JPH0561255B2 - - Google Patents
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Description
本発明はストレプトコツカスアガラクチアエ
（Streptococcus agalactiae）（以下Ｂ群鎖状球菌
という）に対する多糖抗原ないしはワクチンの製
造法、それによつて製造された抗原ないしはワク
チン、およびかかる連鎖状球菌に対する受動的免
疫のために有用な高活性の免疫グロブリン抗体の
製造法および使用法に関する。 グルコース２ｇ／を含有し且つPH6.5〜7.4に
緩衝されたトツド−ヘウイト氏ブイヨン（Todd
−Hewitt broth）内で菌を培養し、そのブイヨ
ンから培養された菌を分離し、しかるのちその菌
から型多糖類を抽出してＢ群連鎖状球菌の型
多糖類を製造することはすでに提案されている。
しかしながら、このようにして製造された多糖類
は収率が低く、しかも型特異性抗血清とのみ反
応性を示す。これについては、「The Journal of
ExperimentalMmedicine」Vol143、第258〜269
頁（1976年）のベーカ（Baker）、カスペル
（Kasper）およびデービス（Davis）の論文を参
照されたい。さらに、多糖類の収率を高めるため
に培養基中のグルコースの濃度を高め且つ緩衝能
を増大させることもすでに提案されている〔ベー
カおよびカスペルの論文、「Infection and
Immunity」Vol.13、189〜194頁（1976年）所載、
参照〕。さらにまた、生きたＢ型連鎖状球菌に感
染された人の血液から自然発生の抗血清を単離す
ることもすでに提案されている。しかしながら、
一般にかかる抗血清の免疫学的活性はきわめて微
弱である。 ここに本発明によつて、従来製造されたものと
は化学的組成において明らかに相違し、向上され
た免疫活性を示す。大きい分子サイズ（0.8〜６
×106d）留分を有する多糖抗原が次のようにして
製造しうることが見出された。すなわち、高濃
度、好ましくは10〜15ｇ／またはそれ以上の濃
度のグルコースを含有する栄養ブイヨン中でＢ群
連鎖状球菌を培養しそしてその際にそのブイヨン
のPH値を６乃至８、好ましくは6.8乃至7.6に保持
するのである。なおここで、「分子サイズ」とい
う言葉は分子排斥クロマトグラフイー
（molecular exclusion chromatography）によ
つて決定されるような分子量を意味するものであ
る。これらの高分子サイズの抗原は型特異性抗
体に対し免疫反応性を示す。さらに本発明によつ
て、当該菌を105ダルトン以上の分子サイズを有
する成分を含んでいないブイヨン中で培養し、培
養後に当該菌をブイヨンから分離すなわち採収
し、しかるのち残存ブイヨンから0.8×106以上の
分子サイズを有する留分を含有する多糖類を回収
することによつて上記の製造法の一層の改良が達
成されそして多糖抗原がより高い収率で得られる
ことが見出された。なお、採収された菌からの抽
出によつて付加的量ただし小量の高分子サイズの
多糖類を得ることができる。さらにまた、上記し
た本発明の方法が、IaおよびIc及び型特異性抗
体に対して免疫反応性を示す高分子サイズ抗原の
製造にも同じく適用しうることが見出された。 本発明により、従来の栄養ブイヨン通に存在す
るグルコースの量、たとえばトツド−ヘウイト氏
ブイヨンの場合のような２ｇ／の量では、多糖
抗原ないしはワクチンの最高収率を得ることは不
可能であることが見出され、そしてこのグルコー
スの量を15ｇ／の量まで増加させることによつ
て抗原の製造が効果的且つ格段と促進され高い収
率が達成されることが見出された。グルコースの
量は有害な作用を伴わずして15ｇ／以上に増加
させることが出来るけれども、15ｇ／以上に増
加させることにより得られる利点はない。グルコ
ースの量は少なくとも10ｇ／であることが望ま
しく、好ましくは14乃至16ｇ／である。 栄養フイヨン中のグルコースの量が約４ｇ／
またはそれ以上である場合、その栄養ブイヨンの
PHを６乃至８の範囲、特に好ましいPH値の範囲で
ある6.8乃至7.6の範囲に保持することは単に通常
のリン酸塩緩衝液のような緩衝剤を菌が導入され
る際にその栄養ブイヨンに添加するだけでは有効
的になし得ない。菌により大量のグルコースが消
費されるので遊離される酸の量はきわめて大き
く、緩衝剤をかなり高い濃度で存在させた場合で
も、緩衝剤がきかなくなり易く、PHは６以下に下
がり、そして製造される免疫物質の特異性が、明
らかに多糖類の分解の結果として、変つてしま
う。しかしながら他方で、PH値を８以上に高める
と、菌の生長率は低下してしまう。しかして本発
明により、菌の培養中に間欠的または継続的にブ
イヨンにアルカリ性物質を導入することが特定範
囲にPHを維持するために必要であることが見出さ
れた。好ましいアルカリ性物質は水酸化ナトリウ
ムであるが、他の強アルカリ性物質たとえば炭酸
ナトリウムまたは水酸化アンモニウムまたは炭酸
アンモニウムなども使用しうる。アルカリ性物質
は水溶液の形態で導入するのが最も好ましい好都
合であり、特に滴定薬が使用される場合は好都合
である。培養は任意常用の温度、たとえば室温ま
たはそれより若干高い温度（24〜40℃）で実施す
ることができる。 上記した条件でＢ群連鎖状球菌を培養すると、
0.8〜６×106ダルトンの分子サイズを有する留分
を含む多糖抗原が産出され、これは公知方法によ
り栄養ブイヨンから菌を分離したのちにその菌か
ら抽出することができる。しかしながら、その多
糖の大部分が菌によつてブイヨン自体の中に放出
されるので、ブイヨンから最初に菌を分離し、そ
して次に残存ブイヨンから所望の高分子サイズ
（0.8〜６×106）且つ高い免疫作用を持つ多糖類
を回収することによつて高い収率が達成されるこ
とが本発明によつて見出された。この回収を好都
合ならしめるためには、培養の開始時に105以上
の分子サイズを有する成分を含まない栄養ブイヨ
ンすなわち培養基を使用するのが望ましいことが
判明した。３×104以上の分子サイズを有する成
分を含まないものであればさらに好ましい。Ｂ群
連鎖状球菌の培養に従来使用されている栄養ブイ
ヨンは高分子サイズ成分を含有する動物組織の液
汁を含んでいる。たとえば、従来使用されている
トツド−ヘウイト氏ブイヨンはその主成分として
牛の心臓の浸出汁を含んでいる。たとえば105d以
上の高分子サイズ成分は常用の分別ないし分離法
たとえば透析、限外過またはクロマトグラフイ
ーによつてブイヨンから除去することができる。
残りの、低分子サイズ成分と５〜15ｇ／のグル
コースのみを含むブイヨンはＢ群連鎖状球菌の培
養にきわめて有効である。 ブイヨンから菌をたとえば遠心沈降によつて採
収ないし分離したのちに、産出された高分子サイ
ズ多糖抗原は残存するブイヨン、すなわち上澄み
のブイヨンから容易に回収することができ、そし
てそれを低分子サイズ成分から上述のごとき常用
の分別または分離法によつて容易に分離すること
ができる。さらに同じ高分子サイズ（0.8〜６×
106）の多糖抗原の付加的量がブイヨンから分離
された菌の抽出によつて得られる。抽出はＢ群
型連鎖状球菌から低分子サイズ多糖類を抽出する
ために従来採用されていた方法を用いて実施する
ことができる。この従来法は好ましくはエチレン
ジアミンテトラ酢酸ナトリウムを含有するサリン
緩衝液を含有する抽出媒質中にPH６〜８、室温で
数時間菌を懸濁し、そしてその媒質から菌を分離
するものである。ただし、任意の中性の水性緩衝
液が使用しうる。 栄養ブイヨンから、あるいは菌の抽出から得ら
れた高分子サイズ多糖抗原は次のようにしてさら
に精製することができる。すなわち常用のエタノ
ール沈殿を行ない、次に酵素分解を行なつて核酸
とタンパクを除き、そしてPH7.3の0.05Mトリス
（Tris）緩衝液を用いてゲルクロマトグラフイー
を実施して0.8×106以上の分子サイズを有する画
分を単離するのである。もちろん、6.5乃至8.0の
PH値の多の緩衝剤を使用してもよい。この画分の
中の多糖類を次に塩−エタノール沈殿処理にか
け、蒸留水に再懸濁しそして凍結乾燥すると乾燥
固体の多糖抗原が得られる。一般的に言つて、
型菌の培養物の各１から１乃至８mgの精製型
多糖抗原が得られる。この精製多糖抗原はその主
成分としてシアル酸、ガラクトース、グルコース
およびグルコースアミンを含有し、そして下記単
位のくり返しからなる。 Glcp：グルコース（ピラノース型） Galp：ガラクトース（ピラノース型） GlcNAcp：２−アセトアミド−２−デオキシグ
ルコース（ピラノース型） NeuNAcp：シアル酸（ピラノース型） この多糖抗原は従来法によつて製造されたもの
と次の点で相違する。すなわち、本発明のものは
マンノースもヘプトースも含有していないが、従
来法のものはマンノースとヘプトースの両者を含
んでいる。 IaまたはIcまたは型のＢ群連鎖状球菌を上記
と同じ工程にかけると、別種の精製された可溶性
多糖が得られ、これもその主成分としてシアル
酸、ガラクトース、グルコースおよびグルコース
アミンを含有している。 型抗原は下記単位のくり返しよりなる。 上記において、符号の意味は前述のものと同じ
である。この多糖（型）も0.8×106以上の分子
サイズを有しそして型からの場合とほぼ同じ収
率で得られる。 型多糖抗源と型の多糖抗原とは免疫学的に
別個のものであり、両者はそれぞれの血清型のＢ
群連鎖状球菌に対して製造された型特異性血清を
用いた毛管沈殿系反応によつて容易に区別され
る。この判別試験に用いる上記血清は従来法によ
り製造できたとえば「J.Experimental
Medicine」Vol59、第441〜458頁（1934年）にラ
ンスフイールド（Lancefield）により記載された
方法、「ibid」Vol.67、第25頁以下（1938年）に
記載された方法、「Infection and Immunity」
Vol.4、第596頁以下（1971年）にウイルキンソン
（Wilkinson）等によつて記載された方法などが
使用できる。 ワクチンとして使用するためには、精製多糖抗
原を発熱物質を含まないサリンまたは他の生理学
的に許容される非毒性ビヒクルまたは媒質中に懸
濁する。所望の場合はヒビクルに常用の安定剤な
どの添加物を含有させることができる。抗原の濃
度は臨界的なものでなく、広い範囲で変えうるも
のであるが、多くの場合には10乃至1000μｇ／ml
の範囲が好都合且つ適当である。この形態で４℃
で長時間保存しても安定であり、食物薬物投与規
定（Food and Drug Administration
Regulation）（第21章、第610.11〜610.13項）に
定められている動物試験に供しても無菌、無毒、
且つ非発熱性である。本ワクチン中にはなんらの
生物学的に活性な菌体内毒素も検出されなかつた
し、またマウスモルモツト、ウサギまたは霊長類
動物に供与してもなんらの全身性の症候も観察さ
れなかつた。本ワクチンをウサギまたは霊長類動
物に注射した際に抗体形成は全く見られなかつ
た。 PHが６以下に下げられるのであれば（たとえば
栄養ブイヨン中にリン酸塩緩衝剤を使用した場
合）、中分子サイズ（５〜６×105ダルトン）の多
糖を含有するワクチンを製造することができる。
このワクチンぱベーカ等により「J.Clin.Invest.」
Vol.61、第1107〜1110（1978年）に記載されてい
るように人体内で抗原性を有する。 かかる多糖類は上記した高分子サイズ（0.8〜
６×106）の多糖類とは異なる免疫学的特性を有
するものであるが、しかしワクチンとして使用さ
れるのに十分な高い活性を有している。これら多
糖類は選択されたワクチン内の抗体を十分に高め
るのにも有効であり、従つてその抗血清のガンマ
グロフリン画分を単離することによつて受動的免
疫を得るための注射用として有効な程度の十分に
高い力価を持つ抗体を得ることが可能である。 以下に本発明を説明するための実施例を示す。
これは本発明の一層の理解を助けるためのもので
あり、本発明を限定するものではない。 実施例 商業的供給者から下記組成のトツド−ヘウイト
氏ブイヨンを入手した。成 分 ｇ／ 午心臓浸出物（過したもの）（固体） 500 ネオペプトン（固体） 20 デキストロース ２ 塩化ナトリウム ２ 二リン酸ナトリウム 0.4 炭酸ナトリウム 2.5 このブイヨンを適当な膜を通して蒸留水に対し
て透析して100000d以上の分子サイズを有する成
分をすべて分離した。次いでオートクレーブに入
れて殺菌しそしてさらに14ｇ／の無菌グリコー
スをそのブイヨンに溶解した。 Ｂ群型連鎖状球菌の入つた培養フラスコの内
容物を上記ブイヨンに導入して菌を植えそしてPH
滴定によりそのPHを6.8乃至7.6の範囲内に継続的
に保持しながら該ブイヨン中で室温において菌培
養を行なつた。菌の量が３×108菌／を超過し
た時に、その菌を遠心分離により採収した。 残存上澄みブイヨンを105d以上の分子サイズを
有するすべての物質を保留しつつ限外過により
１／１０容量まで濃縮し、そして次に低分子サイズ成
分を除去するため蒸留水に対して徹底的に透析し
た。冷無水アルコールを30容量％の量で加えそし
ていくらかの外来の核酸を含有するその沈殿物な
いしは凝集物を遠心分離により分離した。 この上澄みに80容量％の冷無水アルコールを加
えそして多糖を含有する沈殿物を遠心分離した。
得られた固体ペレツトを乾燥し、そして0.01Mト
リス（ヒドロキシメチルアミノメタン）塩酸塩、
0.001M塩化カルシウムおよび0.001M塩化マグネ
シウムを含有するPH7.3の緩衝溶液に懸濁した。
この懸濁液を0.5ｇ／の濃度でリボヌクレアー
ゼとデオキシリボスクレアーゼを用いて37℃で３
時間ずつ２回分解させ、次に1.0ｇ／の濃度で
プロナーゼを用いて２回分解させて所望されない
核酸とタンパクを破壊した。 酸素処理された上記液をPH7.3の0.01Mトリス
塩酸塩で平衡化されたセフアロース4B
（Sepharose4B）のカラムのクロマトグラフイー
にかけて分画し、低分子サイズ（105以下）の物
質を含有している画分を分離した。高分子サイズ
画分（８〜11×105）を溶離し、１つに集め、そ
して４倍量の無水エタノールと混合し高分子サイ
ズ多糖を沈殿させた。この沈殿物を遠心分離し、
そして凍結乾燥した。しかして、上記に定義した
型抗原の構造単位のくり返しよりなる精製され
た乾燥固体生成物を得た。この方法により、型
菌の各１のロツトから総じて約５乃至15mgの多
糖抗原（mw.0.8〜５×106）が収得された。 低分子サイズの多糖型抗原のために従来技術
で用いられているのと同じ方法を用いて採収され
た菌を抽出することによつて上記と同じ分子サイ
ズの抗原が少量であるが得られた。一般的に、菌
の各１から約１乃至４mgの抗原がこの方法によ
つて収得された。 乾燥固体形状で得られた精製高分子サイズ多糖
抗体はIaおよびIc型抗原について上記に定義した
構造単位のくり返しよりなりそして0.8〜５×
106dのサイズを有している。この繰り返し単位は
次の方法を用いて決定および確認された構成糖組
成の決定はDmitriev、B.A.et.al.、Eur.J.
biochem.50、p539−547（1975）の方法によつて
行なつた。多糖を0.25Mの硫酸で100℃16時間加
水分解し、中和後凍結乾燥し、残渣を水に溶かし
たものを33％酢酸と５％硝酸ナトリウムで室温１
時間処理した。この条件下で２−アミノ−２−デ
オキシ−Ｄ−グルコースは２，５−アンヒドロ−
Ｄ−マンノースに変換される。これを
Sawardeker et al.（1965）の方法により対応す
る糖アルコール酢酸エステル化した後GC−MS
により分析した。Ｄ−立体配置はガラクトースと
グルコース残基についてはLeontein et al.の方
法（Carbohydr.Res.62、p359−362（1978）によ
り、２−オクチルグリコシド化したものについて
GC分析を行ない、２−アセトアミド−２−デオ
キシグルコースについては（−）−２−ブタノー
ルグリコシドについてGC分析を行なつた。遊離
のシアル酸は温和な分解（0.1M硫酸 80℃、80
分）により多糖抗原から遊離させ、Aminoff
（Biochemical J.81、p384−392 1965）のチオバ
ルビール酸法により分析した。シアル酸のα−Ｄ
立体配置は13C−NMRにより決定した。糖の配
列は箱守らのメチル化分析（J.biochem.（tokyo）
55、p205−208（1964））法により分析した。スミ
ス分解とメチル化を組み合わせたスミス分解の変
法で連結の確認を行なつた。末端β−Ｄ−ガラク
トピラノシル残基の除去は型についてはＤ−ガ
ラクトースオキシダーゼ分解、Ia、Icについては
スミス分解、型については限定過ヨウ素酸分解
を行なつた。 ワクチンとして使用する場合には、上記により
得られた乾燥型多糖抗原の100μｇ／mlを標準
サリン溶液に含有する懸濁物を調製し、これを各
0.5mlの量で皮下注射する。本発明による製造さ
れた高分子サイズの多糖抗原も低分子サイズ（５
〜６×105）の多糖抗原も共に高い免疫産出作用
を有し、選択されたワクチン注射を受けた者の中
に特定抗体を0.1乃至2000μｇ／ml抗血清の割合で
つくり出す。これは栄養ブイヨンにトリチウム化
した酢酸エステルを導入して内在的に標識を付し
た多糖抗原をトレーサとして用いた抗血清の放射
線免疫分析によつて測定できる。健康成人におい
て評価した精製型多糖抗原の免疫原性を下記表
１に示す。まれには非免疫化された成人がその血
清に非常に高いレベルで型特異性抗体を有してい
ることがあるが、きわめて大きい集団から選別し
てその人の血漿が積極的免疫に有用な十分に高い
力価を持つガンマ画分をつくるためにプールしう
るような人達を選択することが必要あろう。非免
疫化された成人からプールされたガンマグロブリ
ンのいくつかのロツトを抗型多糖抗体について
分析試験した結果では、わずかに５〜20μ／mlの
血清を含有しているにすぎないことが判つてい
る。このような低い力価のグロブリンを静脈注射
して免疫を得るには悪い反作用の危険を伴なう禁
止的大量の投与が必要となる。
（Streptococcus agalactiae）（以下Ｂ群鎖状球菌
という）に対する多糖抗原ないしはワクチンの製
造法、それによつて製造された抗原ないしはワク
チン、およびかかる連鎖状球菌に対する受動的免
疫のために有用な高活性の免疫グロブリン抗体の
製造法および使用法に関する。 グルコース２ｇ／を含有し且つPH6.5〜7.4に
緩衝されたトツド−ヘウイト氏ブイヨン（Todd
−Hewitt broth）内で菌を培養し、そのブイヨ
ンから培養された菌を分離し、しかるのちその菌
から型多糖類を抽出してＢ群連鎖状球菌の型
多糖類を製造することはすでに提案されている。
しかしながら、このようにして製造された多糖類
は収率が低く、しかも型特異性抗血清とのみ反
応性を示す。これについては、「The Journal of
ExperimentalMmedicine」Vol143、第258〜269
頁（1976年）のベーカ（Baker）、カスペル
（Kasper）およびデービス（Davis）の論文を参
照されたい。さらに、多糖類の収率を高めるため
に培養基中のグルコースの濃度を高め且つ緩衝能
を増大させることもすでに提案されている〔ベー
カおよびカスペルの論文、「Infection and
Immunity」Vol.13、189〜194頁（1976年）所載、
参照〕。さらにまた、生きたＢ型連鎖状球菌に感
染された人の血液から自然発生の抗血清を単離す
ることもすでに提案されている。しかしながら、
一般にかかる抗血清の免疫学的活性はきわめて微
弱である。 ここに本発明によつて、従来製造されたものと
は化学的組成において明らかに相違し、向上され
た免疫活性を示す。大きい分子サイズ（0.8〜６
×106d）留分を有する多糖抗原が次のようにして
製造しうることが見出された。すなわち、高濃
度、好ましくは10〜15ｇ／またはそれ以上の濃
度のグルコースを含有する栄養ブイヨン中でＢ群
連鎖状球菌を培養しそしてその際にそのブイヨン
のPH値を６乃至８、好ましくは6.8乃至7.6に保持
するのである。なおここで、「分子サイズ」とい
う言葉は分子排斥クロマトグラフイー
（molecular exclusion chromatography）によ
つて決定されるような分子量を意味するものであ
る。これらの高分子サイズの抗原は型特異性抗
体に対し免疫反応性を示す。さらに本発明によつ
て、当該菌を105ダルトン以上の分子サイズを有
する成分を含んでいないブイヨン中で培養し、培
養後に当該菌をブイヨンから分離すなわち採収
し、しかるのち残存ブイヨンから0.8×106以上の
分子サイズを有する留分を含有する多糖類を回収
することによつて上記の製造法の一層の改良が達
成されそして多糖抗原がより高い収率で得られる
ことが見出された。なお、採収された菌からの抽
出によつて付加的量ただし小量の高分子サイズの
多糖類を得ることができる。さらにまた、上記し
た本発明の方法が、IaおよびIc及び型特異性抗
体に対して免疫反応性を示す高分子サイズ抗原の
製造にも同じく適用しうることが見出された。 本発明により、従来の栄養ブイヨン通に存在す
るグルコースの量、たとえばトツド−ヘウイト氏
ブイヨンの場合のような２ｇ／の量では、多糖
抗原ないしはワクチンの最高収率を得ることは不
可能であることが見出され、そしてこのグルコー
スの量を15ｇ／の量まで増加させることによつ
て抗原の製造が効果的且つ格段と促進され高い収
率が達成されることが見出された。グルコースの
量は有害な作用を伴わずして15ｇ／以上に増加
させることが出来るけれども、15ｇ／以上に増
加させることにより得られる利点はない。グルコ
ースの量は少なくとも10ｇ／であることが望ま
しく、好ましくは14乃至16ｇ／である。 栄養フイヨン中のグルコースの量が約４ｇ／
またはそれ以上である場合、その栄養ブイヨンの
PHを６乃至８の範囲、特に好ましいPH値の範囲で
ある6.8乃至7.6の範囲に保持することは単に通常
のリン酸塩緩衝液のような緩衝剤を菌が導入され
る際にその栄養ブイヨンに添加するだけでは有効
的になし得ない。菌により大量のグルコースが消
費されるので遊離される酸の量はきわめて大き
く、緩衝剤をかなり高い濃度で存在させた場合で
も、緩衝剤がきかなくなり易く、PHは６以下に下
がり、そして製造される免疫物質の特異性が、明
らかに多糖類の分解の結果として、変つてしま
う。しかしながら他方で、PH値を８以上に高める
と、菌の生長率は低下してしまう。しかして本発
明により、菌の培養中に間欠的または継続的にブ
イヨンにアルカリ性物質を導入することが特定範
囲にPHを維持するために必要であることが見出さ
れた。好ましいアルカリ性物質は水酸化ナトリウ
ムであるが、他の強アルカリ性物質たとえば炭酸
ナトリウムまたは水酸化アンモニウムまたは炭酸
アンモニウムなども使用しうる。アルカリ性物質
は水溶液の形態で導入するのが最も好ましい好都
合であり、特に滴定薬が使用される場合は好都合
である。培養は任意常用の温度、たとえば室温ま
たはそれより若干高い温度（24〜40℃）で実施す
ることができる。 上記した条件でＢ群連鎖状球菌を培養すると、
0.8〜６×106ダルトンの分子サイズを有する留分
を含む多糖抗原が産出され、これは公知方法によ
り栄養ブイヨンから菌を分離したのちにその菌か
ら抽出することができる。しかしながら、その多
糖の大部分が菌によつてブイヨン自体の中に放出
されるので、ブイヨンから最初に菌を分離し、そ
して次に残存ブイヨンから所望の高分子サイズ
（0.8〜６×106）且つ高い免疫作用を持つ多糖類
を回収することによつて高い収率が達成されるこ
とが本発明によつて見出された。この回収を好都
合ならしめるためには、培養の開始時に105以上
の分子サイズを有する成分を含まない栄養ブイヨ
ンすなわち培養基を使用するのが望ましいことが
判明した。３×104以上の分子サイズを有する成
分を含まないものであればさらに好ましい。Ｂ群
連鎖状球菌の培養に従来使用されている栄養ブイ
ヨンは高分子サイズ成分を含有する動物組織の液
汁を含んでいる。たとえば、従来使用されている
トツド−ヘウイト氏ブイヨンはその主成分として
牛の心臓の浸出汁を含んでいる。たとえば105d以
上の高分子サイズ成分は常用の分別ないし分離法
たとえば透析、限外過またはクロマトグラフイ
ーによつてブイヨンから除去することができる。
残りの、低分子サイズ成分と５〜15ｇ／のグル
コースのみを含むブイヨンはＢ群連鎖状球菌の培
養にきわめて有効である。 ブイヨンから菌をたとえば遠心沈降によつて採
収ないし分離したのちに、産出された高分子サイ
ズ多糖抗原は残存するブイヨン、すなわち上澄み
のブイヨンから容易に回収することができ、そし
てそれを低分子サイズ成分から上述のごとき常用
の分別または分離法によつて容易に分離すること
ができる。さらに同じ高分子サイズ（0.8〜６×
106）の多糖抗原の付加的量がブイヨンから分離
された菌の抽出によつて得られる。抽出はＢ群
型連鎖状球菌から低分子サイズ多糖類を抽出する
ために従来採用されていた方法を用いて実施する
ことができる。この従来法は好ましくはエチレン
ジアミンテトラ酢酸ナトリウムを含有するサリン
緩衝液を含有する抽出媒質中にPH６〜８、室温で
数時間菌を懸濁し、そしてその媒質から菌を分離
するものである。ただし、任意の中性の水性緩衝
液が使用しうる。 栄養ブイヨンから、あるいは菌の抽出から得ら
れた高分子サイズ多糖抗原は次のようにしてさら
に精製することができる。すなわち常用のエタノ
ール沈殿を行ない、次に酵素分解を行なつて核酸
とタンパクを除き、そしてPH7.3の0.05Mトリス
（Tris）緩衝液を用いてゲルクロマトグラフイー
を実施して0.8×106以上の分子サイズを有する画
分を単離するのである。もちろん、6.5乃至8.0の
PH値の多の緩衝剤を使用してもよい。この画分の
中の多糖類を次に塩−エタノール沈殿処理にか
け、蒸留水に再懸濁しそして凍結乾燥すると乾燥
固体の多糖抗原が得られる。一般的に言つて、
型菌の培養物の各１から１乃至８mgの精製型
多糖抗原が得られる。この精製多糖抗原はその主
成分としてシアル酸、ガラクトース、グルコース
およびグルコースアミンを含有し、そして下記単
位のくり返しからなる。 Glcp：グルコース（ピラノース型） Galp：ガラクトース（ピラノース型） GlcNAcp：２−アセトアミド−２−デオキシグ
ルコース（ピラノース型） NeuNAcp：シアル酸（ピラノース型） この多糖抗原は従来法によつて製造されたもの
と次の点で相違する。すなわち、本発明のものは
マンノースもヘプトースも含有していないが、従
来法のものはマンノースとヘプトースの両者を含
んでいる。 IaまたはIcまたは型のＢ群連鎖状球菌を上記
と同じ工程にかけると、別種の精製された可溶性
多糖が得られ、これもその主成分としてシアル
酸、ガラクトース、グルコースおよびグルコース
アミンを含有している。 型抗原は下記単位のくり返しよりなる。 上記において、符号の意味は前述のものと同じ
である。この多糖（型）も0.8×106以上の分子
サイズを有しそして型からの場合とほぼ同じ収
率で得られる。 型多糖抗源と型の多糖抗原とは免疫学的に
別個のものであり、両者はそれぞれの血清型のＢ
群連鎖状球菌に対して製造された型特異性血清を
用いた毛管沈殿系反応によつて容易に区別され
る。この判別試験に用いる上記血清は従来法によ
り製造できたとえば「J.Experimental
Medicine」Vol59、第441〜458頁（1934年）にラ
ンスフイールド（Lancefield）により記載された
方法、「ibid」Vol.67、第25頁以下（1938年）に
記載された方法、「Infection and Immunity」
Vol.4、第596頁以下（1971年）にウイルキンソン
（Wilkinson）等によつて記載された方法などが
使用できる。 ワクチンとして使用するためには、精製多糖抗
原を発熱物質を含まないサリンまたは他の生理学
的に許容される非毒性ビヒクルまたは媒質中に懸
濁する。所望の場合はヒビクルに常用の安定剤な
どの添加物を含有させることができる。抗原の濃
度は臨界的なものでなく、広い範囲で変えうるも
のであるが、多くの場合には10乃至1000μｇ／ml
の範囲が好都合且つ適当である。この形態で４℃
で長時間保存しても安定であり、食物薬物投与規
定（Food and Drug Administration
Regulation）（第21章、第610.11〜610.13項）に
定められている動物試験に供しても無菌、無毒、
且つ非発熱性である。本ワクチン中にはなんらの
生物学的に活性な菌体内毒素も検出されなかつた
し、またマウスモルモツト、ウサギまたは霊長類
動物に供与してもなんらの全身性の症候も観察さ
れなかつた。本ワクチンをウサギまたは霊長類動
物に注射した際に抗体形成は全く見られなかつ
た。 PHが６以下に下げられるのであれば（たとえば
栄養ブイヨン中にリン酸塩緩衝剤を使用した場
合）、中分子サイズ（５〜６×105ダルトン）の多
糖を含有するワクチンを製造することができる。
このワクチンぱベーカ等により「J.Clin.Invest.」
Vol.61、第1107〜1110（1978年）に記載されてい
るように人体内で抗原性を有する。 かかる多糖類は上記した高分子サイズ（0.8〜
６×106）の多糖類とは異なる免疫学的特性を有
するものであるが、しかしワクチンとして使用さ
れるのに十分な高い活性を有している。これら多
糖類は選択されたワクチン内の抗体を十分に高め
るのにも有効であり、従つてその抗血清のガンマ
グロフリン画分を単離することによつて受動的免
疫を得るための注射用として有効な程度の十分に
高い力価を持つ抗体を得ることが可能である。 以下に本発明を説明するための実施例を示す。
これは本発明の一層の理解を助けるためのもので
あり、本発明を限定するものではない。 実施例 商業的供給者から下記組成のトツド−ヘウイト
氏ブイヨンを入手した。成 分 ｇ／ 午心臓浸出物（過したもの）（固体） 500 ネオペプトン（固体） 20 デキストロース ２ 塩化ナトリウム ２ 二リン酸ナトリウム 0.4 炭酸ナトリウム 2.5 このブイヨンを適当な膜を通して蒸留水に対し
て透析して100000d以上の分子サイズを有する成
分をすべて分離した。次いでオートクレーブに入
れて殺菌しそしてさらに14ｇ／の無菌グリコー
スをそのブイヨンに溶解した。 Ｂ群型連鎖状球菌の入つた培養フラスコの内
容物を上記ブイヨンに導入して菌を植えそしてPH
滴定によりそのPHを6.8乃至7.6の範囲内に継続的
に保持しながら該ブイヨン中で室温において菌培
養を行なつた。菌の量が３×108菌／を超過し
た時に、その菌を遠心分離により採収した。 残存上澄みブイヨンを105d以上の分子サイズを
有するすべての物質を保留しつつ限外過により
１／１０容量まで濃縮し、そして次に低分子サイズ成
分を除去するため蒸留水に対して徹底的に透析し
た。冷無水アルコールを30容量％の量で加えそし
ていくらかの外来の核酸を含有するその沈殿物な
いしは凝集物を遠心分離により分離した。 この上澄みに80容量％の冷無水アルコールを加
えそして多糖を含有する沈殿物を遠心分離した。
得られた固体ペレツトを乾燥し、そして0.01Mト
リス（ヒドロキシメチルアミノメタン）塩酸塩、
0.001M塩化カルシウムおよび0.001M塩化マグネ
シウムを含有するPH7.3の緩衝溶液に懸濁した。
この懸濁液を0.5ｇ／の濃度でリボヌクレアー
ゼとデオキシリボスクレアーゼを用いて37℃で３
時間ずつ２回分解させ、次に1.0ｇ／の濃度で
プロナーゼを用いて２回分解させて所望されない
核酸とタンパクを破壊した。 酸素処理された上記液をPH7.3の0.01Mトリス
塩酸塩で平衡化されたセフアロース4B
（Sepharose4B）のカラムのクロマトグラフイー
にかけて分画し、低分子サイズ（105以下）の物
質を含有している画分を分離した。高分子サイズ
画分（８〜11×105）を溶離し、１つに集め、そ
して４倍量の無水エタノールと混合し高分子サイ
ズ多糖を沈殿させた。この沈殿物を遠心分離し、
そして凍結乾燥した。しかして、上記に定義した
型抗原の構造単位のくり返しよりなる精製され
た乾燥固体生成物を得た。この方法により、型
菌の各１のロツトから総じて約５乃至15mgの多
糖抗原（mw.0.8〜５×106）が収得された。 低分子サイズの多糖型抗原のために従来技術
で用いられているのと同じ方法を用いて採収され
た菌を抽出することによつて上記と同じ分子サイ
ズの抗原が少量であるが得られた。一般的に、菌
の各１から約１乃至４mgの抗原がこの方法によ
つて収得された。 乾燥固体形状で得られた精製高分子サイズ多糖
抗体はIaおよびIc型抗原について上記に定義した
構造単位のくり返しよりなりそして0.8〜５×
106dのサイズを有している。この繰り返し単位は
次の方法を用いて決定および確認された構成糖組
成の決定はDmitriev、B.A.et.al.、Eur.J.
biochem.50、p539−547（1975）の方法によつて
行なつた。多糖を0.25Mの硫酸で100℃16時間加
水分解し、中和後凍結乾燥し、残渣を水に溶かし
たものを33％酢酸と５％硝酸ナトリウムで室温１
時間処理した。この条件下で２−アミノ−２−デ
オキシ−Ｄ−グルコースは２，５−アンヒドロ−
Ｄ−マンノースに変換される。これを
Sawardeker et al.（1965）の方法により対応す
る糖アルコール酢酸エステル化した後GC−MS
により分析した。Ｄ−立体配置はガラクトースと
グルコース残基についてはLeontein et al.の方
法（Carbohydr.Res.62、p359−362（1978）によ
り、２−オクチルグリコシド化したものについて
GC分析を行ない、２−アセトアミド−２−デオ
キシグルコースについては（−）−２−ブタノー
ルグリコシドについてGC分析を行なつた。遊離
のシアル酸は温和な分解（0.1M硫酸 80℃、80
分）により多糖抗原から遊離させ、Aminoff
（Biochemical J.81、p384−392 1965）のチオバ
ルビール酸法により分析した。シアル酸のα−Ｄ
立体配置は13C−NMRにより決定した。糖の配
列は箱守らのメチル化分析（J.biochem.（tokyo）
55、p205−208（1964））法により分析した。スミ
ス分解とメチル化を組み合わせたスミス分解の変
法で連結の確認を行なつた。末端β−Ｄ−ガラク
トピラノシル残基の除去は型についてはＤ−ガ
ラクトースオキシダーゼ分解、Ia、Icについては
スミス分解、型については限定過ヨウ素酸分解
を行なつた。 ワクチンとして使用する場合には、上記により
得られた乾燥型多糖抗原の100μｇ／mlを標準
サリン溶液に含有する懸濁物を調製し、これを各
0.5mlの量で皮下注射する。本発明による製造さ
れた高分子サイズの多糖抗原も低分子サイズ（５
〜６×105）の多糖抗原も共に高い免疫産出作用
を有し、選択されたワクチン注射を受けた者の中
に特定抗体を0.1乃至2000μｇ／ml抗血清の割合で
つくり出す。これは栄養ブイヨンにトリチウム化
した酢酸エステルを導入して内在的に標識を付し
た多糖抗原をトレーサとして用いた抗血清の放射
線免疫分析によつて測定できる。健康成人におい
て評価した精製型多糖抗原の免疫原性を下記表
１に示す。まれには非免疫化された成人がその血
清に非常に高いレベルで型特異性抗体を有してい
ることがあるが、きわめて大きい集団から選別し
てその人の血漿が積極的免疫に有用な十分に高い
力価を持つガンマ画分をつくるためにプールしう
るような人達を選択することが必要あろう。非免
疫化された成人からプールされたガンマグロブリ
ンのいくつかのロツトを抗型多糖抗体について
分析試験した結果では、わずかに５〜20μ／mlの
血清を含有しているにすぎないことが判つてい
る。このような低い力価のグロブリンを静脈注射
して免疫を得るには悪い反作用の危険を伴なう禁
止的大量の投与が必要となる。
【表】
で有為差が認められた。
栄養ブイヨンから得た、あるいは上記のように
型を抽出して得た0.5〜６×106の分子サイズを
持つ多糖抗原をワクチン注射された選択された人
達の血清をプールすれば、200μｇ／mlあるいは
それ以上の比抗体濃度を持つものが容易に得られ
る。このような高い力価のプールされ、濃縮され
た血清は通常の方法で容易に分別して最大限に多
量の型特異性抗体を含み且つ少なくとも2000μ
ｇ／mlの比活性を持つ十分に高活性のグロブリン
を得さしめる。以下この力価の多糖抗原に対する
抗体を得るための具体的実験プロセスを記載す
る。50μｇの上記多糖抗原を50名の志願者に皮下
投与した。免疫化に先立ち血清サンプルを採取
し、免疫後４週間後に再度血清サンプルを採取し
た。免疫化前後の血清中の抗体レベルは放射活性
の抗原結合アツセイを用いて測定した。このアツ
セイにおいては100μのトリチウムで外部ラベ
ルした型多糖抗原（10nｇの多糖を含む）を
100μの血清に加え、室温で１時間インキユベ
ートしたのち、４℃で一晩インキユベートした。
抗体を冷飽和硫酸アンモニウム（50％ｖ／ｖ）で
沈殿させた。沈殿せずに上清に残つている放射活
性のカウントは抗体濃度に反比例する。免疫後に
最低200μｇ／ml以上の特異抗体を血清中に有す
る固体を選んで免疫グロブリンプールを調整し
た。型多糖抗原で免疫した50個体の内26固体が
このレベルに達していた。志願者は１単位の血を
提供した。血清は分離されプーリされた。Cohn
の分画法あるいは硫安沈殿により免疫グロブリン
を濃縮して標準的イムノグロブリンプールを調整
した。この濃厚イムノグロブリンプールは2000μ
ｇ／mlの特異抗体を含有していた。したがつて、
これにより得た高度免疫グロブリンは適当な生理
学的に許容されるキヤリヤーたとえば標準サリン
に溶解して皮下注射または筋肉注射により投与さ
れた場合には0.3乃至１ml、好ましくは約0.5mlの
小量の投与で効果を発揮する。キヤリヤー中のこ
のグロブリンの濃度は５乃至20重量％でありう
る。本高度免疫グロブリンは受動的免疫を与える
ために妊娠している女性にもその分娩前に投与す
ることができ、また生後１ケ月以内の乳児にも投
与することができる。
栄養ブイヨンから得た、あるいは上記のように
型を抽出して得た0.5〜６×106の分子サイズを
持つ多糖抗原をワクチン注射された選択された人
達の血清をプールすれば、200μｇ／mlあるいは
それ以上の比抗体濃度を持つものが容易に得られ
る。このような高い力価のプールされ、濃縮され
た血清は通常の方法で容易に分別して最大限に多
量の型特異性抗体を含み且つ少なくとも2000μ
ｇ／mlの比活性を持つ十分に高活性のグロブリン
を得さしめる。以下この力価の多糖抗原に対する
抗体を得るための具体的実験プロセスを記載す
る。50μｇの上記多糖抗原を50名の志願者に皮下
投与した。免疫化に先立ち血清サンプルを採取
し、免疫後４週間後に再度血清サンプルを採取し
た。免疫化前後の血清中の抗体レベルは放射活性
の抗原結合アツセイを用いて測定した。このアツ
セイにおいては100μのトリチウムで外部ラベ
ルした型多糖抗原（10nｇの多糖を含む）を
100μの血清に加え、室温で１時間インキユベ
ートしたのち、４℃で一晩インキユベートした。
抗体を冷飽和硫酸アンモニウム（50％ｖ／ｖ）で
沈殿させた。沈殿せずに上清に残つている放射活
性のカウントは抗体濃度に反比例する。免疫後に
最低200μｇ／ml以上の特異抗体を血清中に有す
る固体を選んで免疫グロブリンプールを調整し
た。型多糖抗原で免疫した50個体の内26固体が
このレベルに達していた。志願者は１単位の血を
提供した。血清は分離されプーリされた。Cohn
の分画法あるいは硫安沈殿により免疫グロブリン
を濃縮して標準的イムノグロブリンプールを調整
した。この濃厚イムノグロブリンプールは2000μ
ｇ／mlの特異抗体を含有していた。したがつて、
これにより得た高度免疫グロブリンは適当な生理
学的に許容されるキヤリヤーたとえば標準サリン
に溶解して皮下注射または筋肉注射により投与さ
れた場合には0.3乃至１ml、好ましくは約0.5mlの
小量の投与で効果を発揮する。キヤリヤー中のこ
のグロブリンの濃度は５乃至20重量％でありう
る。本高度免疫グロブリンは受動的免疫を与える
ために妊娠している女性にもその分娩前に投与す
ることができ、また生後１ケ月以内の乳児にも投
与することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 実質的に下記組成： （式中、 Glcpはグリコース（ピラノース型）を意味し、
Galpはガラクトース（ピラノース型）を意味し、 GlcNAcpは２−アセトアミド−２−デオキシ
グルコース（ピラノース型）を意味しそして
NeuNAcpはシアル酸（ピラノース型）を意味す
る。） を有する繰返し単位からなり且つ0.8〜５×106の
分子サイズを有するＢ群型連鎖状球菌に特有の
多糖抗原。 ２ 連鎖状球菌を栄養ブイヨン中で培養すること
よりなる、Ｂ群型連鎖状球菌に対する多糖ワク
チンとして使用するための抗原の製造法におい
て、該栄養ブイヨンに少なくとも10ｇ／のグリ
コースを導入しそして該栄養ブイヨンのPHを６乃
至８に保持して0.8〜５×106の分子サイズを有す
る画分を含む多糖抗原を得ることを特徴とする方
法。 ３ 該連鎖状球菌の培養中に該栄養ブイヨンにア
ルカリ性物質を導入して該PH値を維持することを
特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 該PH値を6.8乃至7.6に維持することを特徴と
する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ５ グルコースの量を約14乃至16ｇ／とするこ
とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 ６ 培養の開始時に栄養ブイヨンから105以上の
分子サイズを有する成分を除きそして連鎖状球菌
の採収後に８×105乃至11×105の範囲の分子サイ
ズを有する画分を含む多糖抗原を回収することを
特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ７ ３×104以上の分子サイズを有する成分を栄
養ブイヨンから除きそして14乃至16ｇ／の濃度
を与える量のグリコースを添加することを特徴と
する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ８ 実質的に下記組成： （式中、 Glcpはグリコース（ピラノース型）を意味し、
Galpはガラクトース（ピラノース型）を意味し、 GlcNAcpは２−アセトアミド−２−デオキシ
グルコース（ピラノース型）を意味しそして
NeuNAcpはシアル酸（ピラノース型）を意味す
る。） を有する繰返し単位からなり且つ0.8〜５×106の
分子サイズを有するＢ群型連鎖状球菌に特有の
多糖抗原を10乃至1000μｇ／ml含有している生理
学的に許容される非毒性ビヒクルよりなることを
特徴とするＢ群型連鎖状球菌に対するワクチ
ン。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/934,214 US4207414A (en) | 1978-08-16 | 1978-08-16 | Polysaccharide antigens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6485925A JPS6485925A (en) | 1989-03-30 |
| JPH0561255B2 true JPH0561255B2 (ja) | 1993-09-06 |
Family
ID=25465175
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10364779A Granted JPS5533474A (en) | 1978-08-16 | 1979-08-16 | Vaccine and its manufacture |
| JP63197291A Granted JPS6485925A (en) | 1978-08-16 | 1988-08-09 | B group ii type streptococci idiosyncratic polysaccharide antigen |
| JP63197290A Expired - Lifetime JPH0674211B2 (ja) | 1978-08-16 | 1988-08-09 | Ｂ群ＩａＩｃ型連鎖状球菌特異性多糖抗原 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10364779A Granted JPS5533474A (en) | 1978-08-16 | 1979-08-16 | Vaccine and its manufacture |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63197290A Expired - Lifetime JPH0674211B2 (ja) | 1978-08-16 | 1988-08-09 | Ｂ群ＩａＩｃ型連鎖状球菌特異性多糖抗原 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4207414A (ja) |
| EP (1) | EP0008969B1 (ja) |
| JP (3) | JPS5533474A (ja) |
| AT (1) | ATE7761T1 (ja) |
| CA (1) | CA1154382A (ja) |
| DE (1) | DE2967036D1 (ja) |
| DK (1) | DK341679A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4324887A (en) * | 1978-08-16 | 1982-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Type II group B Streptococci polysaccharide |
| US4439422A (en) * | 1980-01-02 | 1984-03-27 | Research Corporation | Group B Streptococcus antigens and vaccines |
| US4413057A (en) * | 1980-04-14 | 1983-11-01 | Merck & Co., Inc. | Group B streptococcal capsular polysaccharides |
| PT72812B (en) * | 1980-04-14 | 1983-02-16 | Merck & Co Inc | Process for preparing group b streptococcal capsular polysccha-rides |
| US4396763A (en) * | 1981-01-14 | 1983-08-02 | Meiji Milk Products Company Limited | High molecular polysaccharide MPS-80 |
| US4425330A (en) | 1981-05-20 | 1984-01-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Bovine mastitis vaccine and method for detecting efficacy thereof |
| US4476119A (en) * | 1981-08-04 | 1984-10-09 | Fidia S.P.A. | Method for preparing ganglioside derivatives and use thereof in pharmaceutical compositions |
| US4716223A (en) * | 1981-08-04 | 1987-12-29 | Fidia, S.P.A. | Method for preparing ganglioside derivatives and use thereof in pharmaceutical compositions |
| US5302386A (en) * | 1986-04-16 | 1994-04-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture |
| JP2754000B2 (ja) * | 1986-04-16 | 1998-05-20 | ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル，インコーポレイテッド | 細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法 |
| FR2627779B1 (fr) * | 1988-02-26 | 1991-03-15 | Sodima Union Coop Agricoles | Procede d'epaississement d'un produit du type lait fermente, notamment de yaourt et nouveau polysaccharide utile pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US5648241A (en) | 1989-09-15 | 1997-07-15 | The General Hospital Corporation | Conjugate vaccine against group B streptococcus |
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