNC ont grosso modo le même effet prophylactique.
Cette expérience confirme les observations antérieures montrant que c'est l'ensemble du groupe MNC qui possède des propriétés immunomodulatrices exploitables pour l'immunoprophylaxie des cancers.
On observe un effet prophylactique plus accentué avec l'antigène A60 extrait de M. vaccae qu'avec d'autres antigènes : l'incidence du cancer est légèrement inférieure et l'espérance de vie est légèrement plus longue. Ces différences observées semblent non-significatives, mais il est possible que des extraits obtenus à partir d'espèces mycobactériennes particulières soient plus ou moins efficaces selon le type de cancer traité.
Exemple 5
D'autres immunopotentiateurs que les cellules irradiées isologues peuvent être utilisées conjointement avec l'antigène A60 pour obtenir un effet prophylactique encore meilleur.
1. Le poly (I : C) complexé avec la protamine selon des techni- ques connues est un puissant immunopotentiateur ainsi qu'un excellent promoteur d'interféron gamma.
2. L'antigène A60 a été, au cours des expériences précédentes, systématiquement solubilisé dans une phase aqueuse émulsifiée dans un volume égal d'huile minérale.
Cette émulsion d'eau dans l'huile est représentative de
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toute une classe d'agents immobilisateurs de l'antigène (émulsion d'eau dans l'huile, carbonate de calcium, phos- phate d'aluminium, latex, liposomes, bien connus de l'homme de l'art) qui potentialisent la réponse immuni- taire contre l'antigène inclus dans ces agents ou fixés sur eux. Une combinaison de ces deux immunopotentiateurs aspécifiques additionnels est tentée avec des cellules irradiées et avec l'antigène A60.
L'antigène A60 est inoculé 8 jours et 1 jour avant l'injection de cellules tumorales, selon les protocoles précédemment appliqués. L'antigène est solubilisé à 30 pg/50 pl d'une solution aqueuse tamponnée isotonique ou à 30 Mg/100 pl d'une émulsion d'eau dans l'huile. Le poly (I : C) est solubilisé à raison de 40 pg/100 pl d'une solution aqueuse isotonique ou dans 200 pl d'émulsion, inoculés 1 jour avant l'injection de cellules tumorales. Les cellules irradiées isologues sont suspendues dans une solution aqueuse tamponnée isotonique ou dans un volume double d'émulsion et inoculées 15 jours avant le challenge.
Le tableau V donne les index oncologiques trouvés pour le carcinome EMT6 (challenge IM de 100.000 cellules) chez des animaux traités prophylactiquement par ces divers agents immunopotentiateurs.
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Tableau V
EMI16.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur. <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Inc. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> Aucun <SEP> 74-100
<tb> Cellules <SEP> Irradiées <SEP> dans <SEP> phase <SEP> aqueuse <SEP> 79 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> Cellules <SEP> irradiées <SEP> dans <SEP> émulsion <SEP> 87 <SEP> 17, <SEP> 5 <SEP> 70
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60, <SEP> dans <SEP> phase <SEP> aqueuse <SEP> 78 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 80
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60, <SEP> dans <SEP> émulsion <SEP> 89 <SEP> 20 <SEP> 40
<tb> 40 <SEP> J. <SEP> tg <SEP> poly <SEP> (I <SEP> :
<SEP> C) <SEP> dans <SEP> phase <SEP> aqueuse <SEP> 78 <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> 80
<tb> 40 <SEP> J. <SEP> tg <SEP> poly <SEP> (I <SEP> : <SEP> C) <SEP> dans <SEP> émulsion <SEP> 91 <SEP> 23 <SEP> 35
<tb> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (I. <SEP> C) <SEP> dans <SEP> phase <SEP> aqueuse <SEP> 90 <SEP> 21, <SEP> 6 <SEP> 50
<tb> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (I <SEP> : <SEP> C) <SEP> dans <SEP> émulsion <SEP> 94 <SEP> 27 <SEP> 20
<tb> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (I <SEP> : <SEP> C) <SEP> + <SEP> cellules <SEP> dans <SEP> phase <SEP> 110 <SEP> 48,6 <SEP> 40
<tb> aqueuse
<tb> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (I <SEP> :
<SEP> C) <SEP> + <SEP> cellules <SEP> dans <SEP> émulsion- <SEP> - <SEP> 100
<tb>
Par rapport aux émulsions d'eau dans l'huile, l'absence d'émulsion diminue de façon très significative l'effet des différents agents anti-cancéreux mis en oeuvre.
On constate toutefois, même en solution aqueuse, une synergie entre l'antigène A60 et le poly (I : C) : l'augmentation de l'espérance de vie est doublée. Cette synergie est considérablement amplifiée par l'inclusion des agents dans une émulsion, avec un nombre de plus en plus élevé d'animaux qui échappent à la cancérisation. De plus, le système immunopoten- tiateur constitué de cellules irradiées suspendues dans une émulsion, plus l'antigène A60 et le poly (I : C) en émulsion, est le plus efficace, avec une protection contre la croissance tumorale étendue à toutes les souris traitées.
Exemple 6
La vitamine C (acide ascorbique) est un agent connu pour influencer et augmenter la résistance aux agents infectieux. Introduit dans la diète d'animaux cancéreux, il est connu que la vitamine C contribue de façon significative à la régression des tumeurs. La vitamine C a été distribuée dans l'eau de boisson des animaux, à la dose de 1,23 grammes
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par litre, changé tous les 2 à 3 jours, pour définir son effet sur le développement d'un challenge tumoral de cellules EMT6 (100.000 cellules vivantes) chez des souris traitées de façon préventive par différents agents antitumoraux.
Le poly A : U solubilisé dans une phase aqueuse puis émulsionné dans l'huile est utilisé au lieu du poly (I : C), en suivant un protocole identique à celui déjà décrit. Les autres agents sont également utilisés selon les protocoles décrits dans les exemples précédents, c'est-à-dire en une émulsion d'eau dans l'huile. Les résultats sont donnés dans le tableau VI.
TABLEAU VI
Challenge EMT 6 (100.000 cellules, IM)
EMI17.1
<tb>
<tb> Traitement <SEP> Index <SEP> oncologiques
<tb> T. <SEP> Moy. <SEP> Sur. <SEP> Aug. <SEP> Esp. <SEP> Vie <SEP> Inc. <SEP> Lo. <SEP> Terme
<tb> Aucun <SEP> 65 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> (BCG) <SEP> 69 <SEP> 6 <SEP> 30
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> avec <SEP> vitamine <SEP> C <SEP> 83 <SEP> 28 <SEP> 20
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (A:U) <SEP> 98 <SEP> 51 <SEP> 20
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (A:U) <SEP> avec <SEP> vitamine <SEP> C <SEP> 107 <SEP> 65 <SEP> 10
<tb> 2 <SEP> x <SEP> A60 <SEP> + <SEP> poly <SEP> (A:U) <SEP> + <SEP> cellules <SEP> irradiées <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> avec <SEP> vitamine <SEP> C
<tb>
L'incidence du cancer est réduite pour chaque traitement, chaque fois que la vitamine C est additionnée à ce traitement.
On observe également une substantielle augmentation de l'espérance de vie en présence de vitamine C. Avec l'antigène A60 seul, l'incidence est réduite de 30% à 20% et l'augmentation de l'espérance de vie des animaux cancéreux est prolongée de 6 à 26 jours lorsqu'ils reçoivent de la vitamine C. Lorsqu'un traitement composé d'antigène A60 plus acide nucléique bicaténaire dans une émulsion est administré, l'incidence est très réduite (seulement 10% des animaux ont un cancer). L'effet obtenu avec ce traitement, complété par des cellules cancéreuses isologues irradiées et en présence de vitamine C, est encore plus favorable et rejoint ceux observés dans les exemples 2 et 5 où la totalité des animaux
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traités ont été rendus immuns au challenge tumoral.
Cette observation n'est bien sûr valable que pour ce modèle expéri- mental murin précis mais la corrélation systématiquement observée entre les modèles expérimentaux et les effets prophylactiques observés en clinique rendent cette observation très intéressante.