DE69330464T2 - Gruppe b streptococcus typ ii und typ v polysaccharid-protein konjugate als impfstoffe - Google Patents

Gruppe b streptococcus typ ii und typ v polysaccharid-protein konjugate als impfstoffe

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft antigene konjugierte Moleküle, welche das Kapselpolysaccharid eines Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder V umfaßt, die kovalent an ein Protein gebunden sind. Die Erfindung betrifft auch Impfstoffe und Verfahren zur Immunisierung von Säugetieren einschließlich Menschen gegen die Infektion durch Streptokokken der Gruppe B von Bakterien vom Typ II (GBS II) und/oder Typ V (GBS V). Polyvalente Impfstoffe, die die erfindungsgemäßen konjugierten Moleküle und Antigene gegen andere pathogene Bakterien einschließen, werden ebenfalls beansprucht.
  • Auf Streptokokken der Gruppe B (GBS) zurückzuführende Infektionen sind die häufigste einzelne Ursache von Sepsis und Meningitis bei Neugeborenen in entwickelten Ländern (3, 31). Kürzlich veröffentlichte Berichte aus einigen Zentren in den Vereinigten Staaten zeigen eine geringere Mortalität (9 bis 13%) als in der Reihe seit den siebziger Jahren, vielleicht infolge früherer Diagnose und intensiverer Pflege (1, 10). Nichtsdestoweniger kommt es nach wie vor zu tödlichen Infektionen und, was ebenso wichtig ist, bis zu 50% der Überlebenden einer GBS-Meningitis zeigen chronische neurologische Schäden, die von Taubheit und geringfügigen Lernbehinderungen bis hin zu motorischen, sensorischen und kognitiven Beeinträchtigungen reichen (3). Bei der weiteren Reduzierung GBSbedingter Morbidität und Mortalität dürfte eher Prävention als verbesserte Diagnose oder Therapie die signifikantesten Auswirkungen haben.
  • Da GBS-Kapselpolysaccharid-spezifische Antikörper sowohl Versuchstiere (23, 24) als auch Kleinkinder (4, 5) gegen eine GBS-Infektion zu schützen scheinen, wurden einige der Polysaccharide gereinigt und an gesunden Erwachsenen als Versuchsimpfstoffe getestet (6). Stünde ein sicherer und wirksamer GBS-Impfstoff zur Verfügung, könnte er Frauen vor und während der Schwangerschaft verabreicht werden, um Antikörper auszulösen, die in utero auf den Fötus übertragen und Schutz gegen die Infektion des Neugeborenen verleihen würden. Unter den an freiwilligen Versuchspersonen getesteten drei GBS- Polysacchariden (Typ Ia, II und III) wies Typ II die höchste Immunogenität auf und löste bei 88% der zuvor nicht-immunen Empfängerinnen eine Typ II-spezifische Antikörperreaktion aus (6). Obgleich bei einer Vielzahl von GBS-Serotypen bereits anerkannt würde, daß sie signifikant zum Prozentsatz der unter einer GBS-Infektion leidenden Patienten beitragen, wurde der Typ V nicht als für einen signifikanten Prozentsatz der GBS-Infektionen verantwortlich angesehen. Bei Neugeborenen ist das spezifische Antikörperniveau, welches für einen Schutz gegen GBS-Infektionen vom Typ II erforderlich ist, nicht genau definiert, wurde jedoch auf 2 oder 3 ug/ml geschätzt (6). Bei einer Impfstoffempfängerin, die eine Antikörperreaktion erreicht, welche nur geringfügig über dem für eine Schutzwirkung erforderlichen Mindestwert liegt, reicht die Menge der von der Mutter durch die Plazenta übertragenen Antikörper wegen der unvollständigen Übertragung von mütterlichem Immunglobulin G (IgG) auf den Fötus zum Schutz eines Frühgeborenen oder eines Säuglings mit Spätinfektion vielleicht nicht aus, weil die Halbwertzeit der mütterlichen IgG- Antikörper beim Neugeborenen etwa 25 Tage beträgt (13). Viele der zu diesen beiden Patientengruppen gehörenden Kleinkinder könnten geschützt werden, wenn der Umfang der spezifischen Antikörperreaktion auf die Impfung größer wäre. Die Übertragung von IgG von der Mutter auf den Fötus nimmt während des gesamten dritten Schwangerschaftsdrittels zu, so daß ein höheres mütterliches Antikörperniveau einen früheren Schutz, d. h. den Schutz eines noch frühreiferen Kindes, bewirken würde (16). Auf ähnliche Weise würden höhere Werte bei der Mutter zu einer längeren Lebensdauer mütterlicher Antikörper im Kleinkind führen und dadurch auch einen Schutz gegen spät einsetzende Erkrankung bieten.
  • Die Immunogenität mehrerer bakterieller Polysaccharid- Antigene wurde durch die Anlagerung geeigneter Trägerproteine an Polysaccharide oder an ableitende Oligosaccharide erhöht (2, 14, 17-19, 22, 27, 29, 30, 34). Zu den wünschenswerten Eigenschaften von Polysaccharid-Proteinkonjugierten Impfstoffen gehören eine verbesserte Immunogenität des Polysaccharids, eine erhöhte Hapten-spezifische Antikörperreaktion auf Wiederholungsdosen und ein Überwiegen von Antikörpern der Klasse IgG. In jüngster Zeit gelang uns die Entwicklung eines GBS III-Tetanustoxoid (TT)-Impfstoffs durch Verwendung der Seitenketten-Sialinsäure-Teile als Orte gerichteter Proteinkopplung (33). Der III-TT-Impfstoff löste GBS-IIIspezifische, opsonisch aktive Antikörper aus, während das nicht-konjugierte Polysaccharid vom Typ III bei Kaninchen nicht-immunogen war (33).
  • Die Erfindung beansprucht antigene konjugierte Moleküle, umfassend das Kapselpolysaccharid, welches aus einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II und einer Proteinkomponente oder einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ V und einer Proteinkomponente hergeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr in Sialinsäureresten der Polysaccharid-Komponenten vom Typ II oder Typ V endende Seitenketten jeweils durch eine sekundäre Aminbindung mit einem Protein verknüpft sind.
  • Ebenfalls beansprucht wird ein Verfahren zur Herstellung der konjugierten Moleküle eines Kapselpolysaccharids aus einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder Typ V und einem Protein, welches aufweist:
  • (a) Behandlung des Kapselpolysaccharids aus einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder Typ V mit Periodatoxidation, die ausreicht, um eine Aldehydgruppe in zwei oder mehr mit der Hauptkette des Polysaccharids verknüpfte endständige Sialinsäurereste einzuführen;
  • (b) Kopplung des oxidierten Kapselpolysaccharids aus einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder Typ V an ein Protein durch reduktive Aminierung zur Herstellung einer sekundären Aminbindung zwischen dem Kapselpolysaccharid und dem Protein.
  • Nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte konjugierte Moleküle werden ebenfalls beansprucht.
  • Die Erfindung beansprucht außerdem Impfstoffe, die jedes der oben beschriebenen konjugierten Moleküle aufweisen. Darüber hinaus beansprucht die Erfindung polyvalente Impfstoffe, welche die erfindungsgemäßen konjugierten Moleküle und wenigstens ein weiteres immunogenes Molekül aufweisen, die die Produktion von Antikörpern gegen eine andere pathogene Substanz als den Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder Typ V auslösen können. Neben den konjugierten GBS-Molekülen vom Typ II und/oder Typ V weist der erfindungsgemäße polyvalente Impfstoff darüber hinaus insbesondere weitere immunogene Moleküle auf, die die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene auslösen können, die aus der Gruppe, umfassend den Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III, IV und Haemophilus influenzae Typ b und E. coli Typ K1 ausgewählt sind. Die anderen immunogenen Moleküle können vorzugsweise die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene auslösen, die aus der Gruppe, umfassend den Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III und Haemophilus influenzae Typ b und E, coli K1, oder aus der Gruppe, umfassend den Streptococcus der Gruppe B, Typ Ia, Ib, III und E. coli Typ K1, oder aus der Gruppe, umfassend den Streptococcus der Gruppe B, Typ Ia, Ib, III, ausgewählt sind.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung des erfindungsgemäßen konjugierten Moleküls für die Herstellung des Impfstoffs zur Immunisierung von Neugeborenen beansprucht, wobei der Impfstoff einer Frau in einer immunogenen Dosierung verabreicht wird, so daß Antikörper produziert werden, die in einen Fötus übergehen können, der vor oder nach Verabreichung des Impfstoffs in einer Menge, die ausreicht, um das Neugeborene bei der Geburt gegen Infektionen zu schützen, gezeugt wurde. Der Impfstoff wird vorzugsweise vor der Schwangerschaft verabreicht. Der Impfstoff kann einer weiblichen Person im Alter zwischen etwa 10 und 50 Jahren verabreicht werden. Außerdem kann der Impfstoff während der Schwangerschaft verabreicht werden.
  • Die Verwendung des erfindungsgemäßen konjugierten Moleküls für die Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Menschen durch Verabreichung des Impfstoffs in einer immunogenen Dosierung an einen Menschen wird ebenfalls beansprucht. Außerdem wird die Verwendung des erfindungsgemäßen konjugierten Moleküls für die Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Erwachsenen durch Verabreichung des Impfstoffs in einer immunogenen Dosierung an eine Person, bei der das Risiko einer Infektion mit einem Streptococcus der Gruppe B, Typ II oder Typ V, besteht, beansprucht.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein die erfindungsgemäßen konjugierten Moleküle enthaltender Impfstoff in immunogener Dosierung an freiwillige Impfstoffempfänger verabreicht, die Serum oder Plasma spenden könnten, welches den obigen Gruppen passiv verabreicht werden könnte.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immunisierung von Personen, einschließlich Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen, bei denen die Gefahr einer Infektion mit einem Streptococcus der Gruppe B, Typ II oder Typ III, besteht. Zu den Risikopersonen können solche gehören, deren Immunsystem aus den unterschiedlichsten Gründen, u. a. durch Krebs oder Diabetes, geschwächt ist. Der Impfstoff kann in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger verabreicht werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen konjugierten Moleküls für die Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Milchkuhherden gegen Rindermastitis durch Verabreichung des Impfstoffs in einer immunogenen Menge an Milchkühe.
  • Fig. 1. Struktur der Heptasaccharid-Wiederholungseinheit von Kapselpolysaccharid GBS Typ II.
  • Fig. 2. Polysaccharid GBS Typ II komp. ELISA. Polysaccharide GBS Typ Ia (0), Typ II ( ) und Typ III ( ) wurden als Inhibitoren gegen die Bindung von II-TT-Impfstoff-Antikörper an mit Polysaccharid vom Typ II beschichteten Platten verwendet. Die Resultate sind als Prozentsätze der Inhibition im Verhältnis zu derjenigen von Kontrollquellen ohne Inhibitor ausgedrückt.
  • Fig. 3. Polysaccharid GBS Typ II komp. ELISA. Native ( ) und desialylierte oder Kern( )-Polysaccharide vom Typ II wurden als Inhibitoren der durch II-TT-Impfstoff ausgelösten Antikörper eingesetzt. Bezugspunkte sind Mittelwerte (mit Standardabweichungen) aus Dreifachbestimmungen. Die Resultate sind als Prozentsatz der Inhibition im Verhältnis zu Kontrollquellen ohne Inhibitor ausgedrückt.
  • Fig. 4. Struktur der Wiederholungseinheit von Kapselpolysaccharid GBS Typ V.
  • Fig. 5. Polysaccharid GBS Typ V komp. ELISA. Polysaccharide GBS Typ Ia (- -), Typ Ib (- -), Typ II (- -), Typ III (-0-), Typ V (- -) und Typ VI (-a-) wurden als Inhibitoren von durch V-TT-Impfstoff ausgelösten Antikörpern eingesetzt. Bezugspunkte sind Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. Die Resultate sind als Prozentsatz der Inhibition im Verhältnis zu derjenigen von Kontrollquellen ohne Inhibitor ausgedrückt.
  • Fig. 6. Opsonophagozytische In-vitro-Abtötung durch Lymphozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf von GBS. Typ V, Stamm CJB 111, opsonisiert durch Kaninchen-Antiseren, erhöht auf einen konjugierten Impfstoff GBS Typ V-TT. C' ist Komplement.
  • Die Erfindung betrifft antigene konjugierte Moleküle, welche eine Kapselpolysaccharid-Komponente und eine Protein- Komponente aufweisen.
  • Bakterienstäxnme. GBS, Typ II, Stamm 18RS21 und Typ Ia, Stamm 090, wurden ursprünglich von der verstorbenen Rebecca Lancefield von der Rockefeller University bezogen und bei -80ºC als Gefrierkulturen erhalten. Der Stamm 18R521 wurde bei In- vitro- und In-vivo-Prüfungen eingesetzt und war die Quelle des Kapselpolysaccharids vom Typ II, welches in dem konjugierten Impfstoff verwendet wurde. Zwei klinische Isolate GBS vom Typ II (Stämme S16 und S20) und Typ III, Stamm M781, wurden aus der Kultursammlung des Channing Laboratory bezogen.
  • Obgleich der Serotyp V früher nicht als signifikanter Beitrag zur Anzahl der GBS-Infektionen bei Menschen anerkannt war, zeigen neue Beweise jetzt, daß der Typ V zu etwa 15% der GBS-Infektionen beiträgt. Zur Herstellung eines konjugierten Impfstoffs GBS Typ V wurde GBS vom Typ V, Stamm 1169-NT1 von Dr. J. Jelinkova vom Institut für Hygiene und Epidemiologie, Prag, Tschechische Republik, bezogen und bei -80ºC als Gefrierkulturen aufbewahrt. Der Stamm 1169-NT1 wurde bei Invitro- und In-vivo-Prüfungen verwendet und bildete das für den konjugierten Impfstoff verwendete Ausgangs- oder Typ V- Kapselpolysaccharid. GBS vom Typ V, Stamm CJB 111, wurde ursprünglich von Dr. Carol Baker von der Baylor University bezogen.
  • Konjugation von Polysaccharid GBS Typ V oder Polysaccharid Typ V zu TT. Kapselpolysaccharid vom Typ II wurde mittels schon früher beschriebener Verfahren zur Reinigung von Polysaccharid vom Typ III (33) aus Zellen des Stamms 18RS21 zu Kapselpolysaccharid vom Typ II gereinigt. Die Konjugation des Polysaccharids vom Typ II zu monomerem TT erfolgte mit Hilfe von Techniken, die schon früher detailliert für die Konjugation von TT zu Polysaccharid GBS Typ III beschrieben wurden (33). Kurz gesagt, wurde natives Polysaccharid vom Typ II in einer Sepharose CL-6B-Säule (1,6 mal 85 cm; Pharmacia Fine Chemicals) einer Größenfraktionierung unterzogen. Das im Zentrum der Hauptspitze eluierte Material wurde vereinigt, gegen Wasser dialysiert und zu Material mit einem relativ hohen Molekulargewicht von 200.000 lyophilisiert. Eine Analyse dieses Materials mittels Kernresonanzspektroskopie bei 500 MHz bestätigte die Struktur des nativen Polysaccharids vom Typ II (20) und die Abwesenheit von Antigen der Gruppe B (26). Das Molekulargewicht von Polysacchariden, die für die Verwendung in den erfindungsgemäßen konjugierten Molekülen geeignet sind, kann über einen breiten Bereich variieren. Ein bevorzugter Molekulargewichtsbereich für die Polysaccharid- Komponente liegt zwischen 5.000 und 1.000.000 Dalton. Ein stärker bevorzugter Bereich für die Polysaccharid-Komponente liegt zwischen 50.000 und 500.000 Dalton. Ein stärker bevorzugter Bereich liegt zwischen 100.000 und 300.000. Innerhalb des Bereichs von 100.000 bis 300.000 Dalton werden Polysaccharide mit einem Molekulargewicht von 200.000 Dalton bevorzugt.
  • Das größenfraktionierte Polysaccharid vom Typ II wurde einer schwachen Oxidation mit Natriummetaperiodat unterzogen (18). Diese Prozedur führte zur Umwandlung eines Teils der Sialinsäurereste am Polysaccharid in das Acht-Kohlenstoff-Analog der Sialinsäure, 5-Acetoamido-3,5-Dideoxy-D-Galaktosyloktulosonsäure (33). Der Prozentsatz der oxidierten Sialinsäurereste wurde mittels Gaschromatografie-Massenspektroskopie der Sialinsäurereste und ihrer oxidierten Derivate, wie schon früher beschrieben (33), geschätzt. Vorzugsweise zwischen 5 und 50% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids GBS Typ II werden modifiziert und stehen für die Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung. Insbesondere werden vorzugsweise zwischen 5 und 25% der Sialinsäurereste des Polysaccharids GBS Typ II modifiziert und stehen für die Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung. Am stärksten bevorzugt wird eine Modifikation von 5 bis 10% der Polysaccharide GBS Typ II.
  • Vorgezogen wird die Oxidation des Polysaccharids GBS Typ V zur Erzielung einer Modifikation zwischen 5 und 80% der endständigen Sialinsäurereste, die reaktionsfähige Aldehyde bilden. Stärker bevorzugt wird eine Modifikation von 10 bis 50% der endständigen Sialinsäurereste. Den größten Vorzug erhält eine Modifikation von 5 bis 50%, 5 bis 25% und 5 bis 10% der endständigen Sialinsäurereste.
  • Die Proteinkomponente der erfindungsgemäßen konjugierten Moleküle kann jedes physiologisch verträgliche Protein sein.
  • Zu den bevorzugten Proteinen gehören Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid sowie kreuzreaktive Materialien wie CRM&sub1;&sub9;&sub7;.
  • Das oxidierte Polysaccharid vom Typ II wurde durch reduktive Aminierung, wie bereits früher beschrieben (33), mit monomerem Tetanustoxoid ("TT") (Institute Armand Frappier, Montreal. Kanada) verknüpft. Das TT wurde mittels Gelfiltrationschromatografie, wie ebenfalls bereits beschrieben (33), zu seinem Monomer gereinigt. Kurz gesagt, wurden 10 mg des periodatbehandelten Polysaccharids vom Typ II und 10 mg gereinigtes TT in 0,6 ml 0,1 M-Natriumbicarbonat (pH 8.1) gelöst. Dem Gemisch wurde Natriumcyanborhydrid (20 mg) zugesetzt und es wurde 5 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Der Fortschritt der Konjugation wurde durch Schnellproteinflüssigkeitschromatografie (FPLC) kleiner Aliquote des Reaktionsgemischs, analysiert in einer Superose 6® (Pharmacia)-Gelfiltrationssäule, überwacht. Die Reaktion war abgeschlossen, wenn die Höhe der beim Hohlraumvolumen der Säule eluierenden Spitze (die das Konjugat mit hohem Molekulargewicht repräsentiert) konstant blieb. Das Konjugat wurde chromatografisch in einer Säule mit Biogel A®, 0,5 M (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien), wie bereits früher beschrieben (33), gereinigt. Der Proteingehalt des Impfstoffs wurde nach dem Verfahren von Lowry et al. (25) mit Rinderserumalbumin als Standard geschätzt. Der Kohlenhydratgehalt wurde nach dem Verfahren von Dubois et al (11) mit gereinigtem Polysaccharid vom Typ II als Standard ermittelt.
  • Das konjugierte Molekül wurde so hergestellt, daß vorzugsweise zwischen 5 und 50%, 5 und 25% sowie 5 und 10% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Polysaccharid um GBS vom Typ II und 5% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids werden kovalent an ein Protein gebunden.
  • Kapselpolysaccharid vom Typ V wurde nach den früher beschriebenen Verfahren zur Reinigung des Polysaccharids vom Typ III (33) aus GBS-Zellen, Typ V, Stamm 1169-NT1 gereinigt. Die Konjugation des Polysaccharids vom Typ V zu monomerem TT wurde mit Hilfe von Techniken herbeigeführt, die im einzelnen bereits früher für die Konjugation von TT zu Polysaccharid GBS Typ III beschrieben wurden (33).
  • Natives Polysaccharid vom Typ V hatte ein relatives Molekulargewicht von 200.000 Dalton. Eine Analyse dieses Materials mittels H-Kernresonanzspektroskopie bei 500 MHz bestätigte die native Struktur des Typs V (2) und das Fehlen von Antigen der Gruppe B (26).
  • Zur Einführung von reaktionsfähigen Aldehydgruppen in die endständigen Sialinsäurereste des Polysaccharids vom Typ V zur Verknüpfung mit einem Protein wurde Polysaccharid vom Typ V einer schwachen Oxidation mit Natriummetaperiodat unterzogen (18). Diese Prozedur führte zur Umwandlung eines Teils der Sialinsäurereste beim Polysaccharid in das Acht- Kohlenstoff-Analog von Sialinsäure, 5-Acetamido-3,5-Dideoxy- D-Galaktosyloktulosonsäure (33). Der Prozentsatz der oxidierten Sialinsäurereste wurde mittels Gaschromatografie- Massenspektroskopie der Sialinsäurereste und ihrer oxidierten Derivate geschätzt.
  • Das oxidierte Polysaccharid vom Typ V wurde durch reduktive Aminierung, wie bereits früher beschrieben (33), mit monomerem Tetanustoxoid ("TT") (Institute Armand Frappier, Montreal. Kanada) verknüpft. Das TT wurde mittels Gelfiltrationschromatografie, wie ebenfalls bereits beschrieben (33), zu seinem Monomer gereinigt. Kurz gesagt, wurden 8,6 mg des periodatbehandelten Polysaccharids vom Typ V und 8,7 mg gereinigtes TT in 0,5 ml 0,1 M-Natriumbicarbonat (pH 8.2) gelöst. Dem Gemisch wurde Natriumcyanborhydrid (31,5 mg) zugesetzt und es wurde 10 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Der Fortschritt der Konjugation wurde durch Schnellproteinflüssigkeitschromatografie (FPLC) kleiner Aliquote des Reaktionsgemischs, analysiert in einer Superose 6® (Pharmacia)- Gelfiltrationssäule, überwacht. Die Reaktion war abgeschlossen, wenn die Höhe der beim Hohlraumvolumen der Säule eluierenden Spitze (die das Konjugat mit hohem Molekulargewicht repräsentiert) konstant blieb. Das Konjugat wurde chromatografisch in einer 2,6 · 91 cm-Säule mit Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) unter Verwendung von 0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH7 plus 0,01% Thimerosal als Laufpuffer gereinigt. Der Proteingehalt des Impfstoffs wurde nach dem Verfahren von Lowry et al. (25) mit Rinderserumalbumin als Standard geschätzt. Der Kohlenhydratgehalt wurde nach dem Verfahren von Dubois et al (11) mit Galaktose als Standard ermittelt.
  • Das konjugierte Molekül wurde so hergestellt, daß vorzugsweise zwischen 5 und 50%, 5 und 25% sowie 5 und 10% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Polysaccharid um GBS vom Typ V und 25% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids werden kovalent an ein Protein gebunden.
  • Impfung von Kaninchen mit Impfstoff II-TT und Impfstoff V-TT. Gruppen von drei weiblichen, weißen New Zealand-Kaninchen (Millbrook Farms, Amherst, Mass.), von denen jedes ca. 3 kg wog, wurden an vier Stellen auf dem Rücken subkutan mit 50 mg entweder von ungekoppeltem nativem Polysaccharid vom Typ II oder Impfstoff II-TT, jeweils emulgiert mit vollständigem Freundschem Adjuvans in einem Gesamtvolumen von 2 ml, geimpft. Diese Tiere erhielten Wiederholungsinjektionen (50 ug) eines Impfstoffs, der mit unvollständigem Freundschem Adjuvans an den Tagen 20 und 41 hergestellt wurde. Serum wurde von jedem Tier an den Tagen 0, 20, 34, 41, 55 und 70 entnommen, filtersterilisiert und bei -80ºC gelagert.
  • Ein weibliches, weißes New Zealand-Kaninchen (Millbrook Farms, Amherst, Mass.) mit einem Gewicht von ca. 3 kg wurde an vier Stellen auf dem Rücken subkutan mit 50 ug konjugiertem GBS-Impfstoff vom Typ V-TT, gemischt mit Alaun in einem Gesamtvolumen von 2 ml, geimpft. Dieses Tier erhielt Wiederholungsinjektionen (50 ug) eines an den Tagen 22 und 42 mit Alaun hergestellten Impfstoffs. Das Serum wurde jedem Tier an den Tagen 0, 35, 56 und 91 entnommen, filtersterilisiert und bei -80ºC gelagert.
  • ELISAs. GBS-Typ II-spezifische Kaninchen-Antikörper wurden mittels eines heterogenen Enzym-Immungssays (ELISA) mit zu alkaliner Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Tago Inc. Burlingham, Kalifornien) in einer Verdünnung von 1 : 3000 quantifiziert. Mikrotiterplatten (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chantillty, VA) wurden mit 100 ng gereinigtem Polysaccharid vom Typ II, welches gemäß früherer Beschreibung (15, 33) mit Poly-L-Lysin verknüpft war, beschichtet. Antikörpertiter wurden als die reziproke Verdünnung aufgezeichnet, die zu einem A&sub4;&sub0;&sub5;-Wert von ≥ 0,3 führte, wenn Quellen, die das Referenzserum (Kaninchen-Antiserum, erhöht auf ganze BGS 18RS21-Zellen) in einer Verdünnung von 1 : 800 enthielten, einen A&sub4;&sub0;&sub5;-Wert von 0,5 erreichten. Die Menge des für den Proteinanteil des konjugierten Impfstoffs spezifischen Antikörpers wurde mittels ELISA unter Verwendung mit Platten, die mit monomerem TT (100 ng je Quelle) beschichtet waren, geschätzt. TT-spezifische IgG-Titer wurden als die reziproke Verdünnung aufgezeichnet, die 35 Minuten nach Zusatz des Substrats, p-Nitrophenylphosphat (Sigma 104- Phosphatasesubstrattabletten; Sigma Chemical Co.) einen A&sub4;&sub0;&sub5;- Wert von 0,3 ergab.
  • GBS Typ V-spezifische Kaninchen-Antikörper wurden ebenfalls mittels ELISA mit zu alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Tago Inc. Burlingham, Kalifornien) bei einer Verdünnung von 1 : 3000 quantifiziert. Mikrotiterplatten (Immulon 2; Dynatech Laboratories, Inc., Chantillty, VA) wurden mit 100 ng gereinigtem Polysaccharid vom Typ V, welches, wie früher beschrieben, mit Poly-L-Lysin verknüpft war (15), beschichtet. Antikörpertiter wurden als die reziproke Verdünnung aufgezeichnet, die einen A&sub4;&sub0;&sub5;-Wert von ≥ 0,3 ergab, wenn Quellen, die das Referenzserum (Kaninchen- Antiserum, erhöht auf ganze Stämme 1169-NT1 vom Typ V) in einer Verdünnung von 1 : 3000 enthielten, einen A&sub4;&sub0;&sub5;-Wert von 0,3 erreichten.
  • Trennung von IgG und IgM vom Kaninchen-Immunserum. Zur Trennung der Immunglobuline (IgG und IgM) von 0,5 ml vereinigtem Kaninchen-Immunserum, welches am 70. Tag hergestellt und auf eine an anderer Stelle beschriebene Weise (28) auf II-TT- Impfstoff erhöht wurde, wurde die Protein-A-Agarose- Affinitäts-Säulenchromatografie (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) angewandt. Die Trennung der Antikörperklassen wurde mit Typ II-Polysaccharid-beschichteten ELISA-Platten mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (γ und leichtkettenspezifisch; Tago) in einer Verdünnung von 1 : 500 und Ziegen-Anti- Kaninchen-IgM (u-kettenspezifisch; Sera-Lab, Westbury, N. Y.) in einer Verdünnung von 1 : 200 bestätigt.
  • Kompetitiver ELISA. Die Spezifität des auf II-TT-Impfstoff erhöhten Kaninchenserums wurde mittels kompetitivem ELISA mit homologen (Typ II) und heterologen (Typ Ia und III) Polysacchariden als Inhibitoren bestimmt. Die Epitop-Spezifität von Impfstoff-induziertem, vereinigtem Kaninchenserum (hergestellt am 70. Tag) wurde mit nativem, desialyliertem Polysaccharid vom Typ II und β-O-Methylgalaktopyranose als Inhibitoren der Antikörperbindung untersucht. Natives Polysaccharid vom Typ II wurde mittels Behandlung mit 6%iger Essigsäure bei 80ºC während 2 Stunden desialyliert. Polysaccharid- Inhibitoren wurden 4-fach seriell verdünnt und mit einem gleichen Volumen (75 ul) eines am 70. Tag nach Impfung mit II-TT-Impfstoff erzielten, vereinigten Kaninchenserums (10.000-fache Verdünnung) gemischt. Dieses Gemisch (100 ul) wurde dann mit Polysaccharid vom Typ II beschichteten ELISA- Quellen zugesetzt. Als Sekundär-Antikörper wurde alkalisches, Phosphatase-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1 : 3000 verwendet. Die Resultate werden wie folgt ausgedrückt: % Inhibition [A&sub4;&sub0;&sub5; ohne Inhibitor - A&sub4;&sub0;&sub5; mit Inhibitor)/A&sub4;&sub0;&sub5; ohne Inhibitor] · 100.
  • Die Serotyp-Spezifität des GBS V-TT-Kaninchen-Antiserums wurde mit Hilfe der GBS Typ-spezifischen Polysaccharide Ia, Ib, II, III, V und VI ausgewertet. ELISA-Quellen wurden mit 100 ng/Quelle mit GBS Typ V-Polysaccharid, welches mit Poly- L-Lysin verknüpft war, beschichtet. Kaninchen-Antiseren gegen V-TT-Impfstoff, Verdünnung 1 : 6000, wurden mit jedem der Polysaccharid-Inhibitoren inkubiert. Das inkubierte Antiserum wurde den ELISA-Quellen zugesetzt und die Platte wurde mit alkalischem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Phosphatase-Konjugat (Verdünnung 1 : 3000) und Substrat, wie zuvor beschrieben (28), verarbeitet.
  • Antikörper-vermittelte In-vitro-Abtötung von GBS. Die Fähigkeit Impfstoff-induzierter Kaninchen-Antikörper zur Opsonisierung von GBS-Zellen zwecks anschließender Abtötung durch Leukozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf wurde durch einen In-vitro-Opsonophagozytose-Assay ermittelt (7, 8).
  • Der Reaktionsassay zur Bestimmung der opsonophagozytischen Aktivität von GBS-Typ V-reaktiven Antikörpern wurde durchgeführt mittels Inkubation von 1,5 · 10&sup7; weißen Blutkörperchen (WBC) in 300 ul Puffer; 3 · 10&sup6; CFU GBS-Typ V, Stamm CJB 111, in 50 ul; Humankomplement (absorbiert mit GBS-Zellen vom Stamm Typ V) (50 ul); Antikörper-Anti V-TT-Wärme-inaktiviert (50 ul); modifiziertem Eagleschem Medium (50 ul). Das Gemisch wurde unter weiterem Mischen während 60 min bei 37ºC inkubiert. Die Differenz in GBS-Koloniebildungseinheiten (CFU) wurde nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC nach dem Standard-Plattenzählverfahren bestimmt.
  • Passiver Schutz von Mäusen durch Impfstoff-induzierte Kaninchen-Antikörper. Gruppen von 10 weiblichen Swiss-Webster- Outbred-Mäusen (Taconic Farms, Germantown, N. Y.), bei denen jede Maus 18 bis 20 g wog, erhielten intraperitoneal 0,2 ml vereinigtes Serum (70. Tag) von Kaninchen injiziert, die entweder mit Polysaccharid vom Typ II oder Impfstoff II-TT geimpft worden waren. Der mittels ELISA gemessene Titer des vereinigten Serums, welches am 70. Tag Kaninchen entnommen wurde, die mit Polysaccharid vom Typ II immunisiert worden waren, betrug 100 und derjenige des II-TT-Impfstoffs betrug 12.800. Kontrollgruppen von fünf Mäusen erhielten Kaninchen- Vorimmunisierungsserum oder auf ungekoppeltes TT erhöhtes vereinigtes Antiserum (27). Vierundzwanzig Stunden später wurden die Mäuse mit Typ II, Stamm 18RS21 (1,5 · 10&sup5; CFU je Maus) in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml Tood-Hewitt-Bouillon überprüft. Hinsichtlich der Überprüfungsdosis für jeden einzelnen Stamm wurde zuvor festgelegt, daß sie bei > 90% der Mäuse mit ähnlichem Gewicht und ähnlichem Alter letal wäre.
  • An drei darauffolgenden Tagen wurden die überlebenden Mäuse täglich gezählt.
  • Statistische Analyse. Für einen Vergleich der Eignung verschiedener Kaninchenseren, Mäuse passiv gegen eine letale GBS-Infektion zu schützen, wurde der Fisher-Präzisionstest angewandt.
    • RESULTATE
  • Herstellung und Zusammensetzung von II-TT-Impfstoff und V-TT- Impfstoff. GBS II-TT-Impfstoff und GBS V-TT-Impfstoff wurden nach Verfahren hergestellt, die früher für den Aufbau des konjugierten GBS-Impfstoffs vom Typ III im einzelnen beschrieben wurden (33). Eine kontrollierte Periodatoxidation von Polysaccharid GBS Typ II führte zur Modifizierung der mittels Caschromatografie-Massenspektrometrie-Analyse bestimmten Sialinsäurereste des Polysaccharids um 7%. Monomeres TT wurde durch reduktive Aminierung kovalent an modifizierte Sialinsäureorte des Polysaccharids vom Typ II gebunden. Der gereinigte II-TT-Impfstoff enthielt 32% (Gew./Gew.) Protein und 68% (Gew./Gew.) Kohlenhydrat. Die endgültige II- TT-Impfstoff-Ausbeute betrug 7,8 mg oder 39%.
  • Kontrollierte Periodatoxidationen von Polysaccharid GBS Typ V bewirkten eine Modifizierung der Sialinsäurereste im Polysaccharid um etwa 8%, 25% und 50%. Monomeres TT wurde durch reduktive Aminierung kovalent an die modifizierten Sialinsäurereste des Polysaccharids vom Typ V gebunden. Polysaccharide, die so oxidiert waren, daß etwa 8% ihrer Sialiansäurereste modifiziert wurden, ergaben Konjugate mit einem niedrigen Molverhältnis Polysaccharid/Protein. Polysaccharide, bei denen 25 oder 50% des endständigen Sialinsäurerückstands modifiziert waren, ergaben konjugierte Moleküle mit einem bevorzugten Molverhältnis Polysaccharid/Protein. Ein Polysaccharid GBS Typ V, bei dem 25% der Sialinsäurereste modifiziert waren, wurde zur Herstellung von konjugierten Impfstoffen verwendet, die der in Tabelle 1 dargestellten biochemischen Charakterisierung entsprechen.
    • TABELLE 1. Zusammensetzung des Impfstoffs GBS Typ V-TT
  • Polysaccharidgröße (M') 200.000
  • Oxidierte Sialinsäurereste (%) 25
  • Impfstoffmenge als Tetanustoxoid (Trocken-Gew.-%) 38
  • Impfstoffmenge als Kohlenhydrat (Trocken-Gew.-%) 62
  • Mol Kohlenhydrat/Mol Proteina 0,56
  • a Der ermittelte M' des Tetanustoxoid-Monomers betrug 150.000
  • Immunogenität von II-TT-Impfstoff und V-TT-Impfstoff bei Kaninchen. Die Immunogenitätswerte des II-TT-Impfstoffs und des nativen Polysaccharids vom Typ II wurden bei Kaninchen verglichen. Nach Verabreichung der primären Dosis des II-TT- Impfstoffs wurde eine Zunahme beim Typ II-spezifischen Antikörper beobachtet (Tabelle 2). Die Antikörperreaktion wurde durch eine Wiederholungsdosis des Impfstoffs weiter verstärkt. Nach einer zweiten Wiederholungsdosis am 41. Tag blieben die Antikörperwerte unverändert oder stiegen leicht an und blieben während der gesamten restlichen Untersuchungsperiode gleich (Tabelle 2). Im Gegensatz zum II-TT-Impfstoff löste ungekoppeltes, natives Polysaccharid GBS Typ II keine spezifische Antikörperreaktion aus (Tabelle 2). Mit dem II- TT-Impfstoff geimpfte Tiere entwickelten auch Antikörper gegen TT und erzielten einen Anstieg von ca. 3-log&sub1;&sub0; gegenüber den Vorimmunisierungswerten. TABELLE 2. Für Polysaccharid GBS Typ II spezifische Antikörpertiter von Kaninchen, die mit nativem Polysaccharid vom Typ II oder II-TT-Impfstoff geimpft wurden
  • a Der Wert 100 entspricht einem Antikörpertiter von 100. Die Werte sind die Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. Die Kaninchen wurden subkutan mit 50 ug eines Impfstoffs geimpft, der am Tag 0 mit vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde.
  • b Es wurden Wiederholungsdosen mit unvollständigem Freundschem Adjuvans verabreicht.
  • Die Immunogenität des V-TT-Impfstoffs (auf 25% oxidiertes Polysaccharid) wurde ebenfalls an Kaninchen ermittelt. Nach der ersten und zweiten Dosis von Impfstoff des Typs V-II stiegen die Antikörper (IgG)-Werte an und blieben während des weiteren Verlaufs der Untersuchung gleich (Tabelle 3). TABELLE 3. Für Polysaccharid GBS Typ V spezifischer IgG-Titer IgG-Titer bei Bestimmung mittels ELISA am Taga:
  • a Dieses Tier erhielt drei 50 ug-Dosen Impfstoff, gemischt mit Alaun, in 3-Wochen-Intervallen ab Tag 0.
  • Antigene Eigenschaften von Impfstoff-induzierten Kaninchenseren. Die Konjugation von Polysaccharid zu einem Proteinträger sollte wichtige antigene Epitope, wie man sie auf dem Polysaccharid in seiner nativen Form findet, nicht verändern. Wir haben die Spezifität der II-TT-Impfstoff-induzierten Antikörper durch kompetitiven ELISA unter Verwendung von homologen und heterologen GBS-Polysacchariden als Inhibitoren getestet. Das native Polysaccharid vom Typ II hemmte bei einer Konzentration von 450 ng/ml 50% der Bindung der auf II-TT- Impfstoff erhöhten Kaninchen-Antikörper (Fig. 2). Polysaccharide GBS Typ Ia und Typ III hemmten die Bindung eines auf II- TT-Impfstoff erhöhten Serums nicht, sogar wenn die Konzentrationen 500 ug/ml betrugen (Fig. 2). Diese Resultate belegen die Serotyp-Spezifität von II-TT-Impfstoff-induzierten Antikörpern für das Targetantigen und weisen auf eine Erhaltung von antigenen Epitopen des Polysaccharidanteils des konjugierten Impfstoffs hin.
  • Um festzustellen, ob das durch Sialinsäure beeinflußte Epitop während der Herstellung von II-TT-Impfstoff erhalten blieb, wurden in einem kompetitiven ELISA native und desialylierte Polysaccharide vom Typ II als Inhibitoren der Hindung von auf II-TT-Impfstoff erhöhten Kaninchen-Antikörpern verwendet. Die Desialylierung des Polysaccharids wurde durch Behandlung mit 6%iger Essigsäure bei 80ºC für 2 Stunden bewirkt. Die quantitative Beseitigung von Sialinsäureresten wurde durch den Thiobarbitursäureassay (32) mit N-Acetylneuraminsäure (Sigma) als Standard bestätigt. Der Kav-Wert von nativem Polysaccharid vom Typ TI vor der Säurebehandlung betrug 0,49, während der Kav-Wert von säurebehandeltem Polysaccharid in einer Superose 6® FPLC-Säule (LKB-Pharmacia, Schweden) 0,52 betrug, was auf eine geringfügige Reduzierung der Molekülgröße des Polysaccharids infolge des Verlusts der Seitenketten- Sialinsäurereste hinweist, die 20 Gew.-% des nativen Polysaccharids ausmachen. Sogar 200 ug desialyliertes Polysaccharid GBS Typ II je ml hemmten die Bindung von II-TT-Impfstoff- Antikörpern an natives Polysaccharid vom Typ II um 33% (Fig. 3). Die relativ schwache Erkennung des desialylierten oder Kern-Polysaccharids vom Typ II durch II-TT-Impfstoff- Antiserum wurde mittels Immunelektrophorese-Gelen bestätigt, die ein Präzipitinband aufwiesen, welches bei dem nativen Polysaccharid, nicht jedoch bei dem Kern-Polysaccharid vom Typ II (nicht dargestellt) ausgebildet wurde. Die Bindung von II-TT-Impfstoff-Antiseren an natives Polysaccharid vom Typ II konnte mit β-O-Methylgalaktopyranose, die in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 10 mg/ml verwendet wurde (nicht dargestellt), nicht inhibiert werden.
  • Die Spezifität von durch GBS-Impfstoff vom Typ V-TT induzierten Antikörpern wurde mittels eines kompetitiven ELISA unter Verwendung von homologen und heterologen GBS-Polysacchariden als Inhibitoren getestet. Natives Polysaccharid vom Typ V hemmte wirksam die Bindung von auf Impfstoff vom Typ V-TT erhöhten Kaninchen-Antikörpern (Fig. 5). GBS Typ Ia, Typ Ib, Typ II, Typ III und Typ VI hemmten die Bindung von auf Impfstoff vom Typ V-TT erhöhtem Serum nicht (Fig. 5). Diese Resultate beweisen die Spezifität der durch Impfstoff vom Typ V-TT induzierten Antikörper für das Target-Antigen.
  • In-vitro-Aktivität von GBS-Impfstoff-induzierten Antikörpern. Die Fähigkeit von Immunserum zur Opsonisierung von GBS zwecks Abtötung durch Leukozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf in vitro stand in Korrelation mit der Schutzwirkung gegen GBS bei Tier-Schutzversuchen (27, 33). In den drei mit II-TT-Impfstoff geimpften Kaninchen gezogene Antikörper verbesserten die Abtötung von GBS, Typ II, Stamm 18RS21 um ≥ 1,8 log&sub1;&sub0; (Tabelle 4). Kaninchen- Vorimmunisierungsserum oder Serum von Kaninchen, die mit nativem Polysaccharid GBS Typ II oder ungekoppeltem TT geimpft worden waren, bewirkten keine verbesserte In-vitro- Abtötung von GBS (Tabelle 4). Impfstoff-induzierte Kaninchen- Antikörper verbesserten die Abtötung von zwei klinischen GBS- Isolaten vom Typ II (Stämme S16 und S20) durch Leukozyten aus dem menschlichen Blut um ≥ 1,8 log&sub1;&sub0; im Vergleich zu Kaninchen-Vorimmunisierungsserum (Tabelle 5). Kaninchenserum zu Impfstoff vom Typ II-TT wurde als Serotyp-spezifisch bestimmt, da es die In-vitro-Abtötung von heterologen (Typ Ia und Typ III) GBS-Stämmen nicht verbesserte (Tabelle 5). TABELLE 4. Opsonophagozytische In-vitro-Abtötung von GBS, Typ II, Stamm 18RS21 durch auf natives Polysaccharid vom Typ II, Impfstoff II-TT oder TT erhöhtes Kaninchen-Antiserum
  • a Reaktionsgemisch enthielt zu testendes Serum (bei einer abschließenden Assay-Konzentration von 1%), GBSabsorbiertes Humanserum vom Typ II als Komplement-Quelle, Leukozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf und GBS Typ II 18RS21. Die Werte sind Mittelwerte aus der Doppelbestimmung.
  • b Kaninchenserum, entnommen im Anschluß an die Primär-Dosis des nativen Polysaccharids vom Typ II im vollständigen Freundschen Adjuvans. TABELLE 5. Opsonophagozytische In-vitro-Abtötung von GBS-Stämmen durch Vorimmunisierung und auf II-TT- Impfstoff erhöhtes Kaninchen-Immunserum
  • a CFU (log&sub1;&sub0;) bei 60 min - CFU (log&sub1;&sub0;) bei 0 min. Das Reaktionsgemisch enthielt das zu testende Serum, GBSabsorbiertes Humanserum vom Typ II als Komplement-Quelle, Leukozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf und GBS Typ II 18RS21. Die Werte sind Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. NA: nicht ausgeführt.
  • Protein A-Affinitäts-gereinigtes IgG und IgM wurde aus auf Impfstoff II-TT erhöhtem, vereinigtem Serum hergestellt (28). Die Spezifität jeder Ig-Fraktion wurde mittels ELISA mit klassenspezifischem Sekundär-Antikörper bestätigt. Die A&sub4;&sub0;&sub5;S- Werte der IgM- und IgG-Fraktionen (Verdünnung 1 : 100) waren 0,384 bzw. 0,009 bei u-Ketten-spezifischem Konjugat und 0,086 bzw. 2,367 bei Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (γ- und Leicht- Ketten-spezifisch). Isoliertes IgM und IgG wurde auf seine Eignung zur Verbesserung der opsonischen Abtötung von GBS vom Typ II durch Leukozyten aus dem menschlichen Blut getestet. Auf Impfstoff vom Typ II-TT erhöhte, unfraktionierte Seren in einer Verdünnung von 1 : 100 und eine äquivalente Verdünnung von 1 : 100 der IgG-Fraktion aus den gleichen Seren verbesserten die Abtötung von GBS Typ II um 1,65 ± 0,22 bzw. 0,95 ± 0,09 log&sub1;&sub0;. Im Gegensatz dazu wurden GBS vom Typ II nicht abgetötet, sondern wuchsen in Anwesenheit eines Vorimmunisierungsserums (-0,39 ± 0,13 log&sub1;&sub0;) und einer IgM-angereicherten Fraktion auf Impfstoff vom Typ II-TT (-0,28 ± 0,09 log&sub1;&sub0;) erhöhtem Serum beim opsonophagozytischen Assay.
  • Die Fähigkeit von durch GBS-Impfstoff vom Typ V-TT induzierte Kaninchen-Antiseren zur Förderung der Abtötung eines GBS- Stamms vom Typ V (CJB 111) durch Leukozyten aus dem menschlichen Blut wurde ebenfalls mit dem opsonophagozytischen Invitro-Assay bestimmt (8). Wie in Fig. 6 dargestellt, bewirkten GBS-Antiseren vom Typ V-TT bei einer Konzentration von 10 % eine wirksame Optimierung von GBS, Typ V, Stamm CJB 111 im Vergleich zu den Kontrollproben. Die Bedingungen der Kontrollreaktionen waren: Komplement (10%) ohne Antiseren; Antiserum (10%) ohne Komplement; Antiserum (1%) und Komplement.
  • Maus-Schutz-Assay. Um die In-vivo-Schutzwirkung von Impfstoff-induzierten Antikörpern zu testen, wurden Mäuse 24 Stunden vor einer Bestätigung mit GBS vom Typ II, 18RS21 passiv mit vereinigten II-TT-Impfstoff-Seren (Tag 70) immunisiert. Zuvor wurde die Bestätigungsdosis bei 90 bis 100% der getesteten Mäuse als letal bestimmt. Vollen Schutz (100%) erhielten Gruppen von Mäusen, die auf GBS-Impfstoff II-TT erhöhtes Serum erhielten, während von fünf Mäusen, die vor der Impfung Serum erhielten, nur eine überlebte (Tabelle 6). Unter den Mäusen, die Serum von Kaninchen erhielten, welche entweder mit ungekoppeltem Polysaccharid vom Typ II oder ungekoppeltem TT geimpft worden waren, gab es keine überlebenden Tiere (Tabelle 6). TABELLE 6. Passiver Schutz von Swiss-Webster-Outbred- Mäusen gegen GBS vom Typ II, Stamm 18RS21 mit Seren von Kaninchen, die mit nativem Polysaccharid vom Typ II, Impfstoff II-TT oder TTa geimpft wurden
  • a Mäuse erhielten eine 90%ig letale Dosis (1,5 · 10&sup5; CFU je Maus) GBS.
  • b Es wurden Serumproben von drei Kaninchen vereinigt.
  • c Die Überlebensrate wurde 72 h nach Bestätigung bestimmt.
  • d P = 0,0037 im Vergleich zu den Vorimmunisierungswerten (Tag 0)
  • Die bei Polysaccharid GBS Typ III angewandte Kopplungsstrategie, die zuerst für Meningokokken-Polysaccharid entwickelt wurde (18), kann auf alle GBS-Kapselpolysaccharid-Antigene anwendbar sein, da diese alle Sialinsäure enthalten. Anders als bei den übrigen GBS-Polysacchariden, die Sialinsäure als endständiges Saccharid von Di- oder Trisaccharid-Seitenketten aufweisen, besitzt das Polysaccharid GBS Typ II jedoch eine Wiederholungseinheit, die Sialinsäure als einzigen Zucker auf einer der beiden Monosaccharid-Seitenketten aufweist (9, 20). Beim Aufbau des konjugierten GBS-Impfstoffs vom Typ II oxidierten wir 7% Sialinsäurereste an Polysaccharid vom Typ II und verwendeten diese als Orte für die Kopplung des Polysaccharids an TT. Gereinigter II-TT-Impfstoff eluierte im Hohlraumvolumen einer Superose 6®-Säule (mit einem Molekulargewicht von > 10&sup6; kompatibel) und bestand aus 68% (Gew./Gew.) Kohlenhydrat und 32% (Gew.-/ Gew.) Protein.
  • Der mit Adjuvans emulgierte Impfstoff vom Typ II-TT war bei Kaninchen immunogen, im Gegensatz zu ungekoppeltem nativem Polysaccharid vom Typ II, welches keinen Typ II- Polysaccharid-spezifischen Antikörper auslöste. Zwei von drei immunisierten Kaninchen zeigten 3 Wochen nach Verabreichung einer Einzeldosis des II-TT-Impfstoffs eine starke Reaktion. Ein optimaler, typenspezifischer Antikörper wurde bei allen drei Kaninchen 3 Wochen nach Verabreichung einer Wiederholungsdosis II-TT-Impfstoff erreicht. Weitere Anstiege im Typ II-spezifischen Antikörpertiter wurden nach der dritten Dosis von II-TT-Impfstoff nicht beobachtet. Die Resultate von Invitro- und In-vivo-Versuchen zeigten, daß auf II-TT-Impfstoff erhöhte Antikörper funktionell gegen GBS vom Typ II aktiv waren. Serum von jedem von drei mit II-TT-Impfstoff geimpften Kaninchen verbesserte die In-vitro-Abtötung von GBS, Typ II, durch Leukozyten aus dem menschlichen peripheren Blutkreislauf und versahen Outbred-Mäuse mit vollem Schutz (100%) gegen eine letale GBS-Dosis vom Typ II. II-TT-Impfstoff- Antiserum war gegen homologe GBS-Stämme (18RS21, S16 und S20), nicht jedoch die getesteten heterologen GBS-Serotypen (Typ 1a und III) opsonisch aktiv.
  • Während natives Polysaccharid vom Typ II die Bindung von II- TT-Impfstoff-Antiseren an mit Polysaccharid vom Typ II beschichtete ELISA-Quellen hemmte, wurde mit desialyliertem Polysaccharid vom Typ II eine Inhibition von < 40% erzielt, selbst wenn es bei einer Konzentration von 200 ug/ml zum Einsatz kam. Dieses Resultat legt den Gedanken nahe, daß eine wichtige antigene Determinante des Polysaccharids vom Typ II von der Anwesenheit von Sialinsäureresten abhängig ist. Dieses Resultat erhärtete diejenigen Resultate, die mit auf ganze Organismen vom Typ II erhöhten Kaninchen-Antiseren erzielt wurden (21). ELISA-Inhibitionsversuche unter Verwendung von &beta;-O-Methylgalaktopyranose als Inhibitor zeigten jedoch, daß auf II-TT-Impfstoff erhöhte Kaninchen-Antiseren keine galaktosespezifischen Antikörper enthielten. Eine Inhibition der Bindung von II-TT-Impfstoff-Antiserum an natives Polysaccharid vom Typ II wurde sogar mit &beta;-O- Methylgalaktopyranose bei einer Konzentration von 10 mg/ml nicht erzielt. Daher scheint die Seitenketten-Galaktose kein immunodominantes Epitop des Polysaccharids vom Typ II zu sein, wenn das Polysaccharid an TT gekoppelt ist. Diese Resultate stehen im Widerspruch zu immunochemischen Studien, die mit auf ganze GBS-Organismen erhöhten Kaninchenseren (12, 21) durchgeführt wurden, bei denen die Galaktose-Seitenkette zusammen mit einem Sialinsäure-abhängigen Epitop des Polysaccharids vom Typ II einer von zwei immunodominanten Orten zu sein schien. Bei früheren Untersuchungen (12, 21) verwendete ganze GBS-Zellen vom Typ II, die nicht unter pH-Wertkontrollierten Bedingungen kultiviert wurden, können Polysaccharide aufweisen, denen es in gewissem Umfang an Sialinsäure mangelt. Unter diesen Umständen könnte Seitenketten-Galaktose das antigene Hauptepitop sein. Die zur Synthetisierung des II-TT-Impfstoffs verwendete Quelle von Polysaccharid vom Typ II war eine GBS-Kultur vom Typ II, die auf einem pH-Wert von 7.0 gehalten wurde; eine abschließende Analyse bestätigte, daß Sialinsäure -20% (Gew./Gew.) des Polysaccharids ausmachte. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, daß die Konformation des Polysaccharids durch Kopplung von Polysaccharid vom Typ II an TT verändert wurde, so daß das Galaktose-Epitop für eine Erkennung durch das Wirtsimmunsystem nicht mehr zur Verfügung stand. Obgleich dem durch II-TT-Impfstoff induzierten Kaninchen-Antiserum galaktosespezifische Antikörper fehlten, war es in vitro und in vivo gegen GBS-Organismen vom Typ II voll funktionsfähig. Weder durch die chemische Modifizierung einiger Sialinsäurereste noch durch die anschließende Bindung von TT an diese Orte wurden kritische antigene Epitope verändert, die benötigt werden, um einen funktionellen Typ II-spezifischen Antikörper auszulösen. Die Tatsache, daß gereinigtes IgG aus auf II-TT-Impfstoff erhöhten Kaninchenseren die In-vitro-Abtötung von GBS vom Typ II durch menschliche Leukozyten verbesserte, legt den Gedanken nahe, daß nicht nur die Immunogenität von Polysaccharid vom Typ II durch dessen Konjugation zu TT erhöht, sondern daß auch funktionelle IgG-Antikörper ausgelöst wurden.
  • Das GBS-Kapselpolysaccharid vom Typ V besitzt die Struktur einer Wiederholungseinheit, bestehend aus einer Trisaccharid- Hauptkette mit zwei verschiedenen Seitenketten an benachbarten Zuckerresten (Quellenangabe 35; Fig. 4). Bei einem der konjugierten GBS-Impfstoff-Präparate vom Typ V-TT wurden 25% der Sialinsäurereste an der längeren Seitenkette (d. h. 3 Zuckerreste) im Polysaccharid vom Typ V oxidiert. Die oxidierten Sialinsäurereste wurden als Orte für die Kopplung des Polysaccharids vom Typ V an TT benutzt. Der gereinigte Impfstoff vom Typ V-TT bestand aus 38% (Gew. /Gew.) TT und 62% (Gew./Gew.) Kohlenhydrat. Für den mit Alaun gemischten V-TT- Impfstoff wurde bei Kaninchen Immunogenität nachgewiesen. Nach der ersten Dosis und der Wiederholungsdosis des Impfstoffs vom Typ V-TT wurde eine starke Reaktion beobachtet. Die zweite Wiederholungsdosis ergab auch eine weitere Erhöhung im IgG-Titer des Polysaccharids vom Typ V. Die Serospezifität der durch Typ V-TT induzierten Assays wurde durch kompetitive ELISAs nachgewiesen. Gegen den V-TT-Impfstoff gezogenes Kaninchen-Antiserum ist funktionell aktiv, wie dies aus der Fähigkeit hervorgeht, GBS vom Typ V in vitro in Anwesenheit menschlicher weißer Blutkörperchen und von Komplement abzutöten.
  • Wie III-TT-Impfstoff, zeigte der II-TT-Impfstoff bei Kaninchen eine verbesserte Immunogenität im Vergleich zu aktivem Polysaccharid und löste bei Kaninchen trotz Unterschieden in der Polysaccharidstruktur, der Position der Sialinsäure am Polysaccharid, mit dem TT verknüpft war, und der Impfstoff- Zusammensetzung opsonisch aktives IgG aus. Der V-TT-Impfstoff erwies sich bei Kaninchen auch als immunogen und war in der Lage, Antikörper funktionell in vivo auszulösen. Wir erwarten, daß GBS-POlysaccharid-Protein-Konjugate dieses Aufbaus schließlich Komponenten eines polyvalenten GBS-Impfstoffs bilden werden, der Schutz gegen die am häufigsten mit einer Erkrankung von Menschen in Verbindung gebrachten GBS- Serotypen bietet.
  • Außerdem erwarten wir, daß aus den erfindungsgemäßen konjugierten Molekülen Impfstoffe hergestellt werden können, indem die konjugierten Moleküle einem pharmazeutisch verwendbaren Träger zugesetzt werden. Die Quervernetzung in den erfindungsgemäßen antigenen Molekülen wird bevorzugt in einem Umfang kontrolliert, der ausreicht, um Impfstoffe herzustellen, die durch ein 0,2-Mikron-Filter filtersterilisiert werden können. Solche Impfstoffe sind vorzugsweise löslich. Die Immunisierung kann dadurch erfolgen, daß dem Empfänger- Säugetier einmal der Impfstoff injiziert wird, gefolgt von wiederholungsinjektionen nach Bedarf. Eine ausreichende Dosis des zu verabreichenden Impfstoffs kann von der Menge des vorhanden Polysaccharids ausgehen: Verabreicht werden kann die Polysaccharid-Komponente des konjugierten Impfstoffs in einem Mengenbereich von 3-80 ug.
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  • Während bisher eine Anzahl erfindungsgemäße Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, daß die Grundkonstruktionen zu anderen Ausführungsformen abgeändert werden können, die auf den erfindungsgemäßen Verfahren basieren. Man wird daher verstehen, daß der Anwendungsbereich dieser Erfindung durch die hier beigefügten Ansprüche und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen definiert wird, die weiter oben als Beispiele genannt wurden.

Claims (39)

1. Antigenes konjugiertes Molekül, das aus dem Kapselpolysaccharid, das aus der aus einem Streptococcus der Gruppe B von Bakterien vom Typ II oder Typ V hergeleiteten Gruppe ausgewählt ist, und aus einer Proteinkomponente besteht, wobei zwei oder mehr in Sialinsäureresten der Polysaccharidkomponente endende Seitenketten jeweils über eine sekundäre Aminbindung mit einem Protein verknüpft sind, und wobei das Molekulargewicht des Polysaccharids mindestens 5000 Dalton beträgt.
2. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem zwischen 5 und 50% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zur Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung stehen.
3. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 2, bei dem zwischen 5 und 25% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zur Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung stehen.
4. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 3, bei dem zwischen 5 und 10% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zur Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung stehen.
5. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 4, bei dem das Polysaccharid GBS Typ II ist, und bei dem 7% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zur Verknüpfung mit einem Protein zur Verfügung stehen.
6. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem das antigene konjugierte Molekül durch ein 0,2 um-Filter filtersterilisiert werden kann.
7. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem die Polysaccharidkomponente ein Molekulargewicht zwischen 5.000 und 1.000.000 Dalton hat.
8. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem die Polysaccharidkomponente ein Molekulargewicht zwischen 50.000 und 500.000 Dalton hat.
9. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem das Polysaccharid GBS Typ V ist, und bei dem etwa 25% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids mit einem Protein verknüpft sind.
10. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 8, bei dem die Polysaccharidkomponente ein Molekulargewicht zwischen 100.000 und 300.000 Dalton hat.
11. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 10, bei dem die Polysaccharidkomponente ein Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton hat.
12. Konjugiertes Molekül nach Anspruch 1, bei dem das Protein aus der aus Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid und CRM (kreuzreaktives Material) 197 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
13. Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Moleküls aus einem Kapselpolysaccharid von Streptococcus der Gruppe B aus Bakterien vom Typ II oder Typ V und einem Protein, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) das Kapselpolysaccharid von Streptococcus der Gruppe B vom Typ II oder Typ V einer Periodatoxidation unterziehen, die ausreicht, um eine Aldehydgruppe in zwei oder mehr, mit der Hauptkette des Polysaccharids verknüpfte endständige Sialinsäurereste einzuführen;
(b) das oxidierte Kapselpolysaccharid von Streptococcus der Gruppe B vom Typ II oder Typ V durch reduktive Aminierung mit einem Protein koppeln, um eine sekundäre Aminbindung zwischen dem Kapselpolysaccharid und dem Protein zu erzeugen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem zwischen 5 und 50% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zu Aldehydgruppen oxidiert werden, die sich an ein Protein koppeln können.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem zwischen 5 und 25% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zu Aldehydgruppen oxidiert werden, die sich an ein Protein koppeln können.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem zwischen 5 und 10% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zu Aldehydgruppen oxidiert werden, die sich an ein Protein koppeln können.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Polysaccharid GBS Typ II ist, und bei dem 7% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids zu Aldehydgruppen oxidiert werden, die sich an ein Protein koppeln können.
18. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem zwischen 5 und 50% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden sind.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem zwischen 5 und 25% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden sind.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem zwischen 5 und 10% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden sind.
21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Polysaccharid GBS Typ II ist, und bei dem 5% der Sialinsäurereste jedes Polysaccharids kovalent an ein Protein gebunden sind.
22. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Polysaccharid GBS Typ V ist, und bei dem etwa 25% der endständigen Sialinsäurereste jedes Polysaccharids an ein Protein gebunden sind.
23. Konjugiertes Molekül, das nach dem Verfahren von Anspruch 13 hergestellt wurde.
24. Impfstoff mit dem konjugierten Molekül nach Anspruch 1.
25. Polyvalenter Impfstoff mit dem konjugierten Molekül nach Anspruch 1 und mit wenigstens einem weiteren immunogenen Molekül, das die Produktion von Antikörpern gegen eine andere pathogene Substanz als Streptococcus der Gruppe B vom Typ II auslösen kann.
26. Polyvalenter Impfstoff nach Anspruch 25, bei dem die weiteren immunogenen Moleküle die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene, die aus der aus Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III, IV und V, Haemophilus influenzae Typ b und E. coli Typ K1 bestehenden Gruppe ausgewählt sind, auslösen können.
27. Polyvalenter Impfstoff nach Anspruch 26, bei dem die weiteren immunogenen Moleküle die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene, die aus der aus Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III, Haemophilus influenzae Typ b und E. coli Typ K1 bestehenden Gruppe ausgewählt sind, auslösen können.
28. Polyvalenter Impfstoff nach Anspruch 27, bei dem die weiteren immunogenen Moleküle die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene, die aus der aus Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III und E. coli Typ K1 bestehenden Gruppe ausgewählt sind, auslösen können.
29. Polyvalenter Impfstoff nach Anspruch 28, bei dem die weiteren immunogenen Moleküle die Produktion von Antikörpern gegen Pathogene, die aus der aus Streptococcus der Gruppe B vom Typ Ia, Ib, III bestehenden Gruppe ausgewählt sind, auslösen können.
30. Verwendung des konjugierten Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Neugeborenen durch Verabreichen des Impfstoffs in einer immunogenen Menge an eine weibliche Person, um Antikörper zu produzieren, die in einer Menge, die ausreicht, um bei dem Neugeborenen bei der Geburt einen Schutz vor Infektion zu erzeugen, in einen vor oder nach Verabreichung des Impfstoffs gezeugten Fötus gelangen können.
31. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 30, bei dem der Impfstoff vor der Schwangerschaft verabreicht wird.
32. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 30, bei dem der Impfstoff einer weiblichen Person im Alter zwischen etwa 10 und 50 Jahren verabreicht wird.
33. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 30, bei dem der Impfstoff während der Schwangerschaft verabreicht wird.
34. Verwendung des konjugierten Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Menschen, indem der Impfstoff in einer immunogenen Menge an Menschen verabreicht wird.
35. Verwendung des konjugierten Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Erwachsenen durch Verabreichen des Impfstoffs in einer immunogenen Menge an eine Person, die Gefahr läuft, durch einen Streptococcus der Gruppe B vom Typ II oder Typ V infiziert zu werden.
36. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 35, wobei der Impfstoff an eine Person verabreicht wird, deren Immunsystem geschwächt ist.
37. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 36, wobei die Immunsuppression auf Krankheiten zurückzuführen ist, die aus der aus Krebs oder Diabetes bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
38. Verwendung des konjugierten Moleküls nach Anspruch 37, wobei der Impfstoff in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger verabreicht wird.
39. Verwendung des konjugierten Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Milchkuhherden gegen Rindermastitis, indem der Impfstoff in einer immunogenen Menge an Milchkühe verabreicht wird.
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