DE3586398T2 - Kovalentlich modifizierte neutrale bakterielle polysaccharide, stabile kovalente konjugate zwischen diesen polysacchariden und immunogenischen proteinen und verfahren zur herstellung dieser polysaccharide und konjugate. - Google Patents

Kovalentlich modifizierte neutrale bakterielle polysaccharide, stabile kovalente konjugate zwischen diesen polysacchariden und immunogenischen proteinen und verfahren zur herstellung dieser polysaccharide und konjugate.

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Description

  • Die Erfindung betrifft kovalent modifizierte neutrale bakterielle Polysaccharide, genauer Pneumokokken Typ 14- und ähnliche Polysaccharide, sowie kovalente Konjugate solcher Polysaccharide, die über ein zweifaches Bindeglied, das den Nachweis der kovalenten Natur erlaubt und die Reinigung und Konzentrierung von biologisch wünschenswerten Einheiten erleichtert, mit einer immunogenen bakteriellen Membran oder anderen Proteinen verbunden sind, welche Konjugate nützliche Bestandteile von bakteriellen Impfstoffen sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung solcher Polysaccharide und Konjugate.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Gereinigte Hüll-Polysaccharide von Bakterien wurden zur Herstellung von Impfstoffen gegen die zugehörigen Bakterien verwandt, wobei aber die resultierende Immunantwort oft weniger zufriedenstellend als gewünscht ausfiel, insbesondere bei sehr jungen Kindern oder Individuen mit unreifem oder fehlerhaftem Immunsystem. Das Hüll-Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae Typ 14 versagt beispielsweise bei der Herausforderung einer Immunantwort in Kindern, was dieses Polysaccharid selbst ineffektiv für die Bereitstellung eines Schutzes gegen durch Bakterien vom Streptococcus pneumoniae-Typ 14 verursachte ernsthafte pädiatrisch-medizinische Probleme macht, siehe beispielsweise Douglas et al., J. Infect. Diseases, 148, 131-137 (1983) sowie Laurence et al., Am. J. Diseases of Children, 137, 846-850 (1983). Eine Verbesserung der Immunogenizität dieser Polysaccharide kann oft durch ihre Kombination mit Proteinen erreicht werden, Schneerson et al., Infection and Immunity, 45, Nr. 3, 582-591 (1984) (Diskussion der Konjugation von Streptococcus pneumoniae Typ 6A).
  • Bei der Auswahl des Proteins, das mit diesen Polysacchariden kombiniert wird, muß jedoch sorgfältig vorgegangen werden. Bestimmte Proteine (beispielsweise Pertussinogen) sind nicht spezifische Stimulatoren des Immunsystems von Kindern. Diese Proteine können, in gewissem Ausmaß, die Immunantwort auf Polysaccharidantigene verstärken, jedoch führt solche nicht spezifische Aktivierung unglücklicherweise zu unerwünschten biologischen Effekten (das heißt Reaktogenizität). Die bei weitem bevorzugte spezifisch verbesserte Immunantwort auf diese Polysaccharidantigene kann bei Kindern durch "Konjugierung" dieser Polysaccharide mit geeigneten Proteinen erreicht werden, wie zuerst von W. F. Goebel und O. T. Avery in 1929 berichtet (J. Exptl. Medicine, 50, 521-531 (1929)).
  • Die Mittel zur Kombination von Polysaccharid und Protein müssen ebenfalls sorgfältig in Betracht gezogen werden. Falls, wie angenommen wird, die immunologische Verstärkung als Ergebnis der molekularen Nähe der Polysacchariddeterminanten zu den Protein-"Träger"-determinanten realisiert wird, sollten diese Einheiten sich in dem biologischen System nicht einfach trennen. Nicht-kovalente Komplexe, die aus dem polyanionischen Charakter vieler Polysaccharide und dem polykationischen Charakter der "Träger"-Proteine hervorgehen, können eine Immunantwort stimulieren, jedoch sind diese Komplexe chemisch labil, und die resultierende Immunantwort scheint T-Zellen unabhängig zu sein. Konträr dazu besitzen kovalente Konjugate von Polysacchariden und Proteinen eine viel grössere chemische Stabilität und können eine T-Zellen-abhängige Immunantwort zeigen.
  • Kovalente Polysaccharid-Protein-Konjugate wurden in der Literatur beansprucht, jedoch wurde die exakte Natur der kovalenten Bindung nicht bewiesen oder quantifiziert, da der einzige Test für die kovalente Natur die Aktivität in vivo ist. Zusätzlich sind die in der Literatur beschriebenen Verfahren schlecht reproduzierbar. Polysaccharide von Haemophilus influenzae Typ b und Streptococcus pneumoniae Typ 6A wurden mit Cyanogenbromid umgesetzt, dann mit Adipinsäuredihydrazid, dann mit Tetanustoxoid oder mit Hufeisenkrabben-Hämocyaninproteinen "gekuppelt", Schneerson et al., J. Exptl. Med., 152, 361 (1980) sowie Infection and Immunity, 40, 245 (1983). Pneumokokken Typ 19F-Polysaccharid wurde mit Rinderserumalbumin direkt gekuppelt, indem Imine (Schiff'sche Basen) aus den reduzierenden Enden der Polysaccharide und den anhängenden Amingruppen (das heißt Lysinen) des Proteins gebildet wurden, danach diese Imine mit Natriumcyanborhydrid reduziert wurden (Lin et al., Immunology, 46, 333 (1982)).
  • Weiterhin wurden an diazotierte aromatische Amine gebundene Polysaccharide in K. K. Nixdorff et al., Immunology , 29, 87 (1975) an die Tyrosine des Proteins gekuppelt und an aromatische Amine gebundene Polysaccharide in Isothiocyanate umgewandelt, die dann in S. B. Svenson und A. A. Lindberg, J. Immunolog. Methods, 25, 323 (1979) an die anhängenden Aminogruppen des Lysins vom Protein gebunden wurden. In jedem Fall wurde jedoch das resultierende Konjugat nur durch sein gelpermeationschromatographisches Verhalten gekennzeichnet. In einem weiteren Beispiel (S. Nutani et al., Infection and Immunity, 36, 971 (1982)) wurde das Polysaccharid Pullulan mit Cyanurchlorid aktiviert, dann mit Tetanustoxoid umgesetzt. In diesem Fall wurden die Konjugate durch Elektrophorese charakterisiert und es wurde nur gezeigt, daß sie sich von den Ausgangsmaterialien unterscheiden.
  • In keinem dieser Fälle wurde die kovalente Natur auf anderem Weg als durch die Implikationen eines zusammengesetzten Molekulargewichts demonstriert, weshalb die kovalente Natur mit der natürlichen Wechselwirkung von makromolekularen Spezies mit und ohne Ladungen in molekularen Komplexen verwechselt wurde, da solche Komplexe ebenfalls ein zusammengesetztes Molekulargewicht ergeben.
  • In der parallel anhängigen Anmeldung USSN 608 738 vom 10. Mai 1984 (die hier durch Querverweis einbezogen ist), entsprechend EP-A-0 161 188, wurden jetzt kovalent-modifizierte polyanionische Polysaccharide und Proteine gezeigt, zusammen mit kovalenten Konjugaten solcher Polysaccharide, die durch ein zweifaches Bindeglied mit einer immunogenen Bakterienmembran oder anderen Proteinen verbunden sind, sowie Verfahren zur Herstellung derselben und die Bestätigung der kovalenten Natur der Bindung zwischen den Polysacchariden und Proteinen. Unter Verwendung der Methodologie dieser Druckschrift ist es jetzt möglich, chemisch stabile Polysaccharid-Protein-Konjugate herzustellen, die T-Zellen-Abhängigkeit demonstrieren und die als Impfstoffkomponenten zur Erzeugung von schützenden Serumantikörpern gegen insbesondere die zugehörigen Bakterien der verwandten Polysaccharide geeignet sind. Diese Methodologie ist jedoch nur für die kovalente Modifizierung von polyanionischen Polysacchariden geeignet und war nicht geeignet für nicht verfolgbare Polysaccharide, die in organischen Lösungsmitteln oder Salzlösungen unlöslich oder nur halb löslich sind.
  • Es war daher ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Löslichmachen von neutralen Polysacchariden zu entwicklen und diese neutralen Polysaccharide bei der Erzeugung kovalent zu modifizieren, um chemisch stabile Polysaccharid-Protein-Konjugate herzustellen. Es war ferner ein Ziel der Erfindung, neutrale Polysacchariddeterminanten an Protein-"Träger"-Determinanten in chemisch stabilen Konjugaten zu binden, so daß die molekulare Nähe dieser Einheiten in biologischen Systemen beibehalten werden kann, damit diese Konjugate als Komponenten in einem mono- oder polyvalenten Impstoff zur Hervorrufung von schützenden Serumantikörpern auf bestimmte Bakterien, insbesondere der zugehörigen Bakterien des verwandten Polysaccharids, geeignet sind. Ein weiteres Ziel der Erfindung war die Entwicklung von Behandlungsmethoden unter Verwendung dieser Konjugate in immunologisch wirksamen Wirkstoffen zur Verwendung gegen beispielsweise Meningitis- und Otitismedien.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft kovalent modifizierte neutrale bakterielle Polysaccharide und chemisch stabile Konjugate solcher neutralen Polysaccharide mit kovalent modifizierten immunogenen Membranproteinen, viralen Proteinuntereinheiten, synthetischen Polypeptiden, bakteriellen Toxoiden oder anderen geeigneten immunogenen Proteinen, welche Konjugate brauchbare Komponenten von immunogenen bakteriellen Impstoffen sind. Die Polysaccharid-Protein-Konjugate gemäß der Erfindung werden über eine kovalente Thioethergruppe enthaltende zweifache Bindeglieder gekuppelt, worin die zweifachen Bindeglieder Makromoleküle (wie neutrale Polysaccharide und Proteine) verbindende Atomketten sind, wobei ein Ende der Bindeglieder seinen Ursprung in einem modifizierten Makromolekül hat (bespielweise dem kovalent modifizierten neutralen Polysaccharid) und das andere Ende seinen Ursprung im anderen moddifizierten Makromolekül (beispielsweise im funktionalisierten Protein).
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das neutrale Polysaccharid in einem oder mehreren Schritten kovalent funktionalisiert, um ein Polysaccharid mit anhängenden elektrophilen Zentren oder anhängenden Thiolgruppen zu erzeugen. Vorzugsweise wird das neutrale Polysaccharid zuerst durch Erhitzen in Wasser mit oder ohne wässriges Hydrazin fragmentiert, wonach das Wasser entfernt und das fragmentierte Polysaccharid mit einem bifunktionellen Aktivierungsmittel derivatisiert wird, bevor es mit einem Bis-Nukleophil umgesetzt wird. Das nukleophil-funktionalisierte neutrale Polysaccharid wird dann entweder mit einem Reagens zur Erzeugung von anhängenden elektrophilen Stellen oder mit einem Reagens zur Erzeugung anhängender Thiolgruppen umgesetzt. Durch richtige Auswahl des Bis-Nukleophils, das heißt eines, das mit dem aktivierten neutralen Polysaccharid reagieren kann und zu einem kovalent modifizierten Polysaccharid mit anhängenden elektrophilen Stellen oder Thiolgruppen führt, oder durch Auswahl des richtigen Nukleophils kann eine weitere Funktionalisierung des nukleophil-funktionalisierten neutralen Polysaccharids vermieden werden.
  • Unabhängig von der kovalent Modifizierung des neutralen Polysaccharids wird das geeignete bakterielle "Träger"-Protein mit Reagentien umgesetzt, die anhängende Thiolgruppen erzeugen, oder mit Reagentien, die anhängende elektrophile Zentren erzeugen, entweder in einem ein- oder in einem zweistufigen Verfahren. Die geeigneten kovalent-modifizierten neutralen Polysaccharide und Proteine werden dann zur Bildung von kovalenten Polysaccharid-Protein-Konjugaten umgesetz und zur Entfernung unkonjugierter Makromoleküle und überschüssigem Reagens gereinigt, damit die immunogene Dosierung auf die Menge an kovalent gebundenem Polysaccharid in der Konjugatform bezogen werden kann.
  • Immunogene monovalente oder polyvalente Impfstoffe, die immunologisch wirksame Mengen der Polysaccharid-Protein-Konjugate gemäß der Erfindung oder Mischungen der Polysaccharid-Protein- Konjugate gemäß der Erfindung mit anderen kovalenten Polysaccharid- Protein-Konjugaten, wie den in USSN 608 738 vom 10. Mai 1984 beschriebenen, oder mit anderen immunologischen Materialien oder ihre Derivate enthalten, können dann hergestellt werden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die kovalent modifizierten Polysaccharide gemäß der Erfindung können modifizierte Versionen beliebiger neutraler (das heißt nicht anionischer/nicht saurer) Polysaccharide sein und sollen nicht auf besondere Typen beschränkt sein. Beispiele solcher neutraler bakterieller Hüllpolysaccharide schließen (Pneumokokken) Polysaccharide von Streptococcus pneumoniae Typ 14, 7F und 37 ein, beschrieben in L. Kenne und B. Lindberg in The Polysaccharides, Band II, S. 287-363, Academic Press (1983) und A.S. Chaudri et al., Carbohydrate Research, 25, 161-172 (1972).
  • Die erfindungsgemäßen Proteine sind solche mit bewiesener Sicherheit und nachgewiesener Immunogenizität, dabei jedoch nicht auf besondere Typen beschränkt. Geeignete Proteine schließen bakterielle Membranproteine ein; beliebige verschiedener Pflanzenproteine, wie Edestin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor; Virusproteinuntereinheiten, wie Hepatitis A oder B, Herpes gD oder gC, Epstein-Barr- oder Varicella Zoster-Untereinheiten; synthetische Polypeptide; Diphtherietoxoid; oder Tetanustoxoid, wobei jedoch (Meningokokken) Proteine der Außenmembran von Neisseria Meningitidis Serotyp B bevorzugt sind, die T-Zellen-Stimulatoren sind. Ein Beispiel dieser Serotypen-Proteine wurde in Helting et al., "Serotype Determinant Proteins of Neisseria Meningitidis", Actapath. Microbiol. Scand. Sect. C, 89, 69-78, 1981 und Frasch et al., J. Bact., 127, 973-981 (1976) beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen Konjugate können dann beliebige stabile Polysaccharid-Protein-Konjugate sein, die über zweifache Bindeglieder gekuppelt sind, die eine Thioethergruppe und Alkylamid enthalten, welche hydrolytisch-labile kovalente Bindungen mit dem neutralen Polysaccharid und dem Protein bilden. Bevorzugte Konjugate gemäß der Erfindung sind jedoch solche, die über die Formeln Ps-A-E-S-B-Pro oder Ps-A'-S-E'-B'-Pro wiedergegeben werden, worin Ps ein nicht anionisches Polysaccharid, Pro ein immunogenes Protein und A-E-S-B und A'-S-E'-B' zweifache Bindeglieder darstellen, die hydrolytisch stabile kovalente Thioetherbindungen enthalten und kovalente Bindungen (etwa hydrolytisch labile Ester- oder Amidbindungen) mit dem Makromolekül Pro und Ps bilden. Im Bindeglied A-E-S-B ist S Schwefel; E ist das Transformationsprodukt einer thiophilen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe umgesetzt wurde und wird durch
  • oder - H- wiedergegeben, worin R H oder CH&sub3; ist und p 1 bis 3 ist; A ist - (CH&sub2;)mY(CH&sub2;)n-NH-, worin W O oder NH ist, m 0 bis 4 ist, n 0 bis 3 ist und Y CH&sub2;, O, S, NR' oder CHCO&sub2;H ist, worin R' H oder C&sub1;- oder C&sub2;-Alkyl ist, so daß, wenn Y CH&sub2; oder NH ist, dann beide m und n nicht Null sein können, und wenn Y O oder S ist, dann m größer als 1 ist und n größer als 1 ist; und B ist -(CH&sub2;)p H(CH&sub2;)qD-, worin q 0 bis 2 ist, Z NH&sub2;, NH R', COOH oder H, worin R' und p wie oben definiert sind und D , NR',
  • ist. Dann ist im Bindeglied A'-S- E'-B' S Schwefel; A' ist - NH(CH&sub2;)aR"-, worin a 1 bis 4 ist und R" CH&sub2; oder
  • ist, worin Y' NH&sub2; oder NHCOR' ist, und W, p und R' wie vorstehend definiert sind; und E' ist das Transformationsprodukt einer thiophilen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe umgesetzt wurde und wird durch - H- wiedergegeben, worin R wie vorstehend definiert ist; und B' ist - -; oder E' ist
  • und B' ist -(CH&sub2;)p -, worin p 1 bis 3 ist. Weiterhin sind in den zweifachen Bindegliedern A-E-S-B und A'-S-E'-B' die Komponenten E-S-B und A'-S-E' bestimmbar und quantifizierbar, wobei diese Identifizierung die kovalente Natur der Konjugatbindung widerspiegelt, die die Seite des Thioetherschwefels, die ihren Ursprung im kovalent modifizierten nicht anionischen Polysaccharid hat, mit der Seite des Bindeglieds verbindet, die ihren Ursprung im funktionalisierten Protein hat.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Polysaccharid durch (a) Fragmentieren durch Erhitzen des Polysaccharids in Wasser mit oder ohne wässriges Hydrazin, wonach das Wasser durch die Gefriertrocknen und Trocknen mit P&sub2;O&sub5; im Vakuum entfernt wird, danach (b) Aktivieren mit einem bifunktionellen Reagens in einem nicht wässrigen, polaren, aprotischen Lösungsmittel, (c) Umsetzen dieses aktivierten Polysaccharids mit einem bis-Nukleophil und schließlich, falls notwendig, weiteres (d) Funktionalisieren dieses modifizierten Polysaccharids entweder durch Reaktion mit (i) einem elektrophile (beispielsweise thiophile) Stellen erzeugenden Reagens oder (ii) einem thiolgruppenerzeugenden Reagens kovalent modifiziert. Das Protein wird dagegen entweder (i) mit einem Thiolgruppen oder (ii) mit einem thiophile Stellen erzeugenden Reagens umgesetzt, danach das kovalent modifizierte Polysaccharid und das funktionalisierte Protein unter Bildung des stabilen kovalent gebundenen Konjugats miteinander zur Reaktion gebracht und die erhaltene Mischung zur Entfernung unreagierter Polysaccharide und Proteine gereinigt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren schließt auch die Auswahl eines Nukleophils oder bis-Nukleophils ein, das mit dem aktivierten Polysaccharid unter Bildung eines kovalent modifizierten Polysaccharids mit anhängenden elektrophilen Stellen oder anhängenden Thiolgruppen reagiert, wodurch die Notwendigkeit zur weiteren Funktionalisierung des bis-Nukleophil-modifizierten Polysaccharids vor der Umsetzung des kovalent modifizierten Polysaccharids mit dem kovalent modifizierten Protein umgangen wird. Weiterhin kann die Funktionalisierung des Proteins zu jeder Gruppenform in mehr als einem Schritt, je nach Auswahl der Reaktionspartner in diesen Schritten, bewirkt werden.
    • A. HERSTELLUNG DES POLYSACCHARIDS
  • Im ersten Schritt in Richtung auf die kovalente Modifizierung des Polysaccharids muß das feste, weitgehend unlösliche Polysaccharid löslich gemacht werden.
  • Da die neutralen Polysaccharide gemäß der Erfindung in organischen Lösungsmitteln oder Salzlösungen unlöslich sind und in Wasser nur marginal löslich, und weil die nukleophilen alkoholischen Hydroxylgruppen eines Polysaccharids chemisch mit den Hydroxylen von Wasser in einer wässrigen Lösung nicht um elektrophile Reagentien konkurrieren können, muß das Polysaccharid zu einer löslicheren Form modifiziert werden, wonach es in nicht wässrigen (hydroxylfreien) Lösungsmitteln gelöst werden sollte. Geeignete Lösungsmittel schließen Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Formamid, N,N'-Dimethylimidazolidinon und andere ähnlich polare, aprotische Lösungsmittel ein, vorzugsweise Dimethylformamid.
  • Gemäß USSN 608 738 vom 10. Mai 1984 wurden bakterielle Polysaccharide mit Säuregruppen in nicht hydroxylhaltigen organischen Lösungsmitteln dadurch löslich gemacht, daß sie zuerst in eine geeignete Salzform umgewandelt wurden. Im Gegensatz dazu wird von der Anmelderin das Inlösungbringen eines intakten, ansonsten weitgehend unlöslichen neutralen Polysaccharids dadurch bewirkt, daß diese nicht polyanionischen, neutralen Polysaccharide 30 Sekunden bis 10 Minuten in destilliertem Wasser auf 70º bis 100ºC erhitzt werden, das 5 bis 15 %iges wässriges Hydrazin enthalten kann oder auch nicht, wodurch die Polysaccharide fragmentiert werden, die Aktivität der neutralen Polysaccharide für die Verwendung in immunogenen Impfstoffen bewahrt und das Polysaccharid in eine einsatzfähige Form gebracht wird.
  • Nachfolgende Schritte sind dann darauf gerichtet, andere wesentliche physico-chemische Limitierungen bei der Erzeugung kovalenter Bindungen zu Polysacchariden zu überwinden, insbesondere den Mangel an von Hydroxylgruppen verschiedenen funktionellen Gruppen an den Polysacchariden, die reaktiv genug mit Reagentien sind, die gewöhnlich oder praktisch zur Funktionalisierung von Einheiten sind, an die eine Bindung erwünscht ist. Restwasser (und Hydroxylgruppen) wird durch Gefriertrocknen und Trocknen mit P&sub2;O&sub5; im Vakuum entfernt. Danach sind die Aktivierung des Polysaccharids unter Bildung eines aktivierten Polysaccharids, die Umsetzung mit bis-Nukleophilen unter Bildung eines nukleophil funktionalisierten Polysaccharids und die Funktionalisierung mit Reagentien, die entweder elektrophile Stellen oder Thiolgruppen erzeugen, alle auf die kovalente Modifizierung des Polysaccharids und die Entwicklung funktioneller Gruppen am Polysaccharid bei der Erzeugung der Konjugation gerichtet.
  • Im nächsten Schritt wird das depolymerisierte Polysaccharid durch Reaktion mit einem bifunktionellen Reagens bei etwa 0º bis 50ºC aktiviert, wobei 10 Minuten bis eine Stunde gerührt wird und das kritische Gewichtsverhältnis von Aktivierungsmittel zu Polysaccharid im Bereich von 1:5 bis 1:12 liegt. Die Aktivierung mit Cyanogenbromid ist erfindungsgemäß möglich, wobei dieses Reagens selten zur Aktivierung von Polysacchariden verwandt wird und nicht bevorzugt ist. Stattdessen schließen die bevorzugten bifunktionellen Reagentien zur Aktivierung des Polysaccharids Carbonsäurederivate, R²- -R³, ein, worin R² und R³ unabhängig Azolyl, etwa Imidazolyl, Halogenide oder Phenylester, etwa p-Nitrophenyl, oder Polyhalogenphenyl sein können.
  • Carbonyldiimidazol, ein besonders bevorzugtes Reagens, reagiert mit den Hydroxylgruppen unter Bildung von Imidazolylurethanen des Polysaccharids, und Arylchlorformiate unter Einschluß von beispielsweise Nitrophenylchlorformiat ergeben gemischte Carbonate des Polysaccharids. In jedem Fall ist das resultierende aktivierte Polysaccharid sehr empfänglich für nukleophile Reagentien, etwa Amine, und wird durch sie in die entsprechenden Urethane überführt.
  • Im nächsten Schritt wird das aktivierte Polysaccharid mit einem nukleophilen Reagens, etwa einem Amin, insbesondere Diaminen, beispielsweise H (CH&sub2;)mY(CH&sub2;)n- H, worin m 0 bis 4 ist, n 0 bis 3 ist und Y CH&sub2;, O, S, NR', CHCO&sub2;H ist, worin R' H oder ein C&sub1;- oder C&sub2;-Alkyl ist, so daß, wenn Y NH oder CH&sub2; ist, dann sowohl m als auch n nicht gleich Null sein können und, falls Y O oder S ist, dann m größer als 1 ist und n größer als 1 ist, mit einem großen Aminüberschuß (das heißt beispielsweise einem 50- bis 100-fachen molaren Überschuß an Amin gegenüber verwandtem Aktivierungsmittel) umgesetzt. Die Reaktion wird 15 Minuten bis eine Stunde in einem Eisbad gehalten, dann 15 Minuten bis eine Stunde bei etwa 17º bis 40ºC.
  • Ein aktiviertes Polysaccharid, wenn es mit einem Diamin, beispielsweise 1,4-Butandiamin, umgesetzt wurde, führt zu einem Polysaccharid in Urethanform mit anhängenden Aminen, das dann durch Acylierung weiter funktionalisiert werden kann. Gemischte Carbonate reagieren ebenfalls bereitwillig mit Diaminen und führen zu anhängenden Amingruppen.
  • Alternativ kann das aktivierte Polysaccharid mit einem Nukleophil umgesetzt werden, etwa dem Monohalogenacetamid eines Diaminoalkans, beispielsweise 4-Bromacetamidobutylamin (siehe W. B. Lawson et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., 349, 251 (1968), um ein kovalent modifiziertes Polysaccharid mit anhängenden elektrophilen Stellen zu erzeugen. Alternativ kann das aktivierte Polysaccharid mit einem Aminothiol, etwa Cysteamin (Aminoethanthiol) oder Cystein umgesetzt werden, Beispiele für Derivate, die auf dem Gebiet der Peptidsynthese wohlbekannt sind, um ein Polysaccharid mit anhängenden Thiolgruppen zu erzeugen. In beiden Fällen ist keine weitere Funktionalisierung vor der Kupplung des kovalent modifizierten Polysaccharids an das modifizierte bakterielle "Träger "protein notwendig.
  • Der letzte Schritt bei der Herstellung des Polysaccharids, die weitere Funktionalisierung, falls notwendig, des Polysaccharids, kann die Form der Umsetzung des nukleophil-funktionalisierten Polysaccharids entweder mit einem Reagens zur Erzeugung von elektrophilen (das heißt thiophilen) Stellen oder mit einem Reagens zur Erzeugung von Thiolgruppen annehmen.
  • Zur Erzeugung von elektrophilen Stellen geeignete Reagentien schließen beispielsweise solche zur Acylierung zu einem α- Halogenacetyl oder α-Halogenpropionylderivat, etwa X HX (worin R H oder CH&sub3; ist; X Cl, Br oder I ist; und X' Nitrophenoxy, Dinitrophenoxy, Pentachlorphenoxy, Pentafluorphenoxy, Halogen, O-(N-Hydroxysuccinimidyl oder Azido ist) ein, insbesondere Chloressigsäure oder α-Brompropionsäure, wobei die Reaktion bei einem pH-Wert von 8 bis 11 (in diesem Bereich durch Zugabe einer Base gehalten, falls notwendig) und einer Temperatur von etwa 0º bis 35ºC 10 Minuten bis eine Stunde durchgeführt wird. Ein aminoderivatisiertes Polysaccharid kann mit aktivierten Maleinimidoaminosäuren (siehe O. Keller et al., Helv. Chim. Acta, 58, 531 (1975) zur Erzeugung von Maleinimidogruppen,
  • worin p 1 bis 3 ist; mit einem 2-halogenacetylierenden Mittel, wie p-Nitrophenylbromacetat oder mit einem α-Halogenketoncarbonsäurederivat, beispielsweise
  • (Ber., 67, 1204 (1934)) zur Erzeugung von geeignet funktionalisierten Polysacchariden, die für die Thio-Substitution empfänglich sind, acyliert werden.
  • Zur Verwendung bei der Erzeugung von Thiolgruppen geeignete Reagentien schließen beispielsweise Acylierungsmittel, wie Thiolactone, beispielsweise
  • worin R&sup4; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder mono- oder bicyclisches Aryl ist, etwa C&sub6;H&sub5; oder C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub3;, und p 1 bis 3 ist;
  • worin m 0 bis 4 ist, R&sup5; C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder C&sub6;H&sub5; ist und X' wie oben definiert ist, gefolgt von der Behandlung mit HSCH&sub2;CH&sub2;OH; oder
  • worin m, R&sup5; und X' wie unmittelbar oben definiert sind, danach Behandlung mit Dithiothreitol, ein. Solche Reaktionen werden in einer Stickstoffatmosphäre bei etwa 0 bis 35ºC und einem pH-Wert von 8 bis 11 (falls nötig, wird Base zugegeben, um den pH-Wert in diesem Bereich zu halten) über 1 bis 24 Stunden durchgeführt. Beispielsweise kann ein aminoderivatisiertes Polysaccharid mit
  • zur Erzeugung eines geeignet funktionalisierten Polysaccharids umgesetzt werden.
  • Mit diesen Schritten werden dann kovalent modifizierte neutrale Polysaccharide der Formen Ps-A-Eγ- oder Ps-A'-SH-, worin
  • ist und A, A', R, X und p wie oben definiert sind, erzeugt.
    • B. HERSTELLUNG DES PROTEINS
  • Die getrennte Funktionalisierung des Proteins, das an das Polysaccharid gekuppelt werden soll, beinhaltet die Reaktion des Proteins mit einem oder mehreren Reagentien zur Erzeugung einer Thiolgruppe oder Reaktion des Proteins mit einem oder mehreren Reagentien zur Erzeugung eines elektrophilen (das heißt thiophilen) Zentrums, wie in USSN 608 738 vom 10. Mai 1984 gezeigt.
  • Bei der Zubereitung für die Konjugation mit einem elektrophil funktionalisierten Polysaccharid wird das Protein in einer oder zwei Stufen mit einem oder mehreren Reagentien zur Erzeugung von Thiolgruppen umgesetzt, etwa den Acylierungsmitteln, die zur Erzeugung von Thiolgruppen an Polysacchariden verwandt und auf S. 11 und 12 oben diskutiert werden. Thiolierte Proteine können auch durch Aminieren von carboxyaktivierten Proteinen, etwa den in Atassi et al., Biochem et Biophys. Acta, 670, 300 (1981) gezeigten, mit Aminothiolen zur Erzeugung des thiolierten Proteins hergestellt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrenschritts beinhaltet die direkte Acylierung der anhängenden Aminogruppen (das heißt der Lysylgruppen) des Protein mit N-Acetylhomocysteinthiolacton bei etwa 0º bis 35ºC und pH 8 bis 11 über 5 Minuten bis 2 Stunden unter Verwendung von äquivalenten Mengen der Reaktionspartner.
  • Wenn
  • sind die Bedingungen und Verfahren zur Herstellung des funktionalisierten Proteins, wie oben auf den Seiten 11 und 12 zur Herstellung der Polysaccharid-Gegenstücke durch Reaktion mit aktivierten Maleinimidosäuren diskutiert.
  • Zur Vorbereitung für die Konjugation mit einem kovalent modifizierten bakteriellen Polysaccharid mit anhängenden Thiolgruppen wird das Protein mit einem Reagens acyliert, das ein elektrophiles Zentrum erzeugt, etwa Acylierungsmitteln unter Einschluß von beispielsweise
  • worin X und X' wie oben definiert sind, sowie
  • worin X' wie oben definiert ist. Geeignete Proteine mit elektrophilen Zentren schliessen beispielsweise auch solche ein, die durch Acylierung der anhängenden Lysylaminogruppen mit einem Reagens, etwa aktivierten Maleinimidosäuren, beispielsweise
  • oder durch Umsetzung des carboxyaktivierten Proteins mit Monohalogenacetylderivaten von Diaminen hergestellt wurden. In beiden Herstellungsreaktionen ist die Temperature 0º bis 35ºC über 5 Minuten bis eine Stunde und der pH-Wert 8 bis 11.
    • C BILDUNG DES KONJUGATS
  • Die Bildung des Konjugats ist dann bloß eine Sache der Umsetzung beliebiger der kovalent modifizierten Polysaccharide mit anhängenden elektrophilen Zentren mit beliebigen der Proteine mit anhängenden Thiolgruppen bei einem pH-Wert von 7 bis 9 in ungefähr äquivalenten Gewichtsverhältnissen in einer Stickstoffatmosphäre über 6 bis 24 Stunden bei etwa 17º bis 40ºC, wobei ein kovalentes Konjugat erhalten wird. Beispiele solcher Reaktionen schließen
  • ein, worin ein aktiviertes Polysaccharid, das mit einem 4-Bromacetamidobutylamin umgesetzt wurde, mit einem Protein reagiert wird, das mit N-Acetylhomocysteinthiolacton umgesetzt wurde, wobei ein Konjugat gebildet wird, sowie
  • (worin Y" ein C&sub2;-C&sub8;-Alkylrest ist) , worin ein aminoderivatisiertes Polysaccharid, das mit aktivierten Maleinimidosäuren umgesetzt wurde, mit einem carboxyaktivierten Protein umgesetzt wird, das mit einem Aminothiol aminiert wurde, wobei ein Konjugat gebildet wird.
  • In ähnlicher Weise können beliebige der kovalent modifizierten Polysaccharide mit anhängenden Thiolgruppen mit beliebigen der Proteine mit anhängenden elektrophilen Zentren unter Erhalt eines kovalenten Konjugats umgesetzt werden. Ein Beispiel für solch eine Reaktion ist:
  • worin ein aktiviertes Polysaccharid, das mit einem Aminothiol umgesetzt wurde, mit einem carboxyaktivierten Protein zur Reaktion gebracht wird, das mit Monohalogenacetylderivaten eines Diamins umgesetzt wurde, wobei ein Konjugat gebildet wird.
  • Diese Konjugate werden dann bei etwa 100 000 G unter Verwendung eines Rotors mit festem Winkel etwa 2 Stunden bei etwa 1º bis 20ºC zentrifugiert oder einer beliebigen einer Vielzahl anderer Reinigungsverfahren unterworfen, unter Einschluß der Gelpermeation, der Ionenausschlußchromatographie, der Gradientzentrifugation oder einer anderen differentiellen Adsorptionschromatographie, um nicht kovalent konjugierte Polysaccharide und Proteine abzutrennen, wobei der Kovalenztest für das zweifache Bindeglied (siehe unten) als Verfahren zum Nachweis der erwünschten biologischen Aktivität eingesetzt wird.
    • D. ANALYSE ZUR BESTÄTIGUNG DER KOVALENTEN NATUR
  • Die Analyse des Konjugats zur Bestätigung der kovalenten Natur und damit der Stabilität des Konjugats wird von der Anmelderin durch Hydrolysieren (vorzugsweise mit 6N HCl bei 110ºC über 20 Stunden) des Konjugats und danach quantitative Analyse auf die Aminosäure des hydrolytisch stabilen zweifachen Bindeglieds mit der Thioetherbindung und die das Protein bildenden Aminosäuren bewirkt. Der Beitrag der Aminosäuren des Proteins kann, falls erforderlich, durch Vergleich mit dem entsprechenden Aminosäurestandard des beteiligten Proteins berücksichtigt werden, wobei der verbleibende Aminosäurewert die kovalente Natur des Konjugats widerspiegelt, oder die Aminosäure des Bindeglieds kann so zugeschnitten sein, daß sie außerhalb des Aminosäurestandards des Proteins in der Analyse erscheint. Der Kovalenztest ist auch geeignet, um die Reinigungsverfahren zu verfolgen und die Zunahme der Konzentration der biologisch aktiven Komponenten zu markieren. In den vorstehenden Beispielen führt die Hydrolyse von
  • zur Freisetzung von S-Carboxymethylhomocystein, HO&sub2;CCH&sub2;SCH&sub2;CH&sub2; O&sub2;H, die Hydrolyse von
  • zur Freisetzung der Aminodicarbonsäure,
  • und die Hydrolyse von
  • zur Freisetzung von S-Carboxymethylcysteamin, H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;SCH&sub2;CO&sub2;H, indem das Ps-A-E-S-B-Pro-Molekül an den Peptidbindungen und anderen hydrolytisch instabilen Bindungen gespalten wird. Chromatographische Methoden, wie solche von Spackman, Moore und Stein, können dann einfach angewandt und das Verhältnis der Aminosäurebestandteile bestimmt werden.
    • E. ANWENDUNGEN
  • Eines oder mehrere der Konjugate gemäß der Erfindung können in Säugetierspezies zum entweder aktiven oder passiven Schutz prophylaktisch oder therapeutisch gegen Bakteriämien eingesetzt werden, die durch den zugehörigen Organismus verursacht werden. Nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die erfindungsgemäßen Konjugate in mono- oder polyvalenten Impfstoffen entweder allein, mit anderen, andere neutrale Polysaccharide enthaltenden Konjugaten, etwa Streptococcus pneumoniae 7F, 14 und 37; mit anderen polyanionische Polysaccharide enthaltenden Konjugaten, etwa Haemophilus influenzae Typ b oder Streptococcus pneumoniae Typ 6B, 19F oder 23F-Organismen; oder mit unkonjugierten Polysacchariden, etwa Streptococcus pneumoniae Typ 3-Polysaccharid, eingesetzt werden.
  • Aktiver Schutz kann bewirkt werden, indem eine wirksame Menge (eine Menge, die eine meßbare Menge an Antikörpern erzeugen kann, beispielsweise 2 bis 50 ug) Polysaccharid in Konjugatform von jedem der zu verabreichenden Konjugate pro Dosis oder von zu verabreichenden unkonjugierten Polysacchariden pro Dosis, von vollständigem Antiserum, das von zuvor mit dem Konjugat oder den Konjugaten dosierten Tieren erhalten wurde, oder von Globulin oder anderen antikörperhaltigen Fraktionen dieser Antisera mit oder ohne einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, etwa aseptischer Kochsalzlösung, injiziert wird. Solches Globulin wird aus vollständigem Antiserum durch Chromatographie, Salz- oder Alkoholfraktionierung oder durch Elektrophorese erhalten. Passiver Schutz kann durch Standardverfahren mit monoklonalen Antikörpern oder durch die Immunisierung geeigneter Säugetierwirte bewirkt werden. Die Verwendung eines Adjuvans (beispielsweise Alum) soll ebenfalls im Schutzbereich dieser Erfindung liegen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden monovalente oder polyvalente Zusammensetzungen, die unter anderem die erfindungsgemäßen Konjugate einbeziehen, zur aktiven immunogenen Impfung von Menschen, insbesondere Neugeborenen und Kindern, eingesetzt. Zur weiteren Stabilisierung können diese Konjugate auch in Gegenwart von Lactose (beispielsweise 50 ug/ml Pneumokokken-Polysaccharid/10 mg/ml Lactose) vor der Verwendung gefriergetrocknet werden.
  • Ein bevorzugtes Dosisniveau ist eine Menge, von jedem der zur verabreichenden Konjugate oder Derivate davon, von 25 ug Polysaccharid in Konjugatform der Konjugate von Pneumokokken-Polysacchariden, 25 ug unkonjugierten Polysacchariden und Dosierungen von Konjugaten oder Derivaten davon von polyanionische Polysaccharide gemäß USSN 608 738 vom 10. Mai 1984 enthaltenden Konjugaten in einer Einzelverabreichung. Falls notwendig, können weitere ein oder zwei Dosen Konjugat oder Derivat des Polysaccharids von H. influenzae Typ b in einer Menge entsprechend 10 ug des Polysaccharids in der Konjugatform ebenfalls verabreicht werden.
  • Die Erfindung wird weiterhin durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die erläutern und nicht beschränken sollen, definiert.
    • Beispiel 1 Herstellung des Hüllpolysaccharids von Streptococcus Pneumoniae Typ 14 Inokulum und Saatentwicklung Stufe A: Zubereitung der Arbeitssaat
  • Ein gefriergetrocknetes Röhrchen mit bakterieller Inokulumsaat von Streptococcus pneumoniae Typ 14 (erhalten von Dr. Robert Austrian von der University of Pennsylvania) wurde in 1 ml steriler Rinderherzinfusionsbrühe (25 g Herzinfusionsbrühe (Difco) in 0,9 l Wasser) suspendiert und diese Suspension auf fünf Kaninchenblutagarplatten (20 g gereinigtes Agar, 25 g Herzinfusionsbrühe, 100 ml defibriniertes Kaninchenblut, 0,9 l destilliertes Wasser) mit jeweils ungefähr 0,2 ml Kultur ausgebreitet. Nach ungefähr 18 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde der Bewuchs auf den Platten auf jeder Kaninchenblutagarplatte erneut suspendiert (mit jeweils 5 ml Rinderherzinfusionsbrühe) und gepoolt. 1/2 ml dieses erneut suspendierten Bewuchses wurde verwandt, um jede von 6 Flaschen mit flüssigem Blutmedium (90 ml Rinderherzinfusionsbrühe und 10 ml defibriniertes Kaninchenblut) zu inokulieren, die dann ohne Bewegung bei 37ºC ungefähr 18 Stunden inkubiert wurden.
    • Stufe B: Nicht gehemmte 2 l-Erlenmeyer-Kolben
  • Zwei der Flaschen mit der Arbeitseinsaat von Streptococcus pneumoniae Typ 14 aus Stufe A wurden vereinigt und 20 ml dieser Saat in jeden von fünf nicht gehemmten 2 l-Erlenmeyer-Kolben mit 900 ml sterilem Pneumokokkeninokulummedium (siehe unten) und 100 ml 25 %iger Dextroselösung inokuliert. Der pH-Wert der Kolben wurde durch Zugabe von 12 %iger Natriumbicarbonatlösung auf pH 6,0 bis 7,0 gehalten und nach 7 Stunden Inkubation bei 37ºC (zu welcher Zeit ein typischer OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert 2,90 war) der Bewuchs aus vier der Kolben gepoolt (der Pool hatte eine OD&sub6;&sub6;&sub0; von 2,80 und einen pH-Wert von 6,8).
    • Pneumokokkeninoculummedium
  • Sojapepton 20 g
  • Hefeextrakt-Ultrafiltrat (1) 100 ml
  • NaCl-Reagens 5g
  • K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g
  • 2 % Phenolrot .5 ml
  • destilliertes Wasser 1 l
  • Die Lösung wurde im Autoklaven bei 121ºC 25 Minuten sterilisiert.
  • Die Salze und das Sojapepton wurden in einem kleinen Volumen heißem, pyrogenfreiem Wasser gelöst und mit zusätzlichem heißem, pyrogenfreiem Wasser auf das richtige Endvolumen gebracht. Die Fermenter oder Kolben wurden dann etwa 25 Minuten bei 121ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen vor der Inokulierung aseptisch mit dem Hefeextrakt-Ultrafiltrat (1) versetzt. (1) Hefeextrakt-Ultrafiltrat: 100 g Bierhefeextrakt (Amber) wurden in 1 l destilliertem Wasser gelöst und durch ein Amicon DC-30-Hohlfaser mit H10x50-Kartuschen zur Entfernung von Molekülen mit MG 50 000 ultrafiltriert. Das Filtrat wurde gesammelt und als steriles Produkt durch eine Membran von 0,22 um geführt.
    • Stufe C: 70 l-Saatfermenter
  • Das gepoolte Produkt aus Stufe B wurde zur Inokulierung eines 70 l-Fermenters verwandt, der das Pneumokokken-Saatmedium enthielt (hergestellt, wie unten beschrieben), wobei der Ausgangs- pH-Wert 6,8 war.
  • Die Fermentierung wurde unter Rühren bei 100 Upm bei 37ºC gehalten und über die optische Dichte (OD), Glukosetests und pH- Bestimmungen verfolgt, bis eine OD von 3,25 erreicht war (nach etwa 4 Stunden.
    • Vollständiges Pneumokokken-Saatmedium
  • Sojapepton 800 g
  • Hefeextrakt-Ultrafiltrat (1) 4 l
  • K&sub2;HPO&sub4;-Reagens 100 g
  • NaCl-Reagens 200 g
  • 25 % Dextroselösung (2) 4 l
  • Ucon-B625-Schaumhemmer 14 ml
  • destilliertes Wasser 31,8 l
  • (2) Dextrose wurde als sterile 25 %ige Lösung in glas-destilliertem Wasser hergestellt und dem 70 l-Fermenter zusammen mit dem Hefeextrakt-Ultrafiltrat zugesetzt.
    • Stufe D: 800 l-Produktionsfermenter
  • Ungefähr 40 l des Produkts aus Stufe C wurden verwandt, um einen 800 l-Fermenter mit 530 l Pneumokokken-Produktionsmedium (erzeugt, wie unten beschrieben) zu inokulieren.
  • Die Fermentierung wurde unter Rühren mit 100 Upm auf 37ºC gehalten, wobei die OD, der Glukosespiegel und der pH-Wert etwa alle 2 Stunden geprüft wurden, bis die OD über einen 2-Stundenzeitraum gleich blieb, zu welchem Zeitpunkt die Fermentierung beendet wurde (eine typische End-OD war 5,2 nach 6 Stunden).
    • Pneumokokken-Produktionsmedium
  • Sojapepton 10,5 kg
  • Hefeextrakt-Ultrafiltrat (1) 52,5 l
  • K&sub2;HPO&sub4;-Reagens 1,313 kg
  • NaCL-Reagens 2,625 kg
  • 25 % Dextrose-Lösung (2) 58 l
  • Ucon-B625-Schaumhemmer 95 ml
  • destilliertes Wasser 418,5 l
    • Ernte und Inaktivierung
  • Die Charge wurde durch Ernten in einem "Abtötungstank" mit 8,2 l verflüssigtem Phenol inaktiviert.
    • Ausfällung mit 34 % und 58 % Ethanol
  • Zu 640 l der abgetöteten Kultur wurden 213,3 l 95 %iges Ethanol mit 3,6 l/min unter Rühren bei 20 bis 26ºC gegeben, danach 117 l 95 %iges Ethanol mit 2 l/min bis zu einem Gesamt-Endvolumen von 950 l und einer Endkonzentration von 35 % Ethanol nach Volumen. Die Mischung wurde 4 weitere Stunden bei 22ºC gerührt, um vollständige Fraktionierung sicherzustellen, und die überstehende Flüssigkeit über eine Bank von fünf Sharples-Zentrifugen von 4" bei 15 000 Upm gesammelt (Fließrate von etwa 4 l/min). Das unlösliche Pellet wurde verworfen und die geklärte Flüssigkeit durch Zugabe von 559 l zusätzlichem 95 %igem Ethanol mit 7,6 l/min auf 58 % Ethanol gebracht. Die Mischung wurde bei 21ºC 5 weitere Stunden gerührt, um vollständige Ausfällung sicherzustellen.
    • Gewinnung des zweiten Pellets
  • Das resultierende, in 34 %igem Ethanol lösliche und 58 %igem Ethanol unlösliche Präzipitat wurde durch Zentrifugieren in der Sharples-Zentrifuge von 4" bei 15 000 Upm (Fließrate ungefähr 4 l/min) gesammelt und die überstehende Flüssigkeit mit 58 % Ethanol verworfen. Die Rohproduktausbeute war 2,435 kg nasse Paste.
    • Ausfällung mit 24 % Isopropylalkohol
  • Die 2,435 kg des in 58 %igem Ethanol unlöslichen Materials wurden mit 1,626 kg Material vereinigt, das aus einer zweiten Fermentierung in gleicher Weise erzeugt worden war, und die resultierenden 4,061 kg Material wurden in einem Daymax-Dispersionsgefäß bei 15 bis 29ºC mit 30 l glas-destilliertem Wasser 12 Minuten gemischt, bis die Suspension homogen war. Ungefähr 66 weitere Liter destilliertes Wasser wurden zu der Suspension hinzugegeben und diese Mischung wurde 4 Stunden gerührt. 24 l 5 %ige Natriumacetatlösung wurden zu der Mischung hinzugefügt und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Eisessig auf 6,5 eingestellt.
  • Die 120 l der Lösung wurden durch Zugabe von 37,9 l Isopropanol mit 0,3 l/min unter Rühren bei 15 bis 29ºC auf eine Isopropylalkoholkonzentration von 24 % gebracht. Nach weiterem Rühren über 4 Stunden wurde die Mischung 5,75 Stunden durch eine Sharples- Zentrifuge bei 15 000 Upm (Fließrate = 0,35 l/min) und danach durch eine Electronucleonics K3-Ultrazentrifuge (28 000 Upm) bei 200 bis 400 ml/min zentrifugiert, bis der Ausfluß klar erschien, wonach das unlösliche Pellet verworfen wurde.
    • Ausfällung mit 39 % Isopropylalkohol und Sammeln der rohen Produktpaste
  • Die in 24 %igem Isopropylalkohol lösliche überstehende Flüssigkeit aus dem vorhergehenden Schritt wurde durch Zugabe von 38,8 l Isopropylalkohol mit 0,3 l/min unter Rühren auf 39% Isopropanol gebracht. Die Mischung (194 l) wurde dann unter Rühren 3,25 Stunden stehengelassen, danach etwa 18 Stunden in Sharples- Einheiten von 4" bei 15 000 Upm (Fließrate = 0,5 l/min) zentrifugiert, um das pelletisierte rohe Polysaccharid (2,006 kg) zu sammeln.
    • Diafiltration
  • Das Pellet aus der Zentrifugation wurde in einen Daymax-Mischer mit 20 l destilliertem Wasser transferriert und 30 Minuten gemischt, bis die Suspension homogen war. Diese Suspension wurde dann mit 300 l kaltem, glas-destilliertem Wasser verdünnt und bis zu konstanter Leitfähigkeit bei etwa 23ºC an einer Romicon-Ultrafiltrations-Apparatur unter Verwendung von zehn HF26,5-45-XM50- Kartuschen diafiltriert. Das Zurückgehaltene wurde bis zu einem Minimumvolumen konzentriert, die Romicon-Einheit gespült und die Spülflüssigkeit dem Zurückgehaltenen zugefügt, so daß das Endvolumen 86 Liter war. Das Ultrafiltrat wurde verworfen.
    • Cetavlon-Ausfällung
  • 1,84 kg Cetavlon (N,N,N-Trimethyl-1-hexadecanaminiumbromid) wurde in 6 l destilliertem Wasser gelöst und diese Lösung unter Rühren über etwa 1 Stunde zu den 86 l Zurückgehaltenem aus dem vorstehenden Schritt gegeben. Nach 4-stündigem Altern wurden die ausgefällten Verunreinigungen (1,925 kg) durch Zentrifugieren in der K3-Ultrazentrifuge (28 000 Upm) bei 5ºC über 8 Stunden abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit gesammelt.
    • Isopropanol-Fraktionierung
  • 28,55 kg Natriumacetat-Trihydrat wurden über 10 Minuten zu den 86 l der oben erwähnten überstehenden Flüssigkeit unter Rühren zugegeben, wobei der pH-Wert der Lösung mit Eisessig auf 6,6 eingestellt wurde. Die Lösung wurde mit 45,1 l Isopropanol mit 0,38 l/min unter Rühren auf 28 % Isopropanol gebracht und nach 4 weiteren Stunden Rühren in die K3-Ultrazentrifuge (28 000 Upm) eingespeist, aus der 12 g Niederschlag gesammelt und verworfen wurden. 38,9 l Isopropanol (Endkonzentration = 42 %) wurden mit 0,3 l/min zu den 116 l der überstehenden Flüssigkeit unter Rühren zugegeben, wonach nach 4 weiteren Stunden Rühren die Lösung zu zwei Sharples-Zentrifugen von 4" bei 15 bis 29ºC und 15 000 Upm zirkuliert wurde (jeweils 1,3 l/min Fließrate) und der Ausfluß verworfen wurde.
    • Triturieren und Sammeln des Endprodukts
  • Das resultierende Polysaccharidpellet wurde in einem Waring-Mischer von einer Gallone mit der 30 Sekunden-An-30 Sekunden-Aus-Methode mit 3 l absolutem Ethanol trituriert, bis die Paste zu einem harten weißen Pulver wurde. Dieses Pulver wurde auf einem Büchner-Trichter mit einer Teflon-Filterscheibe gesammelt und in situ mit vier 1 l-Portionen absolutem Ethanol und mit zwei 2 l-Portionen Aceton gewaschen. Das Produkt wurde aus dem Trichter entfernt und zur Trocknung im Vakuum bei 20 bis 25ºC (über etwa 18 Stunden) auf austarierte Teller transferiert. Die Endausbeute an Produkt war 315,2 g Trockengewicht, mit den folgenden Eigenschaften: TABELLE 1-1 Pneumokokken Typ 14 Polysaccharid Chemische Analysedaten Analyse Ergebnis Feuchtigkeit (TG) Protein Nukleinsäure Hexosamin Stickstoff Phosphor Molekülgröße (KD an Sepharose 4B)
  • Die folgenden Verfahren wurden zur Durchführung der vorstehenden Analysen verwandt.
  • 1. Feuchtigkeit - Standard-Thermogravimetrie (Gewichtsverlust bis 100ºC) unter Verwendung einer Perkin- Elmer-Thermowaage TSG-1.
  • 2. Protein - Lowry-Methode; Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951).
  • 3. Nukleinsäure - UV-Methode; Warburg und Christian, Biochem. z., 310, 384 (1942).
  • 4. Hexosamin - Elson und Morgan, Biochem. J., 27, 1824 (1933).
  • 5. Stickstoff - Verbrennungsmethode unter Verwendung eines Perkin-Elmer-240-CHN-Elementaranalysators.
  • 6. Phosphor - Molybdatmethode; Chen et al., Anal. Chem. 28, 1756 (1956).
    • Beispiel 2 Herstellung von Membranprotein von Neisseria Meningitidis B11 Serotyp 2 A. Fermentierung 1. Neisseria meningitidis Gruppe B11
  • Ein die gefriergetrocknete Kultur von Neisseria meningitidis enthaltendes Röhrchen (erhalten von Dr. M. Artenstein, Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D.C.) wurde geöffnet und mit Eugonbroth (BBL) versetzt. Die Kultur wurde auf Schokoladenagarplatten (BBL) ausgestrichen und bei 37ºC mit 5 % CO&sub2; 36 Stunden inkubiert, zu welchem Zeitpunkt der Bewuchs in 10 % Magermilchmedium (Difco) geerntet, aliquotiert und bei -70ºC eingefroren wurde. Die Organismen wurden durch Agglutinieren mit von WRAIR geliefertem spezifischem Antiserum und von Difco geliefertem Bestimmungsserum positiv identifiziert.
  • Diese im ersten Durchgang erhaltene Kultur wurde auf Schokoladenagarplatten ausgestrichen und bei 37ºC mit 5 % CO&sub2; 18 Stunden inkubiert, zu welchem Zeitpunkt der Bewuchs in 10 % Magermilchmedium geerntet, in Mengen von 1 ml aliquotiert und bei -70ºC eingefroren wurde. Der Organismus wurde erneut durch Agglutination mit von WRAIR geliefertem spezifischem Antiserum und von Difco geliefertem Bestimmungsserum positiv identifiziert.
  • Eine Phiole der Kultur aus dem zweiten Durchgang wurde aufgetaut und auf 10 Columbia-Schafblutagarplatten (CBAB-BBL) ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37ºC mit 5 % CO&sub2; 18 Stunden inkubiert, wonach der Bewuchs in 100 ml 10 % Magermilchmedium geerntet, in Mengen von 0,5 ml aliquotiert und bei -70ºC eingefroren wurde. Der Organismus wurde durch Agglutination mit spezifischem Antiserum, Zuckerfermentierung und Gram-Färbung positiv identifiziert.
  • Eine Phiole der Kultur aus diesem Durchgang wurde aufgetaut, mit Müller-Hinton-Brühe verdünnt und auf 40 Müller-Hinton- Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37ºC mit 6 % CO&sub2; 18 Stunden inkubiert, wonach der Bewuchs in 17 ml 10 % Magermilchmedium geerntet, in Mengen von 0,3 ml aliquotiert und bei -70ºC eingefroren wurde. Der Organismus wurde durch Gram-Färbung, Agglutination mit spezifischem Antiserum und mit dem Oxidasetest positiv identifiziert.
    • 2. Fermentation und Sammeln von Zellpaste a. Inokulumentwicklung.
  • Das Inokulum wurde aus zwei eingefrorenen 0,5 ml Phiolen Neisseria meningitidis Gruppe B, B-11 von oben (Durchgang 4) gezogen. Vier Blake-Flaschen mit Müller-Hinton-Agar wurden inokuliert, ungefähr 18 Stunden später geerntet und als Inokulum für 5 l Gotschlich's Hefedialysatmedium von pH 7,29 verwandt. Die OD wurde auf 0,065 bei 660 nm (Perkin Elmer) eingestellt. Der Organismus wurde in fünf 2 l-Erlenmeyer-Kolben (jeder mit 1 l Medium; siehe unten) bei 37ºC in einem Rüttler wachsen gelassen. Die OD wurde in Intervallen von 45, 75 und 120 Minuten verfolgt. Es resultierten ungefähr 4 l Kulturbrühe mit einer OD 660 von 0,81 (Spectronic 20). Eine 3 ml-Probe wurde für die Gram-Färbung, Isolationsabstriche auf CBAB, Müller, Hinton und Hefeextrakt-Dextrose-Platten sowie den Agglutinationstest genommen. Alle Reaktionen waren zufriedenstellend.
    • b. 70 l-Saatfermenter.
  • Ungefähr 3600 ml Saatkultur wurden zur Inokulierung eines sterilen 70 l-Fermenters mit 42,6 l vollständigem Produktionsmedium (siehe unten) verwandt.
  • Die Bedingungen für die 70 l-Fermentierung waren 37ºC, 185 Upm bei 10 l/min Luftzufuhr und Einstellung eines konstanten pH-Werts von 7,0 über 5,5 Stunden.
  • Die Kultur wurde auf Müller-Hinton-Agarplatten, Hefeextrakt-Dextrose- und Kaninchenblutagarplatten (Merck) bei 37ºC gestrichen und mit N. meningitidis-Gruppe B- Antiserum auf Agglutination hin getestet. Das Wachstum auf Müller-Hinton-Agarplatten, Hefeextrakt-Dextrose-Platten und Kaninchenblut-Agarplatten war normal und die Agglutinierungsreaktion war positiv. Für diese Charge war die End-OD 0,840 bei 660 nm nach 5,5 Stunden.
    • c. 800 l-Produktionsfermenter
  • Ungefähr 46,2 l Saatkultur wurden verwandt, um einen sterilen, 800 l-Fermenter mit 568,2 l vollständigem Produktionsmedium (siehe unten) zu inokulieren. Die Charge wurde bei 37ºC, 100 Upm mit 60 l/min Belüftung und konstanter pH-Einstellung auf 7,0 inkubiert.
  • Bevor die Charge inaktiviert wurde, wurde die Kultur auf Müller-Hinton-Agarplatten, Hefeextrakt-Dextrose- Platten und Kaninchenblut-Agarplatten bei 37ºC ausgestrichen und auf Agglutination mit N. meningitidis- Gruppe B-Antiserum hin getestet. Das Wachstum auf Müller-Hinton-Agarplatten, Hefeextrakt-Dextrose- und Kaninchenblut-Agarplatten war normal und die Agglutinierungsreaktion positiv. Für diese Charge war die End- OD 13 Stunden nach der Inokulierung 2,24.
    • 3. Vollständiges Medium für die Nephelometerkolben und 70 l- und 800 l-Fermenter Fraktion A
  • L-Glutaminsäure 1,5 g/l
  • NaCl 6,0 g/l
  • Na&sub2;HPO&sub4;.wasserfrei 2,5 g/l
  • NH&sub4;Cl 1,25 g/l
  • KCl 0,09 g/l
  • L-Cystein.HCl 0,02 g/l
    • Fraktion B (Gotschlich's Hefedialysat)
  • 1280 g Difco-Hefeextrakt wurden in 6,4 l destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde in 2 Amicon DC-30-Hohlfaser-Dialyseeinheiten mit drei H10SM-Kartuschen dialysiert. Das Dialysat und 384 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O und 3200 g Dextrose wurden gelöst und das Dialysat im Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 15 l gebracht. Der pH- Wert wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt und durch Filtration durch Millipore (0,22 um) sterilisiert und dem die Fraktion A enthaltenden Fermenter zugesetzt.
    • Für die Nephelometerkolben:
  • 1 l Fraktion A und 25 ml Fraktion B wurden hineingegeben und der PH-Wert mit NaOH auf 7,0 bis 7,2 eingestellt.
    • Für die 70 l-Fermenter:
  • 41,8 l Fraktion A und 900 ml Fraktion B wurden hineingegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0 bis 7,2 eingestellt.
    • Für den 800 l-Fermenter:
  • 553 l Fraktion A und 15,0 l Fraktion B wurden hineingegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0 bis 7,2 eingestellt.
    • d. Ernte und Inaktivierung
  • Nach Beendigung der Fermentierung wurde Phenol (0,5 % V/V Endkonzentration) in ein separates Gefäß gegeben, in das die Zellbrühe dann transferiert wurde. Das Material wurde unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur gehalten, bis die Kultur nicht länger lebensfähig war (etwa 24 Stunden).
    • e. Zentrifugieren
  • Nach etwa 24 Stunden bei 4ºC wurden die 614,4 l inaktivierte Kulturflüssigkeit durch Sharples-Zentrifugen zentrifugiert. Das Gewicht der Zellpaste nach der Phenoladdition war 3,875 kg.
    • B. Isolierung Schritt 1 - Waschen der Bakterienzellen
  • Für jede Isolierung wurde ein 200 g Aliquot der vorstehenden, mit 0,5 % Phenol inaktivierten Paste in einem 800 ml-Anteil sterilem destilliertem Wasser suspendiert und magnetisch bis zur granularen Suspension destilliert. Die suspendierten Zellen wurden 60 Minuten bei 20 000 xg und 5ºC pelletiert (Beckman 19 Ti- Rotor, 14 500 Upm).
    • Schritt 2 - Extraktion
  • Die gewaschenen Zellen wurden in 2000 ml 0,1 M Tris-0,01 M EDTA-Puffer von pH 8,5 mit 0,5 % Natriumdeoxycholat (TED-Puffer) mit einem Sorvall-2-Quart-Omnimischer bei Einstellung 3 60 Sekunden suspendiert. Die homogene Suspension wurde in 16 500 ml-Erlenmeyer-Kolben transferriert, um in einem Rüttelwasserbad bei 56ºC 15 Minuten (bei der Temperatur) extrahiert zu werden.
  • Der Extrakt wurde 60 Minuten bei 20 000 xg und 5ºC (Beckman 19 Ti-Rotor, 14 500 Upm) zentrifugiert. Die viskosen überstehenden Flüssigkeiten wurden dann dekantiert (Gesamtvolumen = 1980 ml) und bei 4ºC aufbewahrt.
  • Die extrahierten Zellpellets wurden erneut in 2000 ml TED- Puffer suspendiert, wie unmittelbar zuvor beschrieben. Die Suspension wurde 15 Minuten bei 56ºC extrahiert und wie oben zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden dekantiert (Volumen = 2100 ml) und bei 4ºC aufbewahrt.
    • Schritt 3 - Konzentration durch Ultrafiltration
  • Die überstehenden Flüssigkeiten der Extraktion aus Schritt 2 wurden gepoolt (Gesamtvolumen = 4005 ml). Zwei Liter des Pools wurden in einen 2 l New Brunswick-Fermentierungsbehälter dispensiert, an dem eine Millipore-Pellicon-Filterapparatur mit zwei 0,45 um Durapore-Membranen (1/2 Fuß² Oberfläche) befestigt war. Die überstehende Flüssigkeit der Extraktion wurde im Fermentierungsbehälter über das 90-minütige Konzentrationsverfahren bei 25ºC gehalten. Die Probe wurde bei einem durchschnittlichen transmembranen Druck von 27,5 psi zehnfach konzentriert.
    • Schritt 4 - Sammeln und Waschen des Serotyp-Proteins
  • Der Rückbehalt aus Schritt 3 (205 ml) wurde zentrifugiert, um das Serotyp-Protein zwei Stunden bei 160 000 xg und 5ºC zu pelletisieren (Beckman 45 Ti-Rotor, 37 000 Upm). Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen.
  • Die Proteinpellets wurden gewogen (8,12 g) und dann in TED- Puffer (190 ml Puffer; 20 ml/g Pellet) manuell mit einem Glasstab und einem Dounce-Homogenisator suspendiert. Die Suspension wurde bei 56ºC 15 Minuten (bei der Temperatur) in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben unter Schütteln extrahiert. Die Suspension wurde 2 Stunden bei 160 000 xg und 5ºC (Beckman 45 Ti-Rotor, 37 000 Upm) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen (Volumen = 190 ml) . Die Pellets wurden ein zweites Mal in 190 ml TED-Puffer, wie oben, gewaschen.
    • Schritt 5 - Gewinnung des Produkts
  • Die gewaschenen Proteinpellets aus Schritt 4 wurden in 100 ml destilliertem Wasser mit einem Glasstab und einem Dounce- Homogenisator zur Sicherstellung der vollständigen Suspendierung suspendiert. Für diese Suspension wurde ein Lowry-Proteinwert von 17,0 mg/ml erhalten. An diesem Punkt wurden 200 mg der Suspension für experimentelle Verwendungen reserviert. Die verbleibende Suspensionscharge (91 ml) wurde mit 102,4 ml glas-destilliertem Wasser auf 8,0 mg/ml verdünnt. Die wässrige Suspension wurde 15 Minuten bei 12 000 xg zentrifugiert, um sie von Aggregaten zu klären (Beckman 45 Ti-Rotor, 10 000 Upm).
  • Das überstehende Produkt wurde sorgfältig mit einer Pipette abgezogen, wobei das weiche Pelletaggregat gemieden wurde. Das Produkt wurde markiert (Volumen = 182,5 ml) und Aliquote auf Sterilität und Pyrogen getestet (steriles Produkt; keine Pyrogene). Das Produkt wurde bei 4ºC als sterile Charge bis zur Verwendung zur Konjugation aufbewahrt, zu welchem Zeitpunkt sie analytisch charakterisiert wurde. Die Ausbeute war 9,5 mg Lowry-Protein/g der ursprünglichen Zellpaste. TABELLE 2-1 Meningococcen B Serotyp 2-Proteinlösung Chemische Analysendaten Analyse Ergebnis Protein Lowry Nukleinsäure* RNS (Bial) DNA (Diphenylamin) Neutralzucker* Anthron Sialinsäure* Mokulargewicht SDS-PAGE *berechnet als Prozent Lowry-Protein
  • Die folgenden Verfahren wurden zur Durchführung der Analysen verwandt:
  • 1. Protein - wie in Beispiel 1.
  • 2. Nukleinsäure - Bei der Orcinol-Reaktion (Bial) wurde eine Farbentwicklung beobachtet, die 1,8 % RNS, berechnet als Prozentanteil der Proteinkonzentration, entsprach. Der Diphenylamintest auf DNS zeigte einen DNS-Gehalt von 0,6 % an, berechnet als Prozentanteil des Proteins in der gelösten Menge.
  • 3. Neutrale Zucker - Der Gehalt an neutralem Zucker, berechnet als Prozentanteil des Proteins, wurde unter Verwendung des Anthron-Colorimetertests bestimmt (Scott und Melvin, Anal. Chem. 25, 1656, 1953).
  • 4. Sialinsäure - Der Sialinsäuregehalt wurde mit dem Resorcin- HCL-Verfahren bestimmt (Svennerholm, Biochem. Biophys., Acta, 24, 604, 1957).
  • 5. Molekulargewicht - Das Molekulargewicht des mit Mercaptoethanol denaturierten Proteins wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt (Nature 227, 680 (1970), LKB Application Note 306).
    • Beispiel 3 Herstellung des Konjugats von S. Pneumoniae Typ 14-Polysaccharid - N. Meningitidis Serotyp B-Außenmembranprotein unter Zentrifugieren im Konjugationsschritt I. Fragmentierung von Pneumokokken Typ 14-Polysaccharid mit wässrigem Hydrazin
  • Ein 100 ml-Rundkolben wurde mit 24 ml H&sub2;O und 1,92 ml 97 %igem Hydrazin beschickt und dann in einem siedenden Wasserbad behandelt, bis die Temperatur 100ºC betrug (etwa 3 Minuten). Hierzu wurden, in einer Portion, 240 mg S. Pneumoniae Typ 14-Polysaccharid (Pn 14) gegeben, wonach die resultierende Lösung schnell 1,0 Min. gerührt wurde. Der Kolben wurde dann schnell in einem Eisbad abgekühlt und sein Inhalt in einem Spectropor 2-Rohr (MG-Ausschluß 12 000 bis 14 000) gegen 32 l H&sub2;O 5 Stunden dialysiert. Danach wurde die Dialyse mit 32 l frischem Wasser 16 Stunden wiederholt. Das Dialysat wurde in ein Zentrifugenröhrchen von 50 ml transferriert und zur Entfernung von Schlamm in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde unter Erhalt von 163 mg fragmentiertem Pn 14 gefriergetrocknet.
    • II. Bildung des Butandiaminderivats von depolymerisiertem Pn 14
  • 150 mg fragmentiertes Pn 14 wurden in einen trockenen 50 ml- Rundkolben gegeben und mit 9 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) bedeckt und unter N&sub2; verschlossen. Die Mischung wurde 5,0 Min. bei 54ºC gerührt und dann 5 Min. bei Raumtemperatur. Zu diesem Zeitpunkt war praktisch alles fragmentiertes Pn 14 in Lösung. 36 mg Carbonyldiimidazol wurden dann hinzugegeben und die Lösung 40 Min. gerührt. Währenddessen wurde eine Lösung von 1,4-Butandiamindihydrochlorid (300 mg/6 ml Wasser; pH mit 2,5 N NaOH auf 9,45 eingestellt) hergestellt und in einem Eisbad gekühlt. Nach 40 Min. Rühren wurde die DMSO-Lösung zur abgekühlten Butandiaminlösung gegeben und bei Raumtemperatur 4,5 Stunden gerührt. Sie wurde dann gegen 30 l Wasser 17,25 Stunden dialysiert und danach gegen 4 l frisches Wasser 4 Stunden. Das resultierende Dialysat wurde dann unter Erhalt von 152 mg Butandiaminderivat von Pn 14, Pn-BuA&sub2;, gefriergetrocknet. Kd = 0,70 Rate-Nephelometereinheiten (153 % des Basispolysaccharids); Fluorescamintiter = 150 nm NH&sub2;/mg.
    • III. Bromacetylierung des 1,4-Butandiaminderivats von Pn 14 (Pn 14-BuA&sub2;)
  • 140 mg Pn-14-BuA&sub2; wurden in 10 ml Puffer von pH 9,15 gelöst und diese Lösung wurde mit 140 mg p-Nitrophenylbromacetat, gelöst in 1 ml Acetonitril, versetzt. Dies wurde dann verschlossen und bei 4ºC 22,5 Stunden gerührt. Es wurde dann 6 Stunden gegen 4 l H&sub2;O, 16 Stunden gegen 4 l frisches H&sub2;O und zum dritten 7 Stunden gegen 4 l H&sub2;O dialysiert. Das Dialysat wurde dann unter Erhalt von 139 mg des Bromacetylderivats von Pn 14-BuA&sub2; gefriergetrocknet (Pn 14-BuA&sub2;-BrAC).
  • KD = 0,79 Rate-Nephelometereinheiten = 120 % des Basispolysaccharids.
  • Fluorescamintiter = 6 Nanomol/mg nach Differenz (Δ = 150-6); zeigt 144 Nanomol Bromacetylgruppen/mg an.
    • IV. Konjugation von Pn 14-BuA&sub2;-BrAc mit funktionalisiertem N.Meningitidis-Protein (NMP)
  • Alle Zentrifugationen wurden in Polycarbonatröhrchen und, sofern nicht anders festgestellt, bei 43 000 Upm über 2 Stunden bei 4ºC in einem Beckman Ti 75-Rotor durchgeführt.
  • Das unfunktionalisierte Protein (10 ml, 5,5 mg/ml) wurde zentrifugiert und das Pellet erneut in einem Dounce-Homogenisator in 7 ml einer Thiolierungsmischung mit 59 mg Ethylendiamintetraessigsäure, 11,2 mg Dithiothreitol und Natriumboratpuffer von pH 11,3 suspendiert. Nach der Resuspension wurde die Mischung in ein mit einem Serumstopfen verschlossenes Zentrifugenröhrchen transferriert und die Luft durch N&sub2; ersetzt. Dieses wurde in eine Stickstoffkammer transferriert und mit 54 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton versetzt. Es wurde verschlossen und dann in der N&sub2;-Kammer 22 Stunden altern gelassen, wonach sein pH-Wert durch Zugabe von 1 M KH&sub2;PO&sub4; auf 8,0 eingestellt wurde. Die resultierende Mischung wurde zentrifugiert und das Pellet dann erneut in 10 ml 0,1 M PO&sub4;- Puffer von pH 8,0 suspendiert. Diese wurde dann erneut zentrifugiert, um verbleibende kleine Moleküle zu entfernen. Das zweite Pellet wurde mit einem Dounce-Homogenisator erneut in 8,5 ml Puffer von pH 8,0 suspendiert. Die Ellman-Analyse zeigte insgesamt 6,4 uMol Thiol an.
  • Zum resuspendierten thiolierten Protein wurden 50 mg Pn 14- BuA&sub2;BrAc gegeben und die resultierende Lösung 17 Stunden bei Raumtemperatur in der Stickstoffkammer gealtert. Sie wurde dann gegen 4 l H&sub2;O 6 Stunden dialysiert. Eine Hälfte der Lösung (5 ml) wurde in ein Zentrifugenröhrchen transferriert, wonach 4,0 g CsCl darin gelöst wurden. Das Röhrchen wurde bis zum Rand (10 ml) mit H&sub2;O aufgefüllt und 20 Stunden bei 43 000 Upm und 4ºC in einen Ti 75-Rotor zentrifugiert. Das resultierende Zentrifugat mit gradierter CsCl-Dichte wurde mit einem Haake-Buchler-Auto-Densi-Flow 2C-Gerät in 1,3 ml-Fraktionen fraktioniert. Es wurden 9 Fraktionen gesammelt und die Nummern 5, 6 und 7 vereinigt, in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, mit 3,5 g CsCl versetzt, wonach die Mischung mit H&sub2;O überschichtet und 24 Stunden, wie oben zentrifugiert wurde. Das Zentrifugat wurde wie oben fraktioniert, die geeigneten Fraktionen durch Rate-Nephelometrie nachgewiesen und die Fraktionen 3 und 4 gegen 4 l 0,1 M PO&sub4;-Puffer (pH 7) 16 Stunden dialysiert und danach gegen 4 l H&sub2;O 4 Stunden. Das resultierende Dialysat wurde mit H&sub2;O auf 10 ml verdünnt.
  • Gefunden: Polysaccharid 0,205 mg/ml
  • Protein 0,550 mg/ml
  • Spinco: S-Carboxymethylhomocystein: 0,020 uMol
  • Lysin 0,145 uMol
  • Verhältnis 0,128
    • Beispiel 4 Herstellung eines Konjugats von S. Pneumoniae Typ 14-Polysaccharid und N. Meningitidis Serotyp B-Außenmembranprotein unter Verwendung einer Säule im Konjugationsschritt
  • Das bromacetylierte 1,4-Butandiaminderivat von Pneumokokken Typ 14 Polysaccharid, Herstellung gemäß Schritt I, II und III von Beispiel 3, wurde dann an das Protein konjugiert, das nach Beispiel 2 in einer Variante von Schritt IV von Beispiel 3 hergestellt worden war.
    • Konjugation von Pn 14-BuA&sub2;-BrAc an das Außenmembranprotein von Neisseria Meningitidis (NMP)
  • 1,2 ml einer NMP-Lösung (12,4 mg/ml) wurde zusammen mit 0,4 ml einer gesättigte NaBO&sub3; (pH 11,00) und 42 mg/ml Ethylendiamintetraessigsäure und 8 mg/ml Dithiothreitol enthaltenden Pufferlösung in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde mit einer Serumkappe verschlossen, entgast und die Luft durch Stickstoff ersetzt. Dann wurde es in einer Stickstoffkammer mit 10 mg N-Acetylhomocysteinthiolacton versetzt. Die Lösung wurde 17 Stunden bei Raumtemperatur altern gelassen. Zwei Sephadex G25-Säulen (PD/10) wurden mit Phosphatpuffer (0,1 M) von pH 8,0 äquilibriert. Zur Reaktionsmischung wurden 0,9 ml des Puffers von pH 8 gegeben, wonach die Gesamtmenge der ersten Säule zugesetzt wurde. Diese wurde mit 3,5 ml pH-Puffer eluiert. 2,5 ml des Eluats wurden in die zweite G-25-Säule gegeben und diese mit 3,5 ml Puffer von pH 8 eluiert. Dieses Eluat hatte nach Ellman's Test 525 Nanomol Thiol (insgesamt). Hierzu wurden 13 mg Pn 14-BuA&sub2;-BrAc gegeben und 7 Stunden unter N&sub2; altern gelassen. Es wurde dann zweimal gegen getrennte 4 L-Chargen Wasser (5 Stunden und 16 Stunden) dialysiert. Eine kleine Probe wurde für die Aminosäurenanalyse gefriergetrocknet. Gefunden wurden 0,0073 -µMol S-Carboxymethylhomocystein; 0,104 uMol Lysin. Das Produkt wurde bei 100 000 xg zentrifugiert und das Pellet erneut in 10 ml H&sub2;O suspendiert und erneut zentrifugiert. Die Resuspension in 10 ml ergab die Lösung des Ps-14- BuA&sub2;BrAc-NMP-Konjugats.
  • Polysaccharid:Protein = 0,25
  • S-Carboxymethylhomocystein:Lysin = 0,07.
    • Beispiel 5 Antikörper-Antworttests in Mäusen mit S. Pneumoniae Typ 14-Polysaccharid - N. Meningitidis Serotyp B-Außenmembranprotein-Konjugat
  • Eine Konjugatlösung S. Pneumoniae Typ 14-Polysaccharid- N. Meningitidis Serotyp B-Außenmembranprotein, hergestellt nach Beispiel 4, wurde auf die immunogene Antwort in Mäusen hin getestet, und die Ergebnisse sind unten aufgeführt. Serumantikörperantwort in Mäusen Probe Probe Dosis mcg. polys. Spezies RIA-Titer (GMT) ng ab N/ml Konjugat Polysaccharidkontrolle Infant-ICR/Ha-Maus (7 Tage alt) ICR/HA-Maus CBA/N-Maus * Regimen: injiziert i.p. an Tagen 0, 7, 28; zur Ader gelassen an Tagen 34 bis 35. ** Die Ergebnisse geben die Serologie aus zwei verschiedenen Würfen wieder.

Claims (21)

1. Stabile, kovalent gekoppelte Polysaccharid-Protein-Konjugate, welche neutrale bakterielle Polysaccharide und immunogene Proteine enthalten, die über Thioetherbindungen enthaltende zweifache Bindeglieder gekoppelt sind, worin die zweifachen Bindeglieder durch die Formel A-E-S-B dargestellt werden können, worin E
worin R H oder CH&sub3; ist; A - (CH&sub2;)mY(CH&sub2;)nNH- ist; worin m 0 bis 4 ist, n 0 bis 3 ist, W O oder NH ist und Y CH&sub2;, O, S, NR' oder CHCO&sub2;H ist, worin R' H oder C&sub1;- oder C&sub2;-Alkyl ist, so daß wenn Y CH&sub2; oder NH ist, dann sowohl m und n nicht gleich Null sind, und wenn Y O oder S ist, dann m größer als 1 und n größer als 1 ist;
und B -(CH&sub2;)p H(CH&sub2;)qD- ist, worin p 1 bis 3 ist, q 0 bis 2 ist, Z NH&sub2;, NH R', CO&sub2;H oder H ist und D , NR',
ist, worin R' wie vorstehend definiert ist.
2. Stabile, kovalent gekoppelte Polysaccharid-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, worin die zweifachen Bindeglieder durch die Formel
wiedergegeben sein können.
3. Polysaccharid-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, worin das neutrale bakterielle Hüll-Polysaccharid aus der aus Polysacchariden von Streptococcus pneumoniae, Typen 7F, 14 und 37, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
4. Polysaccharid-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, worin das immunogene Protein ein äußeres Membranprotein vom Meningococcus-B-Serotyp oder ein Edestin-Protein ist.
5. Polysaccharid-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, worin das neutrale bakterielle Hüll-Polysaccharid ein Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae, Typ 14, ist, das immunogene Protein ein äußeres Membranprotein vom Meningococcus-B-Serotyp ist und das zweifache Bindeglied durch die Formel
wiedergegeben sein kann.
6. Verfahren zum Löslichmachen von nicht-polyanionischen, neutralen, bakteriellen Polysacchariden durch Erhitzen der Polysaccharide in destilliertem Wasser, Entfernen des Restwassers und Lösen des Polysaccharids in einem nicht wässrigen polaren aprotischen Lösungsmittel.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dem destillierten Wasser 5 bis 15 %iges wässriges Hydrazin zugefügt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Polysaccharide 30 Sekunden bis 10 Minuten auf 70ºC bis 100ºC erhitzt werden, das Wasser durch Gefriertrocknung und Trocknung mit P&sub2;O&sub5; im Vakuum entfernt wird und das nicht wässrige, polare, aprotische Lösungsmittel Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Formamid oder N,N'-Dimethylimidazolidinon ist.
9. Verfahren zur kovalenten Modifizierung eines neutralen bakteriellen Polysaccharids durch
(a) Fragmentieren des Polysaccharids und Löslichmachen des fragmentierten Polysaacharids in einem nicht wässrigen, polaren, aprotischen Lösungsmittel;
(b) Aktivieren des Polysaccharids mit einem bifunktionellen Reagens; danach
(c) Reagieren dieses aktivierten Polysaccharids mit einem Bis-Nukleophil.
10. Verfahren nach Anspruch 9, welches ferner das Umsetzen des aktivierten Polysaccharids, das mit einem Bis-Nukleophil umgesetzt worden ist, mit einem anhängende elektrophile Stellen generierenden Reagens umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Polysaccharid durch Erhitzen des Polysaccharids in destilliertem Wasser fragmentiert wird, danach das Wasser durch Gefriertrocknen und Trocknen mit P&sub2;O&sub5; im Vakuum entfernt wird; das nicht wässrige, polare, aprotische Lösungsmittel Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Formamid oder N,N'-Dimethylimidazolidinon ist; das bifuktionelle Reagens aus der aus Carbonsäurederivaten, R³- -R³, worin R² und R³ getrennt Azolyl, Halogenide oder Phenylester darstellen, ausgewählt ist; und das Bis-Nukleophil ein Diamin der Formel H&sub2;N(CH&sub2;)mY(CH&sub2;)nNH&sub2; ist, worin m 0 bis 4 ist, n 0 bis 3 ist und Y CH&sub2;, O, S, NR', CHCO&sub2;H ist, worin R' H oder ein C&sub1;- oder C&sub2;-Alkyl ist, dergestalt, daß wenn Y CH&sub2; oder NH ist, dann m und n beide nicht gleich Null sein können, und wenn Y 0 oder S ist, dann m größer als 1 und n größer als 1 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das nicht wässrige, polare, aprotische Lösungsmittel Dimethylformamid ist, das bifunktionelle Reagens Carbonyldiimidazol ist und das Bis- Nukleophil 1,4-Butandiamin ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, worin das elektrophile Stellen generierende Reagens X' HX ist, worin X' Nitrophenoxy, Dinitrophenoxy, Pentachlorophenoxy, Pentafluorphenoxy, Halogen, O-(N-Hydroxysuccinimidyl) oder Azido ist, R H oder CH&sub3; ist und X Cl, Br oder I ist; oder eine aktivierte Maleinimidosäure
worin p 1 bis 3 ist und X' wie oben definiert ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das elektrophile Stellen generierende Reagens p-Nitrophenylbromacetat ist.
15. Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid-Protein-Konjugaten, welche neutrale bakterielle Hüll-Polysaccharide und immunogene Proteine enthalten, die über Thioetherbindungen enthaltende zweifache Bindeglieder gekuppelt sind, durch
(a) Fragmentieren des Polysaccharids und Löslichmachen des depolymerisierten Polysaccharids in einem nicht wässrigen, polaren, aprotischen Lösungsmittel;
(b) Aktivieren des Polysaccharids mit einem bifunktionellen Reagens;
(c) Umsetzen dieses aktivierten Polysaccharids mit einem Bis-Nukleophil;
(d) Umsetzen dieses aktivierten Polysaccharids, das mit einem Bis-Nukleophil umgesetzt worden ist, mit einem elektrophile Stellen generierenden Reagens unter Ausbildung eines Polysaccharids mit anhängenden elektrophilen Stellen;
(e) unabhängig davon Umsetzen des immunogenen Proteins mit einem Thiolgruppen generierenden Reagens zur Bildung eines Proteins mit anhängenden Thiolgruppen; danach
(f) Umsetzen des Polysaacharids mit anhängenden elektrophilen Stellen mit dem Protein mit anhängenden Thiolgruppen unter Bildung eines Polysaccharid-Protein- Konjugats, das durch eine kovalente Thioetherbindung gekuppelt ist; danach
(g) Zentrifugieren der resultierenden Mischung zur Entfernung nicht kovalent gebundener Polysaccharide und Proteine.
16. Zusammensetzung, welche eine immunologisch wirksame Menge für entweder den aktiven oder den passiven Schutz von Säugetierspezies vor durch den stammverwandten Organismus verursachter Bakteriämie an stabilen, kovalent gekuppelten Polysaccharid-Protein-Konjugaten nach Anspruch 1, von diesen Konjugaten abgeleitete Antiseren oder Gamma- Globulin oder andere antikörperhaltige Fraktionen dieser Antiseren sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, welche weiterhin ein Adjuvans enthält.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin die Polysaccharid- Protein-Konjugate ein Pneumokokken Typ 14-Polysaccharid umfassen, das durch ein zweifaches Bindeglied der Formel
an ein äußeres Membranprotein vom Meningococcus-B-Serotyp gekuppelt ist, eine immunologisch wirksame Menge eine Menge eines jeden der Konjugate in der Zusammensetzung dergestalt ist, daß jedes Konjugat 2 bis 50 ug des Polysaccharids in der Konjugatform enthält, und die Säugetierspezies der Mensch ist.
19. Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Säugetierspezies gegen Bakteriämie des stammverwandten Organismus, welche Zusammensetzung ein oder mehrere Typen von Polysaccharid- Protein-Konjugaten enthält, die neutrale bakterielle Hüll-Polysaccharide umfassen, die über Thioetherbindungen enthaltende zweifache Bindeglieder an immunogene Proteine gekuppelt sind, sowie wenigstens ein Glied der aus einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, einem Adjuvans und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und Adjuvans bestehenden Gruppe.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin die Polysaccharid- Protein-Konjugate ein Polysaccharid vom Pneumokokken-Typ 14 enthalten, das über ein zweifaches Bindeglied der Formel
an ein äußeres Membranprotein vom Meningokokken-B-Serotyp gekuppelt ist, die zu behandelnde Spezies menschliche Neugeborene sind und die wirksame Menge der Zusammensetzung in einer einzelnen Dosis eine 25 ug des Polysaccharids in der konjugierten Form für Konjugate von Pneumokokkenpolysacchariden entsprechende Menge ist.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin eine oder zwei zusätzliche Booster-Zusammensetzungen einer Menge eines Polysaccharid-Protein-Konjugats entsprechend 25 ug Polysaccharid in der Konjugatform an menschliche Neugeborene verabreicht werden können, welches ein Polysaccharid-Protein-Konjugat umfaßt, das über zweifache Bindeglieder an immunogene Proteine gekuppelte neutrale bakterielle Hüll- Polysaccharide enthält.
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