DE69518978T2

DE69518978T2 - Gruppe a streptokokkenpolysaccharide immunogen-zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69518978T2
Application number: DE69518978T
Authority: DE
Inventors: S. Blake; Francis Michon; Y. Tai; B. Zabriskie
Original assignee: Rockefeller University; North American Vaccine Inc
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2015-04-21
Also published as: DE69518978D1; CN1149835A; PT754055E; AU709797B2; GR3034916T3; NO321321B1; NO964413D0; AU2296795A; WO1995028960A1; NO964413L; EP0754055A1; FI118514B; CA2188284C; PL181037B1; ES2151597T3; DK0754055T3; JPH09512276A; FI964189A0; FI964189A; US5866135A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet neuer immunogener Zusammensetzungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Immunisierung von warmblütigen Tieren einschließlich Menschen gegen durch Gruppe A-Streptokokken verursachte Infektionen und Krankheiten.

Hintergrund der Erfindung

Wie durch die Infektionsrate pro Altersgruppe gezeigt wird, ist die Gruppe A-Streptokokkenkrankheit eine Kinderkrankheit (1-3). Sehr ähnlich wie andere Krankheiten in dieser Kategorie wie z. B. Meningokokkenkrankheit (4) und Haemophilus Meningitis (5), Diphtherie (6) und andere (7, 8), treten die meisten dieser Fälle bei Kleinkindern auf und die Infektionsrate sinkt mit dem Alter. Daher ist das Vorkommen von Gruppe A-Streptokokkeninfektionen ab einem Alter von 18 Jahren relativ gering (1-3). Dies deutet darauf hin, dass über die Zeit, wie auch bei anderen Kinderkrankheiten gefunden, eine Art natürliche Immunität gegen diese Gruppe von Organismen auftreten kann. In über mehrere Jahrzehnte andauernden Experimenten zeigten Lancefield und Kollegen (9-11), dass die große Mehrheit der Menschen infizierenden hämolytischen Streptokokken aus der Gruppe A stammen. Diese Unterscheidung beruhte auf serologischen Reaktionen gegen Kohlenhydrate von Gruppe A-Streptokokken. Spätere Studien berichteten, dass die immunodominante Determinante N-Acetylglukosamin (12, 13) war. Mithilfe von Maus-Schutz-Tests und Precipitin-Assays wurden diese Gruppe A-Streptokokken weiter unterteilt in Serotypen basierend auf der Gegenwart von antigenunterschiedlichen M-Proteinen, die auf der Oberfläche der Organismen vorhanden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die gegen den spezifischen M-Serotyp gerichteten Antikörper im Maus-Modell Schutz gegen die Infektion bieten (14). Im Menschen ist die Genesung von einer Gruppe A-Streptokokkeninfektion oft mit einer lang andauernden Immunität verbunden, die typspezifisch gegen den infizierenden Organismus ist (11). In beiden Fällen jedoch ist der Schutz M-Serotyp-spezifisch und erstreckt sich nicht auf den Schutz gegen andere Serotypen. Außerdem war in einer Vielzahl von Studien gezeigt wor den, dass das menschliche Serum kaum spezifische Antikörper gegen multiple M-Protein- Serotypen enthält (11, 15). Diese klassischen Experimente sowohl im Menschen als auch in Versuchstieren wiesen dem M-Protein eine bedeutende Rolle in der Virulenz von Gruppe A- Streptokokken zu und bildeten die Grundlage für eine Anzahl von nicht erfolgreichen Versuchen, Streptokokkenimpfstoffe zu entwickeln, die schützende Antikörper hervorrufen würden, entweder gegen den aminoterminalen Bereich des M-Proteins, in dem sich die serotypischen spezifischen Reste befinden, oder in jüngerer Zeit gegen die gemeinsamen C- Repeat-Regionen des Moleküls (16).
Im Hinblick auf die Altersabhängigkeit der Gruppe A-Infektionen, die auf eine Erhöhung der natürlichen Immunität gegen diese Gruppe von Bakterien hinweist, bleibt jedoch die Frage, ob dies herrührt von einem langsamen Anstieg an Antikörpern, die gegen allgemeinere Regionen des M-Proteins gerichtet sind, oder ob andere Oberflächenantigene, denen weniger Aufmerksamkeit geschenkt wurde, eine Rolle bei diesem natürlich erworbenen nichtserotypischen spezifischen Schutz spielen können. Die Hyaluronsäurekapsel z. B. spielt eine wichtige Rolle bei der Virulenz von Gruppe C-Infektionen bei Meerschweinchen (17), und Anti-Hyaluronat-Antikörper wurden in Tieren (18, 34) und Menschen (19) nachgewiesen. Es wurde berichtet, dass Hyaluronsäure aus Gruppe A-Streptokokken in mit Formaldehyd behandelten, eingekapselten Gruppe A-Streptokokken oder an Liposomen gebundene Gruppe A-Streptokokken (18) bei immunisierten Kaninchen immunogen ist. Die Verwendung von Liposomen in Impfstoffen war ebenso berichtet worden (31). Die Injektion von Mucopeptidfraktionen aus der Streptokokkenzellwand ruft einen kurzzeitigen Schutz bei Versuchstieren hervor (20), ihre Rolle beim Menschen bleibt jedoch unbekannt.
Das gruppenspezifische Kohlenhydrat besteht aus einem Poly-Rhamnose-Rückgrat an das, im Fall von Gruppe A, ein N-Acetylglukosamin an die nicht reduzierende terminale Position gebunden ist (Fig. 1a). Varianten der Gruppe A-Streptokokken wurden beschrieben und charakterisiert (12, 13). In diesen Streptokokken ist das Poly-Rhamnose-Rückgrat vorhanden, jedoch nicht mit N-Acetylglukosamin verbunden (Fig. 1b). In frühen Experimenten wurden Kaninchen mit ganzen Gruppe A-Streptokokken, die kein M-Protein besaßen, infiziert. Dies zeigte, dass präzipitierende Antikörper gegen die Kohlenhydrate der Gruppe A hervorgerufen wurden. In passiven Maus-Schutz-Studien (14) waren diese Antikörper jedoch nicht passiv schützend gegen eine Belastungsinfektion mit M-Protein positiven Gruppe A-Streptokokken. Außerdem waren verschiedene frühere Versuche, ähnliche präzipitierende Antikörper im Menschen zu zeigen, nicht erfolgreich. Dies deutet darauf hin, dass präzipitierende Kohlenhydratantikörper keine signifikante Rolle beim Schutz gegen Streptokokkeninfektionen spielen.
Da jedoch die meisten älteren Methoden zum Nachweis eines Anstiegs von Antikörpern von der Fähigkeit dieser Antikörper, durch Zugabe eines Antigens präzipitiert werden zu können, abhängen, blieben viele Antikörper unentdeckt, die zwar mit einem spezifischen Antigen reagierten, jedoch in solchen Assays nicht präzipitierten. Reaktive Antikörper gegen die Hyaluronsäurekapsel der Gruppe A-Streptokokken geben ein gutes Beispiel. In Studien zur Beseitigung dieses Problems wurden in Berichten von 1965 an (21, 22) sowohl direkte als auch indirekte Agglutinationstechniken zum Nachweis der Antikörper verwendet. Direkte Agglutination wies präzipitierende Antikörper nach, während die indirekte Agglutination sowohl präzipitierende als auch nicht-präzipitierende Antikörper messen würde. Von Interesse war die Feststellung von Karakawa et al. (22), dass die direkt agglutinierenden Antikörper, d. h. die präzipitierenden Antikörper in diesen humanen Seren in erster Linie gegen Kohlenhydrate der Gruppe A-Varianten, dem Poly-Rhamnose-Rückgrat, gerichtet waren. Die indirekten Agglutinationstechniken, die gegen die nicht-präzipitierenden Antikörper gerichtet waren, wiesen einen hohen Antikörpertiter gegen die N-Acetylglucosamindeterminante nach.
Nachfolgende Studien von Zimmerman et al. (23), in denen menschliches Serum von einer Vielzahl von Streptokokkeninfektionen verwendet wurde, zeigten, dass das Vorkommen dieser nicht-präzipitierenden Antikörper variiert von 30% in einer Population, die sorgfältig verfolgt und gegen Streptokokkeninfektionen behandelt wurde, bis zu 84% in einer Population, die kürzlich mit Gruppe A-Streptokokken infiziert wurde. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Antikörpertiter gegen die Gruppe A-Kohlenhydrate ihr Maximum bei einem Alter von 17 Jahren haben und dass es keinen Unterschied im Antikörpertiter gegen dieses Kohlenhydrat gibt bei Rheumatikern mit und ohne Herzkrankheiten. Diese Ergebnisse unterschieden sich von den von Dudding und Ayoub berichteten, in denen Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörper bei rheumatischen Herzkrankheitpatienten dauerhaft erhöht waren im Vergleich zu solchen ohne Klappenfehler (24).
Die Frage, ob diese Antikörper eine Rolle beim Schutz spielen oder nicht, war schwierig zu beantworten. Beim klassischen Opsonophagozytose-Assay von Lancefiled wurde ausgewähltes, ganzes menschliches Blut (15, 25, 26) verwendet, dem hyperimmunes Kaninchenserum mit bekanntem M-Protein serotyp-spezifischen Antikörpern zugegeben wurde. Die Auswahl des ganzen menschlichen Blutes war auf zwei Tatsachen gestützt; (1) es enthielt keine M-Protein reaktiven Antikörper und/oder (2) es würde die Phagozytose von Streptokokken in Abwesenheit von serotypischem spezifischem Kaninchenantiserum nicht fördern. Der Frage, ob das normale menschliche Serum an sich die Phagozytose verstärken könnte, wurde nie richtig nachgegangen.
Reimer et al. (Reimer, K.B. et al., Carbohydrate Res. 232 (1992), 131-142) beziehen sich auf synthetische lineare und verzweigte Trisaccharide und verzweigte Pentasaccharide als Haptene, die die verschiedenen Epitope der Gruppe A-Streptokokken-Zellwand-Polysaccharide repräsentieren, um polyklonale und monoklonale Antikörper zu charakterisieren. Es wurde berichtet, dass Antikörper gegen das verzweigte Pentasaccharid-Antigen Kreuzreaktivität mit dem bakteriellen Antigen zeigten, wohingegen Antikörper gegen die anderen Oligosaccharide nicht kreuzreaktiv waren. Die Glykokonjugate werden als geeignete, besser zugängliche Quelle von definiertem Antigen vorgeschlagen, das in einer Vielzahl von diagnostischen Formaten verwendet werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt eine immunogene Zusammensetzung zum Schutz von Säugern gegen die Infektion durch Gruppe A-Streptokokken zur Verfügung. Die immunogene Zusammensetzung umfasst eine immunogene Menge von Gruppe A-Streptokokken-Polysaccharid (GASP), das die folgende Struktur hat:
wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose oder D-GlcpNAc ist und n eine Zahl mit einem Wert von etwa 3 bis etwa 30 ist, um eine Immunantwort gegen die β-D-GlcpNAc- Reste, die glykosidisch an die Position 3 der Rhamnose und einem Träger gebunden sind, zur Verfügung zu stellen. Diese Region des GASP definiert ein Epitop, das die Bildung bakterizider Antikörper hervorruft.
Die GASP der vorliegenden immunogenen Zusammensetzung können in Form von freien Polysacchariden oder als Teil eines Konjugats, in dem das GASP kovalent an ein Phospholipid gebunden ist, das in der Lage ist, ein Liposom zu bilden oder an ein Protein gebunden, vorliegen. Native oder rekombinante bakterielle Proteine wie Tetanustoxoid, Choleratoxin, Diphterietoxoid oder CRM&sub1;&sub9;&sub7; sind Beispiele für geeignete Proteine, die als Konjugate geeignet sind. In einer anderen Ausführungsform ist ein immunogenes Protein in das Liposom inkorporiert, das GASP kovalent an Phospholipid gebunden enthält.
Die immunogene Zusammensetzung eignet sich auch als Impfstoff und kann weiterhin ein Adjuvans umfassen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Monophosphoryllipid A, QS21 oder Stearyltyrosin. Die erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung kann aktiven und passiven Schutz gegen die Infektion durch Gruppe A-Streptokokken hervorrufen. Für den passiven Schutz werden immunogene Antikörper produziert durch Immunisierung eines Säugers mit einem Impfstoff, der aus der erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzung hergestellt ist und der anschließenden Isolierung der immunogenen Antikörper aus dem Säuger.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Säugers gegen Infektion durch Gruppe A-Streptokokken durch Verabreichung einer immunogenen Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung umfassend kovalente Bindung von GASP an Liposomen; Lösung der Liposomen in einem geeigneten Puffer zum Löslichmachen hydrophober Proteine; Vereinigung der gelösten Liposomen mit im Puffer gelöstem Protein unter Bildung eines Komplexes von Liposomen und Protein. Der Protein/Liposomenkomplex wird dann vom Puffer abgetrennt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, immunogene Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die geeignet sind, Antikörper hervorzurufen, welche Anwendung für prophylaktische und diagnostische Zwecke finden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Immunisierung eines Säugers gegen Gruppe A-Streptokokken durch Verabreichung einer immunogenen Menge von GASP.
Ein anderer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur kovalenten Bindung von GASP an ein Protein zur Bildung eines immunogenen Konjugats. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Konjugat die allgemeine Formel:
wobei R' das Produkt von Reduktion und Oxidation des terminalen reduzierenden Zuckers ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der immunogenen Zusammensetzungen zur Bereitstellung von Schutz gegen Infektion durch Gruppe A-Streptokokken in den Bevölkerungsgruppen, die das höchste Risiko haben, sich Gruppe A-Streptokokkeninfektionen und Krankheit zuzuziehen, namentlich Erwachsene, schwangere Frauen und insbesondere Kinder und Kleinkinder.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt schematisch den strukturellen Aufbau von Gruppe A-Kohlenhydrat (Fig. 1A) und vom varianten Gruppe A-Kohlenhydrat (Fig. 1B). Die Darstellung der dreidimensionalen Struktur des Gruppe A-Kohlenhydrats unterstützt deutlich die Beobachtung, dass die serologische Spezifität des Kohlenhydrats gegen die N-Acetylglucosaminreste des Kohlenhydrats gerichtet ist.
Fig. 2 stellt die ELISA-Titer-Bestimmungen von Gruppe A-Streptokokken Kohlenhydrat-Antikörpern in normalen Kindern im Alter von 5 und 10 Jahren aus Trinidad und New York graphisch dar. Die Messungen waren Endpunktbestimmungen von 1,0 OD bei 405 nm.
Fig. 3 stellt die Inhibitions-ELISA-Studien mit humanen Seren, von denen bekannt war, dass sie Antikörper gegen die Gruppe A-Liposomen besitzen, graphisch dar. Die Seren wurden entsprechend verdünnt, um einen Wert von 1,0 OD Einheiten bei 405 nm zu geben, mit verschiedenen Konzentrationen von verschiedenen Antigenen für eine Stunde bei 37ºC gemischt und fünf Minuten bei 10.000 upm zentrifugiert. Die Überstände wurden auf Reaktivität im ELISA-Assay wie in Beispiel 3 beschrieben getestet. Die Werte stellen den Mittelwert der getesteten Seren dar.
Fig. 4 stellt den indirekten bakteriziden Assay dar. Verwendet wurde gewaschenes menschliches Blut, dem verschiedene Seren zu RPMI und Komplement enthaltenden Gefäßen zugegeben wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das ursprüngliche Inokulum war neun CFU der Gruppe A Typ 6 Streptokokken. Bild A zeigt das Wachstum der Organismen in den rotierten Gefäßen, das normales Kaninchenserum enthält. Bild B zeigt das Wachstum in stationären Gefäßen mit humanem Serum, das einen hohen ELISA-Titer gegen die Gruppe A-Kohlenhydrate hat. Bild C zeigt die Hemmung des Wachstums mit demselben humanen Serum wie in Bild B, jedoch in einem rotierenden Gefäß.
Fig. 5 zeigt die indirekten bakteriziden Assays wie in Fig. 4 beschrieben. Die Organismen waren ein Serotyp 3 (Stamm D58/11/3), ein Serotyp 6 (Stamm 543), ein Serotyp 14 (Stamm S23/101/5) und ein Serotyp 28 (Stamm T28/isoA/5). Die linke Achse zeigt die Zahl der koloniebildenden Einheiten im rotierenden Gefäß gegen das stationäre Gefäß. Die rechte Achse zeigt die Tötungsrate der Organismen in Prozent im rotierenden Gefäß gegen das stationäre Gefäß.
Fig. 6 zeigt den Effekt von Heparin auf die indirekten bakteriziden Assays. Der indirekte bakterizide Assay wurde wie beschrieben zweifach ausgeführt. Heparin (5 Einheiten/ml) wurde zu einem Set von stationären und rotierenden Gefäßen gegeben, während das andere Set von Gefäßen als normale Bakterizidassaykontrolle diente. Die Standardmenge an Heparin, die in den bakteriziden Assays verwendet wurde, richtet sich nach der von Lancefield beschriebenen Menge und ist 10 Einheiten/ml (33-35). Es ist ersichtlich, dass Heparin bei der Hälfte der normal beschriebenen Konzentration die Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat- Antikörper abhängige Tötungsrate drastisch reduziert.
Fig. 7 zeigt bakterizide Assays der Anti-Gruppe A-Assay-Kohlenhydrat-Titer, wie im ELISA- Assay gemessen. 17 individuelle menschliche Seren wurden in beiden Assays unter Verwendung des Serotyp 6 Organismus getestet. Es ist zu beachten, dass alle Seren (13/13), die einen CHO-Titer von größer als 200.000 zeigen, eine Tötungsrate von mehr als 80% im Assay zeigen. Im Gegensatz dazu vermittelt lediglich eines von vier Seren mit Titern weniger als 200.000 Opsonophagozytose des Organismus und der Grad der Phagozytose war deutlich geringer als der bei Seren mit hohen Titern.
Fig. 8 zeigt graphisch opsonophagozytische, bakterizide Assays wie in Beispiel 1 beschrieben. Phagozytose des Organismus ist in Prozent der Tötungsrate des Organismus im Vergleich zu stationären Kontrollen aufgezeigt. Die Balken zeigen die Tötungsrate in Prozent an vor Adsorption an die N-Acetylglukosaminaffinitätssäule, nach Adsorption an die Affinitätssäule und die Tötungsrate in Prozent durch die von der Säule eluierten Antikörper. Zu beachten ist die komplette Abwesenheit der Tötungsrate bei allen Seren nach Adsorption an die N-Acetylglukosaminaffinitätssäule und die partielle Wiedergewinnung der opsonophagozytischen bakteriziden Aktivität nach Elution der Antikörper von der Affinitätssäule. Der Standardfehler ist in jedem Fall gezeigt, außer im Fall von absorbiertem Serum, wo überhaupt keine Tötungsrate auftrat.
Fig. 9 zeigt graphisch den opsonophagozytischen Index von Kaninchenserum, von dem bekannt ist, dass es hohe Titer an Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörper nach der Immunisierung mit Gruppe A-Streptokokken-Kohlenhydrat besitzt. Die Phagozytose der Organismen ist in Prozent der Tötungsrate der Organismen im Vergleich zu stationären Kontrollen angezeigt. Es ist zu beachten, dass bei Organismen mit Titern von < 50.000 keine Phagozytose auftritt, bei Organismen mit Titern von 75.000 eine graduelle Steigerung der Tötungsrate auftritt, und bei Organismen mit Titern über 100.000 komplette Phagozytose auftritt. Der für diese Studien verwendete Organismus war der Gruppe A-Stamm Typ 6 und das Inokulum waren 4 Kolonien bildende Einheiten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In Anbetracht der bekannten serologischen Daten zum Nachweis von Kohlenhydrat-Antikörpern in menschlichen Seren in Verbindung mit der altersbedingten Induktion des Schutzes durch andere Kohlenhydrat-Antigene, namentlich Pneumokokken (27), Meningokokken (4) und Haemophilus Polysaccharide (5), entschieden wir uns, verschiedene menschliche Seren auf die Anwesenheit von Kohlenhydrat-Antikörpern sowohl bei normalen Populationen als auch bei solchen mit Streptokokkeninfektion erneut zu untersuchen. Patienten mit Folgeerscheinungen von Streptokokkeninfektionen waren ebenfalls in diese Studien mit eingeschlossen. Gereinigtes Gruppe A-Kohlenhydrat wurde kovalent an synthetisches Phosphatylethanolamin gebunden, in Liposomen inkorporiert und in einem ELISA basierten Assay verwendet. Die Erfindung zeigt, dass Antikörper gegen das Gruppe A-Kohlenhydrat-Antigen in humanen Seren gut nachgewiesen werden können. Außerdem ist die Menge dieser Antikörper in Abhängigkeit der geographischen Population und der Exposition gegen Streptokokkenkrankheit abhängig vom Alter. Es zeigte sich ebenso ein Anstieg des Antikörpertiters gegen das Gruppe A-Kohlenhydrat infolge einer bekannten Streptokokkeninfektion. Um die Frage zu beantworten, ob diese Antikörper oder ein Teil dieser Antikörper, die reaktiv gegen das Gruppe A-Kohlenhydrat sind, Opsonophagozytose hervorrufen können oder nicht, verwendeten wir einen modifizierten Lancefield bakteriziden Assay. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Antikörper opsonisch sind und die Epitope, gegen die diese opsonischen Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörper gerichtet sind, nicht reduzierende terminale N-Acetylglucosaminreste sind.
Die Erfindung stellt sowohl eine immunogene Zusammensetzung als auch ein Verfahren zur Immunisierung zum Schutz in Säugern, vorzugsweise Menschen, gegen Infektionen durch Gruppe A-Streptokokken zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen immunogenen Konjugate werden gebildet durch kovalente Bindung von Gruppe A-Streptokokkus-Polysaccharid (GASP) an ein geeignetes Protein oder Liposomen bildendes Phospholipid.
Die Isolierung und Kultivierung von Gruppe A-Streptokokken und die Präparation von Gruppe A-Polysaccharid erfolgte nach McCarty (28) und Dubois et al. (31). Das isolierte GASP hat die folgende allgemeine Formel:
wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose oder D-GlcpNAc ist und n eine Anzahl von Wiederholungseinheiten von etwa 3 bis etwa 30 mit einer optimalen Anzahl von etwa 20. Der hier verwendete Begriff Polysaccharid bedeutet jedes Polymer aus Sacchariden einschließlich Saccharide, Oligosaccharide, etc. Kulturen von Varianten der Gruppe A-Streptokokken, welche die vorstehend beschriebenen Polysaccharidstrukturen produzieren, sind in der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt. GASP sollte groß genug sein, um eine Immunantwort in Individuen hervorzurufen. Vorzugsweise ist das mittlere Molekulargewicht etwa 10 Kilodalton. Eine Wiederholungseinheit des GASP hat ein Molekulargewicht von etwa 500 Dalton.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das GASP kovalent an Protein gebunden, um ein Konjugat zu bilden. Solche Konjugate konvertieren die Immunantwort gegen das Polysaccharid bevorzugt von einer T-zellunabhängigen in eine T-zellabhängige. Folglich ist jedes Protein oder Fragment davon als Konjugat für GASP geeignet, das vom Individuum toleriert wird und fähig ist, eine T-zellabhängige Antwort hervorzurufen. Im wesentlichen kann jedes Protein als konjugierendes Protein dienen. Genauer muss das gewählte Protein zur Verwendung bei der Konjugation mit dem Gruppe A-Polysaccharid mindestens eine freie Aminogruppe besitzen. Vorzugsweise ist das Protein ein natives oder rekombinantes bakterielles Protein und ist selbst ein Immunogen, das eine T-zellabhängige Antwort sowohl bei jungen als auch erwachsenen Säugern hervorruft. Beispiele für solche Proteine umfassen unter anderem Tetanustoxoid, Choleratoxin, Diphterietoxoid und CRM&sub1;&sub9;&sub7;. Andere Kandidaten für konjugierende Proteine umfassen Toxine oder Toxoide von Pseudomonaden, Staphylokokken, Streptokokken, Pertussis und enterotoxigenen Bakterien einschließlich Escherichia coli.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße konjugierte Molekül einen Proteinkern, an den das GASP durch eine modifizierte Form des terminal reduzierenden Zuckers gebunden ist. Solche konjugierten Moleküle würden daher monofunktionalisierte GASP gebundene Proteine umfassen. Vorzugsweise ist eine Mehrzahl von GASP, insbesondere zwischen etwa 1 und 12 GASP, an jedes Protein gebunden. Insbesondere sind mindestens etwa 5 GASP an jedes Protein gebunden.
In einer anderen Ausführungsform sind die GASP an das Protein über zwei oder mehr Stellen an jedem GASP gebunden. Da das bakterizide Epitop an den Ästen der GASP-Wiederholungseinheiten zu sein scheint, sollte die Funktionalisierung des GASP und die Bindung an das Protein in einer Weise herbeigeführt werden, in der eine immunogene Menge von bakteriziden Epitopen erhalten wird.
Die Proteine, an die das GASP konjugiert sind, können native Toxine oder ein detoxifiziertes Toxin (d. h. Toxoid) sein. Ebenso können nicht-toxische mutierte Formen von Proteintoxinen verwendet werden. Vorzugsweise behalten solche Mutationen die Epitope des nativen Toxins bei. Solche mutierten Toxine wurden als "cross reacting materials" oder CRMs bezeichnet. CRM&sub1;&sub9;&sub7;, welches einen einzelnen Aminosäureaustausch im aktiven Diphterietoxin besitzt und immunologisch nicht davon unterscheidbar ist, ist eine Komponente von einem Haemophilus influenzae Konjugatimpfstoff, der häufig bei Kleinkindern verwendet wird.
Eine Kultur des Corynebacterium diphteria Stamms C7 (β197), welcher das CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Protein produziert, ist in der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt (accession number ATCC 53281).
Zur Konjugation mit GASP können ebenso Proteinfragmente verwendet werden, sofern sie lange genug sind, d. h. vorzugsweise mindestens 10 Aminosäuren lang, um ein T-Zellepitop zu definieren.
Eine Vielzahl von Verfahren zur Konjugation können verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Gruppe A-Polysaccharid-Proteinkonjugate zu bilden. Vorzugsweise wird ein Verfahren verwendet, bei dem die Immunogenizität des bakteriziden Epitops, das in den glykosidisch an die Position 3 der Rhamnose gebunden β-D-GlcpNAc-Ästen liegt, erhalten wird.
Bindet ein einzelnes GASP zwei oder mehr Proteinmoleküle, ist das daraus resultierende Konjugat quervernetzt hinsichtlich des Proteins. Der Grad der Vernetzung und die Gesamtgröße des konjugierten Moleküls kann durch allgemein bekannte Veränderungen der Bedingungen, die bei der Konjugationsreaktion verwendet werden, reguliert werden. Solche Veränderungen umfassen z. B. die Konjugationsreaktionsrate und das Verhältnis von Proteinen und GASP in der Reaktionsmischung.
Verschiedene chemische Verfahren zur Konjugation von Polysacchariden an Proteine sind bekannt und wurden beschrieben. Beispielsweise ist in der US-PS 4 644 059 ein Konjugat beschrieben, welches unter Verwendung von Adipinsäuredihydrazid (ADH) als homodifunktioneller Linker hergestellt wurde. In der US-PS 4 695 624 sind Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden und Konjugaten unter Verwendung von bigenerischen Spacern beschrieben. Einen Überblick über verschiedene Verfahren zur Herstellung und Faktoren, die beim Design von Konjugaten verwendet werden, gibt Dick, William E. und Michel Beurret, Contrib. Microbiol. Immunol. (1989), Vol. 10, Seiten 48-114. Das bevorzugte Verfahren zur Konjugation der erfindungsgemäßen GASP-Proteinkonjugate ist die reduktive Aminierung gemäß US-PS 4 356 170. Kurz gesagt, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der terminale reduzierende Zucker des GASP mit einem milden Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumborhydrid oder seine Äquivalente unter Ringöffnung reduziert.
Im nächsten Schritt werden mit Natriummetaperiodat oder seinen Äquivalenten die benachbarten terminalen Hydroxylgruppen der zuvor reduzierten Zuckerreste zu terminalen Aldehydgruppen selektiv oxidiert. Dies bildet ein aktiviertes GASP, welches nun in der Lage ist, kovalent an den gewählten Proteinträger zu binden. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das aktivierte GASP auch an ein Phospholipid wie Phosphatidylethanolamin in Form von Liposomen kovalent gebunden werden. Das aktivierte GASP hat folgende allgemeine Formel:
wobei R' das Produkt der Reduktion und Oxidation der terminal reduzierenden Zuckerreste ist, mit Ausnahme des Teils des terminal reduzierenden Zuckerrestes, der den Aldehydrest bildet (CHO). Etwa 10 mg Polysaccharid wird vorzugsweise mit etwa 1 ml etwa 20 mM Natriummetaperiodatlösung für etwa 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur oxidiert. Die Reaktionszeit kann verändert werden, um bei Verwendung anderer Mengen an Periodat gleiche Oxidation zu erhalten. Die Reduktion und das Öffnen der terminal reduzierenden Zuckerreste macht die benachbarten Hydroxylgruppen der reduzierenden Zuckerreste wesentlich reaktiver als die an den glykosidisch gebundenen β-D-GlcpNAc-Ästen. Zusätzliche Verbindungsstellen können jedoch ebenso durch die Oxidation von einigen der glykosidisch gebundenen β-D-GlcpNAc-Äste entstehen. Die aktivierten GASP und die gewählten konjugierenden Proteine werden dann in Gegenwart von Cyanoborhydrid-Ionen oder anderen Reduktionsmitteln durch Kupplung der Aminogruppen des Trägerproteins an die terminalen Aldehydgruppen des GASP konjugiert. Die Gruppe A-Polysaccharide und das Protein werden dabei durch den in der Formel II beschriebenen -CH&sub2;-NH-Proteinlinker verbunden.
Die bei der reduktiven Aminierung entstandenen GASP-Proteinkonjugate sind vorzugsweise begrenzt kreuzvernetzt und sind vorzugsweise in wässrigen Lösungen löslich. Dies macht aus den erfindungsgemäßen GASP-Proteinkonjugaten bevorzugte Kandidaten zur Verwendung als Impfstoff.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die GASP in Liposomen eingebettet und bilden eine immunogene Zusammensetzung. Liposomen werden oft in Konjugaten verwendet, da sie die Fähigkeit haben, einen "capping"-Effekt bei den B-Lymphozyten zu induzieren. Es wird angenommen, dass die GASP-Liposomenkonjugate die Antikörpertiter erhöhen, indem sie, obwohl sie theoretisch nicht binden, die B-Zell-Lymphozyten überziehen ("capping") und dabei aktivieren. Das "capping"-Phänomen ist in der Zellbiologie wohl bekannt. Kurz gesagt, können Liposomen aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften von Antigen umgeben werden, wobei multivalente immunogene Strukturen entstehen. Da die Rezeptormoleküle in der Zellmembran der Liposomen mobil sind, können viele dieser Rezeptoren durch divafente Reagenzien kreuzvernetzt werden und bilden so zweidimensionale Präzipitationen oder "Patches". Diese Patches werden verschmelzen oder sich an den polaren Enden der B-Zell-Lymphozyten sammeln und so eine Kappe auf der Zellmembran der Lymphozyten bilden. Geschieht dieser Vorgang des Antigen-cappings von B-Zell-Lympho zyten in der Gegenwart von Effektor-T-Helferzellen, wird dadurch die Antikörperproduktion von den B-Zell-Lymphozyten aktiviert.
Verschiedene Verfahren zur Konjugation von Polysacchariden an Liposomen sind bekannt und wurden beschrieben. Beispielsweise ist in US-PS 5 283 185 der Transfer von Nukleinsäuren in Zellen durch Herstellung einer vermischten Lipiddispersion aus einem kationischen Lipid und einem Co-Lipid und anschließender Einführung der Nukleinsäuren in die Dispersion, wodurch ein Komplex gebildet wird, beschrieben. Die Zellen werden anschließend mit diesem Komplex behandelt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Liposomen durch Dispersion eines Lipids in einer wässrigen Lösung hergestellt, entweder indem sie durch eine feine Nadel injiziert werden oder vorzugsweise durch Ultraschall gemäß Fillit, H.M., Milan Blake, Christa McDonald und Maclyn McCarty (1988), Immunogenicity of liposome-bound hyaluronate in mice, J. Exp. Med. 168: 971-982.
Zur Herstellung von Liposomen, die kovalent an die GASP-Komponente gebundenes Phospholipid enthalten, werden die Liposomen nach bekannten Verfahren hergestellt. Zum Beispiel wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform Phosphatidylethanolamin in einem Lösungsmittel wie Chloroform gelöst und in ein Gefäß gegeben. Das Chloroformlösungsmittel wird entfernt und dabei das Gefäß mit Phosphatidylethanolamin beschichtet ("coating"). Ein wäßriger Puffer wie Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wird dem Gefäß zugegeben und die Mischung wird mit Ultraschall behandelt, um Liposomen zu bilden. GASP, welches vorzugsweise durch Reduktion und nachfolgende Oxidation aktiviert worden war, wird den Liposomen in äquimolaren Mengen zugegeben und die beiden Komponenten werden über Nacht in Gegenwart eines geeigneten Puffers wie Kochsalzlösung, Ringers Lösung oder vorzugsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) über Nacht gemischt. Anschließend wird der Mischung Natriumcyanoborhydrid zugegeben, um stabile kovalente Bindung zwischen dem Phosphatidylethanolamin und dem GASP-Polysaccharid zu bilden. Das in der allgemeinen Formel III gezeigte Endprodukt kann vom Natriumcyanoborhydrid durch Zentrifugation, Molekularsiebohromatographie oder Dialyse abgetrennt werden.
R' und n in der Formel III sind wie vorstehend beschrieben und R² ist Phosphatidylethanolamin.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die GASP-Liposomen mit Protein kombiniert, um hydrophobes Protein in die Liposomen zu inkorporieren. Entsprechend einer Ausführungsform werden die GASP-Liposomen in einer 5%igen Lösung von β-Octylglukosid gelöst. Das den Liposomen zuzugebende Protein ist ebenso in 5%iger β-Octylglukosidlösung gelöst, und das Protein und die Liposomen werden vereinigt. Nach Mischen zur Inkorporation des Proteins in das Liposom wird das β-Octylglukosid durch Dialyse entfernt. Der daraus resultierende GASP-Liposomen-Proteinkomplex kann dann als ein Immunogen oder Impfstoff verwendet werden.
GASP kann auch an Phospholipide gebunden werden, wobei weniger bevorzugte Techniken verwendet werden, wie die Verwendung von Benzoquinon nach Fillit, H.M., M. McCarty und M. S. Blake (1986) und die Induktion von Antikörpern gegen Hyaluronsäure durch Immunisierung von Kaninchen mit enkapsulierten Streptokokken. J. Exp. Med. 164: 762-776. Die Verwendung solcher Reagenzien kann jedoch nicht wünschenswert sein, wenn die Zusammensetzung als Impfstoff verwendet werden soll.
Die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen können als Mittel zum Hervorrufen von Antikörpern verwendet werden, was geeignet ist für prophylaktische und diagnostische Zwecke. Diagnostik ist insbesondere beim Verfolgen und Nachweis verschiedener Infektionen und Krankheiten, die durch Gruppe A-Streptokokken verursacht sind, geeignet.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die immunogenen Zusammensetzungen als Immunogen sowohl bei aktivem als auch passivem immunogenen Schutz bei den Individuen verwendet, die ein hohes Risiko tragen, mit Gruppe A-Streptokokkeninfektionen oder Krankheit in Kontakt zu treten. Die für passiven Schutz verwendeten immunogenen Antikörper werden durch Immunisierung eines Säugers mit einer beliebigen erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen und anschließender Rückgewinnung der bakteriziden Antikörper in einer Gammaglobulinfraktion oder als Serum oder als spezifische Antikörper von dem Säuger, hergestellt. Wie hierin verwendet, sind die erfindungsgemäßen Impfstoffe in der Lage, Antikörper hervorzurufen, die Schutz gegen Infektion mit Gruppe A-Streptokokken vermitteln.
Weiterhin kann das Gruppe A-Polysaccharid selbst als ein immunisierendes Agens verwendet werden, vorzugsweise assoziiert mit einem Adjuvans wie Aluminiumhydroxid, Alumini umphosphat, Monophosphoryllipid A, QS21 oder Stearyltyrosin. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der immunogenen Zusammensetzungen als immunogenen Schutz gegen Gruppe A-Streptokokkeninfektionen. Die Erfindung stellt insbesondere Schutz für die Populationen zur Verfügung, die das höchste Risiko haben, mit Gruppe A-Streptokokkeninfektionen und Krankheiten in Berührung zu kommen, namentlich Erwachsene, schwangere Frauen und insbesondere Kleinkinder und Kinder.
Die erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung und Impfstoffe werden typischerweise gebildet durch Dispersion des GASP oder Konjugats in einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder andere injizierbare Flüssigkeiten. Der Impfstoff wird parenteral angewendet, z. B. subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär. Außerdem können gebräuchliche Zusätze in Impfstoffen vorhanden sein, z. B. Stabilisatoren wie Lactose oder Sorbitol und Adjuvanzien wie Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxyd, Aluminiumsulfat, Monophosphoryllipid A, QS21 oder Stearyltyrosin.
Die Dosis der immunogenen Zusammensetzungen wird die sein, die immunogeneffektive Ergebnisse hervorruft. Die Dosierung wird normalerweise innerhalb des Rahmens von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht sein. Eine Serie von Dosen kann zum Erreichen optimaler Immunität gegeben werden. Dosierungseinheiten des Impfstoffes können mit Mengen von GASP oder Konjugat entsprechend von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug zur Verfügung gestellt werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden, nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Die Verfahren zur Züchtung, Präparation und Assay der Gruppe A-Streptokokken Kohlenhydrat-Antikörper und deren Verwendung als neuer Impfstoff bei Erwachsenen und Kindern ist wie folgt erläutert:

Kultivierung von Gruppe A-Streptokokken

Eine -70ºC Stammkultur von Gruppe A-Streptokokken wurde auf eine Mediumplatte mit 3 g/l Todd Hewitt Broth und 3 g/l Hefeextrakt (GAS-Medium) ausgestrichen. Die Platte wurde bei 37ºC 48 Stunden inkubiert. Danach wurden Kolonien (8-9) in eine 200 ml GAS-Medium- Schüttelflasche überführt und 18 Stunden bei 37ºC und 120 Umdrehungen pro Minute (upm) kultiviert. Die Vorkultur (150 ml) wurde in einen 15 l-Fermenter (New Brunswick, BioFlo 4) mit Todd Hewitt Broth überführt. Die Kultur wurde für sieben bis acht Stunden bei pH 7,0 und 37ºC kultiviert. Nachdem die Kultur die stationäre Phase erreicht hatte (optische Dichte bei 600 nm etwa 1,5), wurde Glukose auf 3 g/l, zugegeben. Die Kultur wurde für weitere acht Stunden kultiviert und dann geerntet. Die endgültige optische Dichte ist etwa 2,7 bei 600 nm.

Präparation des Gruppe A-Streptokokken-Polysaccharids

60 Gramm von Gruppe A-Streptokokkenzellen in 600 ml Wasser wurden mit 75 ml einer 4 N Natriumnitritlösung und 75 ml Eisessig versetzt. Die Lösung wurde 15 Minuten gemischt und 10 Minuten bei 11.000 upm in einem SS34-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das Gruppe A-Polysaccharid wurde aus dem rohen, lyophilisierten Extrakt durch Gelfiltration über eine Sephadex G-50-Säule (Pharmacia) gereinigt, wobei PBS als Elutionsmittel verwendet wurde. Die von der Säule eluierten Fraktionen wurden mit Hilfe des Phenolschwefelsäureassays von Dubois (31) auf die Anwesenheit von Kohlenhydrat überprüft. Die kohlenhydratpositiven Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser bei 4ºC dialysiert und lyophilisiert. Die Polysaccharidpräparation (240 mg) enthielt weniger als 1% (w/w) Proteine und Nukleinsäuren. Ihre Reinheit wurde weiter durch ¹H-NMR bei 500 MHz mittels eines AM-500 BRUKER-Spektrometers bestätigt.

Präparation der Liposomen:

Gruppe A-Streptokokken-Kohlenhydrat wurde nach den vorstehend beschriebenen Methoden nach McCarty (28) isoliert. Das lyophilisierte Material wurde resuspendiert, auf 10 mg/ml eingestellt und nach Fillit et al. (18) (wobei Streptokokken-Hyaluronat verwendet wurde) mittels Benzochinon kovalent an die Liposomen gebunden. Kurz gesagt, wurde das GASP mit Benzoquinon unter Bildung eines aktivierten Zwischenprodukts umgesetzt. Dieses Zwischenprodukt wird dann weiter mit Phosphatidylethanolamin in Form eines Liposoms unter Bildung des immunogenen GASP-Liposomen-Konjugats umgesetzt.

ELISA-Assays:

Das ELISA-Verfahren war im wesentlichen das von Fillit et al. (18) beschriebene mit folgenden Modifikationen. Vorversuche mit menschlichen Seren zeigten, dass 0,5 ug CHO/ml in PBS, pH 7,2, der liposomalen Präparation zum Empfindlichmachen der Mikrotiterplatten die besten Ergebnisse mit minimalem Hintergrundrauschen gegen die liposomalen Kontrollpräparationen geben. Entsprechend wurden 100 ul der Präparation pro Well in die Mikrotiterplatten (Dynatech plates, USA) gegeben und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden anschließend dreimal in ELISA-Waschpuffer gewaschen (10 mM NaAcetat, 100 mM NaCl, 0,1% Brij 35, pH 8,0). Die menschlichen Seren wurden im selben ELISA-Puffer verdünnt, 100 ul der gegebenen Serumverdünnungen in Platten überführt und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Alle Seren wurden Doppelbestimmungen unterzogen. Nach entsprechendem Waschen wurde eine 1 : 1.000 Verdünnung von Ziegen F(ab')2 antihumanem IgG- (gammakettenspezifisch) oder IgM- (Mu kettenspezifisch) alkalischen Phosphatase-Konjugat (Tago, Inc., USA) als sekundärer Antikörper verwendet und für eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach drei zusätzlichen Waschritten in ELISA-Puffern wurde ein Phosphatasesubstrat (Sigma 104) in 0,1 M Diethanolamin, pH 9,6 zu den Wells gegeben und die Platten eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Danach wurden die Platten mit dem Elida V (Physica Co.) Gerät bei 405 nm gemessen. Der Titer wurde angegeben als die Verdünnung, die einen Wert von 1,0 ergab.

Bakterizide Assays:

Der von Lancefield beschriebe (15, 25, 26) indirekte bakterzide Assay wurde wie folgt durchgeführt. Organismen der verschiedenen Stämme wurden 18 Stunden bei 37ºC in Todd Hewitt Broth kultiviert. Eine Probe der Übernachtkultur wurde zuerst 1 : 2 in frischem Todd Hewitt Broth verdünnt und weitere zwei Stunden bei 37ºC kultiviert. Die Suspension wurde 1 : 100 verdünnt und danach eine Doppelverdünnungsreihe angefertigt, um 5-15 Kolonien in 50 ul Todd Hewitt Broth zu erreichen. Heparinisiertes Blut wurde als Quelle für menschliche Phagozyten verwendet. Zur Vermeidung der Gegenwart von autologem Plasma in der phagozytischen Suspension wurde das Blut bei 2000 upm 10 Minuten zentrifugiert, das Plasma entfernt, das Pellet dreimal in PBS (pH 7,2) gewaschen und schließlich mit RPMI (Gibco- BRL, Co., Rockville, MD) im gleichen Volumen wie die ursprüngliche Blutprobe hatte, resuspendiert. Komplement für das Assay-System wurde frisch aus einem normalen Donor isoliert, von dem bekannt war, dass er geringe Mengen an Anti-Kohlenhydrat-Antikörpem enthielt, und der wiederholt mit Gruppe A- Streptokokken bei 0ºC absorbiert und in Aliquots bei -70ºC gelagert wurde (29). Vor der Verwendung wurde die Komplementquelle sowohl auf Komplementaktivität als auch die Abwesenheit von Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörpern untersucht. Der bakterizide Assay wurde in zweifacher Ausführung in verschlossenen Gefäßen durchgeführt. Der Reaktionsansatz war wie folgt: 300 ul humane Phagozyten in RPMI suspendiert, 100 ul humanes Komplement, 200 ul des zu testenden Serums und 50 ul der verdünnten Streptokokkenkultur. Wie im Lancefield-Assay wurde eines der zweifachen Gefäße für drei Stunden bei 37ºC kopfüber rotiert. Das zweite, als Kontrolle dienende Gefäß blieb stationär bei der selben Temperatur. Nach drei Stunden wurden 100 ul aus jedem Gefäß auf Blutagarplatten plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte gezählt. Die Opsonophagozytenaktivität wurde dann berechnet als der Prozentsatz der Streptokokkentötungsrate von einem speziellen Serum durch die folgende Formel: (1-cfu im rotierten Testserum / cfu in dem stationären Gefäß) · 100.

Adsorption von N-Acetylglukosamin-Antikörpern aus menschlichen Seren:

600 ul einer 50%igen Suspension von einem N-Acetylglukosamin gekoppelt an Sepharosekügelchen (Sigma Chemical Co.) in PBS wurden in ein steriles Eppendorf-Gefäß überführt und bei 4ºC 10 Minuten bei 14.000 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und 300 ul Serum wurde den Kügelchen zugegeben. Die Suspension wurde für eine Stunde bei 37ºC kopfüber rotiert. Nach einer zweiten Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wurde das adsorbierte Serum entfernt und im bakteriziden Assay wie vorstehend beschrieben verwendet. Um die N-Acetylglukos-Aminantikörper von der Affinitätssäule zu entfernen, wurden die Kügelchen, die die adsorbierten Antikörper enthielten, in eine 1 ml Tuberkulinspritze gepackt, über die eine Lösung aus 0,58% (v/v) Essigsäure in 0,15 M NaCl, pH 2,2 lief. Das Eluat wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht und die Peakfraktionen gesammelt, gegen PBS, pH 7,2, dialysiert und mit Hilfe eines Amicon Centriprep 30 Konzentrators (Amicon, Beverly, MA) auf das ursprüngliche Volumen des Serums konzentriert. Menschliche Seren:
Individuen, die diese Studie umfassen, stammten aus Trinidad, New York City und der Great Lakes Naval Training Station. Ihr Alter rangierte von 5 bis 20 Jahren. Das Blut wurde durch Venenpunktion erhalten und das Serum steril gesammelt. Alle Seren wurden, wie in Tabelle I gezeigt, nach Alter, Ursprung und Gesundheitszustand sortiert. TABELLE I Bevölkerungsverteilung

Bakterizide Assays:

Nachdem gezeigt worden war, dass menschliche Seren Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörper enthielten, und dass die Titer dieser Antikörper in Individuen variierten, stellte sich als nächstes die Frage, ob diese Antikörper Opsonophagozytose auch in einem in vitro-Assay-System hervorrufen würden. Der zum Testen von menschlichen Seren verwendete bakterizide Assay war im wesentlichen der von Dr. Lancefield (15, 25, 26) mit den vorstehend beschriebenen Modifikationen. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der phagozytischen Assays. Bei der Verwendung eines Inokulums von neun koloniebildenden Einheiten eines Serotyp 6 Gruppe A-Streptokokkenstammes gab es einen deutlichen Anstieg in der Kolonienzahl in den rotierten Gefäßen in Gegenwart von normalem Kaninchenserum (Fig. 4A). Fig. 4B zeigt eine leichte Erhöhung im stationären Gefäß, in dem menschliches Serum verwendet wurde. Im deutlichen Gegensatz dazu, stellten die Organismen im humanen Serum enthaltenden rotierenden Gefäß das Wachstum völlig ein (Fig. 4C) (vergleiche Fig. 4B und 4C).
Um sicher zu sein, dass die beobachtete Opsonophagozytose der Gruppe A-Streptokokken nicht auf einen Serotyp beschränkt war, wurden diese Experimente unter Verwendung von drei anderen Gruppe A-Stämmen mit verschiedenen M-Proteinserotypen wiederholt. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, wurden alle drei anderen Stämme in Gegenwart menschlicher Seren in ähnlicher Weise zu der beim Typ 6 Stamm beobachteten, phagozytiert. Die Tötungsrate variierte von 80 bis 100% beim Vergleich der rotierten gegen die stationären Gefäße. Die Serotyp 3, 14, 28 Stämme waren identisch mit den von Dr. Lancefield in den phagozytischen Assays verwendeten (15, 25, 26).

Verhältnis zwischen den Anti-CHO-Titern und der Opsonophagozytose durch menschliches Serum:

Bei der Verwendung des phagozytischen Assays ist es klar, dass sich menschliche Seren in ihrer Fähigkeit, Phagozytose von Gruppe A-Streptokokken hervorzurufen, unterscheiden. Im Allgemeinen korrelieren die phagozytischen Eigenschaften eines gegebenen Serums mit den Titern der Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörper. Wie in Fig. 6 gezeigt, zeigten alle Seren mit Titern größer als 200.000 eine Tötungsrate von mehr als 80%, während drei von den vier Seren mit Titern von weniger als 200.000 dies nicht zeigten. Ein Serum mit einem CHO-Titer von 40.000 rief Phagozytose hervor, die Tötungsrate war jedoch deutlich geringer als die bei hochgetiterten Anti-CHO-Seren beobachtete.

Studien der Phagozytose durch menschliche Seren in heparinisiertem Blut gegenüber heparinfreien Assays:

Aufgrund der bekannten Fähigkeit von Heparin, eine Vielzahl von Komponenten von Komplement zu binden und zu inaktivieren, und um unsere phagozytischen Assays mit den zuvor verwendeten zu korrelieren, wurden die opsonophagozytischen Fähigkeiten der vorstehend beschriebenen normalen menschlichen Seren in phagozytischen Assays in Gegenwart und Abwesenheit von Heparin getestet. Heparinisiertes, menschliches Blut wurde durch Venenpunktion isoliert, ausführlich wie vorstehend beschrieben in PBS gewaschen und in zwei Aliquots aufgeteilt. Ein Aliquot wurde im ursprünglichen Volumen mit RPMI resuspendiert und der opsonische Assay wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Das zweite Aliquot wurde in der gleichen Weise behandelt, jedoch fünf Einheiten pro ml Heparin zugegeben. Nachfolgend wurde der Assay in der gleichen Weise durchgeführt wie beim anderen Aliquot.
Die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass in Abwesenheit von Heparin durchschnittlich 94% Phagozytose der Gruppe A-Streptokokken durch menschliches Serum erfolgte. In Gegenwart von Heparin jedoch war das gleiche Serum nur in der Lage, durchschnittlich 12% Phagozytose des gleichen Inokulums zu erreichen.

Adsorptionsexperimente:

Um zu bestimmen, welcher Teil der Streptokokken-Kohlenhydratreste für die bakterizide Aktivität verantwortlich war, wurden humane Seren an mit N-Acetylglukosamin gekoppelten Sepharosekügelchen wie im Methodenteil beschrieben, adsorbiert. Adsorbierte und nicht-adsorbierte Seren wurden dann im Standardbakterizidassay verwendet. Fig. 7 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente. Das nicht-adsorbierte Serum verstärkte die Phagozytose der Streptokokken eindeutig. Demgegenüber entfernte das an N-Acetylglukosamin gekoppelten Kügelchen adsorbierte Serum die opsonisierenden Antikörper. Als Kontrolle zur Lebensfähigkeit verstärkte normales Kaninchenserum die Phagozytose nicht. Diese Experimente zeigten, dass die gegen die nicht-reduzierenden terminalen N-Acetylglukosamingruppen des Gruppe A-Kohlenhydrats gerichteten Antikörper extrem wichtig für die Opsonophagozytose von Gruppe A-Streptokokken in unseren Bakterizidassays waren. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Antikörper aus ausgewählten Seren, welche an eine N- Acetylglukosaminaffinitätssäule adsorbiert worden waren, eluiert und in den bakteriziden Assays verwendet. Wie in Fig. 9 gezeigt; zeigten diese Experimente, dass von der Affinitätssäule eluierte N-Acetylglukosamin-spezifische Antikörper fähig waren, die opsonophagozytische bakterizide Aktivität des Serums teilweise wieder herzustellen.
Bei der Verwendung von Verfahren, die entwickelt wurden, um sowohl präzipitierende als auch nicht-präzipitierende gegen die Gruppe A-Streptokokken-Kohlenhydrate reaktive Antikörper zu messen, wurde dieses Kohlenhydrat kovalent an Phosphatidylethanolamin gekoppelt und in ein Liposom inkorporiert, welches fähig war, an die Mikrotiterplatten zu binden. Dieses Verfahren zeigte deutlich, dass die Mehrheit der menschlichen Seren Antikörper gegen die Gruppe A-Streptokokken-Polysaccharide enthielten.
Überraschenderweise fanden wir, dass Kinder aus verschiedenen geographischen Gegenden deutliche Unterschiede in ihren Titern gegen das Gruppe A-Kohlenhydrat zeigten. Während die Kinder in Trinidad den Streptokokken mehr ausgesetzt sind (sowohl Impetigo als auch Pharyngitis) als in New York, sind die Streptokokkeninfektionen in New York genauso üblich. In diesem Zusammenhang fanden Zimmerman et al. (23) geringere Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörpertiter bei Patienten, die sorgfältig überwacht und gegen Gruppe A-Streptokokkeninfektionen behandelt wurden im Vergleich zu einer nicht kontrollierten Gruppe. Darüber hinaus sind Kohlenhydrat-Antigene generell T-zellunabhängig, und es ist daher vorstellbar, dass wiederholte Exposition gegen das Antigen erforderlich ist, um die Antikörperantwort hervorzurufen.
Die Studien mit Seren, die von Patienten während der akuten Phase und der Genesungsphase von Scharlachfieber erhalten wurden, legen nahe, dass die Antikörpertiter gegen die Gruppe A-Streptokokken-Kohlenhydrate bereits zu Beginn der Krankheit vorhanden waren, sich jedoch während der Genesungsphase verdoppelten. Bei der Untersuchung von ARF- Seren nach einer akuten Streptokokkeninfektion waren die Titer gegen die Gruppe A-Kohlenhydrate zur Zeit des Ausbruch des Scharlachfiebers geringer im Vergleich zu unkomplizierten Scharlachfieber-Seren, erhöhte sich jedoch beim Auftreten von ARF auf das Vierfache. Dies deutet vielleicht auf eine stärkere Immunantwort gegen das Antigen im Vergleich zu unkomplizierten Scharlachfieber-Patienten hin. Die Antikörpertiter gegen die Gruppe A- Kohlenhydrate waren signifikant geringer als die bei Scharlachfieber-Patienten, die kein ARF entwickelten. Inhibitionsstudien mit Gruppe A und Varianten von Gruppe A-Kohlenhydrat zeigen deutlich, dass die Mehrheit dieser Antikörper gegen die Gruppe A-spezifischen nicht reduzierenden terminalen N-Acetylglukosaminreste an der Kohlenhydratgruppe und nicht gegen das Rhamnoserückgrat gerichtet sind.
Die Frage, ob diese Kohlenhydrat-Antikörper Opsonophagozytose der Gruppe A- Streptokokken hervorrufen, wurde mit ja beantwortet. Der Grad der Opsonisierung korrelierte gut mit der Menge an Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern. ELISA-Titer von weniger als 100.000 waren generell ineffektiv, während die Mehrheit der Seren mit Titern größer als 200.000 Phagozytose hervorriefen. Eine wichtige Beobachtung war die Tatsache, dass diese Opsonophagozytose nicht auf einen Serotyp von Gruppe A-Streptokokken beschränkt war, da mindestens drei andere Stämme mit verschiedenen Serotypen ebenso phagozytiert wurden. Die Wichtigkeit der Rolle der N-Acetylglukosamin-reaktiven Antikörper bei der Opsonisierung wurde bestätigt durch die Tatsache, dass die Adsorption dieser Antikörper aus menschlichen Seren die bakterizide Aktivität der Seren komplett vernichtete und dass, wenn diese Antikörper eluiert und zurück in den bakteriziden Assay gegeben wurden, die Tötungsfähigkeit wieder hergestellt wurde.
Verschiedene Beobachtungen, die die Kinetik des bakteriziden Assays mit menschlichen Seren betreffen, sind bemerkenswert. Erstens waren nur kleine Inokula von Streptokokken im bakteriziden Assay effektiv, während größere Inokula die Fähigkeit der menschlichen Seren, die Organismen zu opsonisieren, oft überwältigten. Zweitens funktionierte die bakterizide Aktivität in erster Linie mit unverdünnten Seren in einer Weise ähnlich der von Dr. Lancefield in ihren Studien von menschlichen Seren und typspezifischen Antikörpern beobachteten (15, 25, 26). Im Gegensatz dazu waren Tierseren, die mit einem vorgegebenen typspezifischen Protein immunisiert waren, sogar bei Verdünnungen von 1 : 20 oder mehr effektiv.

Beispiel 2

Vergleich von Gruppe A-Kohlenhydrat-reaktiven Antikörpertitern bei normalen Kindern:

Unsere ersten Anstrengungen waren darauf gerichtet, zu bestimmen, ob normale Kinder Antikörper gegen Gruppe A-Streptokokken-Kohlenhydrat entwickelten oder nicht, und ob der Titer dieser Antikörper vom Alter des Individuums und der geographischen Lage, in der das Individuum lebte, abhängt. Entsprechend wurden die Gruppe A-Kohlenhydrat-reaktiven Antikörpertiter mit dem in Material und Methoden beschriebenen ELISA-Assay in Seren gemessen, die von normalen fünf und zehn Jahre alten Kindern aus Trinidad stammten (hohe Exposition gegen Streptokokken) und verglichen mit den Seren von altersgleichen Kindern von New York (geringe Exposition gegen Streptokokken). Fig. 2 zeigt, dass im Alter von fünf Jahren 94% der Kinder aus Trinidad Antikörpertiter von weniger als 1 : 10.000 mit einem durchschnittlichen Antikörpertiter von 1 : 158.472 zeigten. Diese Antikörpertiter waren nicht signifikant verschieden von den von zehn Jahre alten Kindern getesteten Seren. Im Gegensatz dazu zeigten fünf Jahre alte Kinder aus New York signifikant niedrigere Titer mit einem Durchschnitt von 1 : 6.100, die im Alter von zehn Jahren auf 1 : 25.500 stiegen. Die Titer von Kindern aus New York in beiden Altersgruppen waren eindeutig geringer als die entspre chenden Titer von Kindern aus Trinidad. Dies wird gezeigt durch die Tatsache, dass 69% der New Yorker Kinder Titer von größer als 1 : 10.000 hatten.
Um zu bestimmen, ob die Immunantwort gegen Gruppe A-Kohlenhydrat entweder von der IgG-Klasse oder der IgM-Klasse ist, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Ausgewählte Seren, die hohe Titer gegen Gruppe A-Kohlenhydrate zeigten, wurden entsprechend verdünnt, so dass jedes Serum einen Wert von 1,0 bei 405 nm im ELISA-Assay ergab. Jedes Serum wurde dann entweder mit affinitätsgereinigtem menschlichem Anti-IgG alkalischen phosphatase-konjugiertem sekundärem Antikörper oder Anti-IgM alkalischen Phosphatase-konjugiertem sekundärem Antikörper getestet. Wie in Tabelle II zu sehen ist, war die Mehrheit der nachgewiesenen Antikörper gegen das Streptokokken-Kohlenhydrat der IgG Klasse und nur minimale Reaktionen wurden bei der IgM-Klasse beobachtet. TABELLE II ELISA-Bestimmungen der IgG- und IgM-Antikörpertiter gegen den Streptokokken-CHO-Liposomen-Komplex
Jedes Serum war entsprechend verdünnt, um einen optischen Dichtewert von 1,0 bei 405 nm im ELIDA V Reader zu ergeben.

Beispiel 3

Partialstrukturbestimmung von den Gruppe A-reaktiven Antikörpern:

Zimmerman et al. (23) hatten zuvor gezeigt, dass manche menschlichen Seren Antikörper enthielten, die reaktiv waren mit der Gruppe an Kohlenhydraten, die von Gruppe A varianten Streptokokken isoliert worden waren, und daher gegen den Polyrhamnoserückgratbereich des Gruppe A-Polysaccharidmoleküls gerichtet waren. Zur Bestimmung der Menge dieser Rhamnoserückgrat-reaktiven Antikörper im Vergleich zu den gegen die terminale N-Acetyl glukosamin Gruppe A-Determinante gerichteten Antikörper im individuellen Serum wurden Inhibitionsstudien mit normalen Seren durchgeführt, wobei gereinigte Kohlenhydrate sowohl der Gruppe A als auch Varianten der Gruppe A verwendet wurden. Wie zuvor wurde der Gruppe A-Kohlenhydrat-Liposomenkomplex verwendet, um die Mikrotiterplatten empfindlich zu machen. 100 ul des entsprechenden Serums wurden mit verschiedenen Konzentrationen an Kohlenhydrat vermischt und eine Stunde bei 37ºC im Wasserbad inkubiert. Die Mischung wurde dann fünf Minuten bei 10.000 upm zentrifugiert. Der Überstand reagierte im ELISA- Assay. Die Kontrollen beinhalteten das Serum mit physiologischer Kochsalzlösung gemischt. Wie in Fig. 3 gezeigt, war die Mehrheit der Anti-Gruppe A-kohlenhydratreaktiven Antikörper in normalen Seren gegen den Gruppe A-Kohlenhydratrest gerichtet, d. h. gegen die N- Acetylglukosamindeterminante. Etwas Inhibition wurde mit dem A varianten Kohlenhydrat beobachtet. Die Menge jedoch, die benötigt wurde, um das gleiche Maß an Inhibition zu erreichen, war 1000 bis 5000-fach höher als beim Gruppe A-Kohlenhydrat. Da das Gruppe A variante Kohlenhydrat mit etwa 4% N-Acetylglukosamin kontaminiert ist (im Vergleich zu 36 % beim Gruppe A-Kohlenhydrat) könnte ein Teil der nachgewiesenen Inhibition reaktiv mit dem verbleibenden N-Acetylglukosamin sein. Dies zeigte, dass der größte Anteil der Immunoreaktivität der Seren gegen die N-Acetylglukosaminreste gerichtet waren, was an dem Verlust der Gruppe A-Antikörperreaktivität im ELISA-Assay bei der Zugabe von gereinigtem N-Acetylglukosamin (Sigma) gesehen werden kann. Dies kann direkt verglichen werden mit dem Fehlen jeglicher Inhibition durch Zugabe des nahe verwandten Monosaccharids N-Acetylgalactosamin.

Beispiel 4

Vergleich der Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörpertiter bei ARF-Patienten gegenüber APSGN- Patienten:

Um zu bestimmen, ob sich die Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörpertiter bei Patienten mit gut dokumentierten Folgeerscheinungen einer Streptokokkeninfektion unterscheiden, wurden Serumproben von Patienten mit akutem rheumatischem Fieber (ARF) verglichen mit Seren von Patienten mit akuter Poststreptokokkenglomerulonephritis (APSGN). Alle Seren wurden von gut dokumentierten ARF und AGN-Patienten erhalten, die in Trinidad im Krankenhaus lagen, und die Seren wurden vor der Behandlung während der akuten Phase der Krankheit genommen. Tabelle III fasst die Ergebnisse zusammen. Es ist zu sehen, dass beim Ausbruch der Krankheit in Seren von APSGN-Patienten eine erhöhte Reaktivität gegen Gruppe A-Kohlenhydrate (< 50%) vorhanden ist im Vergleich zu ARF-Patienten. Im Vergleich zu normalen Kindern aus Trinidad gab es ebenso einen signifikanten Unterschied in den Titern zwischen diesen Patienten und den Titern von normalen Kindern aus Trinidad (vergleiche Fig. 2). TABELLE III Durchschnittliche Titer von Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern in Seren von Patienten mit APSGN, ARF und unkompliziertem Scharlachfieber

Beispiel 5

Bestimmung der Anti-Gruppe A-Kohlenhydrat-Antikörpertiter bei Patienten mit unkomplizierten Streptokokkeninfektionen im Vergleich zu Patienten mit ARF:

Unsere Sammlung von Great Lakes Seren wurde von Patienten erhalten, die sich alle das Scharlachfieber bei der Great Lakes Naval Training Station 1946 zugezogen haften. Ein Teil dieser Patienten entwickelte klassische ARF. Entsprechend wurden die Seren von diesen Patienten wie folgt gesammelt: 1) Während des akuten Ausbruchs von Scharlachfieber, 2) während der Genesungsphase von Scharlachfieber (4 Wochen später), 3) während dem Ausbruch von ARF (3 bis 4 Wochen) nach der akuten Streptokokkeninfektion. Tabelle III zeigt, dass bei einer kleinen Anzahl von Fällen die Reaktivität gegen die Gruppe A-Kohlenhydrate während der Genesungsphasen der Krankheit anstieg im Vergleich zum Ausbruch (definiert als die Zeit, in der sich das Scharlachfieber zeigte). Dieser Anstieg des Antikörpertiters gegen Gruppe A-Kohlenhydrate wurde sowohl in der Gruppe mit unkompliziertem Scharlachfieber beobachtet als auch bei den Patienten, die 4 Wochen nach dem Ausbruch von Scharlachfieber ARF entwickelten. Da die Anzahl von untersuchten Fällen gering ist, ist es von Interesse, dass die Titer gegen die Gruppe A-Kohlenhydrate bei ARF-Patienten sowohl beim Ausbruch des Scharlachfiebers als auch bei Ausbruch des rheumatischen Fiebers 4 Wochen später im Vergleich zu den Fällen mit unkompliziertem Scharlachfieber geringer waren.

Beispiel 6

Gruppe A-Polysaccharid-Proteinkoniugate

A. NaBH&sub4;-Reduktion der reduzierenden Enden von Gruppe A-Polysaccharid

Gereinigtes Gruppe A-Polysaccharid (GASP) (100 mg) wurde in 10 ml Wasser gelöst und der pH wurde mit 0,5 N NaOH auf 10 eingestellt. Festes NaBH&sub4; (100 mg) wurde der Lösung zugegeben, gefolgt von zweistündiger Inkubation der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur. Der Überschuss an Borhydrid wurde mit 1 M Essigsäure zerstört. Die Lösung wurde in der Kälte gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert, was zu einem Ertrag von 91 mg an reduziertem GASP führte.

B. Einführung einer terminalen Aldehydgruppe in das Gruppe A-Polysaccharid durch kontrollierte Periodatoxidation

Das reduzierte GASP (90 mg) wurde in 4,5 ml Wasser gelöst und dann zu 4,5 ml einer 50 mM NaIO&sub4;-Lösung gegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Überschuss an Periodat durch Zugabe von 1 ml Ethylenglykol zerstört und die Lösung wurde in der Kälte gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert, was zu einer Ausbeute von 73 mg an oxidiertem GASP führte.

C. GASP-TT und GASP-HSA-Konjugate

Das oxidierte GASP wurde durch reduktive Aminierung mit NaBH&sub3;CN entweder an ein monomeres Tetanustoxoid (TT) (SSI, Kopenhagen, Dänemark) oder menschliches Serumalbumin (HSA) (Sigma) gebunden.
Oxidiertes GASP (40 mg) und entweder monomeres TT (20 mg) oder HSA (20 mg) wurden in 0,2 molarem Phosphatpuffer pH 7,4 (0,7 ml) gelöst. Nach der Zugabe von NaBH&sub3;CN (20 mg) wurde die Reaktionsmischung vier Tage bei 37ºC inkubiert. Der Konjugationsprozeß wurde mittels HPLC verfolgt. Kleine Aliquots der Reaktionsmischung wurden auf Superose- 12 (Pharmacia) analysiert. Die Konjugate wurden mittels Chromatographie auf einer Superdex G-200-Säule (Pharmacia) mit PBS als Elutionsmittel gereinigt. Die von der Säule eluierten Fraktionen wurden mittels eines Waters R403 Differentialrefraktometers und mittels eines U.V.-Spektroskops bei 280 nm überwacht. Gruppe A-Polysaccharidkonjugate enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, dialysiert und lyophilisiert. Der Proteingehalt der Konjugate wurde nach der Methode von Bradford (Bradford, M. M., 1976 Anal. Biochem. 72 : 248- 254) mit humanem Serumalbumin als Standard abgeschätzt. Der Kohlenhydratgehalt wurde nach der Methode von Dubois et al. (31) mit gereinigtem GASP als Standard gemessen. Das TT-Konjugat enthielt 39% (w/w) Kohlenhydrat und 61% (w/w) Protein. Unter der Annahme eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 10 Kilodalton für das Polysaccharid (wie durch HPLC auf Superose-12 unter Verwendung von Dextranen als Molekulargewichtsmarker bestimmt und wie durch Laserscattering als Molekulargewichtsmarker gemessen) und einem Molekulargewicht von 150 Kilodalton für monomeres TT, hatte das GASP- TT-Konjugat entsprechend ein molares Verhältnis von Polysaccharid zu TT von 9-10 : 1.

Beispiel 7

Immunisierungen und Immunoassays

A. Immunisierungsverfahren

Eine Gruppe von fünf weißen, weiblichen Neuseeland-Kaninchen (7 bis 8 Wochen alt) wurden subkutan an zwei Stellen auf dem Rücken (dreimal in dreiwöchigen Intervallen) mit 10 mcg von entweder ungekoppeltem nativen Gruppe A-Polysaccharid oder als -TT-Konjugat in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml geimpft. Die Impfstoffe wurden entweder an Aluminiumoxyhydroxid (Alhydrogel; Superfos, Dänemark) oder Stearyltyrosin (ST) adsorbiert oder unadsorbiert jeweils in Konzentrationen von 1,0 mg in Alaun oder ST/ml physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Thimerosal wurde den Impfstoffen in einer Endkonzentration von 1/10.000 zugegeben. Eine Gruppe von fünf Kaninchen erhielt den Konjugatimpfstoff bei der ersten Injektion in komplettem Freundschen Adjuvans (Sigma Laboratories) emulgiert und bei der nachfolgenden Auffrisch-Injektion in inkomplettem Freundschen Adjuvans emulgiert. Von jedem Tier wurde Serum an den Tagen 0, 21, 42 und 52 gesammelt.

B. ELISA

Mikrotiterplatten (Nung Polysorb ELISA plates) wurden beschichtet mit 100 ng des GASP- HSA-Konjugats auf 1,0 mcg/ml in PBS verdünnt. Die Platten wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dem Beschichten wurden sie mit 0,05% Tween 20 enthaltendem TBF (PBS- T), und mit 0,5% BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Wells wurden dann mit 100 ul von aufeinanderfolgenden Zweifachverdünnungen von Kaninchenantiserum in PBS-T gefüllt und die Platten wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-T wurden die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 ul Peroxidase markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H&L) (Kirkegaard & Perry Laboratories) inkubiert und anschließend fünf mal mit PBS-T gewaschen. Am Schluß wurden 50 ul des TMB-Peroxidasesubstrats (Kirkegaard & Perry Laboratories) in jedes Well zugegeben und nach der Inkubation der Platten bei Raumtemperatur für zehn Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 1 M H&sub3; PO&sub4; gestoppt. Die Platten wurden in einem Molecular Devices Emax Mikrotiterplatten Reader bei 450 nm gemessen, wobei 650 nm als Referenzwellenlänge diente (vergleiche Tabelle IV).
Wir haben vorstehend eine Anzahl an erfindungsgemäßen Ausführungsformen erläutert. Es ist offensichtlich, dass der grundlegende Aufbau verändert werden kann, um weitere Ausführungsformen, die die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden, bereitzustellen. Es ist ersichtlich, dass der Umfang dieser Erfindung durch die angefügten Ansprüche definiert wird und nicht nur durch die spezifischen Ausführungsformen, die vorstehend in Form von Beispielen gegeben wurden. TABELLE IV GAS Polysaccharid-spezifische Antikörperliter von Kaninchen, die mit GAS Polysaccharid oder GAS Polysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugat in verschiedenen Zusammensetzungen geimpft worden waren.
Geometrischer mittlerer Titer (Bereich), wobei ein Wert von 100 einen Antikörper-Titer von ≤ 100 anzeigt. Die Werte sind das Mittel von Doppelbestimmungen. Die Kaninchen (Gruppen von 5 Kaninchen) wurden subkutan mit 100 mcg des Polysaccharides (nativ oder konjugiert) am Tag 0, 21 und 42 geimpft.

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Claims

1. Eine immunogene Zusammensetzung, umfassend eine immunogene Menge an Gruppe A-Polysaccharid der Formel (I)

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder D-GlcpNAc-Gruppe und wobei n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist, und ein Träger, wobei diese Zusammensetzung in Säugern Schutz gegen eine Infektion durch Streptokokken der Gruppe A bereitstellt.

2. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Gruppe A- Polysaccharid ein Molekulargewicht von etwa 10 kD besitzt.

3. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus physiologischer Kochsalzlösung, Ringers Lösung und Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung.

4. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die immunogene Zusammensetzung weiter ein Adjuvans umfasst.

5. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Monophosphoryllipid A, QS21 und Stearyltyrosin.

6. Ein immunogenes Polysaccharid-Protein Konjugatmolekül, das in Säugern die Produktion von opsonierenden Antikörpern induziert, die in Gegenwart von Komplement und Phagozyten bakterizid wirken, wobei das Konjugatmolekül ein Gruppe A- Polysaccharid der Formel (I) umfasst

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder D-GlcpNAc-Gruppe und n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist, und wobei das Polysaccharid kovalent an Protein gebunden ist.

7. Das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat gemäß Anspruch 6, wobei das Polysaccharid über eine sekundäre Aminbindung an Protein gebunden ist unter Bildung eines Konjugats der Formel (II)

wobei R' das Produkt von Reduktion und Oxidation des terminalen reduzierenden Zuckers ist, der nicht in der -CH&sub2;-NH-Protein sekundären Aminbindung der Formel II repräsentiert ist.

8. Das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat gemäß Anspruch 7, wobei das Protein ein natives oder rekombinantes bakterielles Protein ist.

9. Das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat gemäß Anspruch 8, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxin, Diphterie-Toxoid oder CRM&sub1;&sub9;&sub7;.

10. Das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat gemäß Anspruch 9, wobei das Protein Tetanus-Toxoid ist.

11. Das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat gemäß Anspruch 10, wobei das Polysaccharid ein Molekulargewicht von etwa 10 kD besitzt.

12. Das Protein-Polysaccharid Konjugat gemäß Anspruch 6, wobei das Protein des Konjugats ein T-Zell-Epitop umfasst und mindestens etwa 10 Aminosäuren lang ist.

13. Ein Impfstoff zum Schutz vor Infektion durch Streptokokken der Gruppe A, umfassend eine immunogene Menge an Gruppe A-Polysaccharid der Formel (I)

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder D-GlcpNAc-Gruppe und n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist, und ein Träger, wobei diese Zusammensetzung in Säugern Schutz gegen eine Infektion durch Streptokokken der Gruppe A bereitstellt.

14. Der Impfstoff gemäß Anspruch 13, wobei das Polysaccharid kovalent an Protein gebunden ist.

15. Der Impfstoff gemäß Anspruch 13, wobei das Polysaccharid über eine sekundäre Aminbindung an Protein gebunden ist, unter Bildung eines Konjugats mit der Formel (II)

wobei R' das Produkt von Reduktion und Oxidation des terminalen reduzierenden Zuckers ist, der nicht in der -CH&sub2;-NH-Protein sekundären Aminbindung von Formel (II) repräsentiert ist.

16. Der Impfstoff gemäß Anspruch 15, wobei das Protein ein natives oder rekombinantes bakterielles Protein ist.

17. Der Impfstoff gemäß Anspruch 16, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxin, Diphterie-Toxoid und CRM&sub1;&sub9;&sub7;.

18. Der Impfstoff gemäß Anspruch 17, wobei das Protein des Polysaccharid- Protein Konjugats Tetanus-Toxoid ist,

19. Der Impfstoff gemäß Anspruch 18, wobei das Polysaccharid im Konjugat ein Molekulargewicht von etwa 10 kD besitzt.

20. Ein immunogenes Polysaccharid-Liposom Konjugatmolekül, umfassend Gruppe A-Polysaccharid der Formel (I)

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder D-GlcpNAc-Gruppe und n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist, kovalent gebunden an Liposomen zur Bildung von Konjugatmolekülen.

21. Das Polysaccharid-Liposom Konjugat gemäß Anspruch 20, wobei die Liposomen aus kationischen Lipiden gebildet sind.

22. Das Polysaccharid-Liposom Konjugat gemäß Anspruch 21, wobei die Liposomen Phosphatidylethanolamin enthalten.

23. Das Polysaccharid-Liposom Konjugat gemäß Anspruch 22, wobei das Gruppe A-Polysaccharid ein Molekulargewicht von etwa 10 kD besitzt.

24. Das Konjugat gemäß Anspruch 20, wobei das Polysaccharid-Liposom Konjugat weiter in das Liposom eingebettetes Protein umfasst.

25. Der Impfstoff gemäß Anspruch 13, wobei Polysaccharid kovalent an Liposomen gebunden ist.

26. Der Impfstoff gemäß Anspruch 25, weiter umfassend in die Liposomen eingebettetes natives oder rekombinantes bakterielles Protein.

27. Der Impfstoff gemäß Anspruch 26, wobei das bakterielle Protein Tetanus- Toxoid ist.

28. Der Impfstoff gemäß Anspruch 25, wobei die Polysaccharid-Liposom Zusammensetzung des Impfstoffs ein Molekulargewicht von etwa 10 kD besitzt.

29. Eine immunogene Zusammensetzung zum Verleihen passiver Immunität gegen Streptokokken der Gruppe A, wobei die immunogene Zusammensetzung opsonierende Antikörper umfasst, die in Gegenwart von Komplement und Phagozyten gegen Streptokokken der Gruppe A bakterizid sind und wobei diese Antikörper a) von einem Säuger erhalten werden und b) an Polysaccharid von Streptokokken der Gruppe A der Formel (I) binden

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder GlcpNAc-Gruppe und n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist.

30. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 29, wobei die bakteriziden Antikörper im Serum, in einer Gamma-Globulinfraktion oder einer gereinigten Antikörperpräparation anwesend sind.

31. Verfahren zur kovalenten Bindung von Gruppe A-Polysaccharid der Formel I

wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose- oder GlcpNAc-Gruppe und n eine Zahl von Wiederholungseinheiten von etwa 3 bis etwa 30 ist, an ein Liposom enthaltend Phosphatidylethanolamin, umfassend:

a) Bildung von Liposom aus Phosphatidylethanolamin;

b) Aktivieren von Gruppe A-Polysaccharid durch Reduzieren der terminalen Zuckergruppe und Oxidieren der reduzierten Zuckergruppe unter Bildung einer terminalen Aldehydgruppe;

c) Vereinigen des aktivierten Gruppe A-Polysaccharids mit den Liposomen und kovalente Bindung des Gruppe A-Polysaccharids an das Liposom durch reduktive Aminierung zur Bildung eines Gruppe A-Polysaccharid-Liposom Konjugats; und

d) Gewinnung des Gruppe A-Polysaccharid-Liposom Konjugats.

32. Die Verwendung der immunogenen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz von Säugern gegen Infektion durch Streptokokken der Gruppe A.

33. Die Verwendung der immunogenen Zusammensetzung gemäß Anspruch 32, wobei die immunogene Zusammensetzung in einer Dosis von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht an ein Individuum verabreicht wird.

34. Die Verwendung des immunogenen Polysaccharid-Protein Konjugatmoleküls gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion der Produktion von opsonierenden Antikörpern in Säugern, die in der Gegenwart von Komplement und Phagozyten bakterizid sind.

35. Die Verwendung des immunogenen Polysaccharid-Protein Konjugatmoleküls gemäß Anspruch 34, wobei das immunogene Polysaccharid-Protein Konjugat in einer Dosis von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht an ein Individuum verabreicht wird.

36. Die Verwendung des Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 13 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz gegen Infektion durch Streptokokken der Gruppe A.

37. Die Verwendung des Impfstoffs gemäß Anspruch 36, wobei der Impfstoff in einer Dosis von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht an ein Individuum verabreicht wird.

38. Die Verwendung des immunogenen Polysaccharid-Liposom Konjugatmoleküls gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz gegen Infektion durch Streptokokken der Gruppe A.

39. Die Verwendung des immunogenen Polysaccharid-Liposom Konjugatmoleküls gemäß Anspruch 38, wobei das immunogene Polysaccharid-Liposom Konjugatmolekül in einer Dosis von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht an ein Individuum verabreicht wird.

40. Die Verwendung des Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz gegen Infektion durch Streptokokken der Gruppe A.

41. Die Verwendung des Impfstoffs gemäß Anspruch 40, wobei der Impfstoff in einer Dosis von etwa 0,01 ug bis etwa 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht an ein Individuum verabreicht wird.

42. Die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 29, wobei die Antikörper durch Immunisierung eines Individuums mit einer der immunogenen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1, 6, 13 und 20 produziert werden.

43. Die immunogenen Zusammensetzungen gemäß Anspruch 29, wobei die Antikörper aus Serum eines Individuums erhalten werden.

44. Die immunogenen Zusammensetzungen gemäß Anspruch 43, wobei die Antikörper aus humanen Seren mit einem Titer größer als etwa 40000 isoliert werden.

45. Die immunogenen Zusammensetzungen gemäß Anspruch 44, wobei die Antikörper aus humanen Seren mit einem Titer größer als etwa 200000 isoliert werden.

46. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 29 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

47. Die Verwendung von Antikörpern, die zur bakteriziden Antwort in Gegenwart von Komplement und Phagozyten beitragen, und von einem Säuger erhalten werden und welche Polysaccharid von Streptokokken der Gruppe A der Formel (I)

binden, wobei R eine terminale reduzierende L-Rhamnose-Gruppe oder D-GlcpNAc- Gruppe und n eine Zahl von etwa 3 bis etwa 30 ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Infektion durch Streptokokken der Gruppe A.

48. Die Verwendung der Antikörper gemäß Anspruch 47, wobei die Antikörper von einem Individuum erhalten werden.

49. Die Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 47, wobei die Antikörper zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung in Serum, in einer Gamma- Globulinfraktion oder in einer gereinigten Antikörperpräparation vorliegen.

50. Die Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 49, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einen von humanem Serum abgeleiteten Antikörper mit einem Titer größer als etwa 40000 umfasst.

51. Die Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 50, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einen von humanem Serum abgeleiteten Antikörper mit einem Titer größer als etwa 200000 umfasst.