DE69331495T2

DE69331495T2 - Impfstoffe gegen neisseria meningitidis gruppe c

Info

Publication number: DE69331495T2
Application number: DE69331495T
Authority: DE
Inventors: Lucjan J.J. Hronowski; Harold Jennings; Sharon Mates; Francis Michon; Joseph Y. Tai
Original assignee: Baxter Healthcare SA
Current assignee: Baxter Healthcare SA
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-30
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2013-08-31
Also published as: CA2142981A1; PL175595B1; CA2142981C; WO1994005325A1; NO950739D0; NO950739L; PT658118E; EP0658118B1; DK0658118T3; DE69331495D1; ATE212233T1; JP2008044955A; EP0658118A1; PL307745A1; AU4841693A; ES2171418T3; JP4097691B2; NO323616B1; EP0658118A4; JPH08500607A

Description

FACHBEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Vakzinen, die gegen Neisseria meningitidis der Gruppe C nützlich sind, wobei diese Vakzinen Konjugate von modifizierten Gruppe-C-Kapsel-Polysacchariden umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Erreger Neisseria meningitidis der Gruppe C ist weltweit für einen hohen prozentualen Anteil an bakteriellen Meningitis-Erkrankungen verantwortlich. Die derzeitigen Maßnahmen zur Verhütung dieser Krankheit stützen sich auf Impfstoffe, die aus gereinigten Gruppe-C-Kapsel-Polysacchariden zusammengesetzt sind.
Diese Vakzine erweisen sich bei Erwachsenen als wirksam, doch bei Kindern als nur schwach immunogen. Die schlechten Ergebnisse bei Säuglingen sind in hohem Maße unerwünscht, da diese Bevölkerungsgruppe am stärksten von diesen Infektionen betroffen sind.
Beim Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid (GCMP) handelt es sich um ein schwaches Immunogen, weshalb Anstrengungen unternommen wurden, die Immunogenität dieser Polysaccharide zur Steigerung ihrer Nützlichkeit als Vakzine zu erhöhen. Eine mögliche Methode zu diesem Zwecke, die sich auf in gewisser Weise als vielversprechend erwiesen hat, besteht in der Konjugation dieser Polysaccharide an einen Träger, wie z. B. ein Protein.
Verschiedene Forscher isolierten und reinigten intakte Kapsel-Polysaccharide und banden sie kovalent an Trägerproteine. Diese Konjugate erweisen sich als immunogener als das Polysaccharid allein. In der Literatur lassen sich viele Beispiele finden, die den Erfolg dieser Konjugat-Antigene verdeutlichen. Ein in US-Patentschrift Nr. 4.673.574 gezeigtes derartiges Beispiel beschreibt die Anwendung bakterieller Kapsel-Polysaccharide in Konjugation an Trägerproteine zum Erhalt immunogener Verbindungen. Ein anderes Beispiel in US-Patentschrift Nr. 4.356.170 beschreibt die Immunogenität von mit einem spezifischen Polysaccharid hergestellten Konjugaten, nämlich eines an ein Trägerprotein gekoppelten Gruppe- A-Meningokokken-Polysaccharids (GAMP). Diese Konjugate stellen eine verbesserte Methode zur Verabreichung wirksamer Mengen an Antigen an einen Wirt bereit.
Eine andere Methode zur Steigerung der Immunogenität erwies sich bezüglich der Gruppe-B-Meningokokken-Polysaccharid (GBMP)-Antigene als vielversprechend, wie aus US-Patentschrift Nr. 4.727.136 ersichtlich. Diese Methode bringt die Substitution der N-Acetylgruppen der Sialyl-Komponente des Polysaccharids mit N-Propenylgruppen und dann die Konjugation des modifizierten Polysaccharids an ein Trägerprotein mit sich. Bei diesen Konjugaten handelt es sich um gute Immunogene, die wirksam mit dem nativen GBMP kreuzreagieren. Dieser Befund zeigt, dass die Addition von Substituenten an das Polysaccharid-Antigen zusätzliche immunogene Stellen oder Epitope zur Erkennung durch Antikörper schaffen kann.
Vakzine, die derzeit aus O-Acetyl-positivem Gruppe C-N. meningitidis hergestellt werden, sind als schwach immunogen bekannt. Es wurde berichtet, dass eine aus einer O-Acetyl-negativen Variante hergeleitete Vakzine immunogen ist. Siehe Glode et al. The Journal of Infectious Disease Bd. 139, Nr. 1, Jan. 1979, S. 52-59; Steinkoff et al.; Infection and Immunity, Okt. 1981, S. 144-145; und Arakere et al., Infection and Immunity, Dez. 1991, S. 4349-4356.
Die meisten Gruppe C-N. meningitidis-Stämme produzieren ein O-Acetyl-positives (OAc+) Polysaccharid, bei dem die O-Acetylgruppen ausschließlich zwischen C-7 und C-8 seines Sialinsäure-Restes verteilt sind. Zu den bekannten OAc-negativen (OAc-) Stämmen zählen Gruppe C-N. meningitidis-MC19-Bakterien.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer hochgradig immunogenen Vakzine, umfassend ein modifiziertes Gruppe-C- N. meningitidis-Polysaccharid in Konjugation an einen Träger, ebenso wie die Bereitstellung einer hochgradig immunogenen Vakzine, die dieses Konjugat aus einem Träger und einem modifizierten Polysaccharid, das aus einer OAc-negativen Variante hergeleitet ist, enthält.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemische Modifikation durch O-Desacetylierung des von OAc+-Stämmen hergeleiteten Gruppe C-Neisseria meningitidis- Polysaccharids (GCMP) als auch die Konjugation des desacetylierten Polysaccharids an einen Träger, zur Bereitstellung eines erhöht immunogenen Materials. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Fragmentierung des desacetylierten Polysaccharids aus OAc+-Stämmen, als auch die Fragmentierung von Polysaccharid aus OAc&supmin;-Stämmen, um die wirksame Größe dieser Polysaccharide zu mindern.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Depolymerisierung des Gruppe-C-Polysaccharids, das entweder nativ oder desacetyliert ist, um Fragmente von geringerem Molekulargewicht mit einer erhöhten immunogenen Aktivität bereitzustellen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Schaffung eines Restes innerhalb des desacetylierten Polysaccharids aus OAc+-Stämmen, welches die Bereitstellung einer reaktiven Stelle zur Kopplung entweder direkt an ein Trägermaterial oder an ein Trägermaterial über ein Linkermolekül umfasst.
Außerdem betrifft diese Erfindung ein immunogenes Konjugat, das durch Kopplung eines O-desacetylierten Meningokokken-C-Polysaccharids, d. h. ein Polysaccharid aus einem OAc&supmin;-Stamm, an ein Trägermaterial oder ein fragmentiertes Meningokokken-C-Polysaccharid erzeugt wird, wobei das Polysaccharid und der Träger kovalent gebunden werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung immunogener Konjugate beschrieben, umfassend die kovalente Bindung eines Trägermaterials und eines O-desacetylierten Gruppe-C-Polysaccharids von Neisseria meningitidis oder ein Polysaccharid von einem OAc&supmin;-Stamm oder Fragmente dieser Polysaccharide oder Fragmente von nicht-desacetyliertem Polysaccharid.
Diese Erfindung betrifft darüber hinaus die Anwendung des Konjugats des O-desacetylierten Gruppe-C-Polysaccharids oder eines OAc&supmin;-Polysaccharids als einer potenten bakteriziden Vakzine bei Säugern, die für bakterielle Meningitis empfänglich sind. Die Vakzine kann ein Adjuvans umfassen, wie etwa Aluminiumhydroxid oder Stearyltyrosin.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Um die Immunogenität des Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharids (GCMP) zu erhöhen, wird ein modifiziertes GCMP geschaffen und kovalent an ein Trägermolekül gebunden. Außerdem wird Polysaccharid aus einem OAc&supmin;-Stamm in entweder isolierter oder modifizierter Form kovalent an ein Trägermolekül gebunden. Das Polysaccharid-Konjugat kann mittels einer Vielfalt chemischer, physikalischer oder enzymatischer Kopplungsreaktionen erhalten werden. Die verwendete Kopplungsmethode hängt von den möglicherweise verwendeten Bindemitteln und den reaktiven Gruppen am Trägermaterial oder -molekül ab. Eine Vielzahl von Kopplungsmethoden sind den Fachleuten des Bereichs bekannt, die auch ohne weiteres angewandt werden könnten.
Das Trägermaterial oder -molekül ist hierin als jegliches Material oder Molekül definiert, das an Polysaccharid-Komponenten kopplungsfähige Gruppen aufweist. Bei polymeren Trägern kann es sich um ein natürliches oder ein synthetisches Material handeln, das wasserlöslich oder wasserunlöslich sein kann. Die Trägermaterialien oder -moleküle sind meistens proteinartiger Natur. Im Falle eines Proteinträgers kann das Protein jegliches physiologisch tolerierte Protein mit einer zur Kopplung verfügbaren reaktiven Gruppe sein. Es kann jede Art von Träger verwendet werden, solange dieser eine primäre oder eine sekundäre Aminogruppe enthält. Die reaktiven freien Aminogruppen können in bequemer Weise an ein Polysaccharid über Komponenten wie Hydroxyle, Aldehyde, Carbonsäuren und ähnliches gekoppelt werden. Zu geeigneten Proteinen zählen natürliche Peptide und Proteine, wie etwa Rinderserumalbumin, aus bakteriellen Toxinen durch deren synthetische Modifikation hergeleitete bakterielle Toxoide, z. B. Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid, Pertussis-Toxin oder Pertussis-Toxoid, Pseudomonas aeruginosarekombinantes Exoprotein A und Clostridium perfringens-Exotoxine. Auch andere, aus Bakterien stammende Proteine können verwendet werden. Die Bakterienquelle kann z. B. Haemophilus influenza, Meningokokken, Pneumokokken, β-haemolytische Streptokokken und E. coli sein. Andere Proteine, die Lysin-Reste enthalten, wie etwa ein synthetisches Polylysin, können ebenfalls nützlich sein. Weitere Proteinträger als auch nicht-proteinartige Trägermoleküle sind den Fachleuten des Bereichs ohne weiteres bekannt und könnten als ein Trägermolekül der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele wasserunlöslicher Träger sind Aminoalkyl-Sepharosen, z. B. Aminopropyl- oder Aminohexyl-Sepharose, und Aminopropyl-Glas. Es können noch weitere Träger verwendet werden, die so modifiziert sind, dass sie eine chemische angekoppelte Aminogruppe enthalten. Solche Träger können von Polysacchariden hergeleitet sein, an die eine Aminoalkylgruppe durch eine kovalente Bindung gebunden ist.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die O-Acetyl- gruppen an Positionen 7 und/oder 8 der Sialyl-Komponenten im Gruppe-C-Polysaccharid aus OAc+-Stämmen selektiv aus dem Gruppe-C-Meningokokken- Polysaccharid durch Behandlung mit einem geeigneten Reagenz in variierendem Umfang entfernt. Den Fachleuten des Bereichs sind viele desacetylierende Reagentien bekannt. Vorzugsweise wird die Desacetylierung unter mild basischen Bedingungen in wässrigem Medium vorgenommen, z. B. in etwa 0,01 bis 0,5 N Natriumhydroxid, bevorzugt 0,1 N Natriumhydroxid, bei etwa 0 bis 50ºC, bevorzugt 25ºC. Andere basische Lösungen, wie etwa Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid und ähnliches, können ebenfalls für diese Reaktionen verwendet werden. Temperatur und Basenkonzentration bei der Desacetylierungsreaktion können einzig unter Berücksichtigung dessen variiert werden, dass milde Bedingungen aufrechterhalten werden sollten. Vorzugsweise sollten die Reaktionsbedingungen so kontrolliert werden, dass lediglich eine Desacetylierung des Gruppe-C-Polysaccharids bis zum gewünschten Umfang erreicht wird. Die O-Desacetylierung wird solange durchgeführt, bis der gewünschte Grad an Desacetylierung erreicht ist, d. h. etwa 1 bis 25, bevorzugt etwa 16 Stunden lang in 0,1 N NaOH.
Die Ausbeute an O-desacetyliertem Polysaccharid aus der Desacetylierungsreaktion unter Anlegung milder Bedingungen beträgt typischerweise mehr als 80%. Der Grad der O-Desacetylierung kann von etwa 30% bis 100% in Abhängigkeit von den angelegten Bedingungen variieren. Typischerweise ermöglicht eine Variierung von Temperatur und Reaktionsdauer eine Variierung des Grads der O-Desacetylierung am Polysaccharid. Vorzugsweise wird eine O-Desacetylierung im Bereich von mehr als 80%, und am bevorzugtesten von 100%, erreicht.
Es kann auch erwünscht sein, die Polysaccharidkette (vor oder nach der Desacetylierung) zu fragmentieren oder zu depolymerisieren, bevor sie an das Trägermolekül konjugiert werden. Polysaccharide sind gegenüber vielen Reagentien empfindlich und können mit schwachen Säuren wie Essigsäure hydrolysiert oder durch Reagentien wie Metaperiodat oxidiert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nicht-desacetyliertes Polysaccharid oder Polysaccharid aus OAc&supmin;-Stämmen vor der Konjugation durch Metaperiodat-Oxidation sowohl fragmentiert als auch aktiviert. Für Fachleute des Bereichs sind weitere Methoden zur Ausführung dieses Reaktionsschritts erkennbar.
Die immunogenen Konjugate der Erfindung werden hergestellt, indem zunächst reduzierende Endgruppen an Fragmenten des O-desacetylierten GCMP oder des Polysaccharids von OAc&supmin;-Stämmen gebildet und dann die reduzierenden Endgruppen mit Amingruppen des Trägermaterials oder -moleküls mittels reduktiver Aminierung umgesetzt werden. Die reduzierenden Endgruppen können mittels jeglicher geeigneter Methode erhalten werden, einschließlich der selektiven Hydrolyse, d. h. durch Säuren oder Enzyme, oder der oxidativen Spaltung, d. h. durch Metaperiodat. Die Konjugation wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung in einer wässrigen Lösung erreicht, die ein Reduktionsmittel wie Cyanoborhydrid- Anionen enthält. Weitere Methoden zur Kopplung eines Polysaccharids an ein Trägermolekül sind den Fachleuten des Bereichs bekannt.
Eine bevorzugte Kopplungsmethode umfasst zwei Reaktionsschritte. Das Polysaccharid wird zur Schaffung von Aldehyd-Komponenten mit Metaperiodat oxidiert und dann in Gegenwart der freien Aminogruppen am Trägermolekül und in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels umgesetzt. Zu geeigneten Reduktionsmitteln zählen typischerweise Cyanoborhydrid, Natriumborhydrid oder ein anderes Reduktionsmittel, das die reduzierenden Enden von Interesse weder reduziert noch das Trägermolekül oder -material nachteilig beeinflußt. Das Reduktionsmittel dient als ein mild selektives Reduktionsmittel des Schiffschen Basen-Intermediats, das zwischen den Carbonylgruppen des hydrolysierten GCMP- Fragments und den Aminogruppen des Trägermoleküls oder -materials entsteht. Typische Reaktionsbedingungen für diese Art von Konjugation sind wiedergegeben bei Jennings et al., US-Patentschrift Nr. 4.356.170.
Es sollte jedoch klar sein, dass die Konjugat-Vakzinen der Erfindung nicht auf jene beschränkt sind, die über reduktive Aminierung erzeugt werden. So können die Vakzinen auch durch Konjugation des Polysaccharids mit dem Trägerprotein unter Verwendung eines Adipindihydrazid-Spacers hergestellt werden, wie beschrieben by Schneerson, R., et al., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae Type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med., 1952, 361-476 (1980), und in US-Patentschrift Nr. 4.644.059 an Lance K. Gordon. Alternativ kann die binäre Spacer-Technologie angewandt werden, wie beschrieben bei Marburg, S., et al., "Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitides Membrane Protein", J. Am. Chem. Soc., 108, 5282-5287 (1986), oder möglicherweise der Methodik der reduzierenden Enden, wie erläutert bei Anderson in US-Patentschrift Nr. 4.673.574.
Die immunogenen Konjugate der Erfindung können mit ein oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträgern und wahlweise weiteren Inhaltsstoffen formuliert werden. Der/die pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträger muss in dem Sinne "geeignet" sein, als er mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung verträglich und nicht für seinen Empfänger schadbringend ist. Die Formulierungen können bequemerweise in Einheiten-Dosierungsform angeboten und mittels einer im pharmazeutischen Fachbereich wohlbekannten Methode präpariert werden.
Die Herstellung von Vakzinen, die Polysaccharid-Konjugate als Wirkstoffe enthalten, ist im Fachbereich wohlbekannt. Typischerweise werden diese Vakzine als Injektionsmittel in entweder Flüssiglösung oder Suspensionen zubereitet; auch feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor Injektion geeignet sind, können hergestellt werden. Außerdem kann die Präparation emulgiert werden. Der immunogene Wirkstoff wird oftmals mit Arzneimittelträgern vermengt, die pharmazeutisch geeignet und mit dem Wirkstoff verträglich sind. Geeignete Arzneimittelträger sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches und deren Kombinationen. Zusätzliche kann die Vakzine, wenn gewünscht, kleinere Mengen an Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien enthalten, die die Wirksamkeit der Vakzine erhöhen. Jegliches, den Fachleuten des Bereichs als geeignet bekannte Adjuvans kann verwendet werden, wobei zu den geeigneten Adjuvantien u. a. zählen: Stearyltyrosin, Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumsulfat. Es wurde festgestellt, dass mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans hergestellte Vakzinen besonders wirksam sind. Die Vakzinen werden herkömmlicherweise parenteral verabreicht, z. B. durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Zu weiteren Formulierungen, die für andere Verabreichungswege geeignet sind, zählen Suppositorien und in manchen Fällen orale Formulierungen. Bei Suppositorien können die herkömmlichen Bindemittel und Träger z. B. Polyalkalenglycole oder Triglyceride umfassen; diese Suppositorien können aus Gemischen bei einem Wirkstoffgehalt im Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1 bis 2%, hergestellt werden. Orale Formulierungen umfassen die normalerweise verwendeten Arzneimittelträger, wie z. B. pharmazeutische Güteklassen von Mannitol, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches. Diese Zusammensetzungen werden in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Retard-Formulierungen oder Pulvern bereitgestellt und enthalten zu 10% bis 95%, vorzugsweise zu 25% bis 70% Wirkstoff.
Die Vakzinen werden in einer Weise verabreicht, bei in einer therapeutisch wirksamen und immunogenen Menge, die mit der Formulierung der Dosierung kompatibel ist. Die zu verabreichende Quantität hängt vom zu behandelnden Patienten, der Fähigkeit des Immunsystems des Patienten, Antikörper zu synthetisieren und dem Grad an gewünschtem Schutz ab. Die exakten Mengen an Wirkstoff, die verabreicht werden müssen, hängen von der Beurteilung durch den betreuenden Arzt ab und sind für jeden Patienten individuell. Geeignete Dosierungsbereiche liegen jedoch in einer Größenordnung von mehreren hundert Mikrogramm Wirkstoff pro Individuum. Auch die geeigneten Dosierungsschemata für die Erstverabreichung und die Auffrischungen sind variabel, doch bestehen typischerweise in einer Erstverabreichung, gefolgt von ein- oder zweiwöchigen Intervallen durch eine Folgeinjektion oder andere Verabreichungsform.
Die Vakzine der vorliegenden Erfindung ruft wirksame Mengen an Anti-GCMP- Antikörpern bei Säugern hervor. Diese Vakzine kann durch Injektion in Säuger jeden Alters verabreicht werden und zur Hervorrufung einer aktiven Immunisierung gegen eine durch Neisseria meningitidis verursachte systemische Infektion genützt werden, indem eine immunogene Menge des Konjugats an für die Erkrankung anfällige Säuger verabreicht wird.
Generell eignen sich Vakzinen, die etwa 5 bis etwa 100 ug, bevorzugt etwa 10 bis 50 ug enthalten, dazu, wirksame Mengen an Antikörper gegen GCMP bei jungen Säugern hervorzurufen. Die exakte Dosis wird durch Experimentieren bestimmt. Mehrere kleine Dosen in sequentieller Verabreichung werden für geeigneter gehalten als dieselbe Menge an Konjugat als Einzelinjektion.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Gamma-Globulin- Fraktion bereit, die zum Schutz gegen durch Gruppe C-N. meningitidis verursachte Meningitis in der Lage ist. Die Fraktion wird durch Immunisieren eines Säugers mit der Vakzine der vorliegenden Erfindung erhalten, welche Fraktion dann an ein Individuum verabreicht wird, um einen Schutz gegen oder die Behandlung von einer durch die obigen Organismen verursachten ausgebrochenen Infektion zu schaffen. Hieraus ist zu erkennen, dass die immunogenen Vakzine-Konjugate der Erfindung eine Quelle für ein therapeutisches Antiserum dank ihrer die Immunogenität begünstigenden Wirkung bereitstellen. Die Konjugate der Erfindung sind auch zum Züchten von monoklonalen Antikörpern und, möglicherweise, Anti-Idiotypenantikörpern nützlich.
Die O-Desacetylierung des Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharids kann durch Behandlung mit einer milden Base, wie z. B. 0,01 bis 0,5 N NaOH, vorzugsweise 0,1 N NaOH, bei etwa 0 bis 50ºC, bevorzugt 25ºC, über etwa 1 bis 25 Stunden hinweg, bevorzugt etwa 16 Stunden hinweg vorgenommen werden. Die Entfernung der Acetylgruppen aus den 7- und/oder 8-Positionen wird mittels NMR-Spektroskopie verifiziert.
Bei den nachfolgenden Schritten wird das Polysaccharid mittels Gelfiltration gereinigt, wie z. B. auf einer Superdex 200-Säule von präparativer Qualität. Eine reduktive partielle Depolymerisation unter Verwendung von Natriumperiodat wird am nicht-desacetylierten Polysaccharid, dem desacetylierten Polysaccharid aus OAc+- Stämmen und dem Polysaccharid aus OAc&supmin;-Stämmen vorgenommen, um ein aktiviertes Polysaccharid mit der optimalen Größe zur Hervorrufung der maximalen Immunreaktion zu erhalten. Das Polysaccharid wird mittels Gelfiltration gereinigt, zur Entfernung der Salze dialysiert und lyophilisiert. Es wird dann an einen geeigneten Proteinträger, z. B. Tetanus-Toxoid, durch die reduktive Aminierungsreaktion gebunden. Die resultierenden Konjugate werden mittels Gelfiltration gereinigt und auf ihre Immunogenität bei FRW-nicht-verwandt gezüchteten Swiss Webster- Mäusen, bezogen von Charles Rivers, analysiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Abb. 1: Wirkung der O-Acetylierung des Polysaccharids bei den GCMP-TT- Konjugaten auf die Serum-ELISA-Titer. Die ELISA-Platten wurden mit O-Acetyl- negativem GCMP-HSA-Konjugat beschichtet.
Abb. 2: Wirkung der O-Acetylierung des Polysaccharids bei den GCMP-TT- Konjugaten auf die Serum-ELISA-Titer. Die ELISA-Platten wurden mit O-Acetyl- negativem GCMP-BSA-Konjugat beschichtet.
Abb. 3: Wirkung der O-Acetylierung des Polysaccharids bei den GCMP-TT- Konjugaten auf die Komplement-abhängige bakterizide Wirksamkeit. Die bakterizide Wirksamkeit wurde gegen Gruppe C-N. meningitidis Stamm C11, einem O-Acetyl- positiven Stamm, bestimmt.
Abb. 4: Wirkung der Polysaccharid-Größe in den GCMP-TT-Konjugaten auf die Serum-ELISA-Titer. Die ELISA-Platten wurden mit O-Acetylnegativem GCMP-HSA- Konjugat beschichtet.
Abb. 5: Wirkung der Polysaccharid-Größe in den GCMP-TT-Konjugaten auf die Serum-ELISA-Titer. Die ELISA-Platten wurden mit O-Acetyl-positivem GCMP-BSA- Konjugat beschichtet.
Abb. 6: Wirkung der Polysaccharid-Größe in den GCMP-TT-Konjugaten auf die Komplement-abhängigen bakteriziden Wirksamkeiten. Die bakterizide Wirksamkeit wurde gegen Gruppe C-N. meningitidis Stamm C11, einem O-Acetyl-positiven Stamm, bestimmt.

Beispiel 1

O-Desacetylierung von Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid (GCMP)

Natives Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid (188 mg) wurde in 0,1 N Natriumhydroxidlösung (30 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei 25ºC über 16 Stunden hinweg gerührt. Es wurde dann bei 4ºC gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das Polysaccharid (144 mg, 77%), das als weißer baumwollartiger Feststoff erhalten wurde, wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie (500 MHz) als Odesacetyliert nachgewiesen.

Beispiel 2

Reinigung des O-acetylierten Gruppe-C-Polysaccharids (GCMP)-(-)

Das O-desacetylierte Polysaccharid (141 mg) wurde in Dulbecco's PBS (10 ml) gelöst und mittels Gelfiltration auf einer Superdex 200-(2,6 · 100 cm)-Säule von präparativer Qualität gereinigt. Die Säule wurde bei 100 ml/Std. eluiert, und es wurden Fraktionen von 5,0 ml entnommen. Das Eluat wurde mit einem Differentialrefraktometer und einem UV-(280 nm)-Nachweisgerät überwacht. Die Fraktionen, die den ersten Haupt-Peak enthielten, wie mittels Differentialrefraktometer nachgewiesenn und die im wesentlichen frei von UV-absorbierendem Material waren, wurden kombiniert. Nach der Dialyse gegen Wasser und der Lyophilisierung wurde gereinigtes GCMP-(-) (180 mg, 77%) als ein weißer baumwollartiger Feststoff erhalten. Das feste Material wurde auf Protein mittels der Bradford-Methode und auf Nukleinsäuren mittels der UV-Extinktion bei 260 nm analysiert. Wie in Tabelle 1 gezeigt, werden diese Kontaminanten durch diesen Reinigungsschritt beträchtlich reduziert. Bei der Zugabe-Analyse von GCMP-(-) mittels HPLC unter Verwendung der Superose-12-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) zeigte sich, dass dieses als ein scharfes Porenvolumen-Peak eluiert, wie dies auch bei dem nativen Ausgangs- Polysaccharid (GCMP) beobachtet wurde, was aufzeigt, dass das gereinigte Polysaccharid in einer hochmolekularen Form vorliegt ist.

Beispiel 3

Oxidation und Klassierung des gereinigten GCMP-(-)

Die Oxidation des Polysaccharids mit Natriummetaperiodat dient dem doppelten Zweck der Aktivierung des Polysaccharids zur anschließenden Bindung an Proteine und der Spaltung des Polysaccharids in kleinere Fragmente, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie eine optimale Immunreaktion erbringen. Da ebenfalls früher gezeigt wurde, dass verschiedene Chargen des Polysaccharids unterschiedliche Periodat-Oxidations-Bedingungen erfordern, um die optimalen Polysaccharid- Kettenlängen zu erhalten, werden diese Bedingungen zunächst an Reaktionen im kleinen Maßstab (5 mg) bestimmt und daraufhin die Reaktion im großen Maßstab durchgeführt. Typischerweise wird die Reaktionsdauer und -temperatur bei 2 Stunden bzw. 25ºC konstant gehalten und die Konzentration des Natriummetaperiodats zwischen 3 und 12 Millimol in entionisiertem Wasser variiert. Die Konzentration des Polysaccharids in den Reaktionen im kleinen und großen Maßstab wird ebenfalls bei 6 bis 10 mg/ml konstant gehalten. Am Ende der zweistündigen Periode wird eine Überschußmenge (10-fach) einer 1,0 M Ethylenglycol-Lösung der Reaktionslösung zugegeben, um nicht-umgesetztes Natriummetaperiodat zu zerstören. Nach mindestens 30-minütiger Reaktion werden die Lösungen mittels HPLC unter Verwendung einer kalibrierten Superose-12-Säule analysiert, um das mittlere Molekulargewicht des oxidierten Polysaccharids zu bestimmen. Die Reaktionsbedingungen, die ein Polysaccharid mit einem mittleren Molekulargewicht von 12.000 bis 16.000 Dalton bereitstellen, werden für die Reaktionen im großen Maßstab verwendet, wie anhand der folgenden Reaktion veranschaulicht.
Gereinigtes GCMP-(-) (63 mg) wurde in entionisiertem Wasser (4,81 ml) gelöst. Dieser Lösung wurde 21 mMol Natriumperiodat-Lösung (4,81 ml) zugegeben, um ein Reaktionsgemisch im entionisiertem Wasser mit einem Polysaccharid-Gehalt von 6,55 mg/ml und einem NaIO&sub4;-Gehalt von 10,5 mMol zu erhalten. Die Reaktion durfte bei 25ºC über 2 Stunden hinweg im Dunklen ablaufen, woraufhin sie mit 1 M Ethylenglycol (0,96 ml) über 30 Minuten hinweg behandelt wurde. Dieses Material eluierte auf der Superose-12-Säule als ein breites Peak mit einem mittleren Molekulargewicht von 12.800 Dalton. Das Volumen der Lösung wurde auf etwa 5 ml auf dem Lyophilisiergerät reduziert und das Material mittels Gelfiltration auf einer Superdex-200-Säule (2,6 · 100 cm) von präparativer Qualität unter Verwendung von Dulbecco's PBS als dem Elutions-Puffer gereinigt und daraufhin 5 ml-Fraktionen abgesammelt. Jene Fraktionen, die ein Material mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.00 bis 18.000 Dalton enthielten, wurden kombiniert. Nach der Dialyse gegen entionisiertes Wasser und der Lyophilisierung wurde das oxidierte und klassierte Polysaccharid [o]-GCMP-(-) (16,0 mg, 23%) als ein weißer baumwollartiger Feststoff erhalten, bei dem mittels FPLC auf Superose-12 ein mittleres Molekulargewicht von 14.500 Dalton nachgewiesen wurde. Tabelle 1 Protein- und Nukleinsäure-Gehalte der Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid-Präparationen

Beispiel 4

Herstellung von [o]-GCMP-(+)

Natives GCMP (350 mg) wurde in 0,02 N NaOH (36 ml) gelöst und bei 25ºC über 3 Stunden hinweg inkubiert. Dieser Lösung wurden dann 0,1 M NalO&sub4; (36 ml) zugegeben und die Inhaltsstoffe bei 25ºC über weitere 50 Minuten hinweg inkubiert. Die Reaktion wurde dann mit 50% Ethylenglycol (5,3 ml) über 20 Minuten hinweg behandelt und das Gemisch mittels Zentrifugation bei 500 UpM über 10 Minuten hinweg geklärt. Der Überstand wurde gegen entionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, was 300 mg an Feststoff ergab. Das Material wurde auf einer Bio-Gel-A- 0,5 m-Säule klassiert, um das oxidierte und das klassierte Polysaccharid {[o]- GCMP-(+)} mit einem Molekulargewicht von 11.500 Dalton zu erhalten.

Beispiel 5

Ausreinigung des Protein-Monomers von Tetanus-Toxoid (TT)

In eine leicht gerührte Tetanus-Toxoidlösung (Statens Seruminstitu) [enthaltend 2,1 mg/ml Protein (Bradford-Protein-Assay unter Verwendung von Human-IgG als Standard)] (75 ml) wurde Ammoniumsulfat (42,1 g) in kleinen Portionen über einen Zeitraum von 45 Minuten zugegeben, um eine 80% gesättigte Lösung zu erhalten. Die trübe Lösung wurde bei 4ºC über Nacht zur vollständigen Ausfällung des Proteins stehengelassen. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 15.000 UpM (23.000 g) über 20 Minuten hinweg abgesammelt und der Überstand, der weniger als 10% des ursprünglichen Proteins enthielt, abgeschüttet. Das Pellet wurde in Dulbecco's PBS-Puffer (10 ml) nochmals gelöst und mittels Gelfiltration auf einer Bio-Gel-A-0,5 m-Säule fraktioniert. Der Haupt-Peak entsprechend dem Tetanus- Toxoid-Monomer wurde gepoolt und gegen entionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, was TT als einen weißen baumwollartigen Feststoff (65,4 mg, 41%) ergab.

Beispiel 6

Kopplung des O-desacetylierten Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharids {[o]-GCMP-(-)} an Tetanus-Toxoid (TT)

Eine Lösung, enthaltend [o]-GCMP-(-) (10 mg), TT (3,3 mg) und Natriumcyanoborhydrid (6,8 mg) in 0,20 M Phosphat-Puffer, pH 7,5, (0,222 ml) wurde bei 37ºC über 5 Tage hinweg stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde mit PBS-Puffer (0,5 ml) verdünnt und die unlöslichen Stoffe mittels Zentrifugation in einer Eppendorf- Zentrifuge bei 10.000 UpM über 2 Minuten hinweg entfernt. Der Überstand wurde auf eine 1,6 · 100 cm Bio-Gel-A-0,5 m-Säule aufgebracht und mit 0,15 M NaCl + 0,02% Thimerosal bei 20 ml/Std. eluiert. Die Fraktionen entsprechend dem beim Porenvolumen eluierenden Peak wurden gepoolt, um das O-desacetylierte Gruppe-C- Meningokokken-Polysaccharid/Tetanus-Toxoid-Konjugat [GCMP-(-)-TT] zu erhalten. Die gepoolte Lösung wurde auf das Protein mittels der Bradford-Methode analysiert und dabei ein Gehalt von 2,86 mg Protein (87% Ausbeute) nachgewiesen. Der Polysaccharid-Gehalt im Konjugat wurde aus dem Gehalt an Sialinsäure geschätzt, welcher mittels des Resorcinol-Assays für Sialinsäure bestimmt wurde, wodurch ein Gehalt von 0,997 mg Polysaccharid (10% Ausbeute) nachgewiesen wurde. Die Charakteristika des Konjugats sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Beispiel 7

Kopplung des O-acetylierten Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharids {[o]-GCMP-(+)} an Tetanus-Toxoid

Eine Lösung, enthaltend [o]-GCMP-(+) (10,2 mg), TT (2,9 mg) und Natriumcyanoborhydrid (5,2 mg) in 0,20 M Phosphat-Puffer, pH 7,5 (0,20 ml) wurde bei 37ºC über 5 Tage hinweg stehengelassen. Das Konjugat wurde mittels Gelfiltrations- Chromatographie gereinigt und wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert. Diese Konjugatlösung enthielt 2,7 mg (93% Ausbeute) an Protein und 1,06 mg (10,4% Ausbeute) Polysaccharid. Die Charakteristika dieses Konjugats sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Charakteristika der GCMP-(-)-TT- und GCMP-(+)-TT-Konjugate

Beispiel 7A

Herstellung der (-)-GCMP-TT-Vakzine

Die (-)-GCMP-TT-Vakzinen wurden in derselben Weise wie die GCMP-(-)-TT- Vakzinen in obigen Beispielen hergestellt, außer dass das Polysaccharid aus Gruppe C-N. meningitidis Stamm MC 19-Bakterien erhalten wurde. Diese Bakterien produzieren ein GCMP, dem die O-Acetyl-Komponenten fehlen.

Beispiel 8

Herstellung der Konjugat-Vakzine-Lösungen und biologische Untersuchungen

Die in Beispielen 6 und 7 beschriebenen Konjugat-Lösungen wurden mit Kochsalzlösung (0,15 M NaCl + 0,02% Thimerosal) so verdünnt, dass die Konzentration an Polysaccarid in allen Vakzinen 10 ug/ml betrug. Die Hälfte dieser Vakzine enthielten auch das Aluminiumhydroxid-Adjuvans bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml.
Die Immunogenitäten dieser Vakzinen wurden bei 4-6 Wochen alten nicht-verwandt gezüchteten weiblichen Swiss Webster CFW-Mäusen untersucht. Die Tiere erhielten subkutane 0,2-ml-Injektionen der Vakzinen am Tag 0, 14 und 28, wobei die Seren für den Antikörper-Assay wurden am Tag 38 entnommen wurden.

Beispiel 9

Enzyme-linked-immunosorbent-Assay (ELISA) für Mäuse-Antikörper gegen Gruppe-C-Neisseria-meningitidis-Polysaccharid

Der ELISA wurde durch Beschichten von Mikrotiterplatten mit dem geeigneten Polysaccharid [GCMP-(-)- oder GMCP-(+)]-Humanserumalbumin-(HSA)-Konjugat, gefolgt von einer Behandlung mit BSA-Blockierpuffer, vorgenommen. Daraufhin wurden die Verdünnungen der Seren in PBS-Tween-Puffer aufgebracht. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert, gewaschen und dann mit dem zweiten Antikörper [Ziege-Anti-Maus-IgG-(H+L)-Peroxidase] bei Raumtemperatur 30 Minuten lang behandelt. Dem folgte ein gründlicher Waschgang mit PBS-Tween und eine Behandlung mit frisch zubereitetem TMB-Peroxidase-Substrat, wie beschrieben bei Kirkegaard & Perry. Nach 15 Minuten wurde die Enzymreaktion mit in jede Vertiefung eingebrachter 1 M Phosphorsäure zum Stopp gebracht und die Extinktion unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts analysiert. Die ELISA-Titer sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Beispiel 10

Bakterizider Assay auf Gruppe-C-Neisseria meningitidis

Die bakterizide Wirksamkeit wurde durch Inkubieren von Gruppe-C-Neisseria meningitidis (Stamm C11) in Gegenwart einer geeigneten Lösung der Testseren und von Zwergkaninchen-Serum (Komplement-Quelle) bei 37ºC über 1 Stunde hinweg untersucht. Zwei negative Kontrollen, wobei in einem Fall die Testseren fehlten und im zweiten Fall ein Gehalt an Wärme-inaktiviertem Komplement vorlag, wurden in ähnlicher Weise inkubiert. Teilmengen dieser Lösungen (50 ul) wurden dann auf Schokoladenagarplatten im Duplikat aufgebracht und bei 35 bis 37ºC in 5% CO&sub2; über Nacht inkubiert, um auf Überlebende zu untersuchen. Am nächsten Morgen wurde die Anzahl von Kolonien auf jeder Platte gezählt und die Mittelwerte für die Duplikate errechnet. Der bakterizide Serum-Titer ist als die Serumverdünnung berichtet, die eine 50%-ige Überlebensrate erbrachte. Die bakteriziden Wirkungen für die verschiedenen Vakzinen sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3
Die Analyse mittels ELISA der aus Gruppen von Mäusen erhaltenen Seren, die mit den beiden Arten von Konjugat immunisiert worden waren, ergab das Vorhandensein hoher Titer des IgG-Antikörpers in beiden Gruppen von Mäusen. Die weitere Analyse der Seren unter Anwendung eines bakteriziden Assays gegen den modifizierten Stamm erbrachte ein überraschendes Ergebnis. Während die ELISA- Titer für aus beiden Vakzine-Gruppen erhaltenen Seren ähnlich waren, wiesen die von Mäusen erhaltenen Seren, die mit dem modifizierten Konjugat immunisiert worden waren, überlegene Mengen an bakteriziden Antikörpern auf, verglichen zu den Seren von Mäusen, die die native Konjugat-Vakzine erhalten hatten. Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen nahe, dass die vorliegende Konjugat-Vakzine eine Klasse von Antikörpern hervorruft, die eine potente bakterizide Wirksamkeit besitzen.

Synthese der Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccarid/Tetanus-Toxoid-Konjugate (GCMP-TT)

Aus O-Acetyl-positiven Stämmen isoliertes Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid wurde gereinigt und teilweise oder vollständig mit verdünnter Base O-desacetyliert. Das O-desacetylierte Polysaccharid als auch gereinigte Polysaccharid-Chargen, die nicht mit Base behandelt worden waren, wurden teilweise depolymerisiert und dann aktiviert und gereinigt. Der Umfang und die Position der O-Acetylierung auf den gereinigten und aktivierten Polysaccharid-Chargen wurde mittels hochauflösender magnetischer Kernresonanz-(NMR)-Spektroskopie (600 MHz) und das mittlere Molekulargewicht mittels Gelfiltrations-Säulenchromatographie bestimmt. Eine Zusammenfassung dieser Daten findet sich in Tabelle 4. Die Kopplung (4) dieser aktivierten Polysaccharide an Tetanus-Toxoid-Protein ergab die in Tabelle 5 gezeigten GCMP-TT-Konjugate, in der auch die prozentualen Polysaccharidgehalte in den GCMP-TT-Konjugaten zusammengefasst sind.

Herstellung der Vakzine-Lösungen und biologische Untersuchungen

Die GCMP-TT-Konjugat-Lösungen wurden mit Kochsalz verdünnt, enthaltend 0,01% Thimerosal, und direkt zur Immunisierung von Mäusen (Kochsalz) verwendet oder an Aluminiumhydroxid (Al-Adjuvans) oder Stearyltyrosin (St-Adjuvans) adsorbiert. Jede fertiggestellte Vakzine-Lösung oder -Gemisch enthielt das Konjugat zu 10 ug/ml bezüglich des Polysaccharidgehalts im Konjugat. Alle Vakzine-Formulierungen wurden zusammen mit den Tetanus-Toxoid- und Polysaccharid-Kontrollen bei Gruppen von 10 weiblichen Mäusen (4 bis 6 Wochen alt) mittels subkutaner Injektion von 0,2 ml der Vakzinelösungen oder Gemische am Tag 0, 14 und 28 getestet. Die Seren wurden am Tag 38 entnommen und bis zur Analyse mittels ELISA oder bakterizidem Assay tiefgefroren gelagert.

Serologische Untersuchungen

Die Immunreaktionen auf das Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid in den Konjugat-Vakzinen sind bezüglich ihrer ELISA-Titer ausgedrückt. Jedes der Seren wurde mittels zweier Methoden analysiert. Bei der ersten enthielt das aufgetragene Antigen [GCMP-Humanserumalbumin-Konjugat] O-Acetyl-negatives Polysaccharid, und bei der zweiten enthielt das aufgetragene Antigen [GCMP-Rinderserumalbumin- Konjugat] das O-Acetyl-positive Polysaccharid. Die ELISA-Daten sind in Abb. 1, 2, 4 und 5 gezeigt. Die Seren aus den Kontrollen, die freies Tetanus-Toxoid- Protein, O-Acetyl-positives Polysaccharid und O-Acetyl-negatives Polysaccharid enthielten, ergaben keine nachweisbaren ELISA-Titer bei den niedrigsten analysierten Verdünnungen (111000). Alle Seren wurden auch auf ihre Komplementabhängigen bakteriziden Wirksamkeiten gegen Gruppe C-N. meningitidis Stamm C 11, einem O-Acetyl-positiven Stamm, analysiert. Die bakteriziden Titer, wie in Abb. 3 und 6 gezeigt, stellen die Serumverdünnungen dar, die eine 50%-ige Überlebensrate erbrachten. Alle Seren aus den Kontrollen zeigten keine bakterizide Wirksamkeit bei den niedrigsten analysierten Verdünnungen (1/1000).

Ergebnisse und Diskussion

Die Immunreaktion auf alle bei dieser Untersuchung präparierten Konjugate wurde in drei verschiedenen Vakzine-Formulierungen unter Verwendung sowohl von ELISA als auch dem Komplement-abhängigen bakteriziden Assay ausgewertet. Die Formulierungen umfassen Kochsalzlösungen der Konjugate oder liegen als adsorbierte Gemische an Aluminiumhydroxid oder Stearyltyrosin vor. Die ELISAs an den Seren von allen Konjugaten zeigen beträchtlich höhere Immunreaktionen, wenn die Konjugate am Aluminiumhydroxid adsorbiert waren, und die geringsten Immunreaktionen, wenn sie als deren Kochsalzlösungen injiziert wurden (siehe Abb. 1, 2, 4 und 5). Die mit Stearyltyrosin komplexierten Konjugate ergaben in allen Fällen höhere Immunreaktionen als die Kochsalzlösungen, doch waren die Immunreaktionen ebenfalls in allen Fällen um ein Mehrfaches geringer als bei den Aluminiumhydroxid adsorbierten Konjugaten. Der bakterizide Assay ergab dieselbe Tendenz für die drei Vakzine-Formulierungen (siehe Abb. 3 und 6).
Die ELISA-Titer für die GCMP-TT-Konjugate, bei denen das mittlere Molekulargewicht des Konjugat-Polysaccharids ähnlich ist (12.000 bis 14.800 Dalton, siehe Tabelle 1) sind in Abb. 1 und 2 gezeigt. In Abb. 1 wurden die ELISA- Titer mit der Antigenbeschichtung (GCMP-HSA), enthaltend das O-Acetyl-negative Polysaccharid, erhalten. Bei diesem Antigen liegt eine Umkehrrelation zwischen den ELISA-Titern und dem Umfang der O-Acetylierung des Konjugat-Polysaccharids insofern vor, als die höchsten Titer für das am wenigsten O-acetylierte Polysaccharid erhalten wurden. Ein völlig anderes Muster ist aus Abb. 2 erkennbar, worin die mit dem aufgetragenen Antigen (GCMP-BAS), enthaltend das O-Acetyl-positive Polysaccharid, erzielten Titer gezeigt sind. In diesem Fall steigen die ELISA-Titer mit zunehmendem O-Acetyl-Gehalt, wobei allerdings die Unterschiede bei den Titern zwischen den Konjugaten, enthaltend den geringsten Umfang und den höchsten Umfang an O-Acetylierung, nicht so groß sind wie bei Verwendung der O-Acetyl- negativen Antigenbeschichtung beobachtet (siehe Abb. 1). Die Beziehung zwischen dem Umfang der O-Acetylierung und der Komplement-abhängigen bakteriziden Wirksamkeit gegenüber dem Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid Stamm C11 (einem O-Acetyl-positiven Stamm) ist in Abb. 3 gezeigt. Es liegt eine deutliche Abnahme der bakteriziden Wirksamkeit mit steigendem Grad der O-Acetylierung vor. Die bakterizide Wirksamkeit korreliert also eng mit den ELISA- Titern, wie mit der O-Acetyl-negativen Antigenbeschichtung erhalten (siehe Abb. 1). Für die an Aluminiumhydroxid adsorbierten Konjugate wird sowohl bei ELISA als auch dem bakteriziden Assay eine annähernd dreifache Abnahme bei den Titern mit einem von 5 bis 70 Prozent steigendem Grad der O-Acetylierung beobachtet. Wie in Abb. 1 bis 3 gezeigt, zeigen die drei Formulierungen der Vakzinen in jedem der drei Assays dieselbe Tendenz. Die in Abb. 1 bis 3 gezeigten Beziehungen wurden auch bei wiederholter Analyse der Seren beobachtet.
Über den Grad der O-Acetylierung und die Art der Formulierung hinaus, zeigt außerdem die Größe des Polysaccharids in den Konjugat-Vakzinen eine wichtige Wirkung auf die Immunreaktion. Dies ist in Abb. 4 bis 6 für GCMP-TT- Konjugate gezeigt, in denen das Polysaccharid zu 61-65% O-acetyliert ist. Dieselben Tendenzen sind in den beiden ELISAs beobachtbar (Abb. 4 und 5). Die höchsten ELISA-Titer werden bei den Konjugat-Vakzinen beobachtet, bei denen das Polysaccharid ein mittleres Molekulargewicht von 12.000 Dalton in den Aluminiumhydroxid- und Stearyltyrosin-Formulierungen aufweist, obschon die Differenzen bei Aluminiumhydroxid-absorbierten Konjugaten besonders groß sind. Im Gegensatz zu den beiden ELISAs sind die bakteriziden Titer bei den Aluminiumhydroxid- und Stearyltyrosin-Formulierungen am höchsten für das Polysaccharid von 6.600 Dalton und nehmen mit steigender Polysaccharid-Größe ab (siehe Abb. 6). Tabelle 4 Mittleres Molekulargewicht (mittl. Mol.-Gew.) und Beschaffenheit der O-Acetylierung in den gereinigten und aktivierten Polysaccharid-Proben
% O-Acetylierung wird mittels hochauflösender NMR-Spektroskopie durch Vergleich der Integrale der Methin-Protonen an Positionen 7 und 8 zu jenen für die Protonen an Position 3 der Sialinsäure-Reste bestimmt. Tabelle 5 Zusammenfassung der % Polysaccharid-Gehalte in den GCMP-TT-Konjugaten

Claims

1. Immunogenes Konjugat, umfassend Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid in kovalenter Bindung an einen polymeren Träger, enthaltend O-desacetyliertes O- Acetyl-positives Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid oder ein Fragment davon, wobei der Grad der Desacetylierung mehr als 80% beträgt, zur Verwendung als eine Vakzine gegen N. meningitidis-Infektion.

2. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Desacetylierung 100% beträgt.

3. Verwendung eines immunogenen Konjugats, umfassend Gruppe-C- Meningokokken-Polysaccharid in kovalenter Bindung an einen polymeren Träger, enthaltend O-desacetyliertes O-Acetyl-positives Gruppe-C-Meningokokken- Polysaccharid oder ein Fragment davon, wobei der Grad der Desacetylierung mehr als 80% beträgt, für die Herstellung einer Vakzine gegen N. meningitidis- Infektion.

4. Verwendung eines immunogenen Konjugats nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad der Desacetylierung 100% beträgt.

5. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Konjugats für die Präparation einer Vakzine gegen N. meningitidis-Infektion, umfassend die Aktivierung von Gruppe-C-Meningokokken-Polysaccharid oder eines Fragments davon zur Bindung, und die Bindung des aktivierten Polysaccharids oder Fragments davon an ein Träger-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Aktivierung mehr als 80% der Acetylgruppen des Polysaccharids oder Fragments davon desacetyliert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass 100% der Acetylgruppen desacetyliert sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Desacetylierung unter leicht basischen Bedingungen in wässrigem Medium vorgenommen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Desacetylierung in 0,01 N bis 0,5 N Ammoniumhydroxid oder Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid bei einer Temperatur von 0 bis 50ºC, vorzugsweise 25ºC, vorgenommen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Desacetylierung über 1 bis 25 Stunden, bevorzugt 16 Stunden hinweg in 0,1 N NaOH vorgenommen wird.

10. Vakzine gegen N. meningitidis-Infektion, umfassend einen pharmazeutisch geeigneten injizierbaren Arzneimittelträger und wahlweise ein physiologisch geeignetes Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, dass es als immunogene Komponente eine immunogene Menge an Konjugat aus einem polymeren Träger in kovalenter Bindung an ein O-desacetyliertes O-Acetyl-positives Gruppe-C- Meningokokken-Polysaccharid oder Fragment davon enthält, das zu mehr als 80% O-desacetyliert ist.

11. Vakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es das Polysaccharid oder Fragment davon zu 100% desacetyliert enthält.