DK175487B1 - Bakterielle antigener, vacciner og fremgangsmåder til fremstilling af antigenet - Google Patents

Description

i DK 175487 B1

Den foreliggende opfindelse angår antigener med immunogene determinanter af gruppe B Streptococcus bakterier, vacciner, der beskytter mod disse bakterier, og fremgangsmåder til fremstilling af antigener ud fra bakterielle polysaccharider. Som anvendt i den foreliggende opfindelse dækker udtryk-5 ket gruppe B Streptococcus (eller GBS) bakterier som sædvanligt for fagmanden på området, især under henvisning til Lancefield, J. Exp. Med. 108: 329-341 (1938) og senere arbejder, der yderligere karakteriserer gruppe B serotyper, f.eks. Russell-Jones, J. Exper. Med, 160:1476 (1984). Udtrykket omfatter specifik bakterier, der taxonomisk betegnes Streptococcus agalac-10 tiae.

GBS er et anerkendt etiologisk middel for bacteremia og/eller meningitis hos spædbørn og for infektioner hos voksne. Se Baker, "Group 8B Streptococcal Infections" i Advances in Internal Medicine, 25:475-500 (1980). Følgelig er 15 det vigtigt at udvikle hurtige og definitive prøver for diagnose af GBS-infektion og metoder til at danne beskyttelse mod GBS, især hos spædbørn og udsatte individer,

De GBS kapsulære polysaccharider er kendt for at være vigtige for GBS 20 virulens og immunitet, se Baker som citeret i det foregående. Endvidere har de anerkendte GBS-typer og -undertyper kemisk beslægtede, men antige-nisk forskellige kapsulære polysaccharider med en gentagende struktur sammensat af galactose, glucose, N-acetylglucosamin og N-acetyl-neura-minsyre (sialsyre), se Baker som citeret i det foregående. Type III GBS kap-2 5 sulært polysaccharid er sammensat af et skelet af gentagende forgrenede pentasaccharidenheder som vist på fig. 1. Jennings et al., Canadian J. Bio-chem, 58:112-120(1980).

Et studie af type III GBS polysaccharider antyder, at det naturlige immuno-30 determinante sted er lokaliseret på sidekæde-skeletsamlingen, jævnfør Jennings et al., Biochemistry 20:4511-4518 (1981). Tilstedeværelsen af de side-kædeterminale N-acetylneuraminsyrerester blev rapporteret som kritiske for

I DK 175487 B1 I

I 2 I

immunodeterminantekspression. I

I Studier af GBS protein immunogenicitet er også rapporteret. Lancefield et al., I

I J. Exp. Med. 142:165-179 (1975) rapporterer, at de såkaldte C-proteiner af I

I 5 GBS er i stand til at indføre beskyttende antistoffer, når de er til stede som et I

I immunogen på hele organismen. Nomenklaturen "C-proteiner" anvendes I

I som defineret af Henrichsen et al., Int. J. of Systematic Bacteriol. 34;ί>00 I

I (1984), og udtrykket omfatter proteiner, der tydeligere blev betegnet Ibc-pro- I

I teiner. I

I 10 I

I Molekylstudier af C-proteiner har vist, at disse stoffer udgør en kompleks I

I gruppe af proteiner med variabel molekylvægt, Wilkinson et al., Infect. Immu- I

I nol. 4:596-604 (1971), Bevanger et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, I

I 87:51-54(1979), Russell-Jones et al., J. Exp. Med. 160:1476-1484(1984) og I

I 15 Bevanger et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 89:205-209 (1981). I

I Wilkinson et al. nævner, at varme syreekstrakter af heltype le GBS giver 13 I

I proteiner med varierende molekylstørrelse (bestemt ved polyacrylamidgel- I

I elektrophorese) med serologisk reaktivitet i agargel mod type le antisera. I

I 20 Bevanger et al. (1979) nævner, at GBS-syreekstrakt indeholdende 9 tryp- I

I sinfølsomme proteiner og 5 trypsinresistente, men pepsinfølsomme protei- I

I ner. Bevanger et al. (1981) omtaler immunogenicitet af delvis rensede syre- I

I ekstraherede proteiner. Russell-Jones et al. nævner ekstrakter indeholdende I

I op til 30 proteiner varierende i molekylvægt fra 20.000 til 130.000, idet det I

I 25 130 kd protein er overvejende. Russell-Jones rapporterer også, at mange I

I proteiner reagerede ved immunoblot (Western) til et enkelt monoklonalt anti- I

I stof, hvilket antyder, at nogle proteiner var nedbrydningsprodukter af andre. I

I Under anvendelse af et andet monoklonalt antistof syntes proteinerne med I

molekylvægt 130.000 og 12 andre proteiner med molekylvægt mellem I

I 30 10.000 og 120.000 at dele en fælles epitop. I

Insel og Andersen, J. Exp. Med. 163:262 (1986) omhandler konjugerende I

3 DK 175487 B1

Haemophilus influenzae kapsulær polysaccharid til proteinbærer i et forsøg på at overføre kapslen til et mere thymus-afhængigt immunogen.

Det har nu vist sig, at oligomere med den gentagende pentasaccharidenhed 5 af type III gruppe B Streptococcus (lll-GBS) polysaccharidkapsel (og endog den enkelte enhed alene) er antigenisk. Antigener indeholdende enheden, især antigener indeholdende gentagne enheder, kan anvendes som en komponent af en lll-GBS vaccine. Følgelig tilsigtes det med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et antigen, der er i stand til at danne et antistof 10 selektivt immunoreaktivt med type III gruppe B Streptococcus (lll-GBS) bakterier og omfattende et renset oligosaccharid med følgende formel:

->4)-p-D-Glcp-( 1 ->6)-p-D-GlcpNAc-(l ->3)-p-D-Galp-( I

T

15 f

X

β-D-Galp

T

t 9 α-D-NeuNAc n

20 J

hvori n=1-50, GIcNAcp repræsenterer N-acetylglucosamin (på pyranose-form), Galfi repræsenterer galactose (på pyranoseform), Glcg repræsenterer 25 glucose (på pyranoseform) og α-D-NeuNAc repræsenterer N-acetyl -neuramin -syre (sialsyre).

"Renset" betyder i alt væsentligt skilt fra de forskellige protein-, lipid- og kulhydratkomponenter, der naturligt forekommer med oligosaccharidet. Især er 30 renset oligosaccharid i alt væsentligt frit for intakt lll-GBS polysaccharidkapsel eller fragmenter deraf med en molekylvægt over 100.000. Spor af fremmede komponenter må i det rensede oligosaccharid ikke interfereres

I DK 175487 B1 I

i 4 I

I med anvendelsen af det rensede materiale i en vaccine eller som antigen. I

I Udtrykket "renset" er ikke ment som udelukkende syntetiske oligosaccharid- I

I præparater retinerende artifakter for deres syntese, ligesom det ikke er me- I

I ningen at udelukke præparater, der indeholder nogle urenheder, så længe I

I 5 præparatet udviser reproducerbare oligosaccharidkarakteriseringsdata, f.eks. I

I molekylvægt, sukkerrestindhold, sukkerbindinger, kromatografisk respons og I

I immunogen opførsel. I

I Opfindelsen angår også en vaccine, der er i stand til at udøve beskyttelse I

I io mod lll-GBS, hvilken vaccine omfatter et farmaceutisk acceptabelt hjælpe- I

I middel og det i det foregående beskrevne antigen, eventuelt konjugeret til en I

I bærer. I

I Derudover angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af oven- I

I 15 nævnte antigen ved 1) dyrkning af lll-GBS bakterier i et egnet medium, 2) I

I fjernelse af polysaccharid i mediet eller fra bakteriecelleme, 3) nedbrydning I

I af polysaccharidet med en endo-p-galactosidase, der er specifik for spaltning I

I af bindingen SiO-^J-p-galO-^^, hvor St og S2 uafhængigt er valgt blandt I

I glucose, glucosamin eller N-acetylglucosamin, og 4) udvinding af oligo- I

I 20 saccharidantigenet fra mediet eller fra bakterierne. Eventuelt er oligsacchari- I

I det konjugeret til en bærer som beskrevet i det følgende. I

I I foretrukne udførelsesformer for opfindelsen fremstilles oligosaccharidanti- I

I genet ved enzymatisk hydrolyse af lll-GBS kapsulært polysaccharid under I

I 25 anvendelse af endo-p-galactosidase, der er specifik for ovennævnte binding. I

I En sådan endo-p-galactosidase findes i Flavobacterium keratolyticus. Oligo- I

I saccharidet er også foretrukkent kovalent bundet (f.eks. via en sekundær I

I aminbinding) til en bærer, såsom et protein, især et bakterielt toxoid eller et I

I bakterielt overfladeprotein, omfattende et bakterielt immunodeterminant sted. I

I 30 I

I Opfindelsen angår yderligere generelt enzymatisk spaltning af et bakterielt I

5 DK 175487 B1 polysaccharid med ovennævnte binding i en metode, der fremstiller et renset oligosaccharid; specifikt dyrkes en bakterie med et overfladepolysaccharid (f.eks. en polysaccharidkapsel eller -membran), og polysaccharidet ekstrahe-res, hvorefter det nedbrydes med de i det foregående beskrevne enzymer, 5 og oligosaccharidet udvindes. Bakterien er foretrukkent gram-positiv, f.eks. type lll-GBS; alternativt kan bakterien være en art med overfladekapsulært polysaccharid, såsom type 14 Streptococcus pneumoniae, f.eks. ATCC nr.

6314.

10 Det omhandlede i alt væsentligt rensede trypsin-resistent C overfladeprotein af type la/c gruppe B Streptococcus har en molekylvægt på ca. 14.000 og er ikke-kryds-immunoreaktivt med gruppe B Streptococcus bakterielle polysac-charider, men kryds-immunogen med type la/c GBS. Med andre ord det i det foregående beskrevne protein anvendes i en vaccine, der giver beskyttelse 15 mod type la/c (og type Ib/c) GBS, hvilken vaccine omfatter proteinet (eventuelt konjugeret til et oligosaccharid, såsom lll-GBS oligosaccharidet beskrevet i det foregående) og en farmaceutisk acceptabel bærer. Det resulterende konjugat giver bred beskyttelse mod GBS derved, at det beskytter mod lll-GBS og mod GBS med C-protein.

20

Den beskrevne gammaglobulinfraktion er i stand til passiv beskyttelse mod GBS og fremstilles ved at immunisere et pattedyr med en eller flere af ovennævnte vacciner. Fraktionen administreres derpå til et individ til tilvejebringelse af beskyttelse mod GBS-infektion eller til at behandle igangværende 25 infektion.

Prøvning for anti-GBS-antistof kan foretages ved til prøven at sætte oligosaccharidet eller proteinantigenet beskrevet i det foregående og derpå detektere dannelsen af et immunokompleks; alternativt foretages prøvning for 3 o tilstedeværelsen af en GBS-immunodeterminant ved at danne et antistof mod oligosaccharidet eller proteinantigenet, sætte antistoffet til prøven og detektere dannelsen af et immunokompleks.

I DK 175487 B1 I

I 6 I

I Den enzymatiske selektive hydrolyse af skelletglycosidbindingeme er bedre I

I end simpel syrehydrolyse, fordi sidstnævnte teknik resulterer i tab af side- I

I kæde-sialsyreresterne og spalter bindinger ikke-selektivt, giver en heterogen I

I 5 blanding af reduceret immunogenicitet. Modsætningsvis bevarer enzymatisk I

I nedbrydning sialsyreresterne og giver kun skeletspaltning ved gal-β 1-4-glc- I

I bindinger, som forekommer en gang pr. skeletgentagelsesenhed. I

I Andre træk og fordele ved opfindelsen fremgår af den efterfølgende beskri- I

I ίο velse af de foretrukne udførelsesformer og af kravene. I

I Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af den medfølgende tegning, hvor- I

pa I

I 15 fig. 1 er et diagram over et gentagen pentasaccharid af lll-GBS kapsulært I

I polysaccharid. I

I Type III GBS antigen og vaccine I

I 20 A. Oliqosaccharid I

I Det specifikke pentasaccharid beskrevet i det foregående opnås ved dyrk- I

I ning af type III GBS og ekstrahering af polysaccharidkapslen fra den over- I

I liggende bouillon eller fra bakteriecellerne ved den generelle metode af Jen- I

I 25 nings et al., Canadian J. Biochem. 58:112-120 (1980). Polysaccharidekstrak- · I

I ten nedbrydes af en endo-p-galactosidase, der specifikt spalter strukturen I

I Si(1 ->3)pgal(1 ->4)pS2, hvor Si og S2 uafhængigt er valgt blandt glucose, I

I glucosamin og N-acetylglucosamin. Ovennævnte struktur forekommer en I

I gang pr. gentagen enhed lll-GBS polysaccharidkapsel, og de resulterende I

I 30 spaltningsprodukter er oligosaccharider med en eller flere af de i det foregå- I

I ende beskrevne pentasaccharid-gentagelsesenheder. I

7 DK 175487 B1

Enzymet opnås fra bakterier, der er kendt for at producere et enzym, der katalyserer den pågældende specifikke spaltning. En sådan foretrukken bakterie er Flavobacterium keratolyticus. En anden bakterie, der menes at producere et enzym med den påkrævede specifikke aktivitet, er Bacteroides 5 fragilis. Kitamikado et al., som citeret i det følgende, rapporterer, at den påkrævede endo-p-galactosidase -aktivitet også er til stede i Escherichia freun-dii, Pseudomonas sp og Cocobacillus sp., indført på keratansulfat. Se Naka-gawa et al., J. Biol. Chem. 250:912-917, og Hirano et al., Connect. Tissue Res. 2:1-10. En egnet F. keratolyticus kan opnås fra Institute of Fermentation io (IFO) Osaka, Japan, under betegnelsen IFO #14087. En egnet generel procedure til fremstilling af endo-p-galactosidase er givet af Kitamikado et al., J.

Biol. Chem, 2:3906-3909 (1981).

Den ekstraherede III GBS polysaccharidkapsel fremstilles som beskrevet i 15 det foregående sættes til et pufret enzympræparat og inkuberes (f.eks. i 48 timer ved 37 °C). Efter nedbrydning skilles oligosacchariderne efter molekylvægt ved gelfiltreringskromatografi, f.eks. på "Sephadex G75" (Pharmacia) og renses ved anionbytningskromatografi, f.eks. HPLC, på "Mono Q" (Pharmacia) eller "QAE Sephadex" (Pharmacia).

20

Et renset oligosaccharid omfattende mellem ca. 1 og ca. 50 (og mest fore-trukkent mellem ca. 2 og ca. 30 pentasaccharidenheder) vælges fra den kromatografiske gruppe og konjugeres derpå til et protein til anvendelse i en vaccine. Proteinet kan være en inaktiv bærer eller kan være valgt til at give 2 5 nogen beskyttelse af sig selv, især beskyttelse, der komplementerer beskyt telsen indført af oligosaccharidet, f.eks. ved indføring af beskyttelse mod andre typer GBS eller andre bakterier. Den ikke-toxiske diphteria-toxinanaloge CRM 197 kan anvendes som beskrevet af Insel et al. (1986), J. Exp. Med.

163:262 og Andersen et al., J. Clin. Invest, 76:52 (1985). Andre toxoider, der 30 kan anvendes, omfatter tetanus- eller standarddiphtheria-toxoider, der kan fås fra Massachusetts State Laboratory, South Street, Jamaica Plain, MA.

I DK 175487 B1 I

I 8 i

I Protein-oligosaccharid-konjugation opnås ved en koblingsreaktion, såsom I

I den generelle metode af Swartz og Gray, Arch. Bioch. Biophys. (1977) I

I 181:542, som kobler en reducerende sukkerart direkte til et protein. Oligo- I

I saccharidfragmenter fremstillet ved deaminering kan direkte knyttes via cya- I

I 5 noborhydrid til bærerproteinet. I tilfælde af lll-GBS dannes en sekundær amin I

I ved binding mellem et nitrogenatom på proteinet og en aldehydgruppe på I

I 2,5-anhydromannose dannet ved deaminering af oligosaccharidet. Dette I

aldehyd er tilgængelig for direkte kobling under anvendelse af cyanobor- I

I hydrid. I

10 I

I Det resulterende oligsaccharid-protein-konjugat suspenderes i pyrogenfrit I

I saltvand eller et andet fysiologisk acceptabelt ikke-toxisk hjælpemiddel eller I

I medium, som kan indeholde vilkårlige konventionelle stabiliseringsmidler I

I eller andre additiver som ønsket. Koncentrationen af antigen er ikke kritisk og I

I 15 kan varieres inden for et vidt område, men til mange formål er et område på I

I 10-1000 pg/ml hensigtsmæssigt og velegnet. På denne form er det stabilt I

I under forlænget opbevaring ved 4 °C og sterilt, ikke-toxisk og ikke-pyrogent, I

I når det underkastes dyreforsøg som foreskrevet af Food and Drug Admini- I

I stration Regulations (Tiele 21, See. 610.11-610.13). Egnede volumina (f.eks. I

I 20 ca. 0,5 ml) af ovennævnte saltvandssuspension administreres (f.eks. ved I

I subkutan injektion) til indføring af lll-GBS beskyttelse. I

I Passiv immunisering, anvendt især til spædbørn eller udsatte voksne, kan I

I foretages ved injektion af oligosaccharid-protein-konjugatvaccinen til et men- I

I 25 neske for at danne antistoffer derimod i høj titer, skille antiserum fra blodet I

I fra mennesket og fraktionere antiserum til fremstilling af en gammaglobulin- I

I fraktion indeholdende antistofferne, der kan anvendes til passiv immunise- I

I ring. Denne metode til tilvejebringelse af donorer for passiv immunisering er I

I nyttig, fordi skønt ikke-immuniserede voksne mennesker lejlighedsvis har I

I 30 meget høje koncentrationer af type-specifikt GBS antistof i deres sera, ville I

I det være nødvendigt at screene meget store populationer for at udvælge de I

I individer, hvis plasma kunne samles for at opnå globulinfraktioner med til- I

9 DK 175487 B1 strækkelig høj titer til at være nyttige til passiv immunisering. Adskillige portioner samlet humant gammaglobulin fra ikke-immuniserede voksne er blevet prøvet for anti-type la og le, anti-type II og anti-type III polysaccharidantistof og har vist sig at indeholde så lidt som 5-20 pg/ml i serum. Immuniseringer 5 ved intravenøs injektion af globuliner med så lav titer ville kræve så store doser, at det ikke tillades, og der vil være risiko for bivirkninger.

Til passiv immunisering kan samlinger af human sera fra udvalgte individer vaccineret med den i det foregående beskrevne konjugerede polysaccharid-10 vaccine koncentreres og fraktioneres ved konventionelle procedurer til tilvejebringelse af en globulinfraktion indeholdende størstedelen af det typespecifikke antistof og med tilstrækkelig høj aktivitet, så at den hyperimmune globulin er effektiv i små doser på 0,3-1 ml, foretrukkent ca. 0,5 ml, når den administreres i en egnet fysiologisk acceptabel bærer, såsom normalt salt-15 vand, enten intravenøst eller intramuskulært. Koncentrationen af globulinen i bæreren kan være fra 5 til 20 vægt-%. Den hyperimmune globulin kan administreres enten til gravide før fødsel, til neonater eller til immunologisk svage individer, til tilvejebringelse af passiv immunisering eller terapi.

20 Qliqosaccharidantistoffer

Oligosaccharider kan generelt udvindes fra endo-p-galactosidasenedbryd-ning af bakterielle polysaccharider. Beskrivelsen i det foregående vedrører III GBS oligosaccharider og deres anvendelse i vacciner, men oligosacchari-25 derne kan også anvendes til at fremkalde antistof i forsøgsdyr, f.eks. ved at udsætte pattedyret, f.eks. ved at injicere oligosaccharidproteinkonjugaterne, og udvinde det resulterende antistof. Monoklonale antistoffer kan også dannes ved standardteknik. De resulterende antistoffer er nyttige f.eks. i immu-noprøver for GBS eller især lll-GBS. F.eks. kan antistoffet mod oligosaccha-30 ridet anvendes til immunoprøver, såsom konkurrerende immunoprøver eller sandwichimmunoprøver, der er kendt på området.

I DK 175487 B1 I

10 I

I De efterfølgende eksempler illustrerer oligosaccharidantigenet, metoden til I

I isolering af oligosaccharidet, vaccinen og metoden til passiv immunisering. I

I EKSEMPEL 1 I

I 5 I

Fremstilling af endo-B-aalactosidase I

I F. keratolyticus dyrkes natten over og anvendes til at inoculere en modificeret I

I tryptitasepeptonbouillon (3% trypticasepepton fra BBL Microbiology Systems, I

I io Cockeysville, MD), 0,1% gærekstrakt (Difco Laboratories, Detroit Ml), 0,2% I

I NaCI, pH 7,0. Bouillonen inkuberes i 18 timer (Biolafitte fermentor, Lafitte, I

I Frankrig), mens luftningen kontrolleres (15 liter/min.), omrøring (150 I

I omdr./min.), temperatur (25 °C) og pH (7,0). Bakterier fjernes ved centrifuge- I

I ring, og den overliggende væske koncentreres (Pellicon Cassette System, I

I 15 Millipore Corp., Bedford MA). Fast (NH^SOi tilsættes til 75%’s mætning, og I

I opløsningen får lov at stå natten over ved 4 °C. I

I Bundfald fjernes ved centrifugering og opløstes i 10 mM natriumacetat, 0,2 Μ I

I NaCI, pH 6,0. Opløsningen påføres en 5 x 90 cm "Sephadex G-100" søjle I

I 20 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway NJ) og elueres med samme puffer I

I ved 40 ml/time, 4 °C. Aktive fraktioner identificeres ved prøvning for endo-β- I

I galactosidaseaktivitet og samles derpå. Specifikt inkuberes fraktionerne med I

I bovin corneakeratansulfat (Sigma Chemical Co., Sti. Louis MO) natten over I

I ved 37 °C. Produktion af reducerende sukkerart måles ved den generelle I

I 25 metode af Parkog Johnson, J. Biol. Chem. 181:149-151 (1949). I

I Samlede aktive fraktioner dialyseres, lyofiliseres og opløses i puffer (50 mM I

natriumacetat, 2 mM CaC^, pH 6,0). Det pufrede enzympræparat påføres en I

2,5 x 14 cm søjle indeholdende "DEAE Sephacel" (Pharmacia) i den øvre I

30 halvdel og "BioRex 70 (BioRad Laboratories, Rockville Center NY) i den I

nedre halvdel. Enzymet eluerer med 250 ml af ovennævnte puffer. Reste- I

11 DK 175487 B1 rende bundet protein elueres med 1,0 M NaCI, og aktive samlede fraktioner dialyseres mod 10 mM natriumacetat, 2 mM CaC^, pH 7,0 og lyofiliseres.

EKSEMPEL 2 5

Polvsaccharidnedbrvdninq GBS type III polysaccharid ekstraheret ved den almindelige teknik af Je-ninngs (1980) som citeret i det foregående. Det lyofiliserede endo-p-ga-10 lactosidasepræparat fra et søjlegennemløb på "DEAE Sephacel/BioRex 70" opløses i 10 ml 10 mM natriumacetat, 2 mM calciumchlorid, pH 7^0 og dialyseres mod 2 liter af samme puffer natten over ved 4 °C med en badudskiftning. 20 mg renset type III GBS kapsulært polysaccharid sættestil enzympræparatet. Blandingen filtersteriliseres og inkuberes ved 37 °C i 48 timer 15 under omrøring.

EKSEMPEL 3

Qliqosaccharidrensninq og -karakterisering 20

Efter nedbrydning adskilles oligosaccharider i sådanne med stor molekylvægt og sådanne med lille molekylvægt ved dialyse mod vand gennem en membran med en porestørrelse på 12.000-14.000 dalton (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA). Oligosaccharider svarende til en (pentasaccha-25 rid) og to (decasaccharid) gentagne enheder renses ved anionbytningskro-matografi. Små mængder oligosaccharider (1 mg eller mindre) kan renses ved anionbytnings-HPLC. 500 pg nedbrydningsblanding (lille molekylvægt) anbringes på en 5 x 50 mm "Mono Q" søjle (Pharmacia), og en og to gentagne enheder oligosaccharider elueres isokratisk med 20 mM Tris HCI-puf-30 fer, pH 7,2. Større oligosaccharider kan elueres med højere saltkoncentrationer. For rensning af store mængder oligosaccharider anvendes en 1,2 x 10

I DK 175487 B1 I

I 12 I

I cm søjle fyldt med "QAE Sephadex A50" (Pharmacia). Prøver på 2-8 mg I

I føres på denne søjle i en startpuffer på 20 mM N-methyldiethanolaminacetat, I

I pH 9,6. Søjlen vasket med 30 ml startpuffer med en hastighed på 1 ml/min., I

I hvorpå den enkeltgentagne enhed oligosaccharid elueres med 50 ml start- I

5 puffer indeholdende 15 mM natriumacetat. Der opsamles fraktioner på 2 ml, I

neutraliseret med 1 mM eddikesyre og analyseres ved tyndtlagskromatografi. I

I Fraktioner indeholdende oligosaccharidet med den enkelt gentagne enhed I

I samles, lyofiliseres og opløses i 2 ml vand, og afsaltes på en 1,6 x 25 cm I

I søjle indeholdende "Sephadex G15" (Pharmacia). I

I 10 I

I Hovednedbrydningsproduktet svarer til et bånd vandrende mellem tetra- I

I saccharid- og decasaccharidstandarder, og det har en molekylstørrelse sam- I

menlignelig med den, der kunne forudsiges for den pentasaccharidenhed, I

I der er vist på fig. 1. Diphenylamin- og resorcinolfarvning af dette bånd er i I

I 15 overensstemmelse med en silyleret sukkerart. Methyleringsanalyse be- I

kræfter, at strukturen er et fuldstændig pentasaccharidgentagelsesenhed. I

I En eller to gentagne enheder oligosaccharider renses ved anionbytnings- I

I kromatografi. Anionbytnings-HPLC er en hurtig og hensigtsmæssig metode til I

I 20 rensning af små mængder oligosaccharider (1-2 mg eller mindre). De enkelt I

I gentagne enhed oligosaccharid eluerer i hulrummet, mens de to gentagne I

I enheder oligosaccharid eluerer senere i den isokratiske fase. Større oligo- I

I saccharider eller nativt polysaccharid tilbageholdes i den isokratiske fase, I

I mens elueres let fra søjlen med 0,5 M natriumchlorid. Denne metode kan an- I

I 25 vendes til at rense tritierede oligosaccharider med en eller to gentagne enhe- I

I der til anvendelse i radioantistofbindingsprøvestudier (RABA). Se Schifferle I

I (1985) J. Immunology 135:4164. Til rensning af større mængder oligosac- I

I charid med en enkelt gentagelsesenhed kan anvendes en åben anionbyt- I

I ningssøjle til tilvejebringelse af en større bindingskapacitet. Under anvendel- I

I 3 o se af denne "QAE Sephadex A50” søjle tilbageholdes enkelt gentagne enhe- I

I der såvel som større oligosaccharider i startpufferen. Den enkelt gentagne I

I enhed elueres, fri for større oligosaccharider, med udgangspufferen indehol- I

13 DK 175487 B1 dende 15 mM natriumacetat. Større oligosaccharider forbliver bundne og kan elueres med forøget saltkoncentration. Fra nedbrydning af 20 mg type III nativt polysaccharid opnås 6 mg renset oligosaccharid med en enkelt gentagen enhed. Det oligosaccharid, der svarer til et mindre bånd vandrende lige 5 efter den enkelt gentagne enhed på TLC, tilbageholdes også noget kraftigere af anionbyttersøjlen. Skønt fuldstændig adskillelse ikke opnås med præparative forsøg, renses oligosaccharidet med den enkelte gentagne enhed på denne måde, så det bedømmes til at være 95% rent ifølge TLC og methyle-ringsanalyse. Større oligosaccharider fraktioneres også ved kromatografi, 10 f.eks. på en "Sephadex G75" søjle.

EKSEMPEL 4

Bindinqsprøve for oligosaccharid 15

Kromatogrambindingsprøven anvendes direkte til at undersøge evnen af oligosaccharidbåndene tydeliggjorte ved TLC til at binde antistof rettet mod det native polysaccharid. Antistofbinding til en enkelt gentagen enhed er klart indlysende. Skønt prøven ikke er kvantitativ, er det klart fra de relative inten-20 siteter af båndene på autoradiografen, at det native polysaccharid binder antistof mere effektivt. Denne prøver er yderst specifik for nativ type III poly-saccharid-krydsreaktioner ses ikke med det desialyserede kemepolysaccha-rid, med gruppe B polysaccharidet eller med kapsulære polysaccharid fra andre GBS serotyper.

25

Oligosaccharidantigenet beskrevet i det foregående konjugeres derpå til et protein som beskrevet i det foregående og suspenderes i pyrogenfri saltvandsopløsning som beskrevet i det foregående til dannelse af en vaccine.

3 o Pentasaccharidet med enkelt'gentagelse (fig. 1) er svagt antigen under anvendelse af radionantistofbindingsprøveinhibering-TLC-bindingsprøve og direkte radioantistofbindingsprøve. Forøgelse af oligosaccharidstørrelse til to

I DK 175487 B1 I

I .14 I

I gentagelsesenheder resulterer i et ottedobbelt forøgelse i antigenbinding. I

I Immunogenet omfatter mest foretrukkent 2-50 enheder. I

I GBS oroteinantiaen I

I 5 I

I Et antigen GBS C protein isoleres fra le GBS kultur-overliggende væsker I

I som vist i det efterfølgende eksempel. Proteinet er immunologisk reaktivt I

I med antisera (f.eks. museantisera) til en P10 GBS proteinfraktion, dvs. en I

I fraktion omfattende proteiner med molekylvægt mellem 10.000 og 30.000. I

I 10 Det rensede protein frembringer kaninantisera, der beskytter mus mod ud- I

I sættelse for type Ib GBS. Denne beskyttende evne påvirkes ikke af inkuba- I

I tioner med GBS polysaccharider. I

I EKSEMPEL 5 I

I 15 I

I Produktion oa rensning af proteinantiaener I

I Type la/c GBS (f.eks. Channing Laboratory Strain A909 Rockefeller Univer- I

I sity N.Y., N.Y., ATCC 27591) dyrkes i den sene logfase i et dialysat af Todd I

I 20 Hewett Broth (THB, Difco Laboratories, Detroit, Ml), og resuspenderes derpå I

I i 0,3% formalin i 0,15 M natriumphosphatpuffer (pH 7,4) ved den generelle I

I metode af Levy et al., J. Infect Dis. 149:851-868 (1984). I

I 1 liter logfasekultur af type le sættes til 15 liter af dialysatet af THB (dialyseret I

I 25 på eksklusionsmembran molekylvægt 10.000), suppleret med 10% glucose I

I og dyrket i den sene logfase under opretholdelse af neutralt pH ved titrering i I

I en fermentator (Biolafitte Model BL 20,2, LSL Biolafitte Inc., Princeton, NJ). I

I Efter fjernelse af bakterierne ved pelletering ved 10.000 g koncentreret den I

I overliggende væske til 100 ml på et Pellicon apparat (Millipore Corp., Bed- I

I 30 ford, MA) indeholdende en MW 10.000 eksklusionsmembran, dialyseret mod I

I vand ekstensivt og fryses ved -20 °C. I

15 DK 175487 B1

Kulturens overliggende væske fraskilles efter tilnærmelsesvis molekylstør-relse under anvendelse af ultrafiltrering. Der opnås to fraktioner, en tilbageholdt af en PM30 membran (P30, MW større end 30.000) og en anden tilbageholdes ved en PM 10 membran, men tilbageholdes ikke af en PM30 5 membran (P10 større end MW 10.000 og mindre end MW 30.000). P10 dialyseres mod 0,05 M natriumphosphatpuffer, pH 7,4 med 0,15 M NaCI og fraktioneres på en "Sephadex G-75" søjle (1,5 x 82 cm) (Pharmacia). Proteinindholdet af fraktioner vises ved absorption ved 750 nm i Lowry-prøven J.

Biol. Chem, 193:265-275 (1951).

10 EKSEMPEL 6 SDS-PAGE og Western blot 15 Prøver analyseres ved SDS-PAGE efter metoden af Laemmli, Nature 227:680-684 (1970). Gradientgeler enten 5-15% eller 10-20% anvendes afhængigt af proteinernes molekylvægt. Prøver for elektrophorese fortyndes i en puffer indeholdende 0,1 M Tris, pH 8,1% SDS, 4 M urinstof og 60 mM iodacetamid som slutkoncentration. Når der kræves reduktion af prøverne, 20 inkorporeres 50 mM dithiotreiotol i pufferen. 100 pi prøver indeholdende 100 pg protein anbringes i hver brønd. Efter elektrophorese visualiseres proteinerne ved farvning med Coomassie brilliantblå.

For at identificere immunologisk reaktive antigener anvendes Western blot.

25 Proteiner underkastes først elektrophorese, og SDS-PAGE gel vaskes i puffer A sammensat af 0,02 M Tris-puffer, pH 8,5 med 0,15 M glycin og 20% methanol. Proteinerne overføres til nitrocelluloseart (Schleicher og Schuell,

Keene, NH) ved elektrophorese (150 mA, 20 timer) i puffer A og vaskes i 0,01 M Tris-puffer, pH 7,4 med 0,5 M NaCI og 0,1% Brig 58 (puffer B). Arket 30 inkuberes derpå med antiserum i 2 timer ved 22 °C og vaskes i puffer B.

Efter inkubering med 125l-protein A i 30 minutter ved 22 °C vaskes arket i

I DK 175487 B1 I

16 I

I puffer B, blottes tørt og udsættes for Kodak XAR 5 film. I

I EKSEMPEL 7 I

I 5 Musebeskvttelsesstudier I

I Hanudavlede CD-1 mus med en vægt på 22-24 g opnås fra Charles River I

I Breeding Laboratories (Wilmington, MA). Sera opnået fra musene indeholdt I

I ikke noget detekterbart antistof mod type la/c GBS polysaccharid antigen I

I lo som afprøvet ved RABA. Hver forsøgsgruppe indeholdt mellem 5 og 10 dyr. I

I For musebeskyttelsesstudier injiceres mus intraperitonealt med 1 ml muse- I

I eller kaninantiserum og udsættes 24 timer senere intraperitonealt for 1 x 106 I

I CFU af type Ib/c GBS. Præimmun kanin- eller museserum anvendes som I

I kontrol. Mus undersøges for hver 24 timer, og antallet af overlevende bereg- I

I 15 nes 48 timer efter bakterieudsættelse. I

I For absorption af beskyttende antistoffer fra antisera anvendes GBS poly- I

I saccharider eller proteinfraktioner i koncentrationer på 1 mg pr. ml. 1 ml anti- I

I serum og 1 ml polysaccharid eller protein inkuberes i 2 timer ved 37 °C og I

I 20 derpå natten over ved 4 °C. Blandingen pelleteres derpå ved 13.000 g i 3 I

I minutter, og den overliggende væske fortyndes i 0,15 M NaCI for beskyttel- I

I sesstudier. I

I Efter delvis rensning ved søjlekromatografi blev 14.000 MW protein reisoleret I

I 25 fra præparativ SDS-PAGE gel og anvendt til at fremkalde antiserum i en I

I kanin. I musebeskyttelsesstudier beskyttedes dette kaninantiserum mus I

I (89%) mod la/c GBS udsættelse. I

I For at undersøge, hvor vidt P10 fraktionen kunne udskille musebeskyttende I

I 30 antistoffer mod en heterolog GBS stamme blev mus immuniseret med type I

I la/c P10 fraktionen. Efter immunisering blev antisera samlet og undersøgt for I

17 DK 175487 B1 deres evne til at beskytte mus mod udfordring med type Ib GBS. Mus blev injiceret intraperitonealt med forskellige fortyndinger af samlet musesera til P10 fraktionen efterfulgt 24 timer senere af udfordring med type Ib/c stammen. Den beskyttende kapacitet af sera begynder at udtynde ved en 1:80 5 fortynding af sera. Derfor blev sera anvendt i en optimal fortynding på 1:40 til disse eksperimenter. I musebeskyttelsesstudier beskyttede immunsera mus mod udsættelse for type Ib stamme (P <0,001) sammenlignet med normal musesera ved samme fortynding. De samlede sera indeholdt intet detekter-bart antistof mod type la polysaccharid målt i RABA. Endvidere ændrede 10 absorption af de samlede antisera med type la eller Ib polysaccharid ikke væsentligt beskyttelsesniveauet. Den beskyttende effektivitet afmuseanti-sera mod P10 fraktion fra type le indeholdt ikke-kapsulære antigener, som dannede antistof i mus, som passivt beskyttede mus mod udfordring med type Ib GBS.

15

Kaninantiserum til SDS-PAGE elueret 14.000 MW protein fra type le GBS blev dernæst anvendt i musebeskyttelsesstudier. Mus blev injiceret med antiserum intraperitonealt og 24 timer senere udsat for smitte med type Ib GBS. Antiserummet dannes til SDS-PAGE elueret 14.000 MW protein var 20 beskyttende i mus i fortyndinger på 1:5 og 1:10. Forskellen mellem det normale kaninserum og antiserum dannet til SDS-PAGE elueret 14.000 MW protein var væsentlig.

Andre udførelsesformer er beskrevet nærmere i de efterfølgende krav.

25

Claims (18)

1. Antigen, der omfatter et polysaccharidfragment med følgende formel: I I 5 I I ->4)-p-D-Glcp-(l-»6)-P-D-GlcpNAc-(l-^3)-|3-D-Galp-(l-^ I I t I i I I x I I β-D-Galp I I t I io i I I t I o I H v^' I I α-D-NcuNAc n I I 15 hvori n=1-50. I

2. Antigen ifølge krav l.kendetegnet ved, at polysaccharidfragmentet I I er covalent bundet til et protein. I I 2 0 3. Antigen ifølge krav 2, kendetegnet ved, at proteinet er bundet til I polysaccharidfragmentet med en sekundær aminogruppe. I

4. Antigen ifølge krav 2, kendetegnet ved, at proteinet omfatter et I bakterielt overfladeprotein. * I

25 I

5. Antigen ifølge krav 2, kendetegnet ved, at proteinet omfatter et I bakterielt toxoid. I

6. Antigen, der omfatter et polysaccharidfragment med følgende formel: I 19 DK 175487 B1 — —1 —>4)-P-D-Glcp-(l->6)-P-D-GlcpNAc-(l—>3)-P-D-Galp-(l-> T 5 1 β-D-Galp J t ? O α-0-NeuNAc n 10 hvori n = 1-5, og hvori polysaccharidfragmentet er fremstillet ved a) dyrkning af type III gruppe B. Streptococcus bacterium i et medium, 15 b) udvinding af polysaccharidkapsel fra mediet eller bakteriecelleme, hvilken polysaccharidkapsel har et skelet og en sidekæde, c) nedbrydning af polysaccharidet med en endo-p-galactosidase, der er 2. specifik til spaltning af en binding på polysaccharidskelettet uden spaltning af polysaccharidets sidekædebindinger, og d) udvinding af polysaccharidfragmentet. É

7. Antigen ifølge krav 6, kendetegnet ved, at endo-p-galactosidasen er opnået fra Flavobacterium keratolyticus.

8. Antigen ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er covalent bundet til et protein. 30

9. Antigen ifølge krav 8, kendetegnet ved, at proteinet er bundet til I DK 175487 B1 1 20 I I polysaccharidfragmentet med en sekundær aminogruppe. I

10. Antigen ifølge krav 8, kendetegnet ved, at proteinet omfatter et I I bakterielt overfladeprotein. 1 I I 5 I

11. Antigen ifølge krav 8, kendetegnet ved, at proteinet omfatter et I I bakterielt toxoid. I

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et antigen ifølge krav l.kendeteg- I I ίο n e t ved, at den omfatter I a) dyrkning af type III gruppe B. Streptococcus bacterium i et medium, I I b) udvinding af polysaccharidkapsel fra mediet eller bakteriecellerne, I I 15 hvilken polysaccharidkapsel har et skelet og en sidekæde, I I c) nedbrydning af polysaccharidet med en endo-p-galactosidase, der er I specifik til spaltning af en binding på polysaccharidskelettet uden I I spaltning af polysaccharidets sidekædebindinger, og I I 20 I I d) udvinding af polysaccharidfragmentet. I

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at endo-β- I galactosidasen er opnået fra Flavobacterium keratolyticus. I I 25 I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den yder- I I ligere omfatter covalent binding af polysaccharidfragmentet til et protein. I

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at proteinet er I I 30 covalent bundet til polysaccharidfragmentet med en sekundær aminogruppe. I 21 DK 175487 B1

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at proteinet omfatter et bakterielt overfladeprotein. \

17. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at proteinet . 5 omfatter et bakterielt toxoid.

18. Vaccine, der frembringer immunologisk beskyttelse mod type III gruppe B. Streptococcus bakterier, kendetegnet ved, at den omfatter et farmaceutisk acceptabelt hjælpemiddel og antigenet ifølge et vilkårligt af kravene 1 10 til 11. 1 t