MX2011006648A - Vacunas meningococales que incluyen receptor de hemoglobina. - Google Patents

Vacunas meningococales que incluyen receptor de hemoglobina.

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Rino Rappuoli
Maria Scarselli
Beatrice Arico
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Novartis Ag
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Abstract

El receptor de hemoglobina, meningococal, HmbR, se usa como un antígeno de vacuna en combinación con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo, en combinación con una vesícula de membrana exterior, meningococal, con otro antígeno meningococal purificado (por ejemplo, fHBP, 287, NadA, NspA, NhhA, App, 0mp85, LOS), con un sacárido capsular meningococal conjugado, etc.

Description

VACUNAS MENINGOCOCALES QUE INCLUYEN RECEPTOR DE HEMOGLOBINA Campo de la Invención Esta invención está en el campo de vacunas meningococales .
Antecedentes de la Invención Actualmente se están investigando varias vacunas contra el serogrupo B de Neisseria meningitidis ( "MenB" ) . Algunas vacunas se basan en vesículas de membrana exterior (OMV) , tal como el producto MENZBM de Novartis Vaccines, el producto VA-MENGOC-BCMR de Finlay Institute, y el producto ENBVACMR de Norwegian Institute of Public Health. Otras se basan en proteínas recombinantes , tal como la "vacuna universal para meningococo de serogrupo B" reportadas por Novartis Vaccines en referencia 1.
Breve Descripción de la Invención La invención se refiere al uso del receptor de hemoglobina meningococal , HmbR, como un antígeno de vacuna. A diferencia de la referencia 2, sin embargo, no se incluye HmbR como el único antígeno en una vacuna. Más bien, se incluye en combinación con uno o más antígenos meningococales adicionales para proporcionar una respuesta inmunitaria mejor y más amplia.
La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno de HmbR meningococal y REF. : 221379 una vesícula de membrana exterior, meningococal.
La invención también proporciona (i) una bacteria meningococal que hiper-expresa HmbR, y (ii) vesículas de membrana exterior preparadas de esta bacteria, y (iii) un proceso para producir vesículas de esta bacteria.
La invención también proporciona un meningococo que comprende un gen de hmbR cuya expresión no es variable en fase. La invención también proporciona un meningococo que expresa de manera constitutiva un hmbR. La invención también proporciona un meningococo que comprende un gen de hmbR bajo el control de un promotor inducible. La invención también proporciona (i) vesículas de membrana exterior preparadas de esta bacteria, y (ii) un proceso para producir vesículas de esta bacteria.
La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno de HmbR meningococal y uno o más de los siguientes antígenos meningococales : fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; 0mp85; y/o LOS.
La invención también proporciona (i) una bacteria no meningococal que expresa un HmbR meningococal, y (ii) vesículas de membrana exterior preparadas de esta bacteria no meningococal, y (iii) un proceso para producir vesículas de esta bacteria.
La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno de HmbR meningococal y un sacárido capsular, meningococal , conjugado.
La invención también proporciona un polipéptido híbrido que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula : -A- [-X-L-]n-B-en donde X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de antígeno meningococal, L es una secuencia de aminoácidos, ligadora, opcional, A es una secuencia de aminoácidos, N-terminal, opcional, B es una secuencia de aminoácidos, C-terminal opcional, y n es un número entero mayor que 1, con la condición que al menos 1 porción X sea un antígeno de HmbR. Las porciones X no de HmbR preferidas son: fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; y/o Omp85. Estos polipéptidos híbridos pueden formar parte de una composición inmunogénica .
La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende una mezcla de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; (iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6; y (iv) un antígeno de HmbR. La mezcla de (i) y (ii) y (iii) se describe en las referencias 1 Y 3.
La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, con la condición de que el polipéptido sea menor de 500 aminoácidos de largo, por ejemplo, <400aa, <300aa, <200aa.
La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, con la condición que el polipéptido sea menor de 750 aminoácidos de largo, por ejemplo, <750aa, <700aa.
La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22, con la condición de que el polipéptido no incluye una secuencia que esté (i) en la dirección 5' de SEQ ID NO: 22 en el polipéptido y (ii) idéntica a los aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 19.
HmbR Las composiciones de la invención incluyen un antígeno de HmbR meningococal . La secuencia de HmbR de longitud completa se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 [109] de serogrupo B meningococal como el gen NMB1668 (SEQ ID NO: 7 en la presente) . La referencia 2 reporta una secuencia de HmbR de una cepa diferente (SEQ ID NO: 8 en la presente) . Los ejemplos reportan en la presente la clonación de SEQ ID NO: 19 de la cepa NZ05/33. SEQ ID NOs : 7 y 8 difieren en longitud por 1 aminoácido y tienen 94.2 % de identidad. SEQ ID NO: 19 es un aminoácido más corto que SEQ ID NO: 7 y tiene 99 % de identidad (una inserción, siete diferencias) por CLUSTALW. La invención también puede usar cualquier polipéptido de HmbR.
La invención puede usar un polipéptido que comprende una secuencia de HmbR de longitud completa, pero frecuentemente usará un polipéptido que comprende una secuencia parcial de HmbR. De esta manera, en algunas modalidades, una secuencia de HmbR usada de acuerdo a la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos i % de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7, donde el valor de i es 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otras modalidades, una secuencia de HmbR usada de acuerdo a la invención puede comprender un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO : 7, donde el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. En otras modalidades, una secuencia de HmbR usada de acuerdo a la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tiene al menos i % de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7 y/o (ii) que comprende un fragmento de al menos j aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 7.
Los fragmentos preferidos de j aminoácidos comprende un epítopo de SEQ ID NO: 7. Estos epítopos comprenderán usualmente aminoácidos que están localizados en la superficie de HmbR. Los epítopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos comprendidos en la unión de HmbR a hemoglobina, puesto que los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria para unirse a la hemoglobina del hospedador. La topología de HmbR y sus residuos funcionales críticos, se investigaron en la referencia 4. Son útiles los fragmentos que retienen una secuencia transmembrana, debido a que se pueden desplegar en la superficie bacteriana, por ejemplo, en vesículas. Los ejemplos de fragmentos largos de HmbR corresponden a SEQ ID NOs : 21 y 22. Si se usa HmbR soluble, sin embargo, se pueden usar secuencias que omiten la secuencia transmembrana, pero típicamente que retienen los epítopos de la porción extracelular .
La mayoría de los antígenos de HmbR, útiles, de la invención, pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7. Los antígenos de HmbR ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales, bactericidas después de la administración a un sujeto.
Diferente de la referencia 5, el antígeno de HmbR de la invención normalmente no se conjugará a un antígeno de sacárido capsular.
Vesículas de Membrana Exterior y Cepas Meningococales, Adecuadas, Productoras de Vesículas Una modalidad de la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende (a) un antígeno de HmbR meningococal y (b) una vesícula de membrana exterior, meningococal. Estos dos componentes (a) y (b) se pueden preparar de manera separada y luego se mezclan para dar la composición inmunogénica [21] . Otra modalidad de la invención proporciona vesículas de membrana exterior preparadas de una bacteria meningococal que hiper-expresan un antígeno de HmbR meningococal. También se proporcionan [21] estas cepas de hiper-expresión . Las vesículas preparadas de estas cepas incluyen de manera preferente antígeno de HmbR, que debe estar en una forma inmunoaccesible en las vesículas, es decir, un anticuerpo anti-HmbR debe ser capaz de unirse al HmbR que está presente en las vesículas.
Estas vesículas de membrana exterior incluyen cualquier vesícula proteoliposómica obtenida por el rompimiento de, o la vesiculación de, una membrana exterior meningococal para formar vesículas de la misma, que incluyen componentes de proteínas de la membrana exterior. De esta manera, el término incluye OMV (algunas veces referidos como "vesículas"), microvesículas (MV [6]) y "OMV nativa" ("NOMV" [7]).
Las MV y NOMV son vesículas de membrana que se presentan de manera natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. Las MV se pueden obtener al cultivar Neisseria en el medio de cultivo en caldo, separando las células enteras de las MV más pequeñas en el medio de cultivo en caldo (por ejemplo, por filtración o por centrifugación a baja velocidad para sedimentar solo las células y no las vesículas más pequeñas) , y luego al recolectar las MV del medio agotado de células (por ejemplo, por filtración, por precipitación diferencial o agregación de las MV, por centrifugación de alta velocidad para sedimentar las MV) . Las cepas para el uso en la producción de las MV se pueden seleccionar en general en base a la cantidad de las MV producidas en cultivo, por ejemplo, referencias 8 y 9 describen Neisseria con alta producción de MV.
Las OMV se preparan de manera artificial de bacterias, y se pueden preparar usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato) , o por medios no detergentes (por ejemplo, ver referencia 10) . Las técnicas para formar las OMV incluyen tratar las bacterias con un detergente de sal de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con desoxicolato de sodio [11 y 12] que se prefiere tratar Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [13] . Se puede realizar sustancialmente otras técnicas en la ausencia de detergente [10] usando técnicas tal como tratamiento con ultrasonido, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, molienda, prensa francesa, mezclado, etc. Los métodos que no usan o usan poco detergente pueden retener los antígenos útiles tal como NspA [10] . De esta manera, un método puede usar un amortiguador de extracción de OMV con aproximadamente 0.5 % de desoxicolato o menor, por ejemplo, aproximadamente 0.2 %, aproximadamente 0.1 %, <0.05 % o cero.
En la referencia 14 se describe un proceso útil para la preparación de OMV y comprende la ultrafiltración de las OMV crudas, en lugar de centrifugación de alta velocidad. El proceso puede comprender el paso de ultra-centrifugación después de que tome lugar la ultrafiltración .
Las vesículas para el uso con la invención se pueden preparar de cualquier cepa meningococal . Las vesículas serán usualmente de una cepa de serogrupo B, pero es posible prepararlas de serogrupos diferentes de B (por ejemplo, la referencia 13 describe un proceso para el serogrupo A) , tal como A, C, W135 o Y. La cepa puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo, y cualquier inmunotipo (por ejemplo, Ll; L2 ; L3 ; L3 , 3 , 7 ; LIO; etc.). EL meningococo puede ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiperinvasivos e hipervirulentos, por ejemplo, cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV- 1; complejo ET-5; complejo ET-37; agrupación A4 ; linaje 3. Estos linajes se han definido por electroforesis enzimática de multilocus (MLEE) , pero también se ha usado tipificación de secuencia de multilocus (MLST) para clasificar los meningococos [referencia 15] por ejemplo, el complejo ET-37 es el complejo ST-11 por MLST, el complejo ET-5 es ST-32 (ET-5), el linaje 3 es ST-41/44, etc. se pueden preparar vesículas de cepas que tienen uno de los siguientes subtipos: P1.2; Pl.2,5; P1.4; Pl .5 ; Pl .5 , 2 ; Pl .5 , C ; P1.5c,10; Pl.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; Pl.9,15; Pl .12 , 13 ; P1.13; P1.14; Pl.21,16; Pl .22 , 14.
Las vesículas usadas con la invención se pueden preparar de cepas meningococales tipo silvestre o de cepas meningococales mutantes (incluyendo cepas manejadas para hiper-expresar un antígeno de HmbR a meningococal ) . Por ejemplo, la referencia 16 describe preparaciones de vesículas obtenidas de N. meningitidis con un gen fur modificado. La referencia 25 enseña que la expresión de nspA se debe favorecer con la supresión concomitante de porA y cps . Los mutantes de supresión adicionales de N. meningitidis para la producción de OMV se describen en las referencias 25 a 27. La referencia 17 describe vesículas en las cuales se favorece la expresión de fHBP. La referencia 18 describe la construcción de vesículas de cepas modificadas para expresar seis diferentes subtipos de PorA. También se puede usar [19, 20] Neisseria mutante con bajos niveles de endotoxina, logrado por supresión de enzimas comprendidas en las biosíntesis de LPS . Estos u otros mutantes se pueden usar todos con la invención .
De esta manera, una cepa usada en la invención puede expresar en algunas modalidades más de un subtipo de PorA. Anteriormente se han construido cepas de PorA 6-valente y 9-valente. La cepa puede expresar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de los subtipos de PorA: Pl.7,16; Pl.5-1, 2-2; Pl .19, 15-1; Pl.5-2,10; Pl.12-1,13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; Pl.7-1,1 y/o Pl.18- 1,3, 6. En otras modalidades, una cepa se puede haber reducido en expresión para la expresión de PorA, por ejemplo, en la cual se ha reducido la cantidad de PorA por al menos 20 % (por ejemplo, >30 %, >40 %, >:50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, etc.), o aún suprimido, con relación a los niveles tipo silvestre (por ejemplo, con relación a la cepa H44/76, como se describe en la referencia 29) .
En algunas modalidades, una cepa puede hiper-expresar (con relación a la cepa tipo silvestre correspondiente) ciertas proteínas. Por ejemplo, las cepas pueden hiper-expresar NspA, proteína 287 [21] , fHBP [17] , TbpA y/o TbpB [22], Cu, Zn-superóxido-dismutasa [22], etc. Como se menciona anteriormente, en algunas modalidades, un meningococo hiper-expresará (con relación a la cepa tipo silvestre correspondiente) un antígeno de HmbR. De esta manera, se puede colocar un gen codificador de HmbR bajo el control de un promotor que conduce a más expresión que el promotor de la cepa tipo silvestre, o la cepa se puede proporcionar con una secuencia codificadora de HmbR, no nativa, por ejemplo, por la integración en el cromosoma o dentro de un plásmido.
De manera ventajosa para la producción de vesículas, se puede manejar genéticamente un meningococo para asegurarse que tiene un gen de hmbR y no se somete a variación de fase. Los métodos para reducir o para eliminar la variabilidad de fase de la expresión génica en el meningococo se describe en la referencia 23. Por ejemplo, se puede colocar un gen hmbR, bajo el control de un promotor constitutivo o inducible, o al remover o reemplazar el motivo de ADN que es responsable de su variabilidad de fase.
En algunas modalidades, una cepa puede incluir una o más de las mutaciones de supresión y/o de hiper-expresión, descritas en las referencias 24 a 27. Los genes preferidos para la reducción de la expresión y/o para la supresión incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, QrC, CtrD, FrpB, GalE , HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [24] ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [25] ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [26] ; y (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, y/o SynC [27] .
Donde se usa una cepa mutante, en algunas modalidades, puede tener una o más, o todas, las siguientes características: (i) LgtB y/o GalE reducido en expresión o suprimido para truncar el LOS meningococal ; (ii) TbpA favorecido en expresión; (iii) NhhA favorecido en expresión; (iv) Omp85 favorecido en expresión; (v) LbpA favorecido en expresión; (vi) NspA favorecido en expresión; (vii) PorA suprimido; (viii) FrpB reducido en expresión o suprimido; (ix) Opa reducido en expresión o suprimido; (x) Opc reducido en expresión o suprimido; (xii) complejo génico cps suprimido. Un LOS truncado puede ser uno que no incluya un epítopo de sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, puede ser un LOS deficiente en galactosa. El LOS puede no tener cadena x.
Dependiendo de la cepa meningococal usada para preparar las vesículas, pueden incluir o no el antígeno de HmbR nativo de la cepa [28] . Se pueden usar ya sea las vesículas que contienen HmbR o que están libres de HmbR con la invención pero, donde las vesículas se preparan de una cepa que hiper-expresa HmbR, la finalidad es asegurarse que las vesículas sean las que contienen HmbR.
Si está presente LOS en una vesícula, es posible tratar una vesícula para enlazar su LOS y los componentes de proteína (conjugación "intra-vesícula" [27]) .
La invención se puede usar con mezclas de vesículas de diferentes cepas. Por ejemplo, la referencia 29 describe una vacuna que comprende composiciones de vesículas meningococales multivalentes , que comprende una primera vesícula derivada de una cepa meningococal con un serosubtipo prevalente en un país de uso, y una segunda vesícula derivada de una cepa que no necesita tener un serosubtipo prevalente en un país de uso. La referencia 30 también describe combinaciones útiles de diferentes vesículas. Una combinación de vesículas de las cepas en cada uno de los inmunotipos L2 y L3 se puede usar en algunas modalidades .
Tres cepas antecedentes útiles para manejar cepas que hiper-expresan HmbR son MC58, NZ05/33 y GB013. MC58 tiene el serosubtipo 1.7,16 de PorA NZ05/33 tiene el serosubtipo 1.7-2,4; GB013 tiene el serosubtipo 1.22,9. fHBP (Proteína de Unión al Factor H) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de fHBP, ya sea como un polipéptido purificado, separado de un antígeno de HmbR purificado o como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de fHBP se ha caracterizado en detalle. También se ha conocido como la proteína "741" [SEQ ID NOS. 2535 y 2536 en referencia 40], "NMB1870", "GNA1870" [referencias 31-33], "P2086", "LP2086" o "ORF2086" [34-36].
De manera natural, es una lipoproteína y se expresa a través de todo los serogrupos meningococales . La estructura del dominio inmunodominante C-terminal del fHbp ("fHbpC") se ha determinado por RMN [37] . Esta parte de la proteína forma un ß-barril de ocho hebras, cuyas hebras están conectadas por asas de longitudes variables. El barril se precede por una hélice a corta y por un extremo N-terminal flexible.
El antígeno de fHBP cae en tres variantes distintas [38] y se ha encontrado que el suero formulado contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir, hay protección cruzada intra-familiar, pero no protección cruzada inter-familiar . La invención puede usar una variante de fHBP individual, pero de manera útil incluirá una fHBP de dos o tres de las variantes. De esta manera, puede usar una combinación de dos o tres diferentes fHBP, seleccionadas de: (a) una primera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos antiguos de SEQ ID NO: 1; (b) una segunda proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos b % de identidad de secuencia SEQ ID NO : 2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; y/o (c) una tercera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos c % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 3 y/o que comprende una secuencia aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO : 3.
El valor de a es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. El valor de b es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. El valor de c es al menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, o más. Los valores de a, b y c no están relacionados intrínsecamente entre sí.
El valor de x es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de z es al menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Los valores de x, y y z no están intrínsecamente relacionados entre sí.
Donde la invención usa una variante de fHBP individual, una composición puede incluir un polipéptido que comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a % de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos b % de identidad de secuencia a SEQ ID NO : 2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; o (c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos c % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO : 3.
Donde la invención usa una fHBP de dos o tres de las variantes, una composición puede incluir una combinación de dos o tres diferentes fHBP seleccionadas de: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos b % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2; y/o (c) un tercer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos c % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3. El primero, segundo y tercer polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.
Donde la invención usa una fHBP de dos de las variantes, una composición puede incluir tanto: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; y (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos b % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 2 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2. El primero y segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.
Donde la invención usa una fHBP de dos de las variantes, una composición puede incluir tanto: (a) un primer polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a % de identidad de secuencia SEQ ID NO: 1 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 1; (b) un segundo polipéptido, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos c % de identidad de secuencia SEQ ID NO : 3 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3. El primero y segundo polipéptidos tienen diferentes secuencias de aminoácidos.
En algunas modalidades, las proteínas fHBP se tratarán con lípidos, por ejemplo, en una cisteína N-terminal . En otras modalidades, no se tratarán con lípidos. 287 Una composición de la invención puede incluir un antígeno 287, ya sea como un polipéptido purificado, separado de un antígeno de HmbR purificado o como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno 287 se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB2132 (número de acceso a GenBank GI:7227388; SEQ ID NO: 9 en la presente). Las secuencias del antígeno 287 de muchas cepas se han publicado desde entonces. Por ejemplo, las formas alélicas de 287 se pueden ver en las Figuras 5 y 15 de la referencia 39, y en el ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 40 (SEQ ID NOS. 3179 a 3184 de la presente) . También se ha reportado varios fragmentos inmunogénicos del antígeno 287.
Los antígenos 287 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 9; y/o (b) que comprende a fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 9, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 9.
Los antígenos 287 más útiles de la invención pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, puedan unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. Los antígenos 287 ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto.
NadA (Adesina A Neisserial) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de NadA, ya sea como un polipéptido purificado separado de un antígeno de HmbR purificado o como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de NadA se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB1994 (número de acceso al GenBank GI : 7227256; SEQ ID NO : 10 en la presente). Las secuencias de antígenos de NadA de muchas cepas se han publicado desde entonces, y la actividad de la proteína como una adesina Neisserial está bien documentada. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NadA.
Los antígenos de NadA preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 10, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 10.
Los antígenos de NadA más útiles de la invención pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10. Los antígenos de NadA ventajosos para el uso en la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto. SEQ ID NO: 6 es uno de estos fragmentos .
NspA (Proteína A de Superficie Neisserial) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de NspA, ya sea como un polipéptido purificado, separado de un antígeno de HmbR purificado como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de NspA se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB0663 (Número de acceso al GenBank GI : 7225888 ; SEQ ID NO: 11 en la presente). El antígeno se conoció anteriormente de las referencias 41 y 42. Las secuencias del antígeno de NspA de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NspA.
Los antígenos de NspA preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 11, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 11.
Los antígenos de NspA más útiles de la invención pueden producir anticuerpo que, después de la administración a un sujeto, puedan unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11. Los antígenos de NspA ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto.
NhhA (Homólogo de hia Neisserial) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de NhhA, ya sea como un polipéptido purificado separado de un antígeno de HmbR purificado o como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de NhhA se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB0992 (Número de acceso al GenBank GI:7226232; SEQ ID NO: 12 en la presente). Las secuencias de antígeno de NhhA de muchas cepas se han publicado desde entonces, por ejemplo, referencias 39 y 43, y se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de NhhA. También se conoce como Hsf.
Los antígenos de NhhA preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 12, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos más preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 12.
Los antígenos de NhhA más útiles de la invención pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12. Los antígenos de NhhA ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto.
App (Proteína de Adhesión y Penetración) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de App, ya sea como un polipéptido purificado, separado de un antígeno de HmbR purificado, como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de App se incluyó en la secuencia de genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB1985 (Número de acceso al GenBank GI:7227246; SEQ ID NO: 13 en la presente). Las secuencias del antígeno de App de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se ha conocido como "0RF1" y "Hap" . También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de App .
Los antígenos de App preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50 o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 13; y/o que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 13, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 13.
Los antígenos de App más útiles de la invención pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13. Los antígenos de App ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti-meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto.
Omp85 (Proteína de Membrana Exterior de 85kDa) Una composición de la invención puede incluir un antígeno de Omp85, ya sea como un polipéptido purificado, separado de un antígeno de HmbR purificado como parte del mismo polipéptido como un antígeno de HmbR (es decir, como parte de un polipéptido híbrido) .
El antígeno de Omp85 se incluyó en la secuencia del genoma publicada para la cepa MC58 de serogrupo B meningococal [109] como el gen NMB0182 (Número de acceso al GenBank GI:7225401; SEQ ID NO: 14 en la presente). Las secuencias del antígeno de Omp85 de muchas cepas se han publicado desde entonces. La información adicional de Omp85 se puede encontrar en las referencias 44 y 45. También se han reportado varios fragmentos inmunogénicos de Omp85.
Los antígenos de Omp85 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) a SEQ ID NO: 14; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 14, en donde "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 14.
Los antígenos de 0mp85 más útiles de la invención pueden producir anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, puedan unirse a un polipéptido meningococal que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Los antígenos de Omp85 ventajosos para el uso con la invención pueden producir anticuerpos anti- meningococales bactericidas después de la administración a un sujeto.
Polipéptidos Híbridos En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido híbrido que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula -A- [-X-L-] ?-?- , en la presente: X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de antígeno meningococal ; L es una secuencia de aminoácidos, ligadora, opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal, opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal, opcional; y n es un número entero mayor que uno (usualmente n es 2 o 3) .
Al menos una porción X es un antígeno de HmbR, como se define anteriormente. De manera ideal, al menos una porción X adicional se selecciona de: fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; y/o 0mp85.
Al expresar al menos dos (por ejemplo, 2, 3 4, 5, o más) antígenos como una cadena de polipéptido individual (el polipéptido "híbrido") hay dos ventajas principales: primero, un polipéptido que puede ser inestable o pobremente expresado en sí mismo se puede ayudar al adicionar un compañero híbrido adecuado que supera el problema; segundo, se simplifica la producción comercial puesto que sólo se necesita emplear expresión y purificación a fin de producir dos polipéptidos que son ambos antigénicamente útiles.
Si una porción -X- tiene una secuencia peptídica guía en su forma tipo silvestre, esto se puede incluir u omitir en la proteína híbrida. En algunas modalidades, los péptidos guía se suprimirán excepto por aquel de la porción -X- localizada en el N-término de la proteína híbrida, es decir, el péptido guía de i se retendrá, pero los péptidos guía de X2... Xn se omitirán. Esto es equivalente a suprimir todos los péptidos guía y usar el péptido guía de Xi como la porción -A- .
Para cada n casos de [-X-L-] , la secuencia de aminoácidos ligadora -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 , el híbrido puede ser NH2-Xi-Li- X2-L2-COOH, NH2-Xi-X2 - COOH , ^ - XI - LÍ - XS - COOH , NH2 - X1 - X2 - L2 - COOH , etc. Las secuencias de aminoácidos ligadoras -L - serán típicamente cortas (por ejemplo 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, ligadores de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y marcas de histidina (es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos, ligadoras, adecuadas, serán evidentes para los expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 15) o GSGSGGGG (SEQ ID NO:16), con el dipéptido GLy-Ser que se forma de un sitio de restricción de BamHI , ayudando de este modo a la clonación y manipulación, y el tetrapéptido (Gly)4 que es un ligador típico de poli -glicina . Otros ligadores adecuados, particularmente para el uso como la Ln final son un dipéptido Leu-Glu .
-A- es una secuencia de aminoácidos, N-terminal, opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Los ejemplos incluyen secuencias guía para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcas de histidina, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos, N—terminales , adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Si Xi carece de su propia metionina N-terminal, -A- es de manera preferente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina de N-término, por ejemplo, Met-Ala-Ser, o un residuo Met individual.
-B- es una secuencia de aminoácidos, C- terminal, opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden marcas de histidina, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como SEQ ID N0:17) , o secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos, C—terminales , adecuadas, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.
LOS Un antígeno de HmbR meningococal se puede usar en combinación con un lipo-oligosacárido (LOS) meningococal, purificado. Se puede usar LOS en sí mismo o conjugado a un portador. Cuando se conjuga, la conjugación puede ser mediante una porción de lípido A en el LOS o por cualquier otra porción adecuada, por ejemplo, sus residuos de KDO. Si la porción de lípido A de LOS está ausente entonces se requiere este enlace alternativo.
El LOS usado con la invención puede ser de cualquier inmunotipo, por ejemplo, L2 , L3 , L7 , etc.
En lugar de usar el LOS nativo, se prefiere usar una forma modificada. Estas modificaciones se pueden lograr de manera química, pero es más conveniente suprimir las enzimas en MenB responsables de ciertas adiciones biosintéticas . Por ejemplo, se puede modificar el LOS para remover al menos el Gal terminal de la unidad nativa de lacto-N-neotetraosa, y esta modificación se puede lograr al suprimir una o más de las enzimas pertinentes. Las enzimas responsables de adicionar los dos monosacáridos terminales en un LOS nativo (ácido siálico y galactosa) se pueden suprimir, ya sea para eliminar solo el Sia terminal o para eliminar el disacárido Sia-Gal. Suprimiendo el gen lgtB, por ejemplo, remueve Sia-Gal. Una supresión del gen galE también proporciona un LOS modificado, útil. Un gen de transferasa grasa de lípido A se puede suprimir [46] .
Se puede remover al menos un ácido graso 0-enlazado, primario del LOS [47] . También se puede usar [48] el LOS que tiene un número reducido de cadenas secundarias de acilo por molécula de LOS. El LOS puede no tener cadena a.
El LOS puede comprender GlcNAc-Hep2fosfoetanolamina-KD02-LipidA [49] .
Sacáridos Capsulares Meningococales Se puede usar un antígeno de HmbR meningococal en combinación con uno o más sacáridos capsulares meningococales, que usualmente se conjugarán a proteínas portadoras.
Las vacunas monovalentes conjugadas contra el serogrupo C se han aprobado para uso en humanos, e incluyen ME JUGATEMR, ME I GITECMR y NEISVAC-CMR. Se conocen [50, 51] mezclas de conjugados de los serogrupos A+C y se han aprobado [52-55] mezclas de conjugados de los serogrupos A+C+W135+Y y se han aprobado en 2005 como el producto MENACTRAMR.
Una composición de la invención puede incluir uno o más conjugados se sacáridos capsulares de 1 , 2, 3 o 4 de los serogrupos meningococales A, C, 135 e Y por ejemplo., A+C, A+W135, A+Y, C+ 135, C+Y, W135+Y, A+C+ 135, A+C+Y, A+ 135+Y, A+C+W135+Y, etc. Son ideales los componentes que incluyen sacáridos de los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y.
El sacárido capsular del meningococo de serogrupo A es un homopolímero de (al?6) -enlazado-N-acetil-D-manosamina-1-fosfato, con O-acetilación parcial en las posiciones C3 y C4. La acetilación en la posición C-3 puede ser de 70-95 %. Las condiciones usadas para purificar el sacárido pueden dar por resultado la des-O-acetilación (por ejemplo, bajo condiciones básicas) , pero es útil para retener OAc en esta posición C-3. En algunas modalidades, al menos 50 % (por ejemplo, al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más) de los residuos de monosamina en los sacáridos se serogrupo A están O-acetilados en la posición C-3. Se pueden reemplazar grupos acetilo con grupos bloqueadores para impedir la hidrólisis [56] , y estos sacáridos modificados son aún sacáridos de serogrupo A dentro del significado de la invención.
El sacárido capsular de serogrupo C es un homopolímero de ácido siálico (a 2?9 ) -enlazado (ácido N-acetil-neuramínico, o "NeuNAc" ) . La estructura del sacárido se escribe como ?9) -Neu p NAc 7/8 OAc- (ct2?. La mayoría de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en C-7 y/o C-8 de los residuos de ácido siálico, pero aproximadamente 15 % de los aislados clínicos carecen de estos grupos de O-acetilo [57, 58] . La presencia o ausencia de grupos OAc genera epitopos únicos, y la especificidad de la unión a anticuerpo al sacárido puede afectar su actividad bactericida contra cepas O-acetiladas (OAc+) y des-O-acetiladas (OAc-) [59-61] . Los sacáridos del serogrupo C usados con la invención se pueden preparar de ya sea las cepas OAc+ u OAc- . Las vacunas de conjugado de MenC licenciadas incluyen sacáridos tanto OAc- (NEISVAC-CMR) y OAc+ (MENJUGATEMR & MENINGITECMR) . En algunas modalidades, las cepas para la producción de conjugados del serogrupo C son cepas OAc+, por ejemplo, serotipo 16, serosubtipo Pl.la,l, etc. De esta manera, se pueden usar cepas C:16:P1.7a,l OAc+. También se usan cepas 0Ac+ en el serosubtipo Pl.l, tal como la cepa Cll.
El sacárido de serogrupo W135 es un polímero de unidades de ácido siálico-galactosa-disacárido . Diferente del sacárido del serogrupo C, tiene O-acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 de ácido siálico [62] . La estructura se escribe como: ?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2?6) -D-Gal-a- (1?.
El sacárido de serogrupo Y es similar al sacárido de serogrupo 135, excepto que la unidad repetitiva de disacárido incluye glucosa en lugar de galactosa. Como el serogrupo W135, tiene O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [62] . La estructura del serogrupo Y se escribe como: ?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2?6) -D-Glc-a- (1?.
Los sacáridos usados de acuerdo a la invención se pueden O-acetilar como se describe anteriormente (por ejemplo, con el mismo patrón de O-acetilación como se ve en los sacáridos capsulares nativos) , o se pueden des-O-acetilar parcial o totalmente en una o más posiciones de los anillos de sacárido, o se pueden hiper-O-acetilar con relación a los sacáridos capsulares nativos.
Las porciones de sacárido en los conjugados pueden comprender sacáridos de longitud completa como se prepara de meningococos , y/o pueden comprender fragmentos de sacáridos de longitud completa, es decir, los sacáridos pueden ser más cortos que los sacáridos capsulares nativos vistos en las bacterias . Los sacáridos de esta manera se pueden despolimerizar, con la despolimerización que se presenta durante o después de la purificación de los sacáridos pero antes de la conjugación. La despolimerización reduce la longitud de cadena de los sacáridos. Un método de despolimerización comprende el uso de peróxido de hidrógeno [52] . Se adiciona peróxido de hidrógeno a un sacárido (por ejemplo, para dar una concentración final de H202 de 1 %) , y la mezcla entonces se incuba (por ejemplo, a aproximadamente 55 °C) hasta que se ha logrado una reducción deseada de la longitud de cadena. Otro método de despolimerización comprende hidrólisis ácida [53] . En la técnica se conocen otros métodos de despolimerización. Los sacáridos usados para preparar conjugados para el uso de acuerdo a la invención se pueden obtener por cualquiera de estos métodos de despolimerización . Se puede usar la despolimerización a fin de proporcionar una longitud óptima de cadena para inmunogenicidad y/o para reducir la longitud de cadena para manejabilidad física de los sacáridos . En algunas modalidades, los sacáridos tienen el siguiente intervalo de grados promedio de polimerización (Dp) : A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. En términos de peso molecular, en lugar de Dp, los intervalos útiles son, para todos los serogrupos : <100kDa; 5kDa-75kDa; 7kDa-50kDa; 8kDa-35kDa; 12kDa-25kDa; 15kDa-22kDa En algunas modalidades, el peso molecular promedio para los sacáridos de cada uno de los serogrupos meningococales A, C, W135 e Y puede ser más de 50kDa por ejemplo, >75kDa, >100kDa, >110kDa, >120kDa, >130kDa, etc. [63] , y aún hasta 1500kDa, en particular como se determina por MALLS . Por ejemplo: un sacárido de MenA puede estar en el intervalo de 50-500kDa, por ejemplo, 60-80kDa; un sacárido de MenC puede estar en el intervalo de 100-210kDa; un sacárido de Men 135 puede estar en el intervalo de 60-190kDa, por ejemplo, 120-140kDa; y/o un sacárido de MenY puede estar en el intervalo de 60-190kDa, por ejemplo, 150-160kDa.
La masa del sacárido meningococal por serogrupo en una composición estará usualmente entre ^g y 20µg, por ejemplo, entre 2 y 10µg por serogrupo, o aproximadamente 4µg o aproximadamente 5µg o aproximadamente l(^g. Donde los conjugados de más de un serogrupo se incluyen entonces pueden estar presentes a masas sustancialmente iguales, por ejemplo, la masa del sacárido de cada serogrupo está dentro de +10 % uno de otro. Como una alternativa a una relación igual, se puede usar una masa doble de sacárido de serogrupo A. de esta manera, una vacuna puede incluir un sacárido de MenA A 10µ9 y sacáridos de MenC, 135 e Y a 5µg cada uno.
Las proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas, tal como toxinas de difteria o tétano, o toxoides o mutantes de estos. Se usan comúnmente en vacunas de conjugado. La toxina mutante de difteria CRMi97 es particularmente preferida [64] . Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen el complejo de proteína de membrana exterior de N. meningitidis [65], péptidos sintéticos [66, 67] proteínas de choque térmico [68, 69], proteínas de pertusis [70, 71] , citocinas [72] , linfocinas [72] , hormonas [72] , factores de crecimiento [72] , proteínas artificiales que comprende múltiples epitopos de células T CD4+, de humano, de varios antígenos derivados de patógeno [73] tal como N19 [74], proteína D de H.influenzae [75-77], pneumolisina [78] o sus derivados no tóxicos [79] , proteína de superficie pneumonococal PspA [80] , proteínas de captación y hierro [81], toxina A o B de C.difficile [82], exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [83] , etc. Una proteína portadora individual puede tener sacáridos de múltiples serogrupos diferentes [84] , pero este arreglo no se prefiere. Donde una composición incluye conjugados de más de un serogrupo meningococal entonces los varios conjugados pueden usar diferentes proteínas portadoras (por ejemplo, un serogrupo en CRM197, otro entoxoide de tétano) o pueden usar la misma proteína portadora (por ejemplo, sacáridos de dos serogrupos conjugados de manera separada a CRM197 y luego se combinan) .
Se pueden usar conjugados con una relación de sacárido :proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso), por ejemplo, relaciones entre 1:2 y 5:1 y relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5.
Como se describe en la referencia 85, diferentes conjugados de serogrupos meningococales en una mezcla pueden tener diferentes relaciones de sacárido: proteína, por ejemplo, uno puede tener una relación de entre 1:2 y 1:5, en tanto que el otro tiene unas relación entre 5:1 y 1:1.99.
La molécula portadora se puede conjugar de manera covalente al glucano directamente o mediante un ligador. Se conocen varios ligadores, por ejemplo, un ligador de ácido adípico, que se puede formar al acoplar un grupo -NH2 libre (por ejemplo, introducido a un sacárido por aminación) con ácido adípico (usando, por ejemplo, activación con diimina) , y luego al acoplar una proteína al compuesto intermedio de sacárido-ácido adípico, resultante [86, 87]. Otro tipo preferido de enlace es un ligador de carbonilo, que se puede formar por reacción de un grupo hidroxilo libre de un glucano modificado con CDI [88, 89] seguido por reacción por una proteína para formar un enlace de carbamato. Otros ligadores incluyen ß-pro ionamido [90] , nitrofenil-etilamina [91] , haluros de haloacilo [92] , enlaces glicosídicos [93] , ácido 6-aminocaproico [94] , N-succinimidil-3- (2-piridiltio) -propionato (SPDP) [95] , dihidrazida de ácido adípico ADH [96] , porciones de C a C12 [97] , etc. También se puede usar condensación de carbodiimida [98] .
Como se describe en la referencia 99, una mezcla puede incluir un conjugado con enlace directo de sacárido/proteína y otro conjugado con enlace mediante un ligador. Este arreglo implica de manera particular cuando se usan conjugados de sacáridos de diferentes serogrupos meningococales , por ejemplo, sacáridos de MenA y MenC se pueden conjugar mediante un ligador, en tanto que sacáridos de MenW135 y MenY se pueden conjugar directamente a una proteína portadora.
Donde una composición incluye uno o más de conjugados de MenA, C, W y/o Y, en algunas modalidades, puede incluir también de manera ventajosa un conjugado de Hib (sacárido capsular tipo B de Hameophilus influenzae) . Donde una composición incluye un sacárido de más de un serogrupo meningococal , existe una masa media de sacárido por serogrupo. Si se usan masas sustancialmente iguales de cada serogrupo entonces la masa media será la misma como cada masa individual; donde se usan masas no iguales entonces la media diferirá, por ejemplo, con una cantidad de 10:5:5:5 µg para una mezcla de MenACWY, la masa media es 6.25µg por serogrupo. Si también se incluye un sacárido de Hib, entonces, en algunas modalidades, su masa será sustancialmente la misma como la masa media de sacárido meningococal por serogrupo. En algunas modalidades, la masa de sacárido de Hib será más de (por ejemplo, al menos 1.5x) la masa media de sacárido meningococal por serogrupo. En algunas modalidades, la masa de sacárido de Hib será menor que (por ejemplo, por al menos 1.5x) la masa media de sacárido meningococal por serogrupo [100] .
Bacterias No Meningococales para Despliegue de HmbR En algunas modalidades de la invención, se presenta el antígeno de HmbR meningococal por una bacteria no meningococal, por ejemplo, por una bacteria de E. coli.
De esta manera, la invención proporciona una bacteria no meningococal que expresa un HmbR meningococal. Esta bacteria es de manera útil una bacteria Gram-negativa . De manera ideal es una bacteria de Escherichia coli. La bacteria puede expresar de manera constitutiva el antígeno de HmbR heterólogo, o el gen HmbR puede estar bajo el control de un promotor inducible.
La cepa puede tener un sistema Tol-Pal defectuoso, tal que libera de manera espontánea vesículas durante el crecimiento normal, evitando de este modo cualquier requisito de extracción con detergente, etc. Estos mutantes de Tol-Pal de E. coli se describen, por ejemplo, en las referencias 101 y 102, por ejemplo, una cepa que no exprese una proteína TolR funcional, por ejemplo, con una supresión de tolR.
La invención también proporciona vesículas de membrana exterior preparadas de esta bacteria no meningococal , así como un proceso para producir vesículas de esta bacteria no meningococal .
Composiciones Farmacéuticas La invención se puede usar para preparar composiciones farmacéuticas para la administración a un paciente. Típicamente estas incluirán un portador farmacéuticamente aceptable. En la referencia 103 está disponible un análisis minucioso de portadores farmacéuticamente aceptables.
Los volúmenes efectivos de dosis se pueden establecer por rutina, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de aproximadamente 0.5 mi, por ejemplo, para inyección intramuscular. La vacuna basada en OMV de RIVM se administró en un volumen de 0.5 mi [104] por inyección intramuscular al muslo o brazo superior. Se administró MeNZBMR a 1.5ml por inyección intramuscular al muslo anterolateral o la región daltoide del brazo. Se pueden usar dosis similares paras otras rutas de administración, por ejemplo, vacuna intranasal basada en OMV para atomización puede tener un volumen de aproximadamente ???µ? o aproximadamente 130µ1 por aspersión, con cuatro aspersiones o nebulizaciones administradas para dar una dosis total de aproximadamente 0.5ml .
El pH de una composición de la invención usualmente está entre 6 y 8, y de manera más preferente entre 6.5 y 7.5 (por ejemplo, aproximadamente 7) . El pH de la vacuna basada en OMV de RIVM es 7.4 [105], y un pH <7.5 se prefiere para composiciones de la invención. La vacuna basada en OMV de RIVM mantiene el pH al usar un amortiguador de Tris-HCl lOmM, y se puede mantener un pH estable en las composiciones de la invención mediante el uso de un amortiguador, por ejemplo, un amortiguador de Tris, un amortiguador de citrato, un amortiguador de fosfato, o un amortiguador de histidina. De esta manera, las composiciones de la invención incluirán en general un amortiguador.
La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos.
Las composiciones de la invención para administración a pacientes son inmunogénicas , y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir, impedir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno, así como cualquier otro componente, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea como una dosis individual o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se trate, de la edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección que se desea, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor que trata con respecto a la situación médica, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. El contenido de antígeno de las composiciones de la invención se expresará en general en términos de la cantidad de proteína por dosis. Una dosis de aproximadamente 0.9 mg de proteína por mi es típica para vacunas intranasales basadas en OMV.
Las composiciones de la invención pueden incluir un adyuvante inmunológico . De esta manera, por ejemplo, pueden incluir un adyuvante de sal de aluminio o una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno en agua) . Las sales de amonio, adecuadas incluyen hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos , ortofosfatos) , (por ejemplo, ver capítulos 8 y 9 de referencia 106), o mezclas de estos. Las sales pueden tomar cualquier forma adecuada por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.) con adsorción de antígeno a la sal que es lo preferido. La concentración de Al+++ en una composición para administración a un paciente es de manera preferente menor de 5 mg/ml por ejemplo, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido está entre 0.3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de dosis de 0.85 mg/dosis. Los adyuvantes de hidróxido de aluminio son particularmente adecuados para el uso con vacunas meningococales .
Los meningococos afectan varias áreas del cuerpo y de este modo las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas líquidas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, por un inhalador, usando una aspersión fina. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como aspersión o gotas. Los productos inyectables para administración intramuscular son típicos.
Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasan en un formato de múltiples dosis. Los antimicrobianos tal como tiomersal y 2 -fenoxietanol se encuentran comúnmente en las vacunas, pero se prefiere usar ya sea un conservador libre de mercurio o nada de conservador.
Las composiciones de la invención pueden comprender un detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. En general, están presentes detergentes a niveles bajos, por ejemplo, <0.01 %.
Las composiciones de la invención pueden incluir detergente residual (por ejemplo, desoxicolato) de la preparación de OMV. La cantidad de detergente residual es de manera preferente menos de 0.4 g (de manera más preferente, menos de 0.2 pg) por cada g de proteína de MenB.
Si una composición de la invención incluye LOS, la cantidad de LOS es de manera preferente menor de 0.12 ]ig (de manera más preferente menor de 0.05 \ig) por cada pg de proteína.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de NaCl es típica por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.
Métodos de Tratamiento La invención también proporciona un método para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende administrar una composición de la invención al mamífero. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y comprende de manera preferente anticuerpos. El método puede formular una respuesta de refuerzo en un paciente que sea cebado ya contra N. meningitidis .
El mamífero es preferentemente un humano. Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un infante) o un adolecente donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. También se puede administrar una vacuna propuesta para niños a los adultos, por ejemplo, para valorar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
La invención también proporciona composiciones de la invención para el uso como un medicamento. El medicamento se usa de manera preferente para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es de manera más preferente una vacuna.
La invención también proporciona el uso de composiciones de la invención en la elaboración de un medicamento para formular, una respuesta inmunitaria en un mamífero. La invención también proporciona el uso de (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) una vesícula de membrana exterior, meningococal, en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero. La invención también proporciona el uso de (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) uno o más de los siguientes antígenos meningococales : fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; Omp85; LOS, en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero. La invención también proporciona el uso de (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) un sacárido conjugado de un sacárido capsular meningococal, en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero.
Estos usos y métodos son de manera preferente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por N. meningitidis, por ejemplo bacteriana (o, de manera más específica, meningococal), o septicemia.
Una manera para verificar la eficiencia del tratamiento terapéutico comprende monitorizar la infección Neisserial después de la administración de la composición de la invención. Una manera para verificar la eficiencia del tratamiento profiláctico comprende monitorizar las respuestas inmunitarias contra antígenos después de la administración de la composición. La inmunogenidad de las composiciones de la invención se pueden determinar al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales [107] ) y luego al determinar parámetros normales que incluyen anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y títulos de ELISA (GMT) . Estas respuestas inmunitarias se determinarán en general alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y se comparan a valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un incremento de SBA de al menos 4 veces u 8 veces. Donde se administre más de una dosis de la composición, se puede hacer más de una terminación después de la administración.
En general, las composiciones de la invención son capaces de inducir respuestas de anticuerpos bactericidas en suero después de que se administren a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y son un indicador normal de la eficiencia de la vacuna. La actividad bactericida en suero (SBA) mide la aniquilación bacteriana mediada por el complemento, y se puede analizar usando complemento de conejo neonato o humano. Las normas de la WHO requieren que una vacuna induzca al menos un aumento de 4 veces en la SBA en más de 90 % de los pacientes. MeNZBMR produce un aumento de 4 veces en SBA 4-6 semanas después de la administración de la tercera dosis.
Las composiciones preferidas pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente humano que es superior al criterio para seroprotección para un porcentaje aceptable de sujeto. Los antígenos con un título asociado de anticuerpos por arriba del cual se considera que se seroconvierte un hospedador contra el antígeno, son bien conocidos, y estos títulos se publican por organizaciones tal como la WHO. De manera preferente, se seroconvierte más de 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos, de manera más preferente más de 90 %, de manera aún más preferente más de 93 % y de manera más preferente 96-100 %.
Las composiciones de la invención se administrarán en general de manera directa a un paciente. La administración directa se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, de manera subcutánea, intraperitonealmente , de manera intravenosa, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido), o por cualquier otra ruta adecuada. La invención se puede usar para producir inmunidad sistémica y/o mucosa. Se prefiere la administración intramuscular al muslo o brazo superior. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero se puede usar de manera alternativa inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi.
El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria se puede seguir por un programa de dosis de refuerzo. Se puede determinar por rutina la sincronización adecuada entre las dosis de cebadura (por ejemplo, entre 4-16 semanas), y entre la cebadura y el refuerzo. La vacuna de RIVM basada en OMV se probó usando un programa primario de 3 o 4 dosis, con vacunación a 0.2 y 8 o 0, 1, 2 y 8 meses. Se administra MeNZBMR como tres dosis en intervalos de seis semanas .
Las composiciones de la invención se pueden usar para inducir sus respuestas de anticuerpos bactericidas contra más de un linaje hipervirulento de meningococo. En particular, pueden inducir de manera preferente respuestas bactericidas contra dos o tres de los siguientes tres linajes hipervirulentos : (i) agrupación A4 ; (ii) complejo ET5; y (iii) linaje 3. Adicionalmente pueden inducir respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de linajes hipervirulentos de subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37, y contra otros linajes, por ejemplo, linajes hiperinvasivos . Esto no significa necesariamente que la composición puede inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de las cepas de meningococo dentro de estos linajes hipervirulentos, por ejemplo, más bien, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas de meningococo dentro de un linaje hipervirulento particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra al menos 50 % (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. El suero tiene de manera preferente un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o superior, de manera preferente al menos 214) por ejemplo, el suero es capaz de aniquilar al menos 50 % de las bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1/1024.
Las composiciones útiles pueden incluir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas de meningococos de serogrupo B: (i) de agrupación A4 , cepa 961-5945 (B:2b:Pl .21, 16) y/o cepa G2136 (B:-); (ii) de complejo ET-5, cepa MC58 (B : 15 : Pl .7 , 16b) y/o cepa 44/76 (B : 15 : Pl .7 , 16 ) ; (iii) de linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B:NT:-). Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98.
Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia de MLST de Neisseria [puntos 638 y 1002 en referencia 108] . La cepa MC58 está ampliamente disponible (por ejemplo, ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 109. Se ha usado ampliamente la cepa 44/76 y se ha caracterizado (por ejemplo, referencia 110) y es una de las cepas de referencia de MLST de Neisseria [punto 237 en referencia a 108; fila 32 de Tabla 2 en referencia 15]. Originalmente se aisló la cepa 394/98 en Nueva Zelanda en 1998, y se han publicado varios estudios que usan esta cepa (por ejemplo, referencias 111 y 112) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia de MLST (punto 409 en referencia a 108; fila 41 de Tabla 2 en referencia a 15) .
Componentes Antigénicos Adicionales Así como contienen antígenos de N. meningitidis, las composiciones pueden incluir antígenos de patógenos adicionales. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos adicionales. - un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como un sacárido (típicamente conjugado) - un antígeno de virus de hepatitis B, tal como el antígeno de superficie HBsAg. - un antígeno de fíordetella pertussis, tal como la holotoxina de pertusis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3. - un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria . - un antígeno de tétano, tal como un toxoide de tétano . - un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B (Hib) , típicamente conjugado. - antígenos de poliovirus inactivado.
Donde se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere también que incluya el antígeno de tétano y los antígenos de pertussis. De manera similar, donde se incluye un antígeno de tétano se prefiere también incluir antígenos de difteria y de pertussis. De manera similar, donde se incluye un antígeno de pertussis, se prefiere también incluir antígenos de difteria y de tétanos. De esta manera se prefieren combinaciones de DTP.
Si se incluye un sacárido de Hib (típicamente como un conjugado) , la porción de sacárido puede ser un polisacárido (por ejemplo, poliribosilribitol-fosfato (PRP) de longitud completa como se purifica de bacterias) , pero también es posible fragmentar el sacárido purificado para producir oligosacáridos (por ejemplo, pesos moleculares de ~1 a ~5 kDa) por ejemplo, por hidrólisis. La concentración de conjugado de Hib en una composición usualmente estará en el intervalo de 0.5 pg a 50 g por ejemplo, de 1-20 µg, de 10-15 µg, de 12-16 pg, etc. La cantidad puede ser aproximadamente 15 g, o aproximadamente 12.5 yg en algunas modalidades. En una masa de 5 g puede ser adecuada [113] por ejemplo, en el intervalo de 1-5 yg, 2-4 yg, o aproximadamente 2.5 µg . Como se describe anteriormente, en las combinaciones que incluyen sacárido de Hib y sacáridos meningococales , la dosis del anterior se puede seleccionar en base a la dosis del último (en particular, con múltiples serogrupos meningococales, su masa media) . Las características adicionales de conjugados de Hib son como es describen anteriormente para conjugados meningococales, incluyendo la elección de la proteína portadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide de tétano) , enlaces, relaciones, etc.
Si se incluye un antígeno de S. pneumoniae, este puede ser un polipéptido o un sacárido. Los sacáridos capsulares conjugados son particularmente útiles para inmunizar contra pneumococos . El sacárido puede ser un polisacárido que tiene el tamaño que aumenta durante la purificación del sacárido de la bacteria, o puede ser un oligosacárido logrado por fragmentación de este polisacárido. El producto PREV ARMR 7-valente, por ejemplo, 6 de los sacáridos están presentes como polisacáridos intactos en tanto que uno (el serotipo 18C) está presente como un oligosacárido. Una composición puede incluir un sacárido capsular de uno o más de los siguientes serotipos pneumococales : 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y/o 33F. Una composición puede incluir múltiples serotipos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o más serotipos. En la técnica son bien conocidas las combinaciones de conjugados 7-valentes, 9-valentes, 10-valentes, 11-valentes y 13-valentes, como es una combinación no conjugada 23-valente. Por ejemplo, una combinación 10-valente puede incluir sacárido de serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Una combinación 11-valentente puede incluir además sacárido de serotipo 3. Una combinación 12-valente puede adicionarse a la mezcla 10-valente : serotipos 6A y 19A; 6A y 22F; 19A y 22F; 6A y 15B; 19A y 15B; 22F y 15B; una combinación 13-valente puede adicionarse a la mezcla 11-valente: serotipos 19A y 22F; 8 y 12F; 8 y 15B; 8 y 19A; 8 y 22F; 12F y 15B; 12F y 19A; 12F y 22F; 15B y 19A; 15B y 22F, etc. Las características adicionales de conjugados pneumococales son como se describen anteriormente para conjugados meningococales , incluyendo elección de la proteína portadora (por ejemplo, CRM197 o toxoide de tétano), enlaces, relaciones, etc. Cuando una composición incluye más de un conjugado, cada conjugado puede usar la misma proteína portadora o una diferente proteína portadora. La referencia 114 describe ventajas potenciales cuando se usan diferentes proteínas portadoras en vacunas de conjugados pneumococales multivalentes .
General La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, referencia 115-121, etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
El término "aproximadamente" con relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10 % .
Donde la invención se refiere a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de células B y/o epítopo de células T, pero usualmente se hará un epítopo de células B. estos epítopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCA [122,123] o métodos similares), o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson- olf [124] , planteamientos basados en matriz [125] , MAPITOPE [126], TEPITOPE [127,128], redes neurales [129], OptiMer y EpiMer [130, 131], ADEPT [132], Tsites [133], hidrofilicidad [134] , índice antigénico [135] o los métodos descritos en las referencias 136-140, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconocen por, y se unen a, los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos o receptores de células T, y también se pueden referir "determinantes antigénicos" .
Donde la invención usa un antígeno "purificado", este antígeno se separa de su ambiente que se presenta de manera natural. Por ejemplo, el antígeno estará sustancialmente libre de otros componentes meningococales , diferente de otros antígenos purificados que estén presentes. Una mezcla de antígenos purificados se preparará típicamente al purificar cada antígeno de manera separada y luego al recombinarlos, aún si los antígenos están naturalmente presentes en mezcla.
Las referencias a un porcentaje de entidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando están alineadas, este porcentaje de aminoácidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de referencia 141. Una alineación preferida se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de separación de afinidad con una penalidad de abertura de separación de 12 y una penalidad de extensión de separación de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en referencia 142.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando es necesario, la palabra "sustancialmente" se puede omitir de la definición de la invención.
Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A a IB muestran curvas de crecimiento (OD contra tiempo de cultivo en minutos) de cultivos de MC58 (Figura 1A) o M1239 (Figura IB) en la presencia (cuadrados) o ausencia (diamantes) de desferal.
La Figura 2 muestra una Western Blot usando un suero anti-HmbR. Las cuatro sendas son, de izquierda a derecha: MC58, desferal"; MC58, desferal+; M1239, desferal"; M1239, desferal+. La flecha muestra HmbR.
La Figura 3 es la misma como la Figura 2, pero el suero es suero anti-Tbp2. La flecha muestra Tbp2.
La Figura 4 muestra análisis por FACS MC58. Las tres columnas son para diferentes anticuerpos de marcación, de izquierda a derecha: pre-inmunitario; anti-HmbR-2; anti-Tb 2. Las dos filas son para bacterias cultivadas en la ausencia (parte superior) o presencia (fondo) de desferal.
La Figura 5 es la misma como la Figura 4 pero para la cepa M1239.
La Figura 6 es una Western Blot que muestra la expresión de HmbR en: (1 y 8) MC58 tipo silvestre; (2) MC58 con supresión del gen hmbR endógeno; (3-7) la cepa con supresión con un gen hmbR exógeno controlado por un promotor inducible por IPTG, con IPTG 0, 0.001, 0.01, 0.1 o 1 mM; (9) MC58 tipo silvestre crecido con desferal; y cepa NZ tipo silvestre (10) .
La Figura 7 es una Western Blot que muestra la expresión de HmbR en cepas GB013 : wt = GB013 tipo silvestre; k/o = GB013AhmbR; c = GB013AhmbR-chmbR. Cada cepa se analizó por 0.5 o 1 µ9 de proteína.
La Figura 8 es una Western Blot de material de membrana exterior de varias cepas. Las sendas 1-3 contienen HmbR- 2 recombinante a diferentes diluciones. La senda 5 es la cepa BL21 de E.coli con uñ gen hmbR meningococal heterologo. La senda 12 es la cepa GB013 complementadas. Otras sendas son controles .
La Figura 9 es una Western Blot de fracciones obtenidas después del crecimiento por auto- inducción de las cepas de E.coli BL21. Las sendas son para 2-6 una cepa delta AtolR; sendas 8-12 son para una cepa DE3*. Las sendas 4, 6, 9 y 10 muestran fuertes bandas para HmbR.
La Figura 10 muestra análisis por FACS de la expresión de HmbR en una cepa AtolR de E. coli. El pico de la cepa que expresa HmbR está a la derecha.
La Figura 11 es una Western Blot de vesículas de varias cepas. Las sendas 1-3 contienen HmbR-2 recombinante a diferentes diluciones. Las sendas 5, 7 y 9 son de la cepa AtolR de E. coli que expresa HmbR, a diluciones decrecientes. Las sendas 11 y 12 son de la cepa BL21 sin modificación de TolR.
Descripción Detallada de la Invención Muchos aislados meningococales no incluyen un gen hmbR. Además, en las cepas hmbR+, la expresión del gen se somete a variación de fase [143] , que es la alteración de la expresión génica entre fases de activación y desactivación como resultado de cambios reversibles a nivel de ADN. La variación de fase es un mecanismo común de control de la expresión de factores de virulencia expuestos en la superficie en muchos patógenos.
Se ha detectado el gen hmbR en 10 entre 12 cepas en un panel de cepas de linaje III. En las 10 cepas, el gen estuvo conservado con la cepa MC58.
El gen hmbR se clonó de la cepa NZ05/33. La secuencia codificadora, incluyendo el péptido guía, está 2373pb más paro (SEQ ID NO: 18) , que codifica para un polipéptido de 791 aminoácidos (SEQ ID NO: 19). Se produjeron varios derivados de esta secuencia para la expresión: (i) "HmbR-tapón" que tienen los aminoácidos 24-170 de SEQ ID NO: 19 (es decir SEQ ID NO: 20) , fusionado a una marca de polihistidina C-terminal; (ii) "HmbR-bajo" que tiene los aminoácidos 171-791 de SEQ ID NO: 19 (es decir, SEQ ID NO: 21), fusionado a una marca de polihistidina C-terminal; (iii) "HmbR-2" que tiene los aminoácidos 24-791 de SEQ ID NO: 19 (es decir, SEQ ID NO: 22), omitiendo el péptido guía, fusionado a una marca de polihistidina C-terminal; y (iv) "HmbR-3" que tiene los aminoácidos 1-791 de SEQ ID NO: 19, fusionados a una marca de polihistidina C-terminal.
Se transformaron vectores que codifican para estos polipéptidos en células BL21 de E.coli para la expresión. Los polipéptidos expresados se purificaron y usaron para inmunizar ratones. El HmbR-tapón fue soluble, con un peso molecular de 16kDa. El HmbR-bajo (68kDa) fue insoluble pero se puede solubilizar con urea 8M urea para inmunización. El HmbR-2 (85kDa) fue insoluble pero se puede solubilizar con urea 2M para inmunización. Estos tres polipéptidos purificados se usaron para inmunizar ratones en combinación con el adyuvante completo de Freund (FCA) y los sueros inmunitarios se probaron por SBA. También se probó una mezcla de HmbR-tapón y HmbR-bajo de esta manera.
Ninguno de los polipéptidos de HmbR fue capaz de inducir anticuerpos bactericidas en ratones (todos los títulos de SBA <16) . Además, los sueros no pueden detectar la exposición de superficie de HmbR en la cepa homologa NZ05/33 (ensayo por FACS) . Los extractos de proteína, en cambio, los sueros pueden detectar la proteína en cepas hmbR+ (excepto para M01-240149) .
A pesar de la ausencia de activad de SBA, se realizaron experimentos adicionales. Los antisueros anti-HmbR se probaron contra bacterias que se han cultivado en la presencia de desferal 25µ?, limitando de este modo la disponibilidad de hierro a la bacteria. Se cultivaron dos cepas: una cepa hmbR+ (MC58) y una cepa hmbR~ (M1239) . Las cepas crecieron mucho menos bien en la presencia de desferal (Figuras 1A y IB) .
Se usó Western Blot y análisis por FACS para valorar la expresión. Para comparación, se usó Tbp2 como un control positivo puesto que la expresión de esta proteína se ha reportado anteriormente que se induce en condiciones de poco hierro.
El análisis por Western Blot mostró que la expresión de HmbR en MC58 se incrementó en condiciones de poco hierro, pero no es vio en M1239 en ninguna condición (Figura 2) . En contraste, se expresó Tbp2 por ambas cepas en condiciones de poco hierro (Figura 3) . El análisis por FACS se confirmó que la expresión de HmbR inmunoaccesibles se incrementó a condiciones de poco hierro en MC58 (Figura 4) pero no en M1239 (Figura 5) .
En contraste a los resultados de SBA reportados anteriormente, cuando se probaron los sueros contra cepas cultivadas en condiciones de poco hierro, se vio un título bactericida incrementado los sueros anti-HmbR se probaron contra MC58 que se ha cultivado en ya se la ausencia (bacteria a OD 0.25) o en la presencia (bacterias a OD 0.16) de desferal y los títulos fueron como sigue, a comparación a los antisuero bactericidas de control positivo: Desferal - Desferal * Anti-HmbT <16 256 Control positivo 8192 >8192 Los experimentos adicionales confirmaron que los sueros formulados contra los diferentes derivados de HmbR (o combinaciones de los mismos) no tienen actividad bactericida contra la cepa C58 cuando se han cultivado en medio libre de desferal, pero presentaron alguna actividad bactericida contra MC58 que se ha cultivado en la presencia de desferal 25 µ?. Los títulos por arriba del fondo para las bacterias cultivadas con desferal se vieron usando sueros formulados contra HmbR-2.
Estos experimentos son el primer reporte que los anticuerpos anti-HmbR pueden ser bactericida contra meningococo. De esta manera, en contraste a informes anteriores, los anticuerpos anti-HmbR pueden en realidad jugar un papel en la protección contra infección y enfermedad meningococal , en particular durante las fases de crecimiento donde se expresa HmbR en la superficie bacteriana. Por lo tanto HmbR puede ser útil en vacunas meningococales , particularmente si se usa en combinación con uno o más antígenos meningococales adicionales. La remoción de su variabilidad de fase en una bacteria manejada proporciona una cepa para la cual se pueden preparar fácilmente vesículas HmbR+ .
Se intentaron otros planteamientos para incrementar la expresión de HmbR, en lugar de usar desferal . El crecimiento en la presencia de hemoglobina humana, pueden experimentar la expresión de HmbR [143] y mutantes fur que no expresan el represor Fur también pueden expresar una cantidad máxima de HmbR. Se midió el nivel de expresión de HmbR en estas dos circunstancias, y también se realizó la SBA.
El crecimiento en la presencia de hemoglobina humana 4 µ? no mejora el nivel de expresión de HmbR más allá de los niveles vistos cuando se usa desferal . Los títulos de SBA con sueros anti-HmbR de esta manera fueron bajos.
El mutante fur desplegó un buen niel de expresión de HmbR pero esta cepa no se puede usar para SBA debido a que se aniquiló por complemento sin suero.
También, dos pasos consecutivos de cultivo con un quelador de hierro no mejoran el título de SBA para MC58. Se vio un pequeño incremento con la cepa de Z, pero este incremento puede ser debido (al menos parcialmente) al paso de lavado en el ensayo; este paso puede debilitar algunas veces las bacterias. En conjunto, estos resultados soportan una correlación entre los altos niveles de expresión de HmbR y la aniquilación bacteriana.
En experimentos adicionales, se manejó una cepa MC58 para remover su gen hmbR endógeno. El gen suprimido se complementó por' un gen hmbR exógeno controlado por un promotor inducible por IPTG. La Figura 5 muestra que la cepa manejada puede expresar muchos niveles elevados de HmbR que la cepa tipo silvestre, por ejemplo, sendas 6 y 7. También se usó FACS para estudiar la expresión en superficie, usando sueros formulados contra HmbR-2, HmbR-bajo y HmbR-tapón. Los experimentos de FACS confirmaron una expresión muy baja en la superficie de la cepa tipo silvestre, ninguna expresión en la superficie de la cepa con supresión, ninguna expresión en la superficie de la cepa con supresión cultivada sin IPTG, pero buena expresión después de la inducción con IPTG. Se vieron altos niveles similares con inducción con IPTG 0.1 y 1 mM.
Los experimentos con SBA en estas cepas mostraron que la alta expresión y exposición en superficie de HmbR hace a la cepa más sensible al complemento. A altos niveles de IPTG, las bacterias se aniquilaron por el complemento solo (de conejo o humano) , pero IPTG no tiene efecto en las cepas tipo silvestre. Los experimentos mostraron que la cepa de hiperexpresión de HmbR se une al complemento solo, y que está unión no depende de los antisueros que se usaron.
Las cepas de supresión y de hiperexpresión también se obtuvieron usando la cepa GB013 como el antecedente, para dar una cepa de supresión (GB013AhmbR) y la cepa complementada (GB013AhmbR-chmbR) . El gen de complementación fue de la cepa NZ . Estas cepas basadas en GB013 mostraron resultados similares a las cepas basadas en MC58 para la expresión, FACS y SBA.
En conjunto, los datos sugieren que existe un umbral crítico de la expresión de HmbR que se puede tolerar por bacterias en la presencia de complemento de conejo/humano .
Se prepararon OMV de las cepas basadas en GB013. La Figura 7 muestra una Western Blot de la OMV de las tres cepas usando un suero policlonal anti-HmbR-2. La concentración de proteína en las preparaciones de OMV fue 0.272 mg/ml (tipo silvestre), 0.504 mg/ml (AhmbR) y 0.457 mg/ml (complementado) . La hiperexpresión de HmbR con relación a la cepa de antecedente, tipo silvestre, es evidente en la Figura 7.
En trabajo adicional, se manejó una cepa de E. coli para expresar HmbR meningococal de la cepa NZ . Se transformó una cepa BL21 (BL21DE* ) con pET21b hmbR. La Western Blot confirmó que la cepa expresó HmbR (por ejemplo, senda 5 de la Figura 8) . También se transformó una cepa ..ItolR de E.coli [101, 102] con pET21b hmbR para proporcionar una cepa que libere vesículas que contienen HmbR durante el crecimiento (por ejemplo, sendas 4 y 6 de la Figura 9) . FACS confirmó la expresión de HmbR en ambas cepas, ver, por ejemplo, Figura 10 para las cepas AtolR. Se confirmó que las vesículas preparadas de la cepa AtolR contienen HmbR (por ejemplo, senda 5 de la Figura 11) .
Para inmunización se usan las OMV de las cepas GB013 meningococales y de las cepas de E.coli.
Se entenderá que la invención se describe anteriormente sólo a manera de ejemplo y se pueden hacer modificaciones en tanto que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) una vesícula de membrana exterior, meningococal.
2. Una bacteria meningococal, manejada, caracterizada porque hiper-expresa un antígeno de HmbR meningococal .
3. Una bacteria meningococal, manejada, caracterizada porque comprende un gen hmbR cuya expresión no es variable en fase.
4. Una bacteria meningococal, manejada, caracterizada porque expresa de manera constitutiva un HmbR.
5. Una bacteria meningococal, manejada, caracterizada porque comprende un gen hmbR bajo el control de un promotor inducible.
6. Vesículas de membrana exterior, preparadas de la bacteria de conformidad con la reivindicación 2, reivindicación 3, reivindicación 4 o reivindicación 5, caracterizadas porque incluyen el antígeno de HmbR meningococal .
7. Un proceso para producir vesículas de membrana meningococales , caracterizado porque comprende el paso de romper una bacteria meningococal de la reivindicación 2, reivindicación 3, reivindicación 4 o reivindicación 5 para proporcionar las vesículas.
8. Una composición inmunogénica , caracterizada porque comprende (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) uno o más antígenos meningococales seleccionados del grupo que consiste de: fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; 0mp85; y LOS .
9. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende (i) un antígeno de HmbR meningococal y (ii) uno o más sacáridos capsulares, meningococales, conjugados de los serogrupos A, C, W135 o Y.
10. Un polipéptido híbrido que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula: NH2-A- [-X-L-]n-B-C00H caracterizado porque: X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de antígeno meningococal, L es una secuencia de aminoácidos, ligadora, opcional, A es una secuencia de aminoácidos, N-terminal, opcional, B es una secuencia de aminoácidos, C-terminal, opcional, y N es un número entero mayor que 1, con la condición que al menos una porción X es un antígeno de HmbR.
11. El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque una porción X se selecciona del grupo que consiste de: fHBP; 287; NadA; NspA; NhhA; App; y Omp85.
12. Una composición inmunogénica , caracterizada porque comprende una mezcla de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 5 ; (iii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 6 y (iv) un antígeno de HmbR.
13. La composición, bacteria, vesículas, proceso o polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizados porque el HmbR comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia a SEQ ID. NO: 7 y/o que comprende un epítopo de SEQ ID NO: 7.
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