"Procédé d'obtention de variants à infectivité réduite à partir de parasites protozoaires, variants ainsi obtenus et leur utilisation".
La présente invention est relative à un procédé d'obtention de parasites variants à infectivité réduite à partir de parasites protozoaires,
aux parasites variants ainsi obtenus ainsi qu'aux vaccins vivants ou tués contenant de tels variants .
De nombreux procédés de vaccination utilisant soit des souches de parasites protozoaires avirulents (Seah et Marsden, 1969 .:' The protection of mice against a virulent strain of Trypanosoma cruzi by previous inoculation with an avirulent strain. Ann. Trop. Med. parasitol., 63, 211-214), soit des extraits antigéniques (Seneca et coll.,
1966 : Active immunization of mice with Chagatoxin. Nature, 209, 309-310 ), soit des parasites protozoaires tués par irradiation (Hanson et coll., 1974 :
Current status of vaccination against Chagas' disease:
use of irradiated parasites in Parasitic zoonoes :
clinical and experimental studies. Ed. by E. Soulsby,
117-131. Académie press. ), par traitement à la mitomycine (Tarleton et coll., 1981 : Mitomycin C-treated Trypanosoma cruzi in vaccination of mice :
induction of immunosuppression but not protection. Infect.
Immun., 31, 693-697),par désintégration mécanique (Yanovsky et coll., 1969 : Trypanosoma cruzi; expérimental immunization of mice. Exp. Parasitol.
26, 73-85; Gonzales Cappa et coll. 1974 : Trypanosoma cruzi; protection of mice with epimastigote antigens from immunologically différent parasite strains.
Exp. Parasitol., 35, 179-186) , par congélation
(McHardy et Elphick, 1978 : Immunization of mice against infection with Trypanosoma cruzi. Cross - immunization between five strains of the parasite using freezethawed vaccines containing epimastigotes of up to
five strains. Int. J. Parasitol., 8, 25-31) ou par traitement au perchlorate (Rierzenbaum et coll.,
1975 : Immunization against expérimental Chaga's disease by using culture forms of Trypanosoma cruzi killed with a solution of sodium perchlorate. Infect. Immun. 12, 461-465) ont été décrits dans la littérature . Bien que des protections significatives aient été obtenues, il semble qu'aucun de ces procédés
n'ait permis de développer une manière générale de conférer sans danger une protection efficace contre les parasites protozoaires, et en particulier de permettre une immunité stérile et efficace.
Il est également connu qu'en traitant
in vitro avec un agent mutagène des cellules tumorales de souris, il est possible d'obtenir des variants cellulaires (tum-) qui sont incapables de former des tumeurs dans les souris syngéniques normales, tout en restant capables de former des tumeurs dans des souris immunodéprimées par une irradiation sublétale (Boon, T. et Kellerman, 0. (1977) : Rejection by syngeneic mice of cell variants obtained by mutagenesis of a malignant teratocarcinoma cell line Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 272-275; Van Pel et coll., (1979) : Tumor cell variants obtained by mutagenesis of a Lewis lung carcinoma cell line :immune rejection by syngeneic mice. Proc.Natl.Acad.Sci.:
<EMI ID=1.1> <EMI ID=2.1>
fréquences très élevées. Leur incapacité à former des tumeurs est due au fait qu'ils provoquent un rejet immunitaire chez l'hôte. La plupart des variants tum- portent un nouvel antigène, absent sur la cellule tumorale originale et propre à chaque variant (Boon et Van Pel, 1978 : Teratocarcinoma cell variants rejected by syngeneic mice; protection of mice immunized with these variants against other variants and against the original malignant cell line. Proc. Natl. Acad� Sci. USA, 75, 1519-1523: Van Pel et coll., 1979 : Mouse teratocarcinoma cell variants obtained by mutagenesis; rejection by syngeneic mice
<EMI ID=3.1>
Protides of biological fluids, 2 7th colloquium, 173-
177 ; Uyttenhove et coll., 1980 : Immunogenic variants obtained by mutagenesis of mouse mastocytoma P815 : T lymphocyte mediated cytolysis. J. Exp. Med., 152,
1184-1193) . En rejetant les variants tum-, les souris syngéniques acquièrent souvent une protection immunitaire vis-à-vis de la tumeur originale, même lorsque celle-ci paraît complètement incapable de susciter une réaction de rejet. (Boon et Van Pel, 1978 : Teratocarcinoma cell variants rejected by syngeneic mice :
protection of mice immunized with these variants against other variants and against the original malignant cell line. Proc. Natl; Acad. Sci. USA, 75,
1519-1523) .
On a donc examiné, suivant l'invention,
la possibilité d'obtenir une protection efficace contre les parasites protozoaires, totalement différente des procédés utilisés jusqu'à présent,
au départ de souches virulentes de parasites .
La présente invention consiste donc à palier aux inconvénients des procédés de vaccination connus et elle consiste essentiellement à mettre en contact in vitro une souche virulente de parasites protozoaires avec au moins un agent mutagène chimique dans des conditions qui permettent l'obtention de parasites variants, et plus particulièrement de clones variants à inactivité réduite etd'une immunogénicité accrue.
Suivant une forme de réalisation particulière.du procédé de l'invention, le parasite protozoaire est choisi dans le groupe formé par le Trypanosome cruzi, le Trypanosome africain (Rhodesiense, Ganbiense, Brucei , Vivax, congolense), le Leishmania
(Donovani, Tropica) , et le Plasmodium Falciparum
et l'agent. mutagène chimique est choisi
dans le groupe formé par la N-Méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, l'éthylméthanesulfonate, la N-méthylN-nitrosourée et leurs mélanges, l'agent mutagène chimique N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine convenant particulièrement bien avec le Trypanosome cruzi.
Suivant une autre forme de réalisation particulière de l'invention, le procédé d'obtention de variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite comprend n otamment l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi avec de la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine, dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose et des sels inorganiques à une
<EMI ID=4.1>
de cellules myocardiques de souris par la préparation de Trypanosome mutagénisé précitée à une température
<EMI ID=5.1>
des cellules, la mise en suspension du culot de cellules infectées dans un milieu nutritif aqueux contenant des sels inorganiques, du glucose, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, l'incubation de micropuits contenant un mélange de la suspension de cellules infectées susdite et
d'une préparation de cellules myocardiques de souris non infectées, et la récolte de clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite à partir de ces micropuits.
Avantageusement, après l'incubation de la souche de Trypanosome cruzi en contact avec la Nmëthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans le milieu nutritif aqueux précité, à une température de l'ordre de 36[deg.]C, la durée de cette incubation étant d'environ 1 heure, on centrifuge la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l' obtention d'un culot de Trypanosome cruzi, on introduit le culot de Trypanosome cruzi dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière
à obtenir une suspension aqueuse de Trypanosome cruzi, on met en contact la suspension de Trypanosome cruzi ainsi obtenue avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, le nombre de cellules myocardiques utilisées étant sensiblement supérieur au nombre de T.cruzi,on incube la solution ainsi obtenue pendant une durée'd'environ 3 à 6 jours à une température d'environ 37[deg.]C dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, de manière à obtenir ainsi une pénétration de l'ordre de 1% des cellules myocardiques de souris par les Trypanosomes cruzi et leur multiplication à l'intérieur de ces cellules, cette étape constituant l'infection clonale des cellules myocardiques,
on sépare les cellules myocardiques ainsi traitées de leur solution d'incubation
et on les introduit dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, on centrifuge ledit milieu nutritif jusqu'à l'obtention d'un culot de cellules , on
réintroduit le culot de cellules précité dans un milieu nutritif aqueux comprenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal de manière à obtenir une suspension aqueuse de cellules dont environ 1% sont infectées, on dilue la suspension, on la répartit dans des micropuits dans lesquels on ajoute également une préparation de cellules de souris myocardiques non infectées à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal, le nombre de micropuits étant sensiblement plus élevé que le nombre de cellules effectivement infectées
qui y sont distribuées, on incube les micro-
<EMI ID=6.1>
une période de l'ordre de 10 à 22 jours dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone et on recueille les clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite des micropuits qui en contiennent .
Suivant une forma * réalisation particulièrement avantageuse , l'incubation de la solution précitée permettant la pénétration par les Trypanosomes cruzi des cellules myocardiques et leur multiplication à l'intérieur de celles-ci est réalisée dans des boîtes du type pour culture de tissus, le milieu de culture nutritif utilisé lors de cette incubation étant séparé par aspiration après une période de l'ordre de 48 heures pour le remplacer par du milieu frais de même composition de manière
à éliminer les Trypanosomes cruzi qui n'ont pas pénétré dans les cellules myocardiques, les cellules myocardiques s'agglutinant sur les parois intérieures desdites boîtes.
La présente invention est également relative aux parasites variants à infectivité réduite ainsi obtenus ainsi qu'aux vaccins vivants ou tués contre les maladies parasitaires, qui comprennent, comme ingrédient actif, une souche de parasites va-
<EMI ID=7.1>
qu'obtenue par le procédé susmentionné, en association avec un diluant pharmacologiquement acceptable.
Ainsi qu'on pourra le noter, compte tenu de ce qui précède, les variants immunogéniques de l'invention ont été obtenus, comme dans le cas des variants cellulaires (tum ) obtenus au départ de cellules tumorales de souris, par mutagénèse et clon age. Toutefois, on précisera, à cet effet, que les parasites protozoaires sont tellement différents des cellules cancéreuses et les maladies parasitaires tellement différentes du cancer, qu'il n'est pas raisonnable de traiter l'obtention de parasites variants à infectivité réduite et leur usage en tant que vaccins comme une simple extension des résultats obtenus avec les variants de cellules cancéreuses.
En d'aut�s termes, le procédé d'obtention de variants de parasites par mutagénèse et clonage n'avait rien d'évident et il n'était pas du tout certain à priori que des variants protecteurs de parasites protozoaires et en particulier de Trypanosome cruzi pourraient être obtenus. D'autre part, outre le fait
que les procédés exacts de mutagénèse et de clonage utilisés pour les parasites protozoaires et les cellules cancéreuses saisît très différents, on notera, par exemple, que la protection obtenue contre le Trypanosome cruzi dans les sourie "vaccinées" avec les variants de ce parasite est largement supérieure
à celle obtenue contre le tératocarcinome original dans les souris "vaccinées" avec les variants de
cette lignée tumorale .
De plus, la présente invention diffère complètement des procédés d'atténuation fréquemment utilisés pour la préparation de vaccins. Ces procédés visent à obtenir des préparations d'agents pathogènes physiquement intacts mais dont la viabilité, c'est-à-dire la capacité intrinsèque à se multiplier, est réduite. Au contraire, l'invention vise à obtenir des clones de parasites à viabilité intacte, telle que mesurée par leur multiplication in vitro, mais dont le pouvoir infectieux est réduit en raison d'une susceptibilité accrue aux défenses de l'hôte.
Ainsi qu'on l'a déjà mentionné précédemment, le procédé de l'invention consiste à mettre en contact in vitro une souche virulente de parasite protozoaire avec un agent mutagène chimique dans des conditions qui permettent l'obtention de parasites variants, et plus particulièrement de clones variants
à infectivité réduite. Bien qua la description donnée ci-après soit relative à l'obtention de variants à infectivité réduite à partir de Trypanosome cruzi avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine comme agent mutagène chimique, on notera que le procédé de l'invention peut être applicable à tous les
parasites protozoaires et avec n'importe quel agent mutagène chimique efficace in vitro. On citera, à cet effet, à titre d'exemple comme parasites protozoaires le Trypanosome africain (Rhode siense, Gambiense, Brucei, Vivax, Congolen se), le Leishmania (Donovani, Tropica) et le Plasmodium Falciparum, et comme agents mutagènes, l'éthylméthanesulfonate et la Nméthyl-N-nitrosourée.
Suivant l'invention, on réalise l'incubation de la souche virulente de Trypanosome cruzi
avec de la N-mëthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine comme agent mutagène chimique, dans un milieu nutritif aqueux contenant des sels inorganiques et du glucose. Le milieu de Hanks, dont la composition est donnée ci-après, convient particulièrement bien à cet effet :
<EMI ID=8.1>
La durée de cette incubation est de l'ordre de 1 heure et elle se fait à une température d'environ
36[deg.]C. On centrifuge ensuite la solution d'incubation ainsi obtenue jusqu'à l' obtention d'un culot de Trypanosome cruzi, et on introduit le culot de Trypanosome cruzi dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines, auquel on a ajouté du sérum de veau fëtal, ce qui permet d'obtenir une suspension aqueuse de Trypanosome cruzi contenant, par exemple, environ 1 million de Trypanosomes cruzi par ml. On utilisera de préférence, à cet effet, comme milieu nutritif aqueux le milieu de Eagle modifié par Dulbecco, qui répond à la composition suivante :
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
On met en contact la suspension
de Trypanosome cruzi (T.Cruzi) ainsi obtenue avec des cellules myocardiques de souris dans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, le nombre de cellules myocardiques utilisé étant sensiblement plus élevé que le nombre de T.cruzi, et on incube la solution ainsi obtenue pendant une durée d'environ 3 à 6 jours à une température d'environ 35[deg.]C dans une atmosphère d'air et d'oxyde de carbone, ce qui permet d'obtenir une pénétration de l'ordre de 1 % de cellules myo-. cardiques de souris, par les Trypanosomes cruzi et leur multiplication à l'intérieur de ces cellules, cette étape constituant en fait l'infection clonale des cellules myocardiques.
Cette faible multiplicité d'infection, de l'ordre de 1 % . garantit statistiquement que la presque totalité des cellules infectées l'a été par un seul parasite. On sépare ensuite les cellules myocardiques ainsi traitées de leur solution d'incubation et on les introduit dans du milieu nutritif aqueux à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal (par exemple milieu DMEM + 10% de veau fétal ) , on centrifuge ce milieu nutritif jusqu'à l'obtention d'un culot de centrifugation
formé de cellules, on réintroduit le
oulot de cellules précité dans un milieu nutritif aqueux de la même composition ou d'une composition similaire au milieu nutritif utilisé dans l'étape précédente, de manière à obtenir une suspension aqueuse de cellules dont environ 1% sont infectées contenant, par exemple 10.000 cellules par ml, et on dilue cette suspension pour obtenir,. par exemple,
une concentration d'environ 200 cellules par ml.
Suivant l'invention, l'incubation
de la solution précitée permettant la pénétration
par les Trypanosomes cruzi des cellules myocardiques et leur multiplication à l'intérieur de celles-ci
est de préférence réalisée dans des bottes du type pour culture de tissus, par exemple les boites Falcon de Becton DickinsonJe milieu de culture nutritif utilisé lors de cette incubation étant séparé par aspiration après une période de l'ordre de 48 heures pour le remplacer par du milieu frais de même composition, de manière à éliminer les Trypanosomes cruzi qui n'ont pas pénétré dans les cellules myocardi�ues. Les cellules myocardiques qui s'agglutinent sur les parois intérieures de ces boîtes, sont séparées de celles-ci par un traitement à température ambiante avec une solution saline contenant un mélange de trypsine et d'éthylènediaminetétraacétate
(EDTA) , par exemple une solution saline contenant 0,5 gr/litre ce trypsine et 0,2 gr/litre d'EDTA.
Ensuite, on ajoute à la solution saline contenant les cellules myocardiques, du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal et on centrifuge le milieu nutritif jusqu'à l'obtention d u culot de cellules myocardiques précité.
Une fois que l'on a obtenu la suspension dont question ci-dessus dont la concentration par ml est, par exemple, d'environ 200 cellules myocardiques dont environ 1% sont infectées ,
on la répartit dans des micropuits dans lesquels on ajoute également une préparation de cellules myocardiques de souris non infectées à base de glucose, de sels inorganiques, d'aminoacides, de vitamines et de sérum de veau fétal, on incube les micropuits à une température d'environ 37[deg.]C pendant une période d'environ 10 à 22 jours, de préférence pendant 20 jours, dans une atmosphère d'air et de dioxyde de carbone, et on recueille les clones variants de Trypanosome cruzi à infectivité réduite
<EMI ID=11.1>
infectées sont distribuées dans ces puits en nombre tel qu'environ 5 à 15% des puits reçoivent une cellule infectée et que dès lors la plupart des puits positifs ne contiennent qu'un clone de parasites.
Après la période d'incubation de 10 à 22 jours
dont question ci-dessus, et de préférence après
une incubation de 20 jours, grâce à plusieurs cycles d'une multiplication intracellulaire on obtient une production d'environ 106 parasites par clone. L'obtention de ces clones variants à infectivité réduite nécessite donc l'utilisation d'un nombre
de micropuits sensiblement plus élevé que le nombre de cellules infectées utilisées. Les micropuits sont en fait de petits évidements, dont la profondeur et la largeur sont, par exemple, comprises entre 5 et 20 mm, moulés sur une plaque de matière plastique transparente, pourvue d'un couvercle également transparent. Ces plaques à micropuits sont bien connues des spécialistes de la technique.
Suivant l'invention, les clones variants de Trypanosome cruzi (T.cruzi) à infectivité réduite receuillis des micropuits peuvent soit être transférés à des cultures de cellules myocardiques pour permettre leur multiplication, soit être conservés par congélation, par exemple à une température d'environ -70[deg.]C dans du milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels inorganiques, des aminoacides, des vitamines et du sérum de veau fétal, auquel on ajoute, par exemple, environ 10% de diméthylsulfoxyde.
Pour ce qui est des souches de T.cruzi, celles-ci sont cultivées in vitro d'une manière connue en soi, par exemple avec des cellules myocardiques de sourisdans un milieu nutritif aqueux contenant du glucose, des sels in organique s, des aminoacides ,des vitamines et du sérum de veau fétal à une température d'environ 37[deg.]C dans un mélange d'air et de dioxyde de carbone, le rapport d'infection du nombre de T.cruzi au nombre de cellules étant de l'ordre de 2/1.
Avant l'incubation avec l'agent mutagène chimique, c'est-à-dire la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, dans le milieu nutritif à base de glucose et de sels inorganiques dont question précédemment, on centrifuge le surnageant de la culture de T.cruzi à la température ambiante pour précipiter les cellules myocardiques de souris et on centrifuge ensuite le surnageant de centrifugation ainsi obtenu pour précipiter les Trypanosomes cruzi.
<EMI ID=12.1>
lors de son utilisation, est de préférence utilisée sous la forme d'une solution aqueuse dont la concen-
<EMI ID=13.1>
férence d'environ 8 pg/ml.
L'exemple suivant illustre l'invention, et plus particulièrement l'obtention de clones mutagénisés à infection réduite à partir du Trypanosome cruzi. Il est bien évident que cet exemple est donné uniquement à titre illustratif, et qu'il ne limite en aucun cas l'invention.
Exemple.
Une souche de Trypanosome cruzi (T.cruzi)
<EMI ID=14.1>
Univer sity,Department of Microbiology and Public Health,East Lansing, Michigan, Etats-Unis d'Amérique) est cultivée in vitro avec des cellules de la lignée
<EMI ID=15.1>
T. , Buckingham, Dexter D.,Jakob H.et Jacob F.1974,Ann. Microbiol.(Inst.Pasteur) ,125 B:13-28) comme décrit par Bioul-Marchand, Jadin, Steiger et Boon dans <EMI ID=16.1>
in a mouse myocardial cell line, J. Parasitol., 66,
1050-1052. Le milieu de culture utilisé est le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, pH de l'ordre de
7), dont question précédemment, auquel on ajoute 10% de sérum de veau fétal (FCS) . La culture se fait à
<EMI ID=17.1>
On prend le surnageant d'une culture de T. cruzi contenant environ 50 millions de parasites (2 millions de cellules PCD1 ont été infectées 6 jours avant avec 4 millions de T.cruzi dans 20 ml de milieu dans une boîte pour culture de tissus
<EMI ID=18.1>
Le surnageant est centrifugé à température ordinaire à 160 g pendant 5 minutes pour précipiter les cellules PCD1. Le surnageant de centrifugation est centrifugé ensuite à 1400 g pendant 20 minutes pour précipiter les T. cruzi, que l'on remet en suspension dans du milieu Hanks ( voir ci-dessus, pH d'environ
7), à raison de 2 millions de parasites par ml.
Les parasites (10 millions dans 5 ml) sont incubés avec l'agent mutagène N-méthyl-N'-nitroN-nitrosoguanidine ( 8 �ug/ml) pendant 60 minutes
à 36[deg.]C , dans le tube de centrifugation fermé (mutagénèse).
Le tube est centrifugé à 1400 g pendant 10 minutes pour séparer les parasites du milieu contenant l'agent mutagène. Le culot de T.cruzi est resuspendu dans 10 ml de milieu DMEM + 10% de FCS. On centrifuge à nouveau à 1400 g pendant 10 minutes. On resuspend dans le même milieu pour obtenir un million de T.cruzi par ml.
On infecte avec 1 million de T.cruzi un grand nombre de boîtes "tissue culture" (Falcon
3002, Becton Dickinson) qui ont été chacune inoculées
<EMI ID=19.1>
Après 48 heures de culture, on aspire le milieu et on le remplace par du milieu frais pour éliminer les parasites qui n'ont pas pénétré dans les cellules PCDl (infection clonale des cellules PCDl) .
3 à 6 jours après l'infection décrite ci-dessus, on aspire le milieu de culture. Les cellules PCD1, dont environ 1% sont'infectées par des Trypanosomes, sont décollées de chaque boîte par un traitement de 4 minutes à température ordinaire avec 2 ml d'un mélange de trypsine et d'éthylènediaminetétraécatate (EDTA) (solution saline contenant 0,5g/litre de trypsine et 0,2g/litre d'EDTA délivrée par Grand Island Biological Company
043-5300). Après 4 minutes, on ajoute 2ml de DMEM
<EMI ID=20.1>
de FCS (à 4[deg.]C) dans un tube à centrifuger . Le tube est centrifugé à 160 g pendant 5 minutes pour précipiter les cellules. Le culot de cellules
<EMI ID=21.1>
10 .000 cellules par ml. Ces cellules sont ensuite diluées dans le même milieu pour avoir 200 cellules par ml. On inocule dans 600 micropuits d'une contenance de 3,5 ml (plaques à micropuits de Linbro 76
-033-05, de Flow Laboratories) 0,5 ml de la préparation de cellules infectées (100 cellules) et 0,1 ml contenant 900 cellules PCD1 non infectées. Les
<EMI ID=22.1>
plus tard, on observe qu'environ 15% des puits contiennent environ 1 million de parasites. Les autres puits n'en contiennent aucun (clonage des cellules infectées) .
Les parasites du surnageant de chaque micropuits sont ensuite transférés à des cultures de PCDl, comme décrit ci-dessus. Ceci permet de les multiplier indéfiniment. Les clones de parasites peuvent également être conservés par congélation à -70[deg.]C dans du milieu DMEM + 10% de FCS, auquel on ajoute 10% de diméthylsulfoxyde
<EMI ID=23.1>
mutagénisés) .
On donne ci-après un certain nombre de résultats biologiques mettant en évidence l'intérêt des parasites variants à infectvité réduite de la présente invention.
Des clones de parasites ont été obtenus à partir d'une population non traitée de trypanosomes de la souche FK (clones contrôles) et également à partir d'une population traitée in vitro
<EMI ID=24.1>
tagène N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoquanidine pendant
1 heure (clones mutagénisés). Ce traitement mutagène a tué à peu près 80% des parasites, à en juger par leur efficacité d'infection des cellules myocardiques qui s'est avérée cinq fois plus faible de celle de l'infection par les parasites non traités.
Dix clones contrôles ont été testés in vivo. Ils ont été injectés par voie intrapéritonéale (i.p.) à raison de 200.000 parasites par souris dans 3 souris 129/Sv adultes ayant reçu immédiatement avant une irradiation sublétale de 600 rads de rayonnement gamma provenant d'une source de césium. Toutes les souris ont montré une parasitémie supérieure à
106 par ml de sang au jour 10 après l'injection.
Pour chaque clone, on a sacrifié les souris infectées et prélevé dans leur sang 500.000 parasites que l'on a réinjectés i.p. à chacune de trois souris
129/Sv adultes non irradiées. Toutes ces souris sont mortes entre 15 et 20 jours après l'injection . Ce délai est fort semblable à celui obtenu avec la souche FK non clonée et maintenue en culture. Les résultats obtenus avec 5 de ces clones contrôles sont montrés dans le Tableau 1 ci-après.
TABLEAU 1
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
parasite. Un contrôle de la parasitémie sanguine a été effectué au moyen d'une cellule à numération de Burker : le nombre minimum des parasites pouvant être
<EMI ID=27.1>
indiquées comme survivantes ont vécu plus de 90 jours après l'injection.
A partir des parasites mutagénisés, on a pu obtenir 42 clones par multiplication in vitro. Les clones mutagénisés se sont multipliés in vitro à peu près à la même vitesse que les clones contrôles. Par contre, les résultats obtenus in vivo avec ces clones se sont avérés très différents de ceux obtenus avec les contrôles, comme on peut le voir dans le Tableau 2 suivant.
TABLEAU 2.
<EMI ID=28.1>
Les clones obtenus in vitro ont été injectés i.p. dans des souris irradiées à 600 rads
(200.000 parasites par souris) . Les clones qui ont produit une infection aiguë dans les souris irradiées ont été injectés dans des souris normales (500.000 parasites par souris) .
Lorsque les clones mutagénisés ont
été injectés comme les autres à des groupes de souris irradiées à 600 rads, on a observé que pour 20 d'entre eux les souris n'ont pas présenté les symptômes indiquant une parasïtémie élevée et ont toutes survécu plus de 100 jours, moment auquel la plupart des souris ont montré une parasitémie faible située entre 10 <3> et 104 par ml de sang. Pour les 22 autres clones mutagénisés, tous les groupes de souris irradiées ont montré les symptômes de la maladie aiguë ainsi qu'une parasitémie sanguine supérieure à 106 par ml de sang à un moment situé entre 12 et 29 jours après l'injection. Comme pour les contrôles, on a alors sacrifié ces souris et pour chaque clone,
500.000 parasites prélevés dans leur sang ont été injectés i.p. à trois souris 129/Sv non irradiées.
Contrairement aux clones contrôles, 21 de ces 22 clones mutagénisés se sont avérés incapables de produire une infection aiguë dans les souris normales. Toutes les souris ont survécu plus de 90 jours. A ce moment, on a observé une parasitémie
<EMI ID=29.1>
tenus avec 4 clones mutagénisés produisant une parasitémie particulièrement faible sont donnés dans le Tableau 1 ci-dessus .Afin d'examiner si les clones mutagénisés peuvent induire une protection contre le parasite virulent, les groupes de souris auxquelles on avait injecté ces quatre clones ont reçu
<EMI ID=30.1>
rasites provenant du clone contrôle n[deg.] 4. Les animaux n'ont présenté aucun symptôme de l'infection aiguë et ont survécu pendant 150 jours après cette injection secondaire. Ils ont alors été sacrifiés et leur parasitémie sanguine a été examinée. Aucun parasite n'a été observé,ce qui a permis d'estimer que leur parasitémie était inférieure à 250 par ml de sang. L'injection du même clone contrôle à 7 souris normales a causé leur mort en maladie aiguë
(plus de 106 parasites par ml de sang) au bout de
14 jours en moyenne.
L'infectivité réduite des clones mutagénisés n[deg.] 46, 59, 64 et 69 a pu être confirmée au cours de plusieurs expériences (voir Tableau 3).
TABLEAU 3.
<EMI ID=31.1>
<EMI ID=32.1>
parasite.
Des souris DBA/2 adultes, non irradiées ou irradiées à 750 rads ont reçu une injection i.p. de parasites aux doses indiquées. Les parasites provenaient du sang de souris qui avaient été irradiées à 750 rads avant l'infection . Les animaux indiqués comme survivants ont vécu plus de 100 jours après l'injection.
Des tests effectués à 70 jours après l'injection ont cependant montré que la plupart des souris injectées par ces clones avaient une para-sitémie faible mais non nulle de l'ordre de 10<3> par ml de sang. On a pu confirmer également que ces clones induisent régulièrement une protection contre l'injection du clone contrôle virulent
(voir Tableau 4) .
TABLEAU 4.
<EMI ID=33.1>
Des souris DBA/2 adultes ont été injectées i.p. avec 500.000 parasites provenant d'un clone mutagénisé. 40 jours plus tard, ces souris ont reçu une injection i.p. de 500.000 parasites virulents du clone n[deg.] 4 provenant du sang de souris irradiées et injectées avec ce clone.Les souris non immunisées ont été injectées avec la même dose du clone n[deg.] 4.
Comme mentionné précédemment, de nombreux clones mutagénisés n'ont pas produit d'infections aiguës dans les souris irradiées à 600 rads
(Tableau 2). Trois de ces clones ont été injectés
à des souris irradiées à 750 rads: Ils y ont produit des infections aiguës. Un de ces clones (ne 38) a été injecté à raison de 500.000 parasites à des souris DBA/2 normales. On a observé qu'après une période
de multiplication, ce clone est complètement éliminé par l'hôte environ 20 jours après l'injection. De nombreux testa effectués sur plusieurs souris à des temps supérieurs à 20 jours après l'injection n'ont permis de déceler aucun parasite vivant
<EMI ID=34.1>
une protection contre le clone contrôle virulent.
Il est donc probable que certains variants obtenus par mutagénèse constitueront des vaccins vivants permettant d'obtenir une immunité stérile contre
le T.cruzi virulent.
Les clones de trypanosomes peuvent être conservés par congélation, passage en culture ou passage dans des souris irradiées à 750 rads. On
a observé que l'infectivité réduite des clones mutagénisés n[deg.] 46, 59, 64 et 69 est un caractère stable, persistant après deux mois de transferts continus dans des souris irradiées. Pour les clones
46 et 69, on a pu vérifier que le caractère persiste après 10 mois de passages in vivo.
Les résultats décrits ici indiquent qu'il est possible d'obtenir par traitement mutagène d'une souche de Trypanosome cruzi des clones variants à infectivité réduite. La fréquence des variants
à infectivité réduite dans la population de parasites mutagénisés est très élevée et ces variants paraissent stables. De plus, les variants ont conservé la capacité de provoquer une infection aiguë dans les souris irradiées. Finalement, ces variants induisent une protection significative contre des trypanosomes virulents. Il est dès lors probable que, comme les variants tum , obtenus à partir de cellules tumorales de souris, les parasites variants, <EMI ID=35.1>
immunogénicité accrue qui cause leur rejet par les souris normales mais pas par les souris immunodéprimées par irradiation.
Ainsi qu'on l'a déjà décrit précédemment, la présente invention se rapporte également aux vaccins vivants ou tués comprenant, comme ingrédient actif, une souche de parasites variants à infectivité réduite telle qu'obtenue suivant l'invention, par exemple une souche de T.cruzi, en association avec
un diluant ou véhicule pharmacologiquement acceptable. On pourrait également envisager l'utilisation
de vaccins suivant l'invention combinés à au moins
un autre vaccin vivant ou tué contre les maladies parasitaires, de manière à obtenir des vaccins vivants ou tués polyvalents.
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes
de réalisation décrites et que bien des modifications peuvent être envisagées sans sortir du cadre du présent brevet.
C'est ainsi que l'on pourrait envisager bien entendu d'utiliser d'autres souches de parasites protozoaires et d'autres agents mutagènes chimiques pour la préparation de vaccins efficaces, que ceux
qui ont été cités d'une manière explicite.
REVENDICATIONS .
1. Procédé d'obtention de parasites
<EMI ID=36.1>
du parasite protozoaire avec au moins un agent mutagène chimique dans des conditions qui permettent l'obtention de clones variants à infectivité réduite .