JPS58874B2 - 糖蛋白ｗｅｎａｃ及びその製造法 - Google Patents

糖蛋白ｗｅｎａｃ及びその製造法

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JPS58874B2
JPS58874B2 JP54110724A JP11072479A JPS58874B2 JP S58874 B2 JPS58874 B2 JP S58874B2 JP 54110724 A JP54110724 A JP 54110724A JP 11072479 A JP11072479 A JP 11072479A JP S58874 B2 JPS58874 B2 JP S58874B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、本発明者らが先に特願昭５０−１２２１９７
号（特開昭５２−４７９０９号）をもって特許出願した
発明を更に進展させたものに相当するものである。
すなわち、先の特願昭５０−１２２１９７号発明は非病
原性好気性コリネバクテリウムに属する菌株を培養して
得られた抗アレルギー性、抗ガン作用及び牌細胞並びに
リンパ球の免疫的賦活化作用を有する非水溶性培養物の
製法に関するものであった。
しかしながら得られる培養物（菌体）は、非水溶性であ
るため、懸濁液として皮下注射した場合には、ＢＣＧを
皮下注射した場合と同様の硬結が起り到底連続投与する
ことができず、また毒性も強い等の難点があったため、
現実には医薬として用いることは困難であった。
本発明者らは、更に研究した結果、種々の有用な薬理作
用を有する非病原性好気性コリネバクテリウムの培養物
（菌体）より医薬品として実用的に用いることができる
水溶性の活性物質を分離抽出することに成功した。
そして、この分離抽出物が蛋白、糖及び核酸よりなる物
質で単一体であることを確認し、これをＷＥＮＡＣと命
名するに至った。
すなわち、本発明により得られた水溶性抽出物である糖
蛋白ＷＥＮＡＣは抗ガン作用、免疫的賦活化作用、殊に
即時型アレルギーの本体であるＩｇＥ抗体の産生を特異
的に抑制し強力な抗アレルギー作用を有するだけでなく
、原料培養物（菌体）に比べて毒性も著しく弱い。
そしてこの糖蛋白ＷＥＮＡＣは水溶性であるため、皮下
注射による連続投与が可能であってアレルギー疾患の治
療法として重要な脱感作療法に準じて用いることができ
、医薬として実用的に用いることができる。
まず、本発明物質の製造法について説明すれば、先の特
願昭５０−１２２１９７号発明は使用菌として、いずれ
も非病原性好気性コリネバクテリウムに属する菌株、例
えばコリネバクテリウム、イクイＩＩＤＫｏ−８５株を
好気的に培養して目的物を得たのであったが、本発明に
おいては該目的物を出発原料として使用するものである
。
本発明で用いられる非病原性好気性コリネバクテリウム
に属する菌株としては、コリネバクテリウム、イクイ（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｑｕｉ）ＩＩＤＫ
ｏ−８５、コリネバクリチウム・ピオゲネス（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩＤＴ
ｏｊ。
Ｈａｉ、コリネバクテリウム・セロシス（Ｃｏｒｙｎｅ
−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ）ＩＩＤ５３−
に−１、コリネバクテリウム・レナーレ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）ＩＩＤ Ｕｔｓｕ
ｎｏｍｉｙａ−Ｕｓｈｉが挙げられる。
これ等菌株はいずれも当業者が容易に入手することがで
きるものであり、また東京大学医科学研究所に標準法と
して保存されている（ＪＦＣＣＣａｔａｌｏｇｕｅ ｏ
ｆ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、１９６２）。
特に好ましい菌株としてはコリネバクテリウム・イクイ
ＩＩＤＫｏ−８５である。
これ等非病原性好気性コリネバクテリウムの培養物（菌
体）は、コリネバクテリウム菌の好気性培養に通常用い
られる培養方法により好気的に培養することにより得ら
れる。
かくして得られる原料培養物（菌体）、即ち、非病原性
好気性コリネバクテリウム属に属する菌株を好気的に培
養して得られた培養物（菌体）を、好ましくは低温処理
して、破砕し、得られた破砕物を超音波処理して分離し
た有効成分の水溶液をｐＨ３，７０〜３．７５の範囲内
で沈殿を生じさせ、この沈殿物をほぼ中性の水溶液とし
て透析を行い、次いで所望により凍結乾燥することによ
って水溶性の活性物質である糖蛋白ＷＥＮＡＣが得られ
る。
本発明の糖蛋白ＷＥＮＡＣの構成成分の詳細は不明であ
るが、蛋白部分、糖部分及び核酸部分を一定の比率で含
有する糖蛋白性の物質であることは判明している。
本発明の糖蛋白ＷＥＮＡＣは、次のような理化学的性質
を有する。
ａ）蛋白部分と糖部分の割合： 銅フォーリン法による蛋白含量とフェノール硫酸法によ
る糖含量より算出される蛋白部分／糖部分の割合が３．
９７０．５２〜５．５１０．４１即ち７．５０〜１３．
４２である。
銅フォーリン法による蛋白含量は仔牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）の換算値として、フェノール硫酸法による糖含
量はグルコースの換算値として求めたものである。
ｂ）核酸部分： ２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の
比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）は１．５６〜１．６２で
ある。
この比は核酸部分と蛋白部分の量的関係を意味する。
（日本生化学金線 生化学実験講座５酵素研究法上 東
京化学同人出版１９７５年８月２０日発行第２４−２６
頁） Ｃ）等電点：３．７５〜３．８０ 本島の沈殿法による等電点は、３．５〜４，１の範囲内
にあるが、頂点を求めるとほぼ３．７５〜３．８０とな
る。
ｄ）分子量： セファデックスＧ２００ゲルにおける溶出曲線：第１図
に示すとおりである。
ウルトロゲルＡｃＡ３４における溶出曲線：第１図−Ｂ
に示すとおりである。
ｅ）元素分析： 元素分析値より算出されるＧＨＮの相対比は以下のとお
りである。
Ｃ７１％ ＨＩＯ％ Ｎ１９％ 本島の製造の際に生理食塩水を用いて透析を行うか否か
等により元素分析値は変動するが、元素分析値より算出
されるＣＨＮの相対比は上記の如く一定である。
ｆ）赤外線吸収スペクトル：第５図に示すとおり特性吸
収を有する。
ｇ）紫外線吸収スペクトル：第６図に示すとおり吸収極
大と吸収極小を有する。
ｈ）物質の色・形状： 微黄白色粉末。
本島の水溶液（０，５％）は淡黄褐色の澄明ないしやや
白濁した液である。
ｉ）塩基性、酸性、中性の区別： 本島の水溶液（０，５％）はｐＨ６，２〜７．８を示す
。
ｊ）呈色反応：ビユレット反応（蛋白定性反応）、アン
トロン反応（糖定性反応）陽性 ｋ）比旋光度： １）構成アミノ酸：６Ｎ塩酸の加水分解により次のアミ
ノ酸が確認される。
アラニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、アスパ
ラギン酸、バリン、リジン、スレオニン、アルギニン、
セリン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、
ヒスチジン、メチオニン、チロシン ｍ）構成糖：２．５Ｎトリフロロ酢酸の加水分解により
少なくとも次の糖が確認される。
リボース、マンノース、ガラクトース、グルコース ｎ）本旨は、ＩｇＥ抗体の産生を特異的に抑制する。
原料培養物（菌体）の製法 コリネバクテリウム・イクイＩＩＤＫｏ−８５を培養基
（肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、グルコース１０ｇ
１食塩１ｇ及び蒸留水１，０００ｍ１を水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨ７，４に調整した）を用い３７℃で５日
間培養する。
次いで流速５０ｍ１／分で１０，０００回転／分で連結
遠心し、その沈渣（菌体）を生理食塩水で３回遠心洗浄
し、原料培養物（菌体）とする。
培養物菌体の収量は使用培養基１０１につき１７．０ｇ
（湿重量）であった。
ＷＥＮＡＣの製造例 ｌ 原料培養物（菌体）５０ｇを生理的食塩水で十分洗浄し
、−２０℃において４８時間以上低温処理を施し、次い
でビブロゲンミルにかけて菌体を破砕する。
破砕物を適当量の水または種水酸化ナトリウム水溶液に
浮遊させ、更に氷水中で２０キロサイクル（ＫＣ）超音
波処理を１０分間ずつ６回行なった後に振盪抽出を行な
う。
得られた抽出物１５０ｇを１０５，０００Ｘｇで６０分
間遠心し、破壊菌体残渣及び不溶物を除去する。
この上清液を菌体漫画２５％相当濃度とし、８〜１０℃
でＩＮ塩酸を用いて正確にｐＨ３，７０〜３．７５とし
４８時間以上沈殿物を熟成させる。
沈殿物を遠心して集め、ｐＨ７，２にして水に溶かし、
一夜透析を行ない、ｐＨ７，０に修正して１２，０００
×ｇで６０分間遠心分離後上清液（抽出液）を得る。
次いでこのものを凍結乾燥して糖蛋白ＷＥＮＡＣを得る
。
収量５００ｍｇ（乾重量）。ＷＥＮＡＣの製造例２ 原料培養物（菌体）１５２ｇを一２０℃で４８時間低温
処理した後、０．１ｍｍ径のガラス玉と共に蒸留水に懸
濁し、０℃においてピブロゲンセルミル（ＶＣＨ−１）
で４，５００ｒｐｍで３０分間処理を１０回行なって菌
体を破砕する。
次いで上清液を１．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た後、氷水中で２０キロサイクル（ＫＣ）超音波処理を
１５分間行ない、３．０００ｒｐｍで２０分間、１６，
０００ｒｐｍ（２０，０００Ｇ）で４０分間遠心分離し
、破壊菌体残渣および不溶物を除去する。
この上清液を菌体漫画２５係相当濃度とし、４℃でＩＮ
塩酸を用いて正確にｐＨ３，７０とし、一夜放置し沈殿
物を熟成させる。
この沈殿物を５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して
集め、ＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０にして蒸留水
に溶解し、４℃において蒸留水で一夜、次いで生理食塩
水で２日間透析を行ない、ｐＨを７．０に調整し、１６
，０００ｒｐｍ（２０，０ＯＯＧ）で４０分間遠心分離
後、上清液をメンブランフィルタ−（ミリポアＨＡ）で
濾過して抽出液５００ｍ１を得る。
次いで、この抽出液を凍結乾燥して、糖蛋白ＷＥＮＡＣ
を得る。
Ａ 本抽出液の理化学的性質 本抽出液の外観は淡黄かつ色の澄明な液である。
本抽出液のｐＨを３．７５〜３．８０に調整すると沈殿
を生じる。
上記製造例によって１３個（ロット）の検体（抽出液）
を個別に調製し、それぞれＮｏ、１〜１３で表わした検
体について、銅フォーリン法による蛋白含量、フェノー
ル硫酸法による糖含量、それ等含量より算出される蛋白
部分／糖部分の割合、核酸部分についての２６０ｎｍ及
び２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の比（２６０ｎ
ｍ／２８０ｎｍ）及び沈殿法による等電点を測定した結
果を以下に示す。
※１蛋白含量（銅フォーリン法） 本抽出液に水を加えて１０倍稀釈液とし、その０．６ｍ
ｌにＣ液３ｍｌを加え室温で１０分間反応させる。
反応後フェノール液（市販品を水で倍稀釈）を０．３ｍ
ｌ加え、室温にて３０分間放置したのち、５００ｎｍの
ＯＤを測定する。
ＢＳＡによる検量曲線を０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃
度範囲に作成し検量線から被検液の蛋白含量（ＢＳＡ換
算値）を求める。
Ａ液：０．ＩＮ水酸化ナトリウム溶液に炭酸ナトリウム
を加え濃度を２％とする。
Ｂ液：１０％クエン酸ナトリウム液に硫酸銅を加え濃度
を０，５％とする。
Ｃ液：Ａ液５０ｄ：Ｂ液１ｍ１（５０：１）※２糖含量
（フェノール硫酸法） 本抽出液に水を加えて１０倍稀釈液とし、その１ ｍｌ
に５％フェノール液１ｍｌおよび硫酸５ｍｌをすみやか
に加える。
２０分間放置したのち、４９０ｎｍのＯＤを測定する。
ブドウ糖水溶液による検量曲線を０．０２〜０．２ｍｇ
／ｍｌの濃度範囲に作成し検量線から被検液の糖含量（
グルコース換算値）を求める。
※３核酸部分 本抽出液に水を加えて適当な濃度に希釈し、２６０ｎｍ
及び２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定し、そ
の比を求める。
Ｂ 糖蛋白ＷＥＮＡＣの理化学的性質 ■ 前記抽出液Ｎｏ、Ｉ〜１３を個別に２ｍｌのバイア
ル瓶に分注し、凍結乾燥して糖蛋白ＷＥＮＡＣを得る。
それぞれＮｏ、ｌ〜１３で表わした検体について、銅フ
ォーリン法による蛋白含量、フェノール硫酸法による糖
含量、それ等含量より検出される蛋白部分／糖部分の割
合、核酸部分についての２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにお
ける光学密度（ＯＤ）の比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）
及び沈殿法による等電点を測定した結果を以下に示す。
なお、銅フォーリン法による蛋白含量、フェノール硫酸
法による糖含量及び核酸部分の測定法は、検体の各バイ
アル瓶に水２ｍｌを加えＷＥＮＡＣを溶解した後、前記
※１．※２゜※３と同様に行なった。
また、Ａ１４の検体は、Ｎｏ、５のＷＥＮＡＣ（凍結乾
燥品） １３．８２ｍｇに水２ｍｌを加えて溶解した後
、上記と同様に行なったものである。
■上記各検体（ＷＥＮＡＣ）について、元素分析値より
算出されるＣＨＮの相対比及び比旋光度を測定した結果
を以下に示す。
比旋光度は、各検体１０ｍｇを水に溶解し、適当量の尿
素を加えて全量５ｍｌとし、必要により遠心分離した液
について測定した。
■分子量： 水晶のセファデックスＧ２００ゲルにおける溶出曲線は
第１図に示すように単一のピークを示す。
ヘッドボリウムは３．０Ｘ６０ｃｍ。展開液は０．０１
Ｍリン酸緩衝液で流量は２０．８ｍｌ／時間である。
縦軸は２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）、横軸は溶
出量（ｍｌ）を示す。
また、水晶のウルトロゲルＡｃＡ３４における溶出曲線
は第１図−Ｂのとおりである。
カラムサイズは２．８Ｘ８４ｃｍ、展開液は０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（０，８５％食塩を含む）で、流量は１４
．０ｍｌ／時間である。
縦軸は２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）、横軸は溶
出量（ｍｌ）を示し、■は牛ガンマーグロブリン（分子
量：Ｉ６０，０００）、２はツインビントリプシンイン
ヒビター（分子量：２１，７００）の溶出位置を示す。
■赤外線吸収スペクトル： 臭化カリウム錠剤法により測定した水晶の赤外線吸収ス
ペクトルは第５図に示すとおり特性吸収を有する。
■紫外線吸収スペクトル 水晶の紫外線吸収スペクトルは第６図に示すとおり吸収
極大と吸収極小を有する。
■物質の色・形状： 微黄白色粉末。
水晶の水溶液（０，５％）は淡黄褐色の澄明ないしやや
白濁した液である。
■塩基性、酸性、中性の区別： 水晶の水溶液（０，５％）はｐＨ６，２〜７．８を示す
。
■呈色反応： ビユレット反応（蛋白定性反応）陽性。
即ち、水晶の水溶液（０，５％）０，５ｍｌに水酸化ナ
トリウム試薬０．５ｍｌを加えてアルカリ性とした後、
硫酸銅溶液（１→１００）３滴を加えるとき、液は紫色
を呈する。
アントロン反応（糖定性反応）陽性。
即ち、水晶の水溶液（０，５％） ０．５ ｍｌにアン
トロン試液１ ｍｌを添加し、水浴中で加温するときは
緑色を呈する。
■構成アミノ酸： ６Ｎ塩酸の加水分解により次のアミノ酸が確認される。
即ち、水晶１０ｍｇを含む６Ｎ塩酸溶液１ ｍｌをアン
プルに入れ脱気封管後１１０℃で２４時間加熱加水分解
し、アミノ酸自動分析により分析するとき次のアミノ酸
が確認される。
アラニン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、アスパ
ラギン酸、バリン、リジン、スレオニン、アルギニン、
セリン、プロリン、インロイシン、フェニルアラニン、
ヒスチジン、メチオニン、チロシン。
■構成糖： ２．５Ｎトリフロロ酢酸の加水分解により少なくとも次
の糖が確認される。
即ち、水晶１０ｍｇを含む２．５Ｎトリフロロ酢酸溶液
１０ｍ１をアンプルに入れ脱気封管後１００℃で７時間
加熱加水分解した後、加熱乾燥する。
次いで水０．２５ｍ１で溶解し、アンバーライト１２０
（Ｈ＋）及びアンバーライト４Ｂ（−ＣＯＯ−）を通し
、糖溶出部分を加熱乾燥後、水Ｑ、１ｍｌで溶解し、還
元糖自動分析システムにより分析するとき少なくとも次
の糖が確認される。
リボース、マンノース、ガラクトース、グルコース。
Ｃ糖蛋白ＷＥＮＡＣの生物学的性質 ■イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体産生抑制作用 ２μｇのＤＮＰ−ＯＡを水酸化アルミニウムゲルと共に
生理食塩水に懸濁し、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内投与
した後、２及び７日目にＷＥＮＡＣ６００μｇを腹腔内
投与した。
免疫５日後、１０，１５，２０，２５及び３００日目血
清をプールし、ＳＤ系ううト後背部皮ふに感作し、４時
間後に尾静脈より０．５％Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅを含む
抗原ＤＮＰ−ＢＳＡ溶液を注射し、発現する色素浸出反
応をもってＩｇＥ活性を測定した。
ＤＮＰ−ＯＡ感作ＢＡＬＢ／Ｃマウスを３群に分け、第
一群マウス（第２図中縦軸ム）にはＷＥＮＡＣを、第２
群マウス（第２図中縦軸△）には嫌気性コリネバクテリ
ウムパルバム死菌体を、そして第３群マウス（第２図中
縦軸○）には対照として生理食塩液を感作後２日目と７
日目に接種した。
その結果を第２図に示す。第２図中縦軸はＩｇＥ抗体価
、横軸はＤＮＰ−ＯＡ感作後の日数を示す。
第２図より、本発明のＷＥＮＡＣが即時型アレルギーの
本体であるＩｇＥ抗体産生を特異的に抑制することは明
らかである。
■受身皮肉アナフイラキシス反応（ＰＣＡ）抑制作用 あらかじめＳＤ系ラットを本発明のＷＥＮＡＣで処理し
ておき、２時間後に抗ＤＮＰ（ハプテン）ＩｇＥ抗体を
皮肉に接種し、型のごとくＩｇＥ抗体反応を受身皮肉ア
ナフイラキシス反応（ＰＣＡ）で行なった結果を表Ｉに
示す：本発明のＷＥＮＡＣは表■に示す通り、■ｇＥ抗
体の標的細胞（肥満細胞や好塩球細胞等）への付着をブ
ロックし、抗原侵入時のヒスタミンの遊離を抑制する。
■ＩｇＥ抗体の標的細胞への付着ブロック作用またＩｇ
Ｅ抗体の標的細胞への付着ブロック作用は、ＩｇＥ抗体
感作前に本発明のＷＥＮＡＣを処理する方が感作後に処
理するよりその作用が顕著であった。
その結果は表Ｉ−Ｂに示す。
同表中、本発明のＷＥＮＡＣの処理量は１．０ｍｇであ
り、ＰＣＡ値は抽出色素量で表わされている。
上記実験結果から、本発明のＷＥＮＡＣが抗原の種類を
問わず抗原に感作されたＩｇＥ抗体の標的細胞への結合
を阻止し、その後の広範囲なアレルギー反応を抑制する
ことを示している。
■抗ハプテンＩｇＧ抗体の産生増強作用 ７週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスに本発明の ｗＥＮＡＣｏ、１ｍｇを静脈内に注射し、７日および１
４日後にＤＮＰ−ＯＡ１００μｇを静脈内感作した。
さらに、３日後に肺細胞中の抗体産生細胞数をＤＮＰ−
ＢＳＡ結合ヒツジ赤血球を用いてカニンガムの間接法に
より測定した。
その結果を表Ｈに示す。
本発明のＷＥＮＡＣが、抗ハプテンＩｇＧ抗体の産生を
増強することは表■に示す如く明らかである。
従って、本発明のＷＥＮＡＣが免疫的賦活化作用を有し
ており、本則の投与によりアレルギー性抗体以外の抗体
産生能は促進されても低下しないことは明らかである。
■共通抗原性 ゲル内沈降反応（オフタロニー法）によって共通抗原性
を調べた。
抗コリネバクテリウム・イクイ家兎血清および抗結核菌
家兎血清を用い、ｌｏｍｇ／ｍｌに調整した本発明のＷ
ＥＮＡＣおよびツベルクリン蛋白溶液（ＴＡ２）を抗原
とし、オフタロニー法によりゲル内沈降反応をおこなっ
た。
その結果を第３図に示す。
図中、左図は、抗コリネバクテリウム家兎血清（上部○
）に対するツベルクリン蛋白溶血（ＴＡ２）（下部圧○
）と本発明のＷＥＮＡＣ（下部布○）との共通沈降線を
示す。
右図は、抗結核菌家兎血清（上部○）によるＴＡ２（下
部圧○）及び本発明のＷＥＮＡＣ（下部布○）の共通抗
原性を示す。
第３図に示す沈降線より本発明のＷＥＮＡＣはツベルク
リン蛋白と共通抗原性を有することが明らかである。
■抗補体作用 ＳＤ系ラットの血清を各種濃度の本発明のＷＥＮＡＣと
３７℃で１時間反応させた後、補体の残存溶血活性を抗
ヒツジ赤血球抗体で感作したヒツジ赤血球を用いて測定
した。
その結果を第４図に示す。
図中、横軸は本発明のＷＥＮＡＣの添加量（μｇ） 、
縦軸はヒツジ溶血反応の阻止率（％）を示す。
第４図より明らかな如く、本発明のＷＥＮＡＣに顕著な
抗補体作用があることが、ヒツジ赤血球の溶血反応の阻
止率により確認された。
この抗補体作用は、本発明のＷＥＮＡＣで動物を処理す
ることにより、その血清中の補体価を低下させることに
よっても確認されている。
■ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ及びｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８
／８０によるラット肥満細胞よりのヒスタミン遊離に対
する抑制作用 ａ））リス緩衝液ＴＡＣＭ［０，０２Ｍトリス、０．１
２ＭＮａＣ１，０，００３ＭＫＣｌ、０．１％グルコー
ス（ｗ／ｖ）、０．００１ＭＣａＣｌ２返び０、４ｍＭ
ＭｇＣｌ２．ｐＨ７，０）に懸濁した２×１０５個の
ラット腹腔内肥満細胞をＷＥＮＡＣと３７℃で３０分間
作用させた後、ｐｏｌｙｍｙ−ｘｉｎＢまたはｃｏｍｐ
ｏｕｎｄ ４８／８０と反応させた時の肥満細胞よりの
ヒスタミン遊離に対する抑制率を下表に示す。
表より明らかな如＜、ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢによるヒス
タミン遊離はＷＥＮＡＣ１２，５μｇ／ｍｌより顕著に
抑制され（４０％以上） 、ｃｏｍ−ｐｏｕｎｄ４８／
８０によるヒスタミン遊離の抑制がＷＥＮＡＣ５０μｇ
／ｍ１以上で認められた。
ｂ）ａ）でｐｏＩｙｍｙｘｉｎ Ｂ及びｃｏｍｐｏｕｎ
ｄ ４８／８０の双方に十分な効果を示したＷＥＮＡＣ
１００μｇ／ｍｇを用いて、ラット肥満細胞の前処理時
間のＷＥＮＡＣのヒスタミン遊離に対する抑制作用にお
よぼす影響をａ）と同様の実験系で確認した。
その結果を下表に示す。表から明らかな如く、ｐｏｌｙ
ｍｙｘｉｎ Ｂ及びｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０におい
て１５分以上のＷＥＮＡＣの前処理で５０％以上の抑制
率が認められた。
■コンカナバリンＡとフオスファチジルセリンとの同時
使用によるラット肥満細胞よりのヒスタミン遊離に対す
る抑制作用 トリス緩衝液ＴＡＣＭ〔試験例■ａ）と同様〕に懸濁し
た２×１０５個のラットの腹腔内肥満細胞をコンカナバ
リンＡ（ｃｏｎＡ） 、フォスファチジルセリン（ＰＳ
）及び／又はＷＥＮＡＣと同時に３７℃で３０分間作用
させた場合のラット肥満細胞よりのヒスタミン遊離率を
下表に示す。
表から明らかな如く、ラットの肥満細胞ではｃｏｎＡ１
００μｇ／ｍｌとＰＳ５０μｇ／ｍｌとを同時に作用さ
せた時のみヒスタミンが６７％と顕著に遊離されるが、
その他の場合は殆んど遊離されないことが確認された。
そして、とのｃｏｎＡとＰＳとの同時使用によるヒスタ
ミンの遊離がＷＥＮＡＣ１００μｇ／ｍｌの使用により
６７％から１０％に顕著に抑制されることが確認された
。
Ｄ 本発明のｗＥＮＡｃの毒性 本発明のＷＥＮＡＣおよび原料培養物（菌体）を、ｄｄ
Ｎ系マウス（体重約２０ｇ）に腹腔内投与した場合の急
性毒性は以下の通りである。
なお、原料培養物（菌体）は非水溶性であるので水性懸
濁液として投与した。
本発明のＷＥＮＡＣＬＤ５０：２０ｍｇ以上／マウス 原料培養物（菌体）ＬＤ５０：５ｍｇ／マウス以上の実
験結果より、本発明のＷＥＮＡＣが原料培養物（菌体）
に比べて著しく毒性が弱いことが示されている。
なお、本発明のＷＥＮＡＣの［生物学的製剤基準」の一
般試験法によるマウス白血球減少試験及びマウス体重減
少試験において、異常を認めなかった。
本発明のＷＥＮＡＣを医薬として使用するには、目的と
する薬効を得るのに都合のよい形で使用する。
ＷＥＮＡＣはそのままの状態で医薬となり得るが、製薬
上の慣例に従って製薬的に許容し得る希釈剤及び／又は
他の薬理作用物質との混合物として組成された状態でも
提供され得る。
本発明の医薬は、経口的又は非経口的に適用され得る。
従って本発明の医薬は経口的又は非経口的に投与するた
めの形態を適宜に採り得る。
例えば、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、
坐剤、懸濁剤、液剤、乳剤、注射剤、エアゾール剤であ
る。
本発明の医薬の投薬量は、感受性差、年令、性別、体重
、投与方法、投与の時期、間隔、病状、体調、医薬製剤
の性質、調剤の種類等種々の原因によって変動する。
従って、下記に示す投薬量の最小量より少ない量で十分
であり、又ある場合には下記投薬量を超えて投与する必
要の生ずることもある。
成人の患者に対する投薬量は１日当り１０ｎｇ〜５００
μｇである。
処方例１（注射剤） 本発明のＷＥＮＡＣ（凍結乾燥品）を５ｍｇ／ｍｌの水
溶液とし、さらに生理食塩水により１００倍に稀釈し、
１ｍｌずつアンプルに充填する。
本注射液の用法としては、１同量ｏ、ｉ〜０．８ｍｌを
一週間に１〜２回の間隔で通常の脱感作療法に準じて皮
下注射を行なうことを一応の基準とする。
処方例２（注射剤） ■ｍｌ当り本発明のＷＥＮＡＣ（凍結乾燥品）５．０μ
ｇ及びマンニトール１０ｍｇを含む水溶液とし、１ｄず
つバイアルに充填し、凍結乾燥する。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のＷＥＮＡＣのセファデックスＧ２００
ゲルにおける溶出曲線を示す。 第１図−ＢはＷＥＮＡＣのウルトロゲルＡｃＡ３４にお
ける溶出曲線を示す。 第２図は本発明のＷＥＮＡＣのＩｇＥ抗体産生抑制作用
を示す。 第３図はＷＥＮＡＣの共通抗原性を示し、第４図は抗補
体作用を示す。 第２〜４図は本発明の効果を示すものである。 第５図はＷＥＮＡＣの赤外線吸収スペクトルを示す。 第６図はＷＥＮＡＣの紫外線吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する糖蛋白ＷＥＮＡＣａ）
    蛋白部分と糖部分の割合： 銅フォーリン法による蛋白含量とフェノール硫酸法によ
    る糖含量より算出される蛋白部分／糖部分の割合は７．
    ５０（３，９１０，５２）〜１３．４２（５，５１０，
    ４１）である。 ｂ）核酸部分： ２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）の
    比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）は１．５６〜１．６２で
    ある Ｃ）等電点：３°７５〜３．８０を示す ｄ）ＩｇＥ抗体の産生を特異的に抑制する２ 非病原性
    好気性コリネバクテリウムに属する菌株を好気的に培養
    して得られた培養物（菌体）を低温処理して破砕し、得
    られた破砕物を超音波処理して分離した有効成分の水溶
    液をｐＨ３，７０〜３．７５の範囲内で沈殿を生じさせ
    、この沈殿物をほぼ中性の水溶液として透析を行ない、
    次いで所望により分離した水溶液を凍結乾燥することを
    特徴とする糖蛋白ＷＥＮＡＣの製造法。 ３ コリネバクテリウム・イクイＩＩＤ Ｋｏ−８５を
    使用する特許請求の範囲第２項記載の製造法。
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