JP2754000B2 - 細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法 - Google Patents
細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、B群のストレプトコッカス細菌の免疫決定
子を有する抗原、これら細菌に対し保護するワクチン、
この種のワクチンの製造方法、並びに細菌多糖類からの
オリゴ糖の製造方法に関するものである。本明細書に使
用するB群のストレプトコッカス(すなわちGBS)細菌
という用語は、特にランスフィールド、ジャーナル・エ
キスペリメンタル・メジスン、第108巻、第329〜341頁
(1938)、並びにB群の血清型を特性化するその後の研
究、たとえばラッセル−ジョンズ、ジャーナル・エキス
ペリメンタル・メジスン、第160巻、第1476頁(1984)
を参照して当業者により理解されているように用いられ
る。特にこの用語は、分類学的にストレプトコッカス・
アガラクチア(Streptococcus agalactiae)と命名され
た細菌を包含する。 GBSは、幼児における菌血症及び(又は)脳膜炎、並
びに成人における感染症に対する認められた病因学的薬
剤である[ベーカー、「B群のストレプトコッカス感
染」、アドバンシス・イン・インターナル・メジスン、
第25巻、第475〜500頁(1980)]。したがって、GBS感
染を診断するための迅速かつ明確な分析法並びに特に幼
児及び汚染された個人におけるGBSに対する保護の発生
方法を開発することが重要である。 GBSカプセル状多糖類は、GBS毒性及び免疫に対し重要
であることが知られている[ベーカー、上記]。さら
に、認められたGBS型及び亜型は化学的に相関するが抗
原的には相違したカプセル状多糖類を有し、これら多糖
類はガラクトトース、グルコース、N−アセチルグルコ
サミン及びN−アセチル−ノイラミン(シアリン)酸で
構成された反復構造を有する[ベーカー、上記]。III
型GBSカプセル状多糖類は、第1図に示したような分岐
した五糖類の反復単位で構成された骨格を有する[ジェ
ニングス等、キャナディアン・ジャーナル・バイオケミ
ストリー、第58巻、第112〜120頁(1980)]。 III型GBS多糖類に関する1つの研究は、天然の免疫決
定子部位が側鎖−骨格の接合部に位置することを示唆し
ている[ジェニングス等、バイオケミストリー、第20
巻、第4511〜4518頁(1981)]。側鎖の末端N−アセチ
ル−ノイラミン酸残基の存在は、免疫決定子の発現に対
し臨界的であると報告されている。 さらに、GBS蛋白免疫性の研究も報告されている。ラ
ンスフィールド等[ジャーナル・エキスペリメンタル・
メジスン、第142巻、第165〜179頁(1975)]は、GBSの
いわゆるC蛋白は免疫原として存在すれば全生物に対し
保護抗体を誘発することができると報告している。「C
蛋白」という命名は、ヘンリックセン等によりインター
ナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バ
イテリオロジー、第34巻、第500頁(1984)に定義され
ているように用いられ、この用語は従来Ibc蛋白と命名
された蛋白を包含する。 C蛋白の分子に対する研究が示すところでは、これら
の物質は種々の分子量を有する蛋白の複雑な群を構成す
る[ウイルキンソン等、インフェクション・イミュノロ
ジー、第4巻、第596〜604頁(1971):ベバンガー等、
アクタ・パソロジカル・マイクロバイオロジー・スカン
ジナビヤ・セクションB、第87巻、第51〜54頁(197
9);ラッセル−ジョーンズ等、ジャーナル・エキスペ
リメンタル・メジスン、第160巻、第1476〜1484頁(198
4);ベバンガー等、アクタ・パソロジカル・マイクロ
バイオロジー・スカンジナビア・セクションB、第89
巻、第205〜209頁(1981)]。 ウイルキンソン等は、全IC型GBSの熱酸抽出物か種々
異なる分子寸法(ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定)を有しかつIc型抗血清に対し寒天ゲルにおいて
血清学的反応性を有する13種の蛋白を与えることを開示
している。ベバンガー等(1979)は、9種のトリプシン
感受性蛋白と5種のトリプシン耐性であるがペプチン感
受性の蛋白とを含有するGBS酸抽出物を開示している。
ベバンガー等(1981)は、部分精製された酸抽出蛋白の
免疫性を開示している。ラッセル−ジョーンズ等は、2
0,000〜130,000の範囲で分子量が変化する30種までの蛋
白を含有する抽出物を開示しており、130kdの蛋白が主
体である。さらにラッル−ジョーンズ等は、多数の蛋白
が単一のモノクローナル抗体に対し免疫(ウエスタン)
ブロットにより反応したと報告しており、このことは或
る種の蛋白が他の蛋白の分解生成物であったことを示唆
している。他のモノクローナル抗体を用いて、130,000M
Wの蛋白及び10,000〜120,000MWの範囲の12種の他の蛋白
は共通のエピトープを有すると思われる。 インセル及びアンデルセン、ジャーナル・エキスペリ
メンタル・メジスン、第163巻、第262頁(1986)は、ヘ
モフィルス・インフレンザ(Haemophilus influenzae)
カプセル状多糖類を蛋白キャリヤに結合させて、このカ
プセルをより胸腺依存性の免疫原に変換する試みを開示
している。 発明の要点 今回、III型B群のストレプトコッカス(III−GBS)
多糖類カプセルの反復五糖類単位(及び単一の単位だけ
でも)のオリゴマーが抗原性を示すことを突き止めた。
この単位を含む抗原、特に反復単位を有する抗原は、II
I−GBSワクチンの成分として使用することができる。し
たがって、本発明の一面は、III型B群のストレプトコ
ッカス(IIIGBS)細菌に対し選択的免疫反応性である抗
体を生成することができかつ次式:[式中、n=1〜50であり、GlcNAcpはN−アセチル−
グルコサミン(ピラノース型)を示し、Galpはガラクト
ース(ピラノース型)を示し、Glcpはグルコース(ピラ
ノース型)を示しかつα−D−NeuNAcはN−アセチル−
ノイラミン(シアリン)酸を示す] を有する精製オリゴ糖からなる抗原を特徴とする。 「精製」という用語は、オリゴ糖と共に天然に存在す
る種々の蛋白、脂質及び炭水化物成分から実質的に分離
されることを意味する。特に、精製オリゴ糖は完全IIIG
BS多糖類カプセル又は、100,000以上の分子量を有する
その断片を実質的に含まない。微量の外来成分が精製オ
リゴ糖に存在したとしても、この精製物質をワクチンに
使用したり或いは抗原として使用することを妨げない。
「精製」という用語は、人工的な合成を伴なう合成オリ
ゴ糖調製物を排除することを意図せず、またこの用語は
調製物が再現性のあるオリゴ糖特性データ、たとえば分
子量、糖残部含有量、糖結合、クロマトグラ反応及び免
疫学的挙動を示す限り若干の不純物を含むような調製物
を排除することを意味するものでもない。 第二面において本発明は、IIIGBSに対し保護を示すこ
とができかつ医薬上許容しうるベヒクルと必要に応じキ
ャリヤに結合された上記抗原とからなるワクチンを特徴
とする。 本発明の第三の面は上記抗原の製造方法を特徴とし、
この方法は:(1)III−GBS細菌を適当な培地で培養
し;(2)培地又は細菌細胞から多糖類を回収し;
(3)この多糖類を結合S1(1→3)−β−gal(1→
4)S2[式中、S1及びS2は独立してグルコース、グルコ
サミン又はN−アセチル−グルコサミンから選択され
る]の開裂につき特異性であるエンド−β−ガラクトシ
ダーゼによって切断し;かつ(5)培地又は細菌からオ
リゴ糖抗原を回収することからなっている。必要に応
じ、オリゴ糖は下記するようにキャリヤに結合される。 前記3種の局面の好適具体例において、オリゴ糖抗原
は、上記結合に対し特異性のエンド−β−ガラクトシダ
ーゼを用いてIIIGBSカプセル状多糖類を酵素加水分解し
て生成される。この種の1種のエンド−β−ガラクトシ
ダーゼはフラボバクテリウム・ケラトリチクス(Flavob
acterium keratolyticus)に見出される。さらに好まし
くは、オリゴ糖は細菌免疫決定子部位を有するたとえば
蛋白、特に細菌トキソイド又は細菌表面蛋白のようなキ
ャリヤに共有結合される(たとえば第2アミン結合を介
する)。 第四の面において、一般に本発明はさらに上記結合を
有する細菌多糖類の酵素開裂を特徴とし、すなわち精製
オリゴ糖の製造方法に関し、この方法は特に表面多糖類
(たとえば多糖類カプセル若しくは膜)を有する細菌を
培養しかつこの多糖類を抽出し、次いでこれを上記酵素
で切断し、さらにオリゴ糖を回収する。好ましくは、細
菌はグラム陽性菌、たとえばIIIGBSである。或いは、こ
の細菌はたとえば14型ストレプトコッカス・ニューモニ
ア(Streptococcus pneumoniae)(たとえばATCCNo.631
4)のような表面カプセル状多糖類を有する菌種とする
ことができる。 第五の面において、本発明はIa/c型B群のストレプト
コッカスの実質的に精製されたトリプシン耐性のC表面
蛋白を特徴とし、この蛋白は約14,000の分子量を有しか
つB群のストレプトコッカス細菌多糖類に対し非交差免
疫反応性であるが、Ia/c型GBSに対し交差免疫性を有す
る。他の局面において、上記蛋白はIa/c型(及びIb/c
型)GBSに対し保護を示すワクチンに使用され、このワ
クチンは蛋白(必要に応じ、たとえば上記したIII型GBS
オリゴ糖のようなオリゴ糖に結合される)と医薬上許容
しうるキャリヤとからなっている。得られる結合体はGB
Sに対し広範な保護を与え、IIIGBS及びC蛋白を有するG
BSに対し保護を示す。 さらに他の局面において、本発明はGBSに対し受働保
護を与えうるγグロブリンフラクションを特徴とし、こ
のフラクションは哺乳動物を上記ワクチンの1種で免疫
化することにより生成される。次いで、このフラクショ
ンを個人に投与して、GBS感染に対し保護を与えるか又
は進行中の感染を処置する。 最後に、本発明は抗GBS抗体に関する試料の分析方法
を特徴とし、この方法は試料へ上記オリゴ糖又は蛋白抗
原を添加し、次いで免疫複合体の生成を検出することか
らなっている。或いは、試料をGBS免疫決定子の存在に
つき分析し、その際オリゴ糖若しくは蛋白抗原に対する
抗体を生成させ、この抗体を試料に添加し、かつ免疫複
合体の生成を検出する。 骨格グリコシド結合の酵素選択加水分解は、単純な酸
加水分解よりも優れている。何故なら、後者の技術は側
鎖シアリン酸残基の損失を伴い、かつ結合を非選択的に
切断して免疫性の減少した不均質混合物を生成するから
である。これに対し、酵素切断法はシアリン酸残基を保
持し、かつ骨格反復単位につき一旦生ずるとgal−β1
−4−glc結合においてのみ骨格の切断をもたらす。 本発明の他の特徴及び利点は、好適具体例に関する以
下の説明から明らかとなるであろう。 好適具体例の説明 以下、本発明の好適具体例につき説明し、先ず最初に
図面につき簡単に説明する。 I.図面 第1図はIII型GBSカプセル状多糖類の反復五糖類の図
面である。 II.III型GBS抗原及びワクチン A.オリゴ糖 上記特定の五糖類は、III型GBSを培養しかつ多糖類カ
プセルを上澄ブロスから又は細菌細胞からジェニングス
等の一般的方法[キャナディアン・ジャーヤル・バイオ
ケミストリー、第58巻、第112〜120頁(1980)]により
抽出して得られる。多糖類抽出物を、構造: S1(1→3)βgal(1→4)βS2 [ここでS1及びS2は独立してグルコース、グルコサミン
又はN−アセチル−グルコサミンから選択される]を特
異的に切断するエンド−β−ガラクトシダーゼによって
切断する。上記構造はIII型GBS多糖類カプセルの反復単
位1個につき一回発生し、かつ得られた切断生成物は1
個若しくはそれ以上の上記五糖類反復単位を有するオリ
ゴ糖である。 酵素は、必須の特異的切断を触媒する酵素を産生する
ことが知られた細菌から得られる。この種の好適な1種
の細菌はフラボバクテリウム・ケラトリチクスである。
必須の特異的活性を有する酵素を産生すると思われる他
の細菌は、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides
fragilis)である。キタミカデス等[下記]は、エッシ
エルキヤ・フロインディ(Escherichia freundii)、シ
ュードモナス・sp.(Ps−eudomonas sp.)及びココバチ
ルス・sp.(Cocobacillus sp.)にも硫酸ケラタン上で
誘発させれば必須のエンド−β−ガラクトシダーゼ活性
が存在することを報告している[ナカガワ等、ジャーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第250巻、第912〜
917頁;及びヒラノ等、コネクティブ・ティシュー・リ
サーチ、第2巻、第1〜10頁]。適するF.ケラトリチク
スは日本国、大阪在、醗酵研究所(IFO)からIFO No.14
087として得ることができる。エンド−β−ガラクトシ
ダーゼを作成するための適する一般的方法は、キタミカ
ド等によりジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第2巻、第3906〜3909頁(1981)に示されている。 上記のように作成した抽出III型GBS多糖類カプセルを
緩衝酵素調製物に添加しかつ培養する(たとえば、37
℃、48時間)。切断後、オリゴ糖をゲル濾過クロマトグ
ラフィー、たとえばセファデックスG75(ファルマシア
社)により分子量で分離し、かつ陰イオン交換クロマト
グラフィー、たとえば陰イオン交換高性能液体クロマト
グラフィー(HPLC)、モノQ(ファルマシア社)又はQA
Eセファデックス(ファルマシア社)によって精製す
る。 約1〜50個(特に好ましくは約2〜30個)の五糖類単
位からなる精製されたオリゴ糖をクロマトグラフ群から
選択し、次いでこれをワクチンに使用するための蛋白に
結合させる。この蛋白は不活性キャリヤとすることがで
き、或いはそれ自身にて保護を与えるよう、特に他の種
類のGBS又は他の細菌に対し保護を誘発することにより
オリゴ糖で誘発される保護を補完して保護を与えるよう
選択することができる。非毒性のジフテリヤ毒素同族体
(CRM197)を、インセル等(1986)によりジャーナル・
エキスペリメンタル・メジスン、第163巻、第262頁及び
アンデルセン等、ジャーナル・クリニカル・インベスチ
ゲーション、第76巻、第52頁(1985)に記載されたよう
に使用することもできる。使用しうる他のトキソイド
は、マサチューセッツ州、ジャマイカ・プレイン、サウ
スストリート在、マサチューセッツ州立ラボラトリーか
ら入手しうる破傷風毒素又は標準的ジフテリア毒素を包
含する。 蛋白−オリゴ糖結合体は、たとえばシュワルツ及びグ
レーの一般的方法[アーキテクチャー・バイオケミカル
・バイオフィジオロジー(1977)、第181巻、第542頁]
のようなカップリング反応によって得られ、この方法は
還元糖を蛋白へ直接に結合させる。脱アミノ化によって
生成されたオリゴ糖断片を、シアノ硼水素化物を介して
キャリヤ蛋白へ直接に結合させることができる。IIIGBS
の場合、蛋白における窒素とオリゴ糖の脱アミノ化によ
り生成された2,5−アンヒドロマンノースにおけるアル
デヒド基との間の結合によって第2アミンが生成され
る。このアルデヒドは、シアノ硼水素化物を用いる直接
的カップリングによって得られる。 得られたオリゴ糖−蛋白結合体を、発熱物質を含有し
ない塩水又は他の任意の生理学上許容しうる無毒性ベヒ
クル若しくは媒体に懸濁させ、これらの媒体は任意慣用
の安定化剤又は他の添加剤を所望に応じて含有すること
ができる。抗原の濃度は臨界的でなく広範囲に変化しう
るが、多くの目的には10〜1000μg/mlの範囲が便利かつ
好適である。この形態において、4℃にて長期間貯蔵す
る際に安定となり、さらにフッド・アンド・ドラッグ・
アドミニストレーション・レジスレーション(第21節、
第610.11〜610.13項)に記載されたような動物試験にか
けた際無菌・無毒かつ非発熱性である。上記塩水懸濁物
の適する容量(たとえば約0.5ml)を投与して(たとえ
ば皮下注射により)、IIIGBS保護を誘発させる。 さらに、本発明は特に幼児又は汚染した成人に使用さ
れる受働免疫法を特徴とし、この方法はオリゴ糖−蛋白
結合体のワクチンをヒトに注射して高タイターで抗体を
発生せしめ、抗血清をヒトの血液から分離し、かつ抗血
清を分画して受働免疫に作用しうる抗体を含んだγグロ
ブリンフラクションを生成させる。受働免疫のための供
与体を作成するこの方法は、免疫化されていないヒト成
人が極めて高レベルのタイプ特異性GBS抗体をその血清
中に有するが、充分高いタイターのグロブリンフラクシ
ョンを受働免疫に使用すべく血漿を貯蔵しうる個体を選
択するには極めて多数の試料をスクリーニングする必要
があるので有用である。免疫化されてない成人からの幾
種かの貯蔵ヒトγグロブリンのロットを抗−Ia及びIc
型、抗−II型及び抗−III型多糖類抗体につき分析し
て、僅か5〜20kg/mlの血清を含有することが判明し
た。このような低タイターのグロブリンの静脈内注射に
よる免疫化は、恐らく逆反応の危険性を伴う多量の投与
量を必要とする。 受働免疫化には、上記結合多糖類ワクチンでワクチン
接種した選択個人からのヒト血清保存物を濃縮しかつ常
法により分画して、タイプ特異性抗体の大部分及び充分
高い活性を有するグロブリンフラクションを与えること
ができ、この高免疫グロブリンはたとえば規定濃度の塩
水のような適当な生理学上許容しうるキャリヤにて静脈
内又は筋肉内投与する際0.3〜1ml、好ましくは約0.5ml
という少投与量にて有効である。キャリヤ中のグロブリ
ンの濃度は5〜20重量%とすることができる。この高免
疫グロブリンは、出産前の妊娠した婦人、新生児又は免
疫学的に汚染した個人に投与して受働免疫又は治療を与
えることができる。 III.オリゴ糖抗体 一般に、オリゴ糖は細菌多糖類のエンド−β−ガラク
トシダーゼ切断によって回収することができる。上記説
明はIIIGBSオリゴ糖並びにワクチンにおけるその使用に
関するものであるが、さらにオリゴ糖はたとえば哺乳動
物にオリゴ糖−蛋白結合体を注射しかつ得られた抗体を
回収することにより哺乳動物を処理して、実験哺乳動物
中に抗体を発生させるべく使用することもできる。さら
に、標準技術によってモノクローナル抗体を発生させる
こともできる。得られる抗体は、たとえばGBS或いは特
にIIIGBSに対する免疫分析に有用である。たとえば、オ
リゴ糖に対する抗体を、当業界で知られた競合若しくは
サンドイッチ免疫分析のような免疫分析に使用すること
もできる。 以下の実施例によりオリゴ糖抗原、オリゴ糖の分離方
法、ワクチン及び受働免疫化法につき説明する。 例1:エンド−β−ガラクトシダーゼの作成 F.ケラトリチクスを1晩培養し、かつこれを使用して
改変トリプチカーゼペプトンブロス(BBLマイクロバイ
オロジー・システムス社、ミズーリー州、コッケイスビ
ル在からの3%のトリプチカーゼペプトン);0.1%酵母
抽出物(ジフコ・ラボラトリース社、ミシガン州、デト
ロイト在);0.2%NaCl、pH7.0に接種した。このブロス
を18時間培養し(フランス国、ラフイット在、ビオラフ
ィッテ、ファメンタ)、その間通気(15l/min.)、撹拌
(150rpm)、温度(25℃)及びpH(7.0)を調節した。
遠心分離によって細菌を除去し、そして上澄液を濃縮し
た(マサチューセッツ州、ベッドフォード在、ペリコン
・カセット・システム、ミリポア・コーポレーション
社)。固体の(NH4)2SO4を75%飽和まで添加しかつ溶液
を4℃にて1晩静置した。 沈澱物を遠心分離によって除去しかつ10mlの酢酸ナト
リウム(0.2M NaCl、pH6.0)に溶解させた。この溶液を
5×90cmのセファデックスG 100カラム(ニュージャジ
ー州、ピスカタウエイ在、フェルマシア・ファイン・ケ
ミカルス社)に充填し、かつ同じ緩衝液を用い4℃で40
ml/hr.の速度にて溶出させた。活性フラクションをエン
ド−β−ガラクトシダーゼ活性につき分析して同定し、
次いで貯蔵した。特に、これらフラクションを牛角膜の
硫酸ケラタン(ミズーリ州、セントルイス在、シグマ・
ケミカル・カンパニー社)と共に37℃にて1晩培養し
た。還元糖の生成を、パーク及びジョンソン、ジャーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第181巻、第149〜
151頁(1949)の一般的方法により測定した。 貯蔵した活性フラクションを透析し、凍結乾燥し、か
つ緩衝液(50mM酢酸ナトリウム、2mM CaCl2、pH6.0)に
溶解させた。この緩衝した酵素調製物を、上半分にDEAE
セファセル(ファルマシア社)を含有しかつ下半分にビ
オレックス70(ニューヨーク州、ロックビル・センター
在、ビオラド・ラボラトリース社)を含有する2.5×14c
mのカラムに充填した。この酵素を上記緩衝液250mlで溶
出させた。残留した結合蛋白を1.0M NaClで溶出させ、
かつ活性貯蔵フラクションを10mM酢酸ナトリウム、2mM
CaCl2(pH7.0)で透析しかつ凍結乾燥した。 例2.多糖類切断 III型GBS多糖類を上記ジェニングスの一般的技術(19
80)によって抽出した。DEAEセファセル/ビオレックス
70カラムの試験から得られた凍結乾燥したエンド−β−
ガラクトシダーゼ調製物を10mlの10mM酢酸ナトリウム、
2mM塩化カルシウム(pH7.0)に溶解させ、かつ2lの同じ
緩衝液に対し4℃にて浴を1回交換して1晩透析した。
20mgの精製されたIII型GBSカプセル多糖類を酵素調製物
に添加した。この混合物を濾過滅菌し、かつ撹拌しなが
ら37℃で48時間培養した。 例3:オリゴ糖の精製及び特性化 切断後、オリゴ糖を12,000〜14,000ダルトンの孔径の
膜(カリホルニア州、ロスアンゼルス在、スペクトラム
・メジカル・インダストリーズ社)を介しての水に対す
る透析により大分子量と小分子量との貯蔵物に分離し
た。1個(五糖類)及び2個(十糖類)の反復単位に対
応するオリゴ糖を陰イオン交換クロマトグラフィーによ
って精製した。少量のオリゴ糖(1mg若しくはそれ以
下)は、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー
(HPLC)により精製することができる。500μgの切断
混合物(小分子量貯蔵物)を5×50mmのモノQカラム
(ファルマシア社)に充填し、かつ1個及び2個の反復
単位のオリゴ糖を20mMトリスHCl緩衝液(pH7.2)によっ
て平等に溶出させた。より大きいオリゴ糖は、より高い
塩濃度で溶出させることができる。多量のオリゴ糖を精
製するため、QAEセファデックスA50(ファルマシア社)
を充填した1.2×10cmのカラムを用いた。2〜8mgの試料
を、20mM N−メチルジエタノールアミンアセテート(pH
9.6)の出発緩衝液にてこのカラムに充填した。カラム
を30mlの出発緩衝液で1ml/min.の速度にて洗浄し、次い
で単一反復単位のオリゴ糖を50mlの15mM酢酸ナトリウム
を含有する出発緩衝液で溶出させた、2mlのフラクショ
ンを集め、1M酢酸で中和しかつ薄層クロマトグラフィー
(TLC)によって分析した。単一反復単位のオリゴ糖を
含有するフラクションを集め、凍結乾燥し、2mlの水に
溶解させ、かつセファデックスG15(ファルマシア社)
を含有する1.6×25cmのカラムで脱塩した。 主たる切断生成物は四糖類と十糖類との標準間で移動
するバンドに対応し、第1図の五糖類単位につき予測さ
れる物質に適合した分子寸法を有する。このバンドのジ
フェニルアミン及びレゾルシノール染色はシアリル化さ
れた糖類に一致した。メチル化分析は、この構造が完全
に五類反復単位であることを確認した。 1個及び2個の反復単位オリゴ糖を陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより分析した。陰イオン交換HPLCは、
少量のオリゴ糖(1〜2mg若しくはそれ以下)を精製す
るための迅速かつ便利な方法である。単一反復単位のオ
リゴ糖はボイド空間に溶出し、2個反復単位のオリゴ糖
は平等相中にその後に溶出する。より大きいオリゴ糖又
は天然多糖類は平等相に保持されるが、0.5M塩化ナトリ
ウムによりこのカラムから容易に溶出される。この方法
を用いて、放射性抗体結合分析(PABA)研究に使用する
ためのトリチウム化された1個及び2個の反復単位のオ
リゴ糖を精製することができる[シフェルレ(1985)、
ジャーナル・イミュノロジー、第135巻、第4164頁参
照]。多量の単一反復単位のオリゴ糖を精製するため、
開放陰イオン交換カラムを用いて、より大きい結合容量
を与えることができる。このQAEセファデックスA50カラ
ムを用いて、単一反復単位並びにそれより大きいオリゴ
糖を出発緩衝液に保持した。より大きいオリゴ糖を含ま
ない単一反復単位を、15mM酢酸ナトリウムを含有する出
発緩衝液で溶出させた。より大きいオリゴ糖は結合状態
に維持され、かつ塩濃度を増加させて溶出することがで
きる。20mgのIII型天然多糖類の切断物から、6mgの精製
された単一反復単位のオリゴ糖が得られた。TLC上にて
単一反復単位から離間移動する少量バンドに対応するオ
リゴ糖も、陰イオン交換カラムにより若干多量に維持さ
れた。調製試験では完全分離が達成されないが、このよ
うに精製した単一反復単位のオリゴ糖はTLC及びメチル
化分析により純度95%であると推定される。さらに、よ
り大きいオリゴ糖をクロマトグラフィー、たとえばセフ
ァデックスG75カラムによって分画した。 例4:オリゴ糖に対する結合分析 クロマトグラム結合分析を用いて、天然多糖類に指向
した抗体を結合するTLCにより可使化されるオリゴ糖バ
ンドの能力を直接に検査した。単一反復単位のバンドに
結合する抗体が明らかに証明された。この分析は定量的
でないが、放射能写真におけるバンドの相対強度から天
然多糖類はより効率的に抗体を結合することが明らかで
ある。この分析は天然II型多糖類につき極めて特異性で
あり、交差反応は脱シアリル化されたコア多糖類、B群
多糖類或いは他のGBS血清型からのカプセル多糖類につ
いては見られない。 上記オリゴ糖抗原を次いで上記のように蛋白に結合さ
せ、かつ発熱物質を含まない塩水溶液に上記と同様に懸
濁させてワクチンを作成した。 単一反復単位の五糖類(第1図)は放射性抗体結合分
析、阻止TLC結合分析及び直接的放射性抗体結合分析を
用いて弱い抗原性であった。オリゴ糖寸法を2反復単位
まで増大すると、抗原結合において8倍の増加を示し
た。特に好ましくは、免疫原は2〜50単位を有する。 IV.GBS蛋白抗原 抗原性GBS C蛋白をIc型GBSの培養上澄液から次の例に
示すように分離した。この蛋白はP10GBS蛋白フラクショ
ン、すなわち10,000〜30,000のMWの蛋白を含むフラクシ
ョンに対する抗血清(たとえばネズミ抗血清)に対し免
疫学的に反応性である。精製された蛋白は、Ib型GBSで
の処理に対しネズミを保護するウサギ抗血清を発生す
る。この保護能力は、GBS多糖類と共に培養しても影響
されない。 例5:蛋白抗原の産生及び精製 Ia/c型GBS(たとえばニューヨーク州、チャニング・
ラボラトリー・ストレインA909、ロックフェラー大学、
ニューヨーク、ATCC27591)を、トッド・ヘベット・ブ
ロス(ミシガン州、デトロイト在、ジフコ・ラボラトリ
ーズ社、THB)の透析物における後期対数増殖期まで培
養し、次いでレビー等、J,Infect・Dis、第149巻、第85
1〜868頁(1984)の一般的方法により0.15M燐酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.4)における0.3%ホルマリンに再懸濁
させた。 Ic型の対数増殖期の培養物1を15lのTHBの透析物
(10,000MWの排析膜で透析)に添加し、10%グルコース
を補添し、かつ滴定により中性pHを維持しながら醗酵装
置(ニュージャジー州、プリンストン在、LSLビオラフ
ィッテ・インコーポレーション社、ビオラフィッテBL2
0.2型)で後期対数増殖期まで増殖させた。10,000gにて
ペレット化させることにより細菌を除去した後、上澄液
を10,000MWの排析膜を備えたペリコン装置(マサチュー
セッツ州、ベッドフォード在、ミリポア・コーポレーシ
ョン社)にて、100mlまで濃縮し、徹底的にH2Oで透析し
かつ−20℃にて凍結させた。 培養上澄液を、限外濾過により大凡の分子寸法によっ
て分離した。2種のフラクションが得られ、一方のフラ
クションはPM30膜(P30;30,000MWより大)によって保持
されかつ他方のフラクションはPM10膜により保持される
がPM30では保持されない(P10;10,000MWより大かつ30,0
00MWより小)。P10を0.15M NaClを含む0.05M燐酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.4)にて透析し、かつセファデックス
G−75カラム(1.6×82cm)(ファルマシア社)で分画
した。これらフラクションの蛋白含有量をラウリー分析
[ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第193
巻、第265〜275頁(1951)]にて750nmにおける吸収に
より監視した。 例6:SDS−PAGE及びウエスタンブロット 試料をレムリの方法[ネイチャー、第227巻、第680〜
684頁(1970)]にしたがってSDS−PAGEにより分析し
た。蛋白の分子量に応じて、5〜15%又は10〜20%のい
ずれかの濃度勾配のゲルを用いた。電気泳動用の試料
を、0.1Mトリス(pH8)と1%SDSと4M尿素と60mMヨード
アセタミドとを最終濃度として含有する緩衝液にて希釈
した。これら試料の還元を必要とする場合は、50mMジチ
オスレイトールを緩衝液に含ませた。100μgの蛋白を
含有する100μlの試料を各穴部に入れた。電気泳動の
後、これら蛋白をクーマシー・ブリリアント青染色によ
って可視化させた。 免疫反応性抗原を同定するため、ウエスタンブロット
を用いた。蛋白を先ず最初に電気泳動にかけ、SDS−PAG
Eゲルを0.02Mトリス緩衝液(pH8.5)と0.15Mグリシン及
び20%メタノールとで構成された緩衝液Aで洗浄した。
これら蛋白をニトロセルロースシート(ニューハンプシ
ャー州、キーン在、シュライヒャ・アンド・シュエル
社)に移して緩衝液Aで電気泳動し(150mA、20h)、か
つ0.01Mトリス緩衝液(pH7.4)と0.5M NaCl及び0.1%ブ
リッグ58(緩衝液B)で洗浄した。次いで、このシート
を抗血清と共に22℃にて2時間培養し、かつ緩衝液Bで
洗浄した。I125蛋白Aと共に22℃にて30分間培養した
後、このシートを緩衝液Bで洗浄し、乾燥プロットし、
かつコダックXAR5番フィルムに露出した。 例7:ネズミ保護試験 体重22〜24gの異系交配された雄CD−1ネズミを、チ
ャールス・リバー・ブリージング・ラボラトリース(マ
サチューセッツ州、ウイルミントン在)から入手した。
このネズミから得られた血清は、RABAにより試験してIa
/c型GBS多糖類抗原に対する検出可能な抗体を含有しな
かった。各実験群は5〜10匹の動物を含んだ。ネズミ保
護試験のため、これらネズミに1mlのネズミ若しくはウ
サギ抗血清を腹腔内注射し、かつ24時間後に1b/c型GBS
の1×106CFUを腹腔内接種した。比較として、予備免疫
ウサギ若しくはネズミ血清を用いた。これらのネズミを
24時間毎に検査し、生存するネズミの個数を細菌接種し
てから48時間後に計算した。 抗血清からの保護抗体を吸収するため、1ml当り1mgの
濃度にてGBS多糖類又は蛋白フラクションを用いた。1ml
の抗血清及び1mlの多糖類若しくは蛋白を37℃にて2時
間培養し、次いで4℃にて1晩培養した。次いで、この
混合物を13,000gにて3分間ペレット化させ、かつ上澄
液を保護研究用として0.15M NaClで希釈した。 カラムクロマトグラフィーによって部分精製した後、
14,000MWの蛋白を調製用SDS−PAGEゲルから再分離し、
かつこれを用いウサギ中に抗血清を発生させた。ネズミ
保護試験において、このウサギ抗血清はIa/c型GBS接種
に対しネズミを89%保護した。 P10フラクションが異質GBS株に対しネズミ保護抗体を
発生しうるかどうかを検討するため、ネズミをIa/c型P1
0フラクションで免疫化した。次いで、免疫後の抗血清
を集め、かつIb型GBSの接種に対しネズミを保護する能
力につき検査した。これらネズミにP10フラクションに
対する保存ネズミ抗血清の種々の希釈物を腹腔内注射
し、その24時間後にIb/c型株を接種した。血清の保護能
力は、1:80の血清希釈率にて消失し始めた。したがっ
て、これらの実験には1:40の最適希釈率にて血清を使用
した。ネズミ保護試験において、この免疫血清はIb型株
での接種に対し、同じ希釈率における正常なネズミ血清
と比較して、ネズミを保護した(P<0.001)。この保
存血清は、RABAで測定しIa型多糖類に対する検出可能な
抗体を含有しなかった。さらに、Ia型若しくはIb型多糖
類を有する保存抗血清の吸収は、保護レベルを顕著には
変化させなかった。Ic型からのP10フラクションに対す
るネズミ抗血清の保護効果はネズミに抗体を発生する非
カプセル状抗原を含有し、これはIb型GBSでの接種に対
しネズミを受働保護した。 特に、IC型GBSからのSDS−PAGE溶出された14,000MWの
蛋白に対するウサギ抗血清を、次いでネズミ保護試験に
使用した。ネズミに抗血清を腹腔内注射し、かつ24時間
後にIb型GBSを接種した。SDS−PAGE溶出された14,000MW
の蛋白に対し発生した抗血清は、1:5及び1:10の希釈率
にてネズミで保護を示した。SDS−PAGE溶出された14,00
0MWの蛋白に対し発生した抗血清と正常なウサギ血清と
の間の差は顕著であった。 その他の具体例については以下の請求の範囲に示す。
子を有する抗原、これら細菌に対し保護するワクチン、
この種のワクチンの製造方法、並びに細菌多糖類からの
オリゴ糖の製造方法に関するものである。本明細書に使
用するB群のストレプトコッカス(すなわちGBS)細菌
という用語は、特にランスフィールド、ジャーナル・エ
キスペリメンタル・メジスン、第108巻、第329〜341頁
(1938)、並びにB群の血清型を特性化するその後の研
究、たとえばラッセル−ジョンズ、ジャーナル・エキス
ペリメンタル・メジスン、第160巻、第1476頁(1984)
を参照して当業者により理解されているように用いられ
る。特にこの用語は、分類学的にストレプトコッカス・
アガラクチア(Streptococcus agalactiae)と命名され
た細菌を包含する。 GBSは、幼児における菌血症及び(又は)脳膜炎、並
びに成人における感染症に対する認められた病因学的薬
剤である[ベーカー、「B群のストレプトコッカス感
染」、アドバンシス・イン・インターナル・メジスン、
第25巻、第475〜500頁(1980)]。したがって、GBS感
染を診断するための迅速かつ明確な分析法並びに特に幼
児及び汚染された個人におけるGBSに対する保護の発生
方法を開発することが重要である。 GBSカプセル状多糖類は、GBS毒性及び免疫に対し重要
であることが知られている[ベーカー、上記]。さら
に、認められたGBS型及び亜型は化学的に相関するが抗
原的には相違したカプセル状多糖類を有し、これら多糖
類はガラクトトース、グルコース、N−アセチルグルコ
サミン及びN−アセチル−ノイラミン(シアリン)酸で
構成された反復構造を有する[ベーカー、上記]。III
型GBSカプセル状多糖類は、第1図に示したような分岐
した五糖類の反復単位で構成された骨格を有する[ジェ
ニングス等、キャナディアン・ジャーナル・バイオケミ
ストリー、第58巻、第112〜120頁(1980)]。 III型GBS多糖類に関する1つの研究は、天然の免疫決
定子部位が側鎖−骨格の接合部に位置することを示唆し
ている[ジェニングス等、バイオケミストリー、第20
巻、第4511〜4518頁(1981)]。側鎖の末端N−アセチ
ル−ノイラミン酸残基の存在は、免疫決定子の発現に対
し臨界的であると報告されている。 さらに、GBS蛋白免疫性の研究も報告されている。ラ
ンスフィールド等[ジャーナル・エキスペリメンタル・
メジスン、第142巻、第165〜179頁(1975)]は、GBSの
いわゆるC蛋白は免疫原として存在すれば全生物に対し
保護抗体を誘発することができると報告している。「C
蛋白」という命名は、ヘンリックセン等によりインター
ナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バ
イテリオロジー、第34巻、第500頁(1984)に定義され
ているように用いられ、この用語は従来Ibc蛋白と命名
された蛋白を包含する。 C蛋白の分子に対する研究が示すところでは、これら
の物質は種々の分子量を有する蛋白の複雑な群を構成す
る[ウイルキンソン等、インフェクション・イミュノロ
ジー、第4巻、第596〜604頁(1971):ベバンガー等、
アクタ・パソロジカル・マイクロバイオロジー・スカン
ジナビヤ・セクションB、第87巻、第51〜54頁(197
9);ラッセル−ジョーンズ等、ジャーナル・エキスペ
リメンタル・メジスン、第160巻、第1476〜1484頁(198
4);ベバンガー等、アクタ・パソロジカル・マイクロ
バイオロジー・スカンジナビア・セクションB、第89
巻、第205〜209頁(1981)]。 ウイルキンソン等は、全IC型GBSの熱酸抽出物か種々
異なる分子寸法(ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定)を有しかつIc型抗血清に対し寒天ゲルにおいて
血清学的反応性を有する13種の蛋白を与えることを開示
している。ベバンガー等(1979)は、9種のトリプシン
感受性蛋白と5種のトリプシン耐性であるがペプチン感
受性の蛋白とを含有するGBS酸抽出物を開示している。
ベバンガー等(1981)は、部分精製された酸抽出蛋白の
免疫性を開示している。ラッセル−ジョーンズ等は、2
0,000〜130,000の範囲で分子量が変化する30種までの蛋
白を含有する抽出物を開示しており、130kdの蛋白が主
体である。さらにラッル−ジョーンズ等は、多数の蛋白
が単一のモノクローナル抗体に対し免疫(ウエスタン)
ブロットにより反応したと報告しており、このことは或
る種の蛋白が他の蛋白の分解生成物であったことを示唆
している。他のモノクローナル抗体を用いて、130,000M
Wの蛋白及び10,000〜120,000MWの範囲の12種の他の蛋白
は共通のエピトープを有すると思われる。 インセル及びアンデルセン、ジャーナル・エキスペリ
メンタル・メジスン、第163巻、第262頁(1986)は、ヘ
モフィルス・インフレンザ(Haemophilus influenzae)
カプセル状多糖類を蛋白キャリヤに結合させて、このカ
プセルをより胸腺依存性の免疫原に変換する試みを開示
している。 発明の要点 今回、III型B群のストレプトコッカス(III−GBS)
多糖類カプセルの反復五糖類単位(及び単一の単位だけ
でも)のオリゴマーが抗原性を示すことを突き止めた。
この単位を含む抗原、特に反復単位を有する抗原は、II
I−GBSワクチンの成分として使用することができる。し
たがって、本発明の一面は、III型B群のストレプトコ
ッカス(IIIGBS)細菌に対し選択的免疫反応性である抗
体を生成することができかつ次式:[式中、n=1〜50であり、GlcNAcpはN−アセチル−
グルコサミン(ピラノース型)を示し、Galpはガラクト
ース(ピラノース型)を示し、Glcpはグルコース(ピラ
ノース型)を示しかつα−D−NeuNAcはN−アセチル−
ノイラミン(シアリン)酸を示す] を有する精製オリゴ糖からなる抗原を特徴とする。 「精製」という用語は、オリゴ糖と共に天然に存在す
る種々の蛋白、脂質及び炭水化物成分から実質的に分離
されることを意味する。特に、精製オリゴ糖は完全IIIG
BS多糖類カプセル又は、100,000以上の分子量を有する
その断片を実質的に含まない。微量の外来成分が精製オ
リゴ糖に存在したとしても、この精製物質をワクチンに
使用したり或いは抗原として使用することを妨げない。
「精製」という用語は、人工的な合成を伴なう合成オリ
ゴ糖調製物を排除することを意図せず、またこの用語は
調製物が再現性のあるオリゴ糖特性データ、たとえば分
子量、糖残部含有量、糖結合、クロマトグラ反応及び免
疫学的挙動を示す限り若干の不純物を含むような調製物
を排除することを意味するものでもない。 第二面において本発明は、IIIGBSに対し保護を示すこ
とができかつ医薬上許容しうるベヒクルと必要に応じキ
ャリヤに結合された上記抗原とからなるワクチンを特徴
とする。 本発明の第三の面は上記抗原の製造方法を特徴とし、
この方法は:(1)III−GBS細菌を適当な培地で培養
し;(2)培地又は細菌細胞から多糖類を回収し;
(3)この多糖類を結合S1(1→3)−β−gal(1→
4)S2[式中、S1及びS2は独立してグルコース、グルコ
サミン又はN−アセチル−グルコサミンから選択され
る]の開裂につき特異性であるエンド−β−ガラクトシ
ダーゼによって切断し;かつ(5)培地又は細菌からオ
リゴ糖抗原を回収することからなっている。必要に応
じ、オリゴ糖は下記するようにキャリヤに結合される。 前記3種の局面の好適具体例において、オリゴ糖抗原
は、上記結合に対し特異性のエンド−β−ガラクトシダ
ーゼを用いてIIIGBSカプセル状多糖類を酵素加水分解し
て生成される。この種の1種のエンド−β−ガラクトシ
ダーゼはフラボバクテリウム・ケラトリチクス(Flavob
acterium keratolyticus)に見出される。さらに好まし
くは、オリゴ糖は細菌免疫決定子部位を有するたとえば
蛋白、特に細菌トキソイド又は細菌表面蛋白のようなキ
ャリヤに共有結合される(たとえば第2アミン結合を介
する)。 第四の面において、一般に本発明はさらに上記結合を
有する細菌多糖類の酵素開裂を特徴とし、すなわち精製
オリゴ糖の製造方法に関し、この方法は特に表面多糖類
(たとえば多糖類カプセル若しくは膜)を有する細菌を
培養しかつこの多糖類を抽出し、次いでこれを上記酵素
で切断し、さらにオリゴ糖を回収する。好ましくは、細
菌はグラム陽性菌、たとえばIIIGBSである。或いは、こ
の細菌はたとえば14型ストレプトコッカス・ニューモニ
ア(Streptococcus pneumoniae)(たとえばATCCNo.631
4)のような表面カプセル状多糖類を有する菌種とする
ことができる。 第五の面において、本発明はIa/c型B群のストレプト
コッカスの実質的に精製されたトリプシン耐性のC表面
蛋白を特徴とし、この蛋白は約14,000の分子量を有しか
つB群のストレプトコッカス細菌多糖類に対し非交差免
疫反応性であるが、Ia/c型GBSに対し交差免疫性を有す
る。他の局面において、上記蛋白はIa/c型(及びIb/c
型)GBSに対し保護を示すワクチンに使用され、このワ
クチンは蛋白(必要に応じ、たとえば上記したIII型GBS
オリゴ糖のようなオリゴ糖に結合される)と医薬上許容
しうるキャリヤとからなっている。得られる結合体はGB
Sに対し広範な保護を与え、IIIGBS及びC蛋白を有するG
BSに対し保護を示す。 さらに他の局面において、本発明はGBSに対し受働保
護を与えうるγグロブリンフラクションを特徴とし、こ
のフラクションは哺乳動物を上記ワクチンの1種で免疫
化することにより生成される。次いで、このフラクショ
ンを個人に投与して、GBS感染に対し保護を与えるか又
は進行中の感染を処置する。 最後に、本発明は抗GBS抗体に関する試料の分析方法
を特徴とし、この方法は試料へ上記オリゴ糖又は蛋白抗
原を添加し、次いで免疫複合体の生成を検出することか
らなっている。或いは、試料をGBS免疫決定子の存在に
つき分析し、その際オリゴ糖若しくは蛋白抗原に対する
抗体を生成させ、この抗体を試料に添加し、かつ免疫複
合体の生成を検出する。 骨格グリコシド結合の酵素選択加水分解は、単純な酸
加水分解よりも優れている。何故なら、後者の技術は側
鎖シアリン酸残基の損失を伴い、かつ結合を非選択的に
切断して免疫性の減少した不均質混合物を生成するから
である。これに対し、酵素切断法はシアリン酸残基を保
持し、かつ骨格反復単位につき一旦生ずるとgal−β1
−4−glc結合においてのみ骨格の切断をもたらす。 本発明の他の特徴及び利点は、好適具体例に関する以
下の説明から明らかとなるであろう。 好適具体例の説明 以下、本発明の好適具体例につき説明し、先ず最初に
図面につき簡単に説明する。 I.図面 第1図はIII型GBSカプセル状多糖類の反復五糖類の図
面である。 II.III型GBS抗原及びワクチン A.オリゴ糖 上記特定の五糖類は、III型GBSを培養しかつ多糖類カ
プセルを上澄ブロスから又は細菌細胞からジェニングス
等の一般的方法[キャナディアン・ジャーヤル・バイオ
ケミストリー、第58巻、第112〜120頁(1980)]により
抽出して得られる。多糖類抽出物を、構造: S1(1→3)βgal(1→4)βS2 [ここでS1及びS2は独立してグルコース、グルコサミン
又はN−アセチル−グルコサミンから選択される]を特
異的に切断するエンド−β−ガラクトシダーゼによって
切断する。上記構造はIII型GBS多糖類カプセルの反復単
位1個につき一回発生し、かつ得られた切断生成物は1
個若しくはそれ以上の上記五糖類反復単位を有するオリ
ゴ糖である。 酵素は、必須の特異的切断を触媒する酵素を産生する
ことが知られた細菌から得られる。この種の好適な1種
の細菌はフラボバクテリウム・ケラトリチクスである。
必須の特異的活性を有する酵素を産生すると思われる他
の細菌は、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides
fragilis)である。キタミカデス等[下記]は、エッシ
エルキヤ・フロインディ(Escherichia freundii)、シ
ュードモナス・sp.(Ps−eudomonas sp.)及びココバチ
ルス・sp.(Cocobacillus sp.)にも硫酸ケラタン上で
誘発させれば必須のエンド−β−ガラクトシダーゼ活性
が存在することを報告している[ナカガワ等、ジャーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第250巻、第912〜
917頁;及びヒラノ等、コネクティブ・ティシュー・リ
サーチ、第2巻、第1〜10頁]。適するF.ケラトリチク
スは日本国、大阪在、醗酵研究所(IFO)からIFO No.14
087として得ることができる。エンド−β−ガラクトシ
ダーゼを作成するための適する一般的方法は、キタミカ
ド等によりジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第2巻、第3906〜3909頁(1981)に示されている。 上記のように作成した抽出III型GBS多糖類カプセルを
緩衝酵素調製物に添加しかつ培養する(たとえば、37
℃、48時間)。切断後、オリゴ糖をゲル濾過クロマトグ
ラフィー、たとえばセファデックスG75(ファルマシア
社)により分子量で分離し、かつ陰イオン交換クロマト
グラフィー、たとえば陰イオン交換高性能液体クロマト
グラフィー(HPLC)、モノQ(ファルマシア社)又はQA
Eセファデックス(ファルマシア社)によって精製す
る。 約1〜50個(特に好ましくは約2〜30個)の五糖類単
位からなる精製されたオリゴ糖をクロマトグラフ群から
選択し、次いでこれをワクチンに使用するための蛋白に
結合させる。この蛋白は不活性キャリヤとすることがで
き、或いはそれ自身にて保護を与えるよう、特に他の種
類のGBS又は他の細菌に対し保護を誘発することにより
オリゴ糖で誘発される保護を補完して保護を与えるよう
選択することができる。非毒性のジフテリヤ毒素同族体
(CRM197)を、インセル等(1986)によりジャーナル・
エキスペリメンタル・メジスン、第163巻、第262頁及び
アンデルセン等、ジャーナル・クリニカル・インベスチ
ゲーション、第76巻、第52頁(1985)に記載されたよう
に使用することもできる。使用しうる他のトキソイド
は、マサチューセッツ州、ジャマイカ・プレイン、サウ
スストリート在、マサチューセッツ州立ラボラトリーか
ら入手しうる破傷風毒素又は標準的ジフテリア毒素を包
含する。 蛋白−オリゴ糖結合体は、たとえばシュワルツ及びグ
レーの一般的方法[アーキテクチャー・バイオケミカル
・バイオフィジオロジー(1977)、第181巻、第542頁]
のようなカップリング反応によって得られ、この方法は
還元糖を蛋白へ直接に結合させる。脱アミノ化によって
生成されたオリゴ糖断片を、シアノ硼水素化物を介して
キャリヤ蛋白へ直接に結合させることができる。IIIGBS
の場合、蛋白における窒素とオリゴ糖の脱アミノ化によ
り生成された2,5−アンヒドロマンノースにおけるアル
デヒド基との間の結合によって第2アミンが生成され
る。このアルデヒドは、シアノ硼水素化物を用いる直接
的カップリングによって得られる。 得られたオリゴ糖−蛋白結合体を、発熱物質を含有し
ない塩水又は他の任意の生理学上許容しうる無毒性ベヒ
クル若しくは媒体に懸濁させ、これらの媒体は任意慣用
の安定化剤又は他の添加剤を所望に応じて含有すること
ができる。抗原の濃度は臨界的でなく広範囲に変化しう
るが、多くの目的には10〜1000μg/mlの範囲が便利かつ
好適である。この形態において、4℃にて長期間貯蔵す
る際に安定となり、さらにフッド・アンド・ドラッグ・
アドミニストレーション・レジスレーション(第21節、
第610.11〜610.13項)に記載されたような動物試験にか
けた際無菌・無毒かつ非発熱性である。上記塩水懸濁物
の適する容量(たとえば約0.5ml)を投与して(たとえ
ば皮下注射により)、IIIGBS保護を誘発させる。 さらに、本発明は特に幼児又は汚染した成人に使用さ
れる受働免疫法を特徴とし、この方法はオリゴ糖−蛋白
結合体のワクチンをヒトに注射して高タイターで抗体を
発生せしめ、抗血清をヒトの血液から分離し、かつ抗血
清を分画して受働免疫に作用しうる抗体を含んだγグロ
ブリンフラクションを生成させる。受働免疫のための供
与体を作成するこの方法は、免疫化されていないヒト成
人が極めて高レベルのタイプ特異性GBS抗体をその血清
中に有するが、充分高いタイターのグロブリンフラクシ
ョンを受働免疫に使用すべく血漿を貯蔵しうる個体を選
択するには極めて多数の試料をスクリーニングする必要
があるので有用である。免疫化されてない成人からの幾
種かの貯蔵ヒトγグロブリンのロットを抗−Ia及びIc
型、抗−II型及び抗−III型多糖類抗体につき分析し
て、僅か5〜20kg/mlの血清を含有することが判明し
た。このような低タイターのグロブリンの静脈内注射に
よる免疫化は、恐らく逆反応の危険性を伴う多量の投与
量を必要とする。 受働免疫化には、上記結合多糖類ワクチンでワクチン
接種した選択個人からのヒト血清保存物を濃縮しかつ常
法により分画して、タイプ特異性抗体の大部分及び充分
高い活性を有するグロブリンフラクションを与えること
ができ、この高免疫グロブリンはたとえば規定濃度の塩
水のような適当な生理学上許容しうるキャリヤにて静脈
内又は筋肉内投与する際0.3〜1ml、好ましくは約0.5ml
という少投与量にて有効である。キャリヤ中のグロブリ
ンの濃度は5〜20重量%とすることができる。この高免
疫グロブリンは、出産前の妊娠した婦人、新生児又は免
疫学的に汚染した個人に投与して受働免疫又は治療を与
えることができる。 III.オリゴ糖抗体 一般に、オリゴ糖は細菌多糖類のエンド−β−ガラク
トシダーゼ切断によって回収することができる。上記説
明はIIIGBSオリゴ糖並びにワクチンにおけるその使用に
関するものであるが、さらにオリゴ糖はたとえば哺乳動
物にオリゴ糖−蛋白結合体を注射しかつ得られた抗体を
回収することにより哺乳動物を処理して、実験哺乳動物
中に抗体を発生させるべく使用することもできる。さら
に、標準技術によってモノクローナル抗体を発生させる
こともできる。得られる抗体は、たとえばGBS或いは特
にIIIGBSに対する免疫分析に有用である。たとえば、オ
リゴ糖に対する抗体を、当業界で知られた競合若しくは
サンドイッチ免疫分析のような免疫分析に使用すること
もできる。 以下の実施例によりオリゴ糖抗原、オリゴ糖の分離方
法、ワクチン及び受働免疫化法につき説明する。 例1:エンド−β−ガラクトシダーゼの作成 F.ケラトリチクスを1晩培養し、かつこれを使用して
改変トリプチカーゼペプトンブロス(BBLマイクロバイ
オロジー・システムス社、ミズーリー州、コッケイスビ
ル在からの3%のトリプチカーゼペプトン);0.1%酵母
抽出物(ジフコ・ラボラトリース社、ミシガン州、デト
ロイト在);0.2%NaCl、pH7.0に接種した。このブロス
を18時間培養し(フランス国、ラフイット在、ビオラフ
ィッテ、ファメンタ)、その間通気(15l/min.)、撹拌
(150rpm)、温度(25℃)及びpH(7.0)を調節した。
遠心分離によって細菌を除去し、そして上澄液を濃縮し
た(マサチューセッツ州、ベッドフォード在、ペリコン
・カセット・システム、ミリポア・コーポレーション
社)。固体の(NH4)2SO4を75%飽和まで添加しかつ溶液
を4℃にて1晩静置した。 沈澱物を遠心分離によって除去しかつ10mlの酢酸ナト
リウム(0.2M NaCl、pH6.0)に溶解させた。この溶液を
5×90cmのセファデックスG 100カラム(ニュージャジ
ー州、ピスカタウエイ在、フェルマシア・ファイン・ケ
ミカルス社)に充填し、かつ同じ緩衝液を用い4℃で40
ml/hr.の速度にて溶出させた。活性フラクションをエン
ド−β−ガラクトシダーゼ活性につき分析して同定し、
次いで貯蔵した。特に、これらフラクションを牛角膜の
硫酸ケラタン(ミズーリ州、セントルイス在、シグマ・
ケミカル・カンパニー社)と共に37℃にて1晩培養し
た。還元糖の生成を、パーク及びジョンソン、ジャーナ
ル・バイオロジカル・ケミストリー、第181巻、第149〜
151頁(1949)の一般的方法により測定した。 貯蔵した活性フラクションを透析し、凍結乾燥し、か
つ緩衝液(50mM酢酸ナトリウム、2mM CaCl2、pH6.0)に
溶解させた。この緩衝した酵素調製物を、上半分にDEAE
セファセル(ファルマシア社)を含有しかつ下半分にビ
オレックス70(ニューヨーク州、ロックビル・センター
在、ビオラド・ラボラトリース社)を含有する2.5×14c
mのカラムに充填した。この酵素を上記緩衝液250mlで溶
出させた。残留した結合蛋白を1.0M NaClで溶出させ、
かつ活性貯蔵フラクションを10mM酢酸ナトリウム、2mM
CaCl2(pH7.0)で透析しかつ凍結乾燥した。 例2.多糖類切断 III型GBS多糖類を上記ジェニングスの一般的技術(19
80)によって抽出した。DEAEセファセル/ビオレックス
70カラムの試験から得られた凍結乾燥したエンド−β−
ガラクトシダーゼ調製物を10mlの10mM酢酸ナトリウム、
2mM塩化カルシウム(pH7.0)に溶解させ、かつ2lの同じ
緩衝液に対し4℃にて浴を1回交換して1晩透析した。
20mgの精製されたIII型GBSカプセル多糖類を酵素調製物
に添加した。この混合物を濾過滅菌し、かつ撹拌しなが
ら37℃で48時間培養した。 例3:オリゴ糖の精製及び特性化 切断後、オリゴ糖を12,000〜14,000ダルトンの孔径の
膜(カリホルニア州、ロスアンゼルス在、スペクトラム
・メジカル・インダストリーズ社)を介しての水に対す
る透析により大分子量と小分子量との貯蔵物に分離し
た。1個(五糖類)及び2個(十糖類)の反復単位に対
応するオリゴ糖を陰イオン交換クロマトグラフィーによ
って精製した。少量のオリゴ糖(1mg若しくはそれ以
下)は、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー
(HPLC)により精製することができる。500μgの切断
混合物(小分子量貯蔵物)を5×50mmのモノQカラム
(ファルマシア社)に充填し、かつ1個及び2個の反復
単位のオリゴ糖を20mMトリスHCl緩衝液(pH7.2)によっ
て平等に溶出させた。より大きいオリゴ糖は、より高い
塩濃度で溶出させることができる。多量のオリゴ糖を精
製するため、QAEセファデックスA50(ファルマシア社)
を充填した1.2×10cmのカラムを用いた。2〜8mgの試料
を、20mM N−メチルジエタノールアミンアセテート(pH
9.6)の出発緩衝液にてこのカラムに充填した。カラム
を30mlの出発緩衝液で1ml/min.の速度にて洗浄し、次い
で単一反復単位のオリゴ糖を50mlの15mM酢酸ナトリウム
を含有する出発緩衝液で溶出させた、2mlのフラクショ
ンを集め、1M酢酸で中和しかつ薄層クロマトグラフィー
(TLC)によって分析した。単一反復単位のオリゴ糖を
含有するフラクションを集め、凍結乾燥し、2mlの水に
溶解させ、かつセファデックスG15(ファルマシア社)
を含有する1.6×25cmのカラムで脱塩した。 主たる切断生成物は四糖類と十糖類との標準間で移動
するバンドに対応し、第1図の五糖類単位につき予測さ
れる物質に適合した分子寸法を有する。このバンドのジ
フェニルアミン及びレゾルシノール染色はシアリル化さ
れた糖類に一致した。メチル化分析は、この構造が完全
に五類反復単位であることを確認した。 1個及び2個の反復単位オリゴ糖を陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより分析した。陰イオン交換HPLCは、
少量のオリゴ糖(1〜2mg若しくはそれ以下)を精製す
るための迅速かつ便利な方法である。単一反復単位のオ
リゴ糖はボイド空間に溶出し、2個反復単位のオリゴ糖
は平等相中にその後に溶出する。より大きいオリゴ糖又
は天然多糖類は平等相に保持されるが、0.5M塩化ナトリ
ウムによりこのカラムから容易に溶出される。この方法
を用いて、放射性抗体結合分析(PABA)研究に使用する
ためのトリチウム化された1個及び2個の反復単位のオ
リゴ糖を精製することができる[シフェルレ(1985)、
ジャーナル・イミュノロジー、第135巻、第4164頁参
照]。多量の単一反復単位のオリゴ糖を精製するため、
開放陰イオン交換カラムを用いて、より大きい結合容量
を与えることができる。このQAEセファデックスA50カラ
ムを用いて、単一反復単位並びにそれより大きいオリゴ
糖を出発緩衝液に保持した。より大きいオリゴ糖を含ま
ない単一反復単位を、15mM酢酸ナトリウムを含有する出
発緩衝液で溶出させた。より大きいオリゴ糖は結合状態
に維持され、かつ塩濃度を増加させて溶出することがで
きる。20mgのIII型天然多糖類の切断物から、6mgの精製
された単一反復単位のオリゴ糖が得られた。TLC上にて
単一反復単位から離間移動する少量バンドに対応するオ
リゴ糖も、陰イオン交換カラムにより若干多量に維持さ
れた。調製試験では完全分離が達成されないが、このよ
うに精製した単一反復単位のオリゴ糖はTLC及びメチル
化分析により純度95%であると推定される。さらに、よ
り大きいオリゴ糖をクロマトグラフィー、たとえばセフ
ァデックスG75カラムによって分画した。 例4:オリゴ糖に対する結合分析 クロマトグラム結合分析を用いて、天然多糖類に指向
した抗体を結合するTLCにより可使化されるオリゴ糖バ
ンドの能力を直接に検査した。単一反復単位のバンドに
結合する抗体が明らかに証明された。この分析は定量的
でないが、放射能写真におけるバンドの相対強度から天
然多糖類はより効率的に抗体を結合することが明らかで
ある。この分析は天然II型多糖類につき極めて特異性で
あり、交差反応は脱シアリル化されたコア多糖類、B群
多糖類或いは他のGBS血清型からのカプセル多糖類につ
いては見られない。 上記オリゴ糖抗原を次いで上記のように蛋白に結合さ
せ、かつ発熱物質を含まない塩水溶液に上記と同様に懸
濁させてワクチンを作成した。 単一反復単位の五糖類(第1図)は放射性抗体結合分
析、阻止TLC結合分析及び直接的放射性抗体結合分析を
用いて弱い抗原性であった。オリゴ糖寸法を2反復単位
まで増大すると、抗原結合において8倍の増加を示し
た。特に好ましくは、免疫原は2〜50単位を有する。 IV.GBS蛋白抗原 抗原性GBS C蛋白をIc型GBSの培養上澄液から次の例に
示すように分離した。この蛋白はP10GBS蛋白フラクショ
ン、すなわち10,000〜30,000のMWの蛋白を含むフラクシ
ョンに対する抗血清(たとえばネズミ抗血清)に対し免
疫学的に反応性である。精製された蛋白は、Ib型GBSで
の処理に対しネズミを保護するウサギ抗血清を発生す
る。この保護能力は、GBS多糖類と共に培養しても影響
されない。 例5:蛋白抗原の産生及び精製 Ia/c型GBS(たとえばニューヨーク州、チャニング・
ラボラトリー・ストレインA909、ロックフェラー大学、
ニューヨーク、ATCC27591)を、トッド・ヘベット・ブ
ロス(ミシガン州、デトロイト在、ジフコ・ラボラトリ
ーズ社、THB)の透析物における後期対数増殖期まで培
養し、次いでレビー等、J,Infect・Dis、第149巻、第85
1〜868頁(1984)の一般的方法により0.15M燐酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.4)における0.3%ホルマリンに再懸濁
させた。 Ic型の対数増殖期の培養物1を15lのTHBの透析物
(10,000MWの排析膜で透析)に添加し、10%グルコース
を補添し、かつ滴定により中性pHを維持しながら醗酵装
置(ニュージャジー州、プリンストン在、LSLビオラフ
ィッテ・インコーポレーション社、ビオラフィッテBL2
0.2型)で後期対数増殖期まで増殖させた。10,000gにて
ペレット化させることにより細菌を除去した後、上澄液
を10,000MWの排析膜を備えたペリコン装置(マサチュー
セッツ州、ベッドフォード在、ミリポア・コーポレーシ
ョン社)にて、100mlまで濃縮し、徹底的にH2Oで透析し
かつ−20℃にて凍結させた。 培養上澄液を、限外濾過により大凡の分子寸法によっ
て分離した。2種のフラクションが得られ、一方のフラ
クションはPM30膜(P30;30,000MWより大)によって保持
されかつ他方のフラクションはPM10膜により保持される
がPM30では保持されない(P10;10,000MWより大かつ30,0
00MWより小)。P10を0.15M NaClを含む0.05M燐酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.4)にて透析し、かつセファデックス
G−75カラム(1.6×82cm)(ファルマシア社)で分画
した。これらフラクションの蛋白含有量をラウリー分析
[ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第193
巻、第265〜275頁(1951)]にて750nmにおける吸収に
より監視した。 例6:SDS−PAGE及びウエスタンブロット 試料をレムリの方法[ネイチャー、第227巻、第680〜
684頁(1970)]にしたがってSDS−PAGEにより分析し
た。蛋白の分子量に応じて、5〜15%又は10〜20%のい
ずれかの濃度勾配のゲルを用いた。電気泳動用の試料
を、0.1Mトリス(pH8)と1%SDSと4M尿素と60mMヨード
アセタミドとを最終濃度として含有する緩衝液にて希釈
した。これら試料の還元を必要とする場合は、50mMジチ
オスレイトールを緩衝液に含ませた。100μgの蛋白を
含有する100μlの試料を各穴部に入れた。電気泳動の
後、これら蛋白をクーマシー・ブリリアント青染色によ
って可視化させた。 免疫反応性抗原を同定するため、ウエスタンブロット
を用いた。蛋白を先ず最初に電気泳動にかけ、SDS−PAG
Eゲルを0.02Mトリス緩衝液(pH8.5)と0.15Mグリシン及
び20%メタノールとで構成された緩衝液Aで洗浄した。
これら蛋白をニトロセルロースシート(ニューハンプシ
ャー州、キーン在、シュライヒャ・アンド・シュエル
社)に移して緩衝液Aで電気泳動し(150mA、20h)、か
つ0.01Mトリス緩衝液(pH7.4)と0.5M NaCl及び0.1%ブ
リッグ58(緩衝液B)で洗浄した。次いで、このシート
を抗血清と共に22℃にて2時間培養し、かつ緩衝液Bで
洗浄した。I125蛋白Aと共に22℃にて30分間培養した
後、このシートを緩衝液Bで洗浄し、乾燥プロットし、
かつコダックXAR5番フィルムに露出した。 例7:ネズミ保護試験 体重22〜24gの異系交配された雄CD−1ネズミを、チ
ャールス・リバー・ブリージング・ラボラトリース(マ
サチューセッツ州、ウイルミントン在)から入手した。
このネズミから得られた血清は、RABAにより試験してIa
/c型GBS多糖類抗原に対する検出可能な抗体を含有しな
かった。各実験群は5〜10匹の動物を含んだ。ネズミ保
護試験のため、これらネズミに1mlのネズミ若しくはウ
サギ抗血清を腹腔内注射し、かつ24時間後に1b/c型GBS
の1×106CFUを腹腔内接種した。比較として、予備免疫
ウサギ若しくはネズミ血清を用いた。これらのネズミを
24時間毎に検査し、生存するネズミの個数を細菌接種し
てから48時間後に計算した。 抗血清からの保護抗体を吸収するため、1ml当り1mgの
濃度にてGBS多糖類又は蛋白フラクションを用いた。1ml
の抗血清及び1mlの多糖類若しくは蛋白を37℃にて2時
間培養し、次いで4℃にて1晩培養した。次いで、この
混合物を13,000gにて3分間ペレット化させ、かつ上澄
液を保護研究用として0.15M NaClで希釈した。 カラムクロマトグラフィーによって部分精製した後、
14,000MWの蛋白を調製用SDS−PAGEゲルから再分離し、
かつこれを用いウサギ中に抗血清を発生させた。ネズミ
保護試験において、このウサギ抗血清はIa/c型GBS接種
に対しネズミを89%保護した。 P10フラクションが異質GBS株に対しネズミ保護抗体を
発生しうるかどうかを検討するため、ネズミをIa/c型P1
0フラクションで免疫化した。次いで、免疫後の抗血清
を集め、かつIb型GBSの接種に対しネズミを保護する能
力につき検査した。これらネズミにP10フラクションに
対する保存ネズミ抗血清の種々の希釈物を腹腔内注射
し、その24時間後にIb/c型株を接種した。血清の保護能
力は、1:80の血清希釈率にて消失し始めた。したがっ
て、これらの実験には1:40の最適希釈率にて血清を使用
した。ネズミ保護試験において、この免疫血清はIb型株
での接種に対し、同じ希釈率における正常なネズミ血清
と比較して、ネズミを保護した(P<0.001)。この保
存血清は、RABAで測定しIa型多糖類に対する検出可能な
抗体を含有しなかった。さらに、Ia型若しくはIb型多糖
類を有する保存抗血清の吸収は、保護レベルを顕著には
変化させなかった。Ic型からのP10フラクションに対す
るネズミ抗血清の保護効果はネズミに抗体を発生する非
カプセル状抗原を含有し、これはIb型GBSでの接種に対
しネズミを受働保護した。 特に、IC型GBSからのSDS−PAGE溶出された14,000MWの
蛋白に対するウサギ抗血清を、次いでネズミ保護試験に
使用した。ネズミに抗血清を腹腔内注射し、かつ24時間
後にIb型GBSを接種した。SDS−PAGE溶出された14,000MW
の蛋白に対し発生した抗血清は、1:5及び1:10の希釈率
にてネズミで保護を示した。SDS−PAGE溶出された14,00
0MWの蛋白に対し発生した抗血清と正常なウサギ血清と
の間の差は顕著であった。 その他の具体例については以下の請求の範囲に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12P 19/26 C12P 19/26
(72)発明者 レビー,ナンシー ジェイ.
アメリカ合衆国 02159 マサチューセ
ッツ,ニュートンセンター,コモンウェ
ルス アベニュー 943
(72)発明者 ウェセルズ,マイケル アール.
アメリカ合衆国 02146 マサチューセ
ッツ,ブルックライン,スターンズ ロ
ード 75
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.下記式 [式中、n=1〜50であり、GlcNAcpはN−アセチルグ
ルコサミン(ピラノース型)を示し、Galpはガラクトー
ス(ピラノース型)を示し、Glcpはグルコース(ピラノ
ース型)を示しかつα−D−NeuNAcはN−アセチルノイ
ラミン(シアリン)酸を示す]を有する精製オリゴ糖。 2.オリゴ糖が、結合: S1−β(1→3)−gal−β(1→4)S2 [ここでS1及びS2は独立してグルコース、グルコサミン
又はN−アセチルグルコサミンから選択される] の開裂につき特異的であるエンド−β−ガラクトシダー
ゼを用いるIIIGBS多糖類カプセルの酵素加水分解によっ
て得られる請求項1に記載の精製オリゴ糖。 3.エンド−β−ガラクトシダーゼがフラボバクテリウ
ム・ケラトリチクスから得られる請求項2に記載の精製
オリゴ糖。 4.III型B群のストレプトコッカス(IIIGBS)細菌に
対し選択免疫反応性である抗体を生ぜしめる抗原であっ
て、式: [式中、n=1〜50であり、GlcNAcpはN−アセチルグ
ルコサミン(ピラノース型)を示し、Galpはガラクトー
ス(ピラノース型)を示し、Glcpはグルコース(ピラノ
ース型)を示しかつα−D−NeuNAcはN−アセチルノイ
ラミン(シアリン)酸を示す]を有する精製オリゴ糖が
蛋白に共有結合してなることを特徴とする抗原。 5.蛋白がオリゴ糖に対し第2アミン機能によって結合
されている請求項4に記載の抗原。 6.蛋白が細菌表面蛋白からなる請求項4に記載の抗
原。 7.蛋白が細菌トキソイドからなる請求項4に記載の抗
原。 8.100,000より大きい分子量を有する完全IIIGBS多糖
類カプセル又はその断片を実質的に含まない請求項1に
記載の精製オリゴ糖。 9.(a)III型B群のストレプトコッカス細菌を培養
し、 (b)培地又は細菌細胞中における多糖類を回収し、 (c)前記多糖類を結合: S1(1→3)β−gal−β(1→4)S2 [式中、S1及びS2は独立してグルコース、グルコサミン
及びN−アセチルグルコサミンから選択される] の開裂に対し特異的であるエンド−β−ガラクトシダー
ゼによって切断し、 (d)オリゴ糖を回収し、かつ必要に応じ (e)前記オリゴ糖をキャリヤに結合させることを特徴
とする請求項4に記載の抗原の作成方法。 10.エンド−β−ガラクトシダーゼがフラボバクテリ
ウム・ケラトリチクスから得られる請求項9に記載の方
法。 11.オリゴ糖を蛋白に結合させる請求項9に記載の方
法。 12.蛋白を第2アミン機能によってオリゴ糖に結合さ
せる請求項11に記載の方法。 13.蛋白が細菌表面蛋白からなる請求項11に記載の方
法。 14.蛋白が細菌トキソイドからなる請求項11に記載の
方法。 15.III型B群のストレプトコッカス細菌に対し保護
を与えるワクチンにおいて、医薬上許容し得るベヒクル
と請求項4に記載の抗原とからなるワクチン。 16.少なくとも1個の結合: S1(1→3)β−gal−β(1→4)S2 [式中、S1及びS2は独立してグルコース、グルコサミン
及びN−アセチルグルコサミンから選択される] を有する表面多糖類を含む細菌を培養し、 前記表面多糖類を抽出し、 この多糖類を前記結合に対し特異的であるエンド−β−
ガラクトシダーゼによって切断し、かつ 精製オリゴ糖を回収する ことを特徴とする請求項1に記載の精製オリゴ糖の製造
方法。 17.細菌がグラム陽性細菌であり、かつ表面多糖類が
カプセル状多糖類である請求項16に記載の方法。 18.細菌がIII型B群のストレプトコッカス細菌であ
る請求項17に記載の方法。 19.細菌が14型ストレプトコッカス・ニューモニアで
ある請求項16に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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