DE69433341T2

DE69433341T2 - Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten

Info

Publication number: DE69433341T2
Application number: DE69433341T
Authority: DE
Inventors: Andrew Lees
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2014-09-22
Also published as: EP0720485A1; WO1995008348A1; NZ274376A; CA2171942C; US5693326A; NL300412I1; JPH09502978A; ATE254475T1; CA2171942A1; EP0720485B1; ES2210262T3; FR12C0059I2; JP3828145B2; NL300411I1; DE122009000058I1; AU7839194A; DE69433341D1; FR12C0059I1; US5651971A; AU678613B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren zur Herstellung immunogener Konstrukte.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In dem Verfahren der Impfung nutzt die Medizin die angeborene Fähigkeit des Körpers, sich selbst gegen eindringende Agenzien zu schützen, durch Immunisieren des Körpers mit Antigenen, welche die Krankheit nicht verursachen, jedoch die Bildung von Antikörpern, welche gegen die Krankheit schützen, stimulieren. Zum Beispiel werden tote Organismen injiziert, um gegen bakterielle Krankheiten wie z. B. typhoides Fieber und Keuchhusten zu schützen, Toxine werden injiziert, um gegen Tetanus und Botulismus zu schützen und attenuierte Organismen werden injiziert, um virale Krankheiten wie z. B. Kinderlähmung und Masern zu schützen.
Es ist jedoch nicht immer möglich, die Antikorperbildung lediglich durch Injektion des fremden Antigens zu stimulieren. Das Impfpräparat muss immunogen sein. Das heißt, es muss fähig sein, eine Immunantwort zu induzieren. Die Immunantwort besteht aus einer komplexen Folge von Reaktionen, welche im Allgemeinen wie folgt beschrieben werden kann:

1. Das Antigen dringt in den Körper ein und trifft auf Antigen präsentierende Zellen, welche das Antigen prozessieren und Fragmente des Antigens auf ihren Oberflächen zurückbehalten;
2. die Antigenfragmente, welche au den Antigen präsentierenden Zellen zurückgehalten werden, werden von T-Zellen, welche den B-Zellen Hilfe bereitstellen, erkannt; und
3. die B-Zellen werden stimuliert, zu proliferieren und sich zu Antikörper bildenden Zellen zu teilen, welche Antikörper gegen das Antigen sezernieren.

Gewisse Agenzien, wie z. B. Tetanustoxoid, sind von Haus aus immunogen und können ohne Modifikation in Impfstoffen verabreicht werden. Andere wichtige Agenzien dagegen sind nicht immunogen und müssen in immunogene Moleküle konvertiert werden, bevor sie eine Immunantwort induzieren können.
Ein Verfahren zur Herstellung immunogener Moleküle wird zur Verfügung gestellt in dem hiermit in Zusammenhang stehenden US-Patent Nr. 5,585,100. Dieses Patent beschreibt ein immunogenes Konstrukt mit einem dualen Träger, ein höchst wünschenswertes immunogenes Konstrukt.
Bei der Herstellung immunogener Moleküle wie z. B. dem immunogenen Konstrukt mit einem dualen Träger des oben erwähnten US-Patentes und anderen immunogenen Konstrukten, sollte das verwendete Verfahren ausreichend schonend sein, um die wichtigen antigenen Stellen, d. h. die Epitope auf den Molekülen, zu bewahren. Folglich ist es wünschenswert, die Integrität der Struktur aufrecht zu erhalten und die Epitope in diesen Verbindungen zu erhalten. Bedauerlicherweise sind die Herstellungsschritte, welche gegenwärtig in dem Stand der Technik verwendet werden, häufig nicht schonend und können die native Kohlenhydrat- und/oder Proteinstruktur zerstören. Darüber hinaus ertordem die meisten dieser Methoden zur Modifizierung von Kohlenhydraten wasserfreie Bedingungen, Kohlenhydrate jedoch sind bedauerlicherweise häufig unlöslich in organischen Lösemitteln. Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc., 108: 5282 (1986).
Es gibt zwei allgemeine Verfahren zur Herstellung immunogener Konstrukte:

(1) die direkte Konjugation von Kohlenhydrat und Protein; oder
(2) die Konjugation von Kohlenhydraten und Protein über einen bifunktionellen Linker oder ein Spacer-Reagens.

Im allgemeinen erfordern beide Arten der Konjugation die chemische Aktivierung der Kohlenhydratkomponente vor deren Derivatisierung. Chemische Aktivierung bezieht sich auf die Umwandlung einer funktionellen Gruppe in einer Form, welche zusätzlichen chemischen Reaktionen unterworfen werden kann, z. B. der Addition einer funktionellen Gruppe oder der Addition einer großen Komponente wie z. B. einem Protein.
Derivatisierung bezeichnet die Addition von einer funktionellen chemischen Gruppe (funktioneller chemischer Gruppen) oder eines Spacer-Reagens (Reagenzien) an ein Protein.
Gewisse Kohlenhydrate enthalten Gruppen, wie z. B. Amino- oder Carboxylgruppen, welche vor der Konjugation leichter aktiviert oder derivatisiert werden können. Beispielsweise können die Aminogruppen in Pseudomonas Fisher Typ I leicht mit lodacetylgruppen derivatisiert werden und an thioliertes Protein gebunden werden. Die Carboxylgruppen in Kohlenhydraten wie z. B. dem Typ III aus Pneumonococcen können leicht mit wasserlöslichen Carbodiimiden, wie z. B. EDC aktiviert werden und können dann direkt an das Protein gekoppelt werden. Bedauerlicherweise jedoch ist diese Gruppe von Kohlenhydraten limitiert.
Andere Kohlenhydrate besitzen Aldehydgruppen an dem terminalen reduzierenden Ende, welche für die Derivatisierung und Konjugation ausgenutzt werden können. Es ist ebenfalls möglich, Aldehydgruppen an dem terminalen reduzierenden Ende zu erzeugen durch die Behandlung mit Natriumperiodat. Das Vorhandensein von Aldehydgruppen kann vorteilhaft sein, da die Aktivierung von Kohlenhydraten nicht notwendig sein muss, wenn Aldehydgruppen verwendet werden.
Diese Aldehydgruppen können kondensiert werden mit Aminogruppen auf dem Protein oder mit einem bifunktionellen Linker-Reagens. Diese Kondensationsreaktion, insbesondere mit dem terminalen reduzierenden Ende jedoch läuft häufig ziemlich langsam und ineffizient ab. Dieses wird noch verschlimmert, wenn Kohlenhydrataldehyde direkt an Proteine konjugiert werden. Folglich sind die Ausbeuten unter Verwendung dieses Verfahrens häufig sehr gering. Darüber hinaus kann Natriumperiodat die Kohlenhydrate in kleinere Fragmente aufbrechen und/oder die Epitope zerstören, was unerwünscht sein kann.
Die meisten Kohlenhydrate jedoch müssen vor der Konjugation aktiviert werden, und Cyanogenbromid ist häufig das Aktivierungsmittel der Wahl. Siehe z. B. Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983). Kurz beschrieben wird Cyanogenbromid mit dem Kohlenhydrat bei einem hohen pH-Wert, typischerweise pH 10 bis 12, zur Reaktion gebracht. Bei diesem hohen pH werden Cyanatester mit den Hydroxylgruppen des Kohlenhydrats gebildet. Diese wiederum werden mit einem bifunktionellen Reagens zur Reaktion gebracht, gewöhnlich einem Diamin oder einem Dihydrazid. Diese derivatisierten Kohlenhydrate können anschließend über die bifunktionelle Gruppe konjugiert werden. Die Cyanatester können ebenfalls direkt zu Protein zur Reaktion gebracht werden.
Der hohe pH ist nötig, um die Hydroxylgruppe zu ionisieren, da die Reaktion den nukleophilen Angriff des Hydroxylions auf das Cyanation (CN^–) erfordert. Als Ergebnis produziert Cyanogenbromid zahlreiche Nebenreaktionen, von denen einige geladene Gruppen und Neoantigene an das Polysaccharid anfügen. M. Wilcheck et al., Affinity Chromatopraphy. Meth. Enzymol., 104C: 3–55. Noch wichtiger jedoch ist, dass viele Kohlenhydrate hydrolysiert oder geschädigt werden können durch den hohen pH, welcher nötig ist, um die Cyanogenbromid-Aktivierung durchzuführen.
Zusätzlich ist der Cyanatester, welcher nach der Aktivierung mit Cyanogenbromid gebildet wird, bei hohem pH unstabil und wird rasch hydrolysiert, was die Ausbeute des derivatisierten Kohlenhydrates reduziert und damit die Gesamtausbeute des Kohlenhydrates, welches mit Protein konjugiert ist. Zahlreiche weitere nicht-produktive Nebenreaktionen, wie z. B. solche, die Carbamate und lineare Imidocarbonate produzieren, werden durch den hohen pH gefördert. Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981). Darüber hinaus ist Cyanogenbromid selbst höchst instabil und hydrolysiert spontan bei hohem pH, was weiterhin die Gesamtausbeute reduziert.
Weiterhin ist die Cyanogenbromid-Aktivierung schwer durchzuführen und unzuverlässig. Cyanogenbromid ist hochtoxisch und potentiell explosiv. Alle Arbeitsschritte müssen in einem geeigneten Dunstabzug ausgeführt werden. Es ist den Fachleuten außerdem wohl bekannt, dass die Aktivierung nicht einfach reproduzierbar ist, da einige Chargen von Cyanogenbromid gut funktionieren und andere nicht. Cyanogenbromid ist außerdem schwer löslich in Wasser, was es schwierig macht, die Menge an löslichem Cyano genbromid, welches für die Reaktion mit Kohlenhydrat zur Verfügung steht, zu kontrollieren. Selbst die Verwendung derselben Charge von Cyanogenbromid und offensichtlich identischen Reaktionsbedingungen führt nicht immer zu identischen Ergebnissen.
DE-A-1815332 beschreibt ein Verfahren für die kovalente Konjugation von organischen Verbindungen mit Polymeren, in welchem das Polymer unter Verwendung von p-Nitrophenylcyanat (pNPC) vor der Reaktion mit der organischen Verbindung aktiviert wird.
EP-A-0186576 diskutiert kovalente Konjugate von neutralen bakteriellen Polysacchariden verbunden durch einen bigenerischen Sparer mit einer immunogenen bakteriellen Membran oder anderen Proteinen, wobei die Konjugate nützliche Bestandteile von bakteriellen Impfstoffen sind.
Ein weiteres Dokument (Infection and Immunity, Bd. 40, Nr. 1, 1983, S. 245–256) beschreibt die Verwendung des Konstruktes Pn6A-TT( ein Konjugat von Pneumococcen 6A Polysacchariden mit Tetanustoxoid) zur Herstellung immunogener Substanzen.
Zusätzlich zu den genannten Nachteilen ist es sehr schwierig, den Grad der Kohlenhydrataktivierung, welche durch die Verwendung von Cyanogenbromid erreicht wird, zu steuern. Es ist ebenfalls sehr schwierig, unter Verwendung dieses Verfahrens eine hohe Stufe der Kohlenstoffaktivierung zu erreichen. Eine Erhöhung der Menge an vorhandenem Cyanogenbromid ist ineffektiv und führt lediglich zu verstärkten Nebenreaktionen ohne eine Erhöhung der Aktivierung. Kohn et al., Applied Biochem and Biotech, 9: 285 (1984). Folglich gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für ein Verfahren zur Herstellung immunogener Konstrukte, welches schonend ist, die Integrität der Struktur der Kohlenhydrate und Proteine aufrecht erhält, die Epitope in den Verbindungen erhält, leicht durchzuführen ist, zuverlässig ist und leicht reproduzierbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile der Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung immunogener Konstrukte durch zur Verfügung stellen eines Konjugationsverfahrens, welches ein Kohlenhydrat-Aktivierungsvertahren anwendet, das sicher ist, leicht durchzuführen, kostengünstig und schonend zu den Kohlenhydraten.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet neuartige cyanylierende Reagenzien, um Kohlenhydrat-enthaltende Antigene zu aktivieren. Da die Reaktionsbedingungen mit dem cyanylierenden Reagens so schonend sind, wird das Risiko der Zerstörung von der Kohlenhydratstruktur und damit der Zerstörung von natürlich vorkommenden Epitopen stark vermindert. Dieses Verfahren ist anwendbar auf eine große Vielfalt von löslichen Kohlenhydraten, und die Kohlenhydrate, welche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren aktiviert werden, können entweder direkt mit dem Protein konjugiert werden oder indirekt mit dem Protein konjugiert werden durch die Verwendung eines Spacers oder eines Linkers. Dieses Verfahren wird andere befähigen, effektivere immunogene Konstrukte effizienter und weniger teuer herzustellen als immunogene Konstrukte, welche unter Verwendung der Verfahren des Standes der Technik hergestellt wurden. Wie in Tabelle 1 unten dargestellt, ist dieses Verfahren vorteilhafter als das gegenwärtig verwendete Cyanogenbromid. TABELLE 1 Vergleich der Kohlenhydrataktivierung als Herstellung zur Synthese von Konjugaten

Cyanogenbromid	Neue cyanylierende Reagenzien
Hoher pH (10–12) zerstört viele CHO-Epitope	Schonender pH (7,0) keine Veränderung der CHO-Epitope
Toxisch (Dunstabzug erforderlich)	Nicht-toxisch
Gefährlich in großen Mengen	Sicher
Geringe Ausbeute	Hohe Ausbeute
Zahlreiche Nebenreaktion	Minimale bis keine Nebenreaktionen
Lässt die direkte Konjugation mit Protein nicht einfach zu	Erlaubt die direkte Konjugation mit Protein und erlaubt die Gewinnung von unkonjugiertem Protein
Charge zu Charge Variation	Reproduzierbar
Schwieriger Umgang mit kleinen Mengen	Leichter Umgang mit geringen Mengen

In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, welcher ein immunogenes Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, umfassend die Erzeugung des immunogenen Konstrukts durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Aktivieren von wenigstens einer ersten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einem organischen cyanylierenden Reagens, wobei das genannte organische cyanylierende Reagens ausgewählt ist aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) und N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA); und
(b) kovalentes Verbinden der genannten aktivierten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einer zweiten Komponente.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, welcher ein immunogenes Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, umfassend die Erzeugung des immunogenen Konstrukts durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Aktivieren von wenigstens einer ersten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einem organischen cyanylierenden Reagenz, wobei das genannte organische cyanylierende Reagens ausgewählt ist aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) und N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA); (b) kovalentes Verbinden der genannten ersten Komponente mit einem bifunktionellen Spacer-Reagens; und (c) kovalentes Verbinden einer zweiten Komponente mit dem bifunktionellen Spacer-Reagens aus Schritt (b).

Zusätzliche Vorteile bei der Verwendung von CDAP sind: (1) das Reagens kann im Voraus hergestellt werden und in einer Lösung für mehrere Monate gelagert werden; und (2) die Konzentration des aktiven Reagens kann leicht anhand seiner Absorption bei 301 nm (Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981) bestimmt werden. Dieses macht es möglich, die Konzentration des Reagens zu standardisieren und macht die Derivatisierung des Kohlenhydrates reproduzierbarer, was für dessen Verwendung in Impfstoffpräparaten wichtig ist.
Alle der oben genannten Vorteile gelten sowohl für die direkte Konjugation von Proteinen mit dem Kohlenhydrat als auch für die indirekte Konjugation über einen Spacer.
Zusätzliche Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden teilweise dargestellt in der Beschreibung, welche folgt und teilweise sind sie offensichtlich aus der Beschreibung oder können durch Praktizieren der Erfindung erfahren werden. Die Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden realisiert und erlangt werden durch die Elemente und Kombinationen, auf welche besonders in den angefügten Ansprüchen hingewiesen wird.
Es ist selbstverständlich, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung wie auch die folgende detaillierte Beschreibung lediglich exemplarisch und erläuternd ist und nicht einschränkend für die Erfindung wie beansprucht.
Die beigefügten Zeichnungen, welche eingeschlossen sind in der Beschreibung und einen Teil der Beschreibung bilden, illustrieren mehrere beispielhafte Ausführungsbeispiele der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erklärung der Prinzipien der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt ein verallgemeinertes Schema für die Aktivierung von Kohlenhydrat unter Verwendung von cyanylierenden Reagenzien dar.
2 zeigt Schemata für die direkte Konjugation eines aktivierten Kohlenhydrates mit Protein (linke Seite der Figur) und für die indirekte Konjugation eines aktivierten Kohlenhydrates mit einem Protein unter Verwendung eines bifunktionellen Reagens (rechte Seite der Figur).
3 veranschaulicht ein Modell eines immunogenen Konstruktes.
4 stellt den Einbau von NH₂-Gruppen in Dextran gegenüber den addierten Molen CDAP/Mol Dextran dar.
5 stellt das Elutionsprofil von einem ³H-BSA-Dextran-Konjugat von einer S400SF-Gelfiltrationssäule dar.
6 stellt die OD280-Absorption von immunogenen Konstrukten, welche nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurden, eluiert von einer S400SF-Gelfiltrationssäule, dar. A, PT-PRP; B, P28-PT-Pn14.
7 stellt das Elutionsprofil von Hδ^a/1-(CDAP)-Dextran von einer S400SF-Gelfiltrationssäule dar.
8 stellt die OD280- und OD430-Werte von Säulenproben dar, welche von einer S400SF-Gelfiltrationssäule, die mit Hδ^a/NH₂-(CDAP)-Dextran beladen wurde, eluiert wurden.
9 stellt die Immunreaktivität von immunogenen Konstrukten, welche unter Verwendung der Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurden, dar.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun im Detail auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwiesen, deren Beispiele in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt sind.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aktivierung von Kohlenhydrat-enthaltenden Antigenen zu ihrer Verwendung in der Herstellung von immunogenen Konstrukten. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten, welches die Aktivierung von der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einem cyanylierenden Reagens umfasst. Ein verallgemeinerndes Schema für die Aktivierung von Kohlenhydraten unter Verwendung von cyanylierenden Reagenzien ist in 1 gezeigt. 2 stellt die Verwendung eines aktivierten Kohlenhydrates für dessen direkte Konjugation mit Protein oder dessen indirekte Konjugation über die Verwendung eines bifunktionellen Linker-Reagenzes dar.
Wie hierin verwendet, bezieht sich das immunogene Konstrukt auf eine Einheit, welche die Immunantwort stimulieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine Kohlenhydrat-enthaltende Komponente konjugiert mit wenigstens einer zweiten Komponente, welche ein Protein ist. Wie hierin verwendet bedeutete "Kohlenhydrat" jedes lösliche Monosaccharid, Disaccharid, Oligosacchande oder Polysaccharid. Polysaccharide enthalten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, Stärken, Cellulosen und Pektine. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zweite Komponente ein T-abhängiges Antigen, welches daran konjugiert ist, wie in 3 gezeigt.
Wie hierin verwendet, ist eine Komponente jede Substanz, welche Subtanzen beinhaltet, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, die verwendet werden können, um das Immunsystem entweder selbst oder nach Kopplung zu stimulieren. Komponenten beinhalten Kohlenhydrate, Proteine, Peptide, andere Antigene, Adjuvanzienmoleküle, Haptene oder Kombinationen daraus. Haptene beziehen sich auf kleine Moleküle, wie z. B. Chemikalien, Staub und Allergene, welche selbst nicht fähig sind, eine Antikörperantwort hervorzurufen, es jedoch können, sobald sie an einen Träger gekoppelt sind. Ein Antigen ist jedes Molekül, das unter den richtigen Umständen die Bildung von Antikörpern induzieren kann. Diese Haptene und Antigene können abgeleitet werden von Bakterien, Rickettsien, Pilze, Viren, Parasiten, Arzneimittel oder Chemikalien, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Sie können z. B. kleine Moleküle wie z. B. Peptide, Oligosaccharide (z. B. das Polyribosyl-ribitol-phosphat von H. influenzae), Toxine, Endotoxin usw. beinhalten.
Das Verfahren zur Synthetisierung des Konstruktes gemäß der Erfindung erlaubt es, die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Endproduktes vorteilhaft zu kontrollieren. Die Eigenschaften, welche gesteuert werden können, beinhalten das Modifizieren der Ladung auf der ersten und zweiten Komponente (ein Vorteil angesichts des Anhaltspunktes, nachdem kationisierte Proteine immunogener sein können), Variieren der Größe des Konstruktes durch Variieren der Größe der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente, Selektieren des Grades der Vernetzung des Konstruktes (um Variationen in der Größe zu erhalten), Selektieren der Zahl der Kopien der zweiten Komponente, welche mit den Kohlehydrat-enthaltenden Komponenten konjugiert ist, und Targeting auf selektierte Zellpopulationen (wie z. B. auf Makrophagen, um die Antigenpräsentation zu verstärken). Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Corbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Herausgeber), Bd. 10, S. 48–114 (1989).
Die Immunantwort auf das Konstrukt gemäß der Erfindung kann weiter verstärkt werden durch die Addition von Immunmodulatoren und/oder Zelltargeting-Komponenten. Diese Einheiten beinhalten, z. B., (1) detoxifizierte Lipopolysaccharide oder Derivate, (2) Muramyldipeptide, (3) Kohlenhydrate, Lipide und Peptide, welche mit Zelloberflächendeterminanten interagieren können, um das Konstrukt auf immunologisch relevante Zellen zu targeten, (4) Interleukine und (5) Antikörper.
Die Kohlenhydrat-enthaltende Komponente kann natürlich vorkommen, ein semisynthetisches oder ein vollständig synthetisches hochmolekulares Molekül sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine Kohlenhydrat-enthaltende Komponente ein Kohlenhydrat, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli Polysacchariden, S. aureus Polysacchariden, Dextran, Carboxymethylcellulose, Agarose, Polysacchariden von Pneumococcen, Ficoll, Cryptococcus neo-formans, Haemophilus influenzae PRP, P. aeroginosa, S. pneumoniae, Lipopolysaccharide und Kombinationen daraus.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Kohlenhydrat-enthaltende Komponente ein Dextran. Wie hierin verwendet, bezieht sich Dextran auf ein Polysaccharid, welches aus einem einzelnen Zucker zusammengesetzt ist und von einer Vielzahl von Quellen erhältlich ist, einschließlich Pharmacia. Ficoll, ein Beispiel für ein semisynthetisches Polymer, ist ein inertes synthetisches, nicht-ionisiertes hochmolekulares Polymer. Ein Beispiel für ein synthetisches Polymer ist Polyvinylalkohol. Alle sind Beispiele für eine Kohlenhydrat-enthaltende Komponente.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Komponente ein Albumin, ein Toxoid, ein Protein, ein Peptid, ein T-Zell- oder B-Zell-Adjuvans oder jede andere Verbindung, welche fähig ist, T-Zellhilfe zu aktivieren und zu rekrutieren. Das Protein kann ausgewählt sein aus einer Gruppe bestehend aus, jedoch nicht auf diese beschränkt, virale, bakterielle, parasitische, tierische oder Pilzproteinen. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Komponente bovines Serumalbumin, Tetanustoxoid, Pertussistoxoid, Diphtherietoxoid, Hitzeschockprotein, T-Zell-Superantigen oder Protein der äußeren Bakterienmembran, welche alle von biochemischen oder pharmazeutischen Lieferfirmen erhalten werden können oder durch Standardmethodik präpariert werden können (J. M. Cruse & R. E. Lewis, (Herausgeber), Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, Bd. 10 (1989). Weitere Proteine würden den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein.
Die sekundären Komponenten gemäß der Erfindung sind fähig, mit wenigstens einer Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente konjugiert zu werden. Die sekundären Komponenten können entweder funktionelle Gruppen enthalten, welche mit der Kohlenhydratenthaltenden Komponente reagieren können, oder die sekundäre Komponente kann chemisch manipuliert werden, so dass sie fähig ist, mit der oben erwähnten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente zu reagieren.
Zahlreiche Kopien der spezifischen sekundären Komponenten, wie auch verschiedene sekundäre Komponenten können mit der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente konjugiert werden. Das Koppeln von mehreren Kopien der sekundären Komponente mit der ersten Komponente erhöht signifikant die Antikörperproduktion gegen die zweite Komponente.
In einer weiteren Ausführungsform können tertiäre Komponenten weiterhin mit einer oder mehreren der ersten und/oder der zweiten Komponenten konjugiert werden. Wie in den mit dieser Anmeldung in Zusammenhang stehenden Anmeldungen dargestellt, fördert eine solche Konjugation eine verstärkte Antikörperantwort gegen die tertiäre Komponente. Methoden zur Konjugation verschiedener Komponenten mit entweder den primären oder sekundären Komponenten sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt und beinhalten, zum Teil, das Koppeln durch zur Verfügung stehende funktionelle Gruppen (wie z. B. Amino-, Carboxyl-, Thio- und Aldehydgruppen). Siehe S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991) und Brenkeley et al., "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents", Bioconjugate Chemistry, 3: 1 (Jan. 1992).
In dem Verfahren gemäß der Erfindung wird die Kohlenhydrat-enthaltende Komponente unter Verwendung eines cyanylierenden Reagens aktiviert. Cyanylierende Reagenzien erhöhen die Elektrophilität des Cyanats, und wenn sie mit den Kohlenhydrat-enthaltenden Komponenten zur Reaktion gebracht werden, können cyanylierende Reagenzien eine Cyangruppe auf die Hydroxylgruppen des Kohlenhydrates übertragen und es dadurch für weitere Reaktionen vorbereiten, d. h. für die direkte oder indirekte Konjugation mit Protein. Die Aktivierungsreaktion kann bei neutralem pH durchgeführt werden, was die Stabilität und Integrität des Polysaccharids verbessert.
Verschiedene cyanylierende Reagenzien sind bekannt, wie z. B. N-Cyanotriethylammoniumtetrafluorborat (CTEA), 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridiniumtetrafluoroborat (CDAP), p-Nitrophenylcyanat (pNPC). Wakselman et al. berichteten, dass CDAP ein mildes Reagens ist, welches für die Modifikation von Protein-Cystein-Gruppen verwendet werden kann. J. C. S. Chem. Comm., 1976: 21 (1976). Von diesen Reagenzien ist CDAP das am meisten bevorzugte, da es am stabilsten ist und ohne Abzugshaube verwendet werden kann, CTEA und pNPC sind aber auch Teil der beanspruchten Erfindung. Weitere tertiäre Aminkomplexe mit der Cyanatgruppe mit verschiedenen Gegenionen liegen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung. Besonders nützlich sind nicht-nukleophile Gegenionen wie z. B. Tetrafluoroborat.
Kohn et al. haben CDAP, CTEA und pNPC als aktivierende Mittel für Agarose, einem unlöslichen Polysaccharidharz, verglichen. Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981).
Andere Forscher haben CDAPs verwendet, um andere Arten von unlöslichen Partikeln, wie z. B. Sepharose und Glyceryl-kontrolliertes Porenglas zu aktivieren. A. Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573: 132–135 (1992). Weit entfernt von der beanspruchten Herstellung von Immunogenen Konstrukten, offenbaren diese Dokumente die Verwendung von aktivierten unlöslichen Partikeln zur Herstellung von Gelen für die Affinitätschromatographie.
In dem einzigen Bericht über die Verwendung von CDAP zur Aktivierung eines löslichen Polysaccharides vor der Konjugation mit Protein, Andersson et al., International Journal of Cancer, 47: 439–444 (1991), haben Andersson et al. epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF) mit niedrigmolekularem 40 kDa Dextran, welches mit Cyanat aktiviert wurde, direkt konjugiert. Sie verwendeten sehr hohe Dextran zu EGF-Verhältnisse von etwa 50 : 1 (Gew./Gew.), um Dextran-EGF-Konjugate herzustellen und untersuchten die Bindung dieses Konjugats mit kultivierten Zellen, verwendeten das Konjugat jedoch nicht als ein Immunogen. In der Tat ist es bekannt, dass die Konjugation von Proteinen mit niedrigmolekularen Dextranen schwach oder nicht immunogen sind. T. E. Wilemann, J. Pharm. Pharmocology, 38: 264 (1985).
In dem bevorzugten Verfahren wird die Aktivierung unter Verwendung des cyanylierenden Reagens bei einem pH von 6 bis 8 in nicht-nukleophilem Puffer durchgeführt. Das Aktivierungsvertahren mit cyanylierendem Reagans kann in pH-Bereichen von 6 bis 8 in verschiedenen geeigneten Puffern, welche auf dem Gebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Beispiele für geeignete nicht-nukleophile Puffer beinhalten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, Salzlösung, HEPES, Phosphat, Wasser und einige organische Lösungsmittel.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird CDAP in einer Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml in trockenem Acetonitril gelöst. CDAP-Konzentrationen von 0,1 bis 10 mg/ml sind geeignet für die Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung. Abhängig von der Eigenschaft der verwendeten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente und dem Grad der gewünschten Aktivierung können verschiedene Konzentrationen optimal sein.
In der bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente optimalerweise zwischen 1 und 15 mg/ml. Die Aktivierungsreaktion kann mit Konzentrationen an Kohlenhydrat-enthaltender Komponente von bis zu etwa 100 mg/ml erfolgreich ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Verhältnis von CDAP zu der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente für die direkte Konjugation von Protein zwischen 1 : 100 und 1 : 500 pro 100 kDa der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Verhältnis von CDAP zu der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente für die indirekte Konjugation von Protein unter Verwendung eines Spacers zwischen 1 : 10 und 1 : 500 pro 100 kDa der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente. Abhängig von der Eigenschaft der Komponenten und den verwendeten Bedingungen können verschiedene Verhältnisse der Komponente optimal sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Kohlenhydrat-enthaltende Komponente, welche unter Verwendung eines cyanylierenden Reagens aktiviert wurde, direkt mit der sekundären Komponente konjugiert, um ein immunogenes Konstrukt zu produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Kohlenhydrat-enthaltende Komponente, welche mit einem cyanylierenden Reagens aktiviert wurde, kovalent mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens verbunden. Beispiele für geeignete bifunktionelle Reagenzien enthalten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, Ethyldiamin, 1,6-Hexandiamin, Adipindihydrazid, Cystamin und Lysin, Glutaminsäure, Thiolhydrazide, Thiolamine, Thiolhydrazide. Siehe Wong et al., "Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking", CRC Press (1991). Die zweite Komponente wird dann kovalent mit dem bifunktionellen Reagens verbunden, welches bereits kovalent mit seinem anderen Terminus mit der Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente verbunden wurde.
In einer bevorzugte Ausführungsform wird Triethylamin (TEA) verwendet, um die Cyanylierungsreaktion durch die Bildung eines intermediären Von Braun Komplexes zu erleichtern. TEA kann durch andere tertiäre Amine, welche fähig sind, einen Von Braun Komplex zu bilden, ersetzt werden. J. von Braun, Chem. Ber., 33: 1438 (1900).
Für bestimmte direkte Konjugationsreaktionen können Glycinaminoethanol oder andere Amino-enthaltende Reagenzien verwendet werden, um die Reaktion zu quenschen.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Impfstoffe, welche aus einem immunogenen Konstrukt zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zusammengesetzt sind. Solche Impfstoffe beinhalten eine effektive therapeutische Menge des immunogenen Konstruktes zusammen mit einer geeigneten Menge des Trägers, so dass sie die Form zur richtigen Verabreichung an den Patienten zur Verfügung stellen. Diese Impfstoffe können Alum oder andere Adjuvanzien umfassen.
Pharmazeutisch annehmbare Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie z. B. Wasser und Öle, einschließlich solcher aus Petroleum, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft, wie z. B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, besonders für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger werden in E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die Impfstoffe können aus den immunogenen Konstrukten gemäß der Erfindung hergestellt werden und können die Impfstoffe, welche in Tabelle 1 dargelegt sind, beinhalten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Tabelle 1

Diphtherieimpfstoff
Pertussis (Untereinheit) Impfstoff
Tetanusimpfstoff
H. influenzae Typ b (Polyribosephosphat)
S. pneumonia, alle Serotypen
E. coli, Endotoxin oder J5-Antigen (LPS, Lipid A und Gentabiose)
E. coli, 0 Polysaccharide (Serotyp spezifisch)
Klebsiella, Polysaccharide (Serotyp spezifisch)
S. aureus, Typen 5 und 8 (Serotyp spezifisch und gängige protektive Antigene)
S. epidermidis, Serotyp Polysaccharide I, II und III (und gängige protektive Antigene)
N. meningitidis, Serotyp spezifisch oder Proteinantigene
Polioimpfstoft
Mumps-, Masern-, Rötelnimpfstoft
Respiratorisches Syncytiales Virus (Respiratory Syncytial Virus)
Tollwut
Hepatitis A, B C und andere
Humaner Immundefizienzvirus I und II (GP120, GP41, GP160, p24, weitere)
Herpes simplex Typen 1 und 2
CMV
EBV
Varicella/Zoster
Malaria
Tuberkulose
Candida albicans, weitere Candida
Pneumocystis carinii
Mykoplasma
Influenzae Virus A und B
Adenovirus
Gruppe A Streptococcus
Gruppe B Streptococcus, Serotypen Ia, Ib, II und III
Pseudomonas aeruginosa (Serotyp spezifisch)
Rhinovirus
Parainfluenzae, Typen 1, 2 und 3
Coronaviren
Salmonella
Shigellen
Rotavirus
Enteroviren
Chlamydia trachomatis und pneumoniae (TWAR)
Glycoproteine
Neoformans cryptococcus

Die Impfstoffe sind geeignet für die Behandlung eines Patienten durch Verabreichung einer immunstimulatorischen Menge des Impfstoffes. Patient bezieht sich auf jedes Individuum, für welches die Behandlung vorteilhaft ist und schließt Säugetiere mit ein, ins besondere Menschen, Pferde, Kühe, Hunde und Katzen, wie auch andere Tiere, wie z. B. Hühner. Eine immunstimulatorische Menge bezieht sich auf die Menge an Impfstoff, welche fähig ist, die Immunantwort des Patienten zur Prävention, Verbesserung oder Behandlung von Krankheiten zu stimulieren. Der Impfstoff gemäß der Erfindung kann über jeden Weg verabreicht werden, wird jedoch bevorzugterweise durch intravenöse, intramuskuläre und subkutane Injektionen verabreicht.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung eines immuntherapeutischen Mittels gegen Infektionen, welche durch Bakterien, Viren, Parasiten, Pilze oder Chemikalien verursacht werden, durch die Immunisierung eines Wirtes mit dem oben beschriebenen Impfstoff, so dass der Donor Antikörper produziert, welche gegen den Impfstoff gerichtet sind. Die Antikörper könnten isoliert werden oder B-Zellen können erhalten werden, welche später mit Myelomzellen fusioniert werden können, um monoklonale Antikörper herzustellen. Das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper ist auf dem Gebiet wohl bekannt, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), welches hiermit durch Bezugnahme spezifisch aufgenommen ist, und muss hier nicht weiter beschrieben werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich immuntherapeutisches Mittel auf eine Zusammensetzung von Antikörpern, welche gegen spezifische Immunogene gerichtet sind, zur Verwendung in der passiven Behandlung von Patienten. Ein Plasmadonor ist jedes Individuum, welches mit einem Impfstoff injiziert wird zur Produktion von Antikörper gegen die Immunogene, welche in dem Impfstoff enthalten sind.
BEISPIEL 1
Derivatisierung einer Kohlenhydrat-enthaltenen Modell-Komponente mit einem Spacer
A. Materialien
CDAP, Pyridin, Hexandiamin, Natriumborat, HEPES und Triethylamin (TEA) wurden von Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) erworben. Die Kohlenhydrat-enthaltende Komponente, T2000 Dextran, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 200 kDa, wurde von Pharmacia (Piscataway, New Jersey) erhalten.
Eine Stammlösung von CDAP in trockenem Acetonitril mit 100 mg/ml wurde bei –20°C gelagert und bei der Verwendung auf Eis gehalten. T2000 Dextran® wurde hergestellt mit 10,5 mg/ml in Salzlösung + 0,02% Azid. Wässrige Triethylamin-Stammlösung wurde mit einer Konzentration von 0,2 M hergestellt und während der Verwendung auf Eis gehalten.
Hexandiamin wurde als 0,5 M in 0,1 M Natriumborat hergestellt.
Die Aminogruppen-Bestimmung wurde durchgeführt unter Verwendung von Trinitrobenzensulfonat (TNBS) und einem Extinktionskoeffizienten von 11000 m^–1 bei 366 nm. Franci et al., J. Imm. Methods., 86: 155 (1986). Kohlenhydrat wurde bestimmt durch das Verfahren von M. Monsigny et al., Anal. Chem., 175: 525 (1988) unter Verwendung von T2000 Dextran als Standard.
B. Kontrollreaktionen
Die folgenden Experimente zeigen, dass sämtliche Komponenten, welche in der Derivatisierungsreaktion gemäß der Erfindung verwendet wurden, wichtig sind und dass die Aminogruppen in den Endkonjugaten kovalent mit dem Kohlenhydrat verbunden sind und ihre Präsenz nicht auf ein Artefakt oder "Eintragen" des Reagens in das Endprodukt zurückzuführen ist. Die Reaktionen wurden auf Eis durchgeführt. Für die durchgeführten Experimente erfolgte das Weglassen oder die Substitution von Reagenzien wie in Tabelle 2 angegeben.
In dem Verfahren, welches sämtliche Reagenzien verwendet, Zeile 1 der Tabelle 2, wurde CDAP zu einer gevortexten Lösung von 300 μl Dextran (3,1 mg) dazugegeben und anschließend wieder in den Eisbehälter gegeben. Dreißig Sekunden später wurde das TEA zu der gevortexten Lösung gegeben. Zwei Minuten nachdem das CDAP dazugegeben wurde, wurden 200 μl des Diamins dazugegeben und die Lösung für eine weitere Stunde auf Eis gehalten. Die Proben wurden über Nacht dialysiert, mit einem Millex GV-Filter gefiltert und weiter auf einer 1 × 15 cm P6DG-Säule (BioRad) entsalzen.
Wie in Tabelle 2 unten gezeigt, erforderte der Einbau von Aminogruppen in Dextran die Anwesenheit von Dextran, CDAP, TEA und Hexandiamin. Die Daten in Tabelle 2 zeigen weiterhin, dass die detektierten Aminogruppen nicht auf ein Eintragen von unkonjugierten Reagenzien in die Endprodukte zurückzuführen sind. Ist kein TEA (Übertragungsmittel) präsent, gibt es nur minimale Derivatisierung.
TABELLE 2
C. Derivatisierung von T2000 Dextran^® mit Hexan 1,6-Diamin
Dieses Experiment zeigt, dass CDAP verwendet werden kann, um Kohlenhydrate zu derivatisieren, um Aminogruppen in sowohl hohen als auch niedrigen Anteilen einzuführen. Dextran T2000 wurde als Modell-Kohlenhydrat verwendet. Dextran ist ein Polymer, welches aus Glucosemonomeren zusammengesetzt ist.
Der erste Schritt in der Herstellung von vielen Konjugat-Impfstoffen ist die Addition eines Spacers (Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Herausgeber), Bd. 10, S. 48–114 (1989)). Diese Serie von Experimenten, zusammengefasst in Tabelle 3, unterstreicht die Leichtigkeit, mit welcher ein Spacer an die Polysaccharide addiert werden kann.
TABELLE 3
Das Experiment wurde bei zwei Temperaturen durchgeführt. In den Zeilen 1–7 und 11, wurden sämtlichen Reagenzien auf Eis gehalten und in den Zeilen 8–10 hatten sie Raumtemperatur. Die Verfahren und Reagenzien wurden wie in Tabelle 2 oben beschrieben verwendet, und die zugegebenen Mengen an Reagens sind in Tabelle 3 angegeben. In Zeile 11 wurde Diamin zu 0,15 M HEPES gegeben. Die Reaktion war etwas weniger effizient bei geringerem pH. In einer weiteren Ausführungsform wurde Hexandiamin in 0,1 M Borat, pH 9, hergestellt.
Effizienz ist definiert als die Anzahl von Molen Spacergruppen, welche pro Mol verwendetes CDAP eingebaut wurden, ausgedrückt als Prozentzahl. Die letzte Spalte, "% derivatisiert", gibt die Prozente der Glucose- und Monomereinheiten des Dextrans an, welche mit einem Spacer modifiziert wurden.
Die Ergebnisse sind weiter dargelegt in 4, welche die Gesamtzahl von Aminogruppen (z. B. das dazugegebene Spacer-Reagens) zeigt, welche im Vergleich zu den Molen CDAP, die pro Mol Dextraneinheit zugegeben wurden, eingebaut wurden. Wenn diese Daten in NH₂-Einbau im Vergleich zu Mole CDAP/ Mol Dextran umgewandelt werden, ist es offensichtlich, dass ein CDAP : Glucose Verhältnis von weniger als 1 ausreichend ist, um hohe Level an NH₂-Einbau zu erreichen. Folglich ist eine minimale Modifikation von Dextranpolysaccharid für einen hohen Einbau von NH₂-Gruppen nötig.
Da eine unbestimmte Menge an dem aktiven Cyanatester ohne Zusatz eines Spacers hydrolysiert wird, ist das CDAP/Glucose-Verhältnis darüber hinaus tatsächlich eine Überbewertung des Grades der Modifikation des Polymers. Folglich ist der tatsächliche Grad an Modifikation geringer als das berechnete CDAP/Glucose-Verhältnis.
Der Grad des Einbaus von Spacergruppen bei der geringsten getesteten Dosis an Reagens (Zeile 1), 3,1%, ist vergleichbar mit dem, welcher für die Synthese von Konjugat-Impfstoffen verwendet wird (Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983); Dick & Beurret, "Glyconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Herausgeber), Bd. 10, S. 48–114 (1989).
Die Tabelle und Figur zeigt die hohe Effizienz der CDAP-Reaktion für das Addieren von Spacer-Reagenzien. Weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen kann die Effizienz erhöhen. Ebenfalls gezeigt ist der sehr hohe Level an Einbau von Spacergruppen in das Polysaccharid, welcher durch Verwendung von CDAP möglich ist. Bei der höchsten Menge an dazugegebenem CDAP (Zeile 7) wurden etwa 1 von 5 der Glucoseeinheiten (20%) mit einem Spacer modifiziert. Es ist nicht möglich, diesen Grad an Einbau eines Spacers mit Cyanogenbromid zu erhalten (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25: 1855 (1971)).
Während der Reaktionen gab es keine offensichtliche Präzipitation des Dextranpolysaccharids. Dagegen kann die Aggregation und Präzipitation des Polysaccharides mit dem Cyanogenbromid-Verfahren ein Problem sein (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25: 1855 (1971)).
Diese Reaktionen wurden in kleinen Volumina (< 1 ml) durchgeführt, wodurch es möglich wurde, viele Probeexperimente günstig durchzuführen. Dies ist wichtig, wenn ein Verfahren optimiert wird, ohne wertvolle Kohlenhydrate zu verschwenden. Es ist dagegen schwierig, mit sehr geringen Mengen an Cyanogenbromid günstig zu arbeiten, aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit, ungewissen Wirkungsstärke und Toxizität.
Darüber hinaus erscheint es, wenn man die Zeilen 8–10 der Tabelle 3 mit den Zeilen 1–7 und 11 vergleicht, dass die Menge an Aminogruppen, welche in Dextran eingebaut wurden, ungefähr die gleiche war, wenn die Kopplungsreaktion bei 0°C oder bei Raumtemperatur ausgeführt wurde.
D. Darstellung der Effizienz der Konjugationsreaktion unter Verwendung von CDAP und Verifizierung der Konjugation unter Verwendung eines radioaktiv markierten Proteins
Da die Konjugationsreaktion unter Verwendung von CDAP zu einiger Absorption bei 280 nm führte, der Wellenlänge, welche normalerweise für die Abschätzung der Proteinkonzentration verwendet wird, wurde radioaktiv markiertes Protein direkt mit Dextran konjugiert. Dies erlaubte eine unabhängige Bestimmung der Proteinkonzentration aufgrund seiner spezifischen Aktivität. Die Ausbeuten und die Rückgewinnung des Proteins wurden bestimmt.
1. BSA wurde leicht mit N-Hydroxysuccinimid (³N-2,3) propionat (Amersham) radioaktiv markiert, im Wesentlichen wie durch Brunswick et al. beschrieben. Radioaktiv markiertes BSA wurde gründlich in PBS + 0,02% Azid dialysiert und einer Gelfiltrationschromatographie auf einer S100HR-Säule (Pharmacia) unterzogen, um Aggregate zu entfernen, und durch Ultrafiltration unter Verwendung eines YM30-Filters (Amicon) konzentriert. Die BSA-Konzentration betrug 21 mg/ml, bestimmt anhand seines Extinktionskoeffizienten bei 280 nm (44000 M^–1). Die spezifische Aktivität der Stammlösung, bestimmt durch Flüssigszintillationszählung, betrug 5,48 × 10^–2 cpm/mol.
2. Weitere Reagenzien waren die folgenden: T2000-Dextran (etwa 2000 kDa) (Pharmacia) wurde zu 10,5 mg/ml in Wasser gelöst. CDAP wurde als 100 mg/ml in trockenem Acetonitril hergestellt, Triethanolamin (TEA) wurde 0,2 M in Wasser hergestellt. Glycin (pH 5,0) wurde 1 M in Wasser hergestellt.
3. Protokoll: Die Reagenzien wurden auf Eis gehalten und alle Reaktionen wurden auf Eis durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde während jeder Zugabe gevortext. 25 μl CDAP wurde zu 0,5 ml Dextran (5,25 mg) gegeben und 30 Sekunden später wurden 25 μl TEA dazugegeben. Nach einer Gesamtzeit von 2,5 Minuten wurden 5,25 mg radioaktives BSA dazugegeben. 30 Minuten später wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl Glycinlösung gequenscht und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Ein Aliquot von 0,6 ml wurde anschließend unter Verwendung einer Spin-X-Membran (COSTAR) gefiltert. Ein Vergleich der Radioaktivität der Aliquots vor und nach der Filtration zeigte, dass im Grunde genommen 100% der Radioaktivität in dem Filtrat zurückgewonnen wurden.
500 μl des Filtrats wurden auf eine 1 × 57 cm S400SF-Gelfitrationssäule (Pharmacia), welche mit einer Salzlösung plus 0,02% Azid äquilibriert wurde, gegeben und bei 0,2 ml/min laufen gelassen. Fraktionen von 0,89 ml wurden gesammelt und analysiert. Dextrankonzentrationen wurden durch das Verfahren von Monsigny et al. unter Verwendung einer Absorption bei 480 nm bestimmt. Die Radioaktivität von 50 μl Aliquots, welche von jedem Reaktionsgefäß entnommen wurden, wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt und (³H)BSA-Konzentrationen wurden unter Verwendung einer spezifischen Aktivität berechnet. Die Position des unkonjugierten BSA in der Säulenelution wurde in einem unabhängigen Säulenlauf bestimmt.

4. Wie in 5 gezeigt, liegt ein großer Teil des BSA, repräsentiert durch den cpm, in einer hochmolekularen Form vor, welche an gleicher Position wie das Dextran, repräsentiert durch OD480, läuft. Es gibt einen kleinen Rest-BSA-Peak, welcher unkonjugiertes Protein repräsentiert. Tabelle 4 enthält die Daten der Aufreinigung. TABELLE 4

Gesamtes gewonnenes Protein	3,0 mg
Protein, welches auf die Säule gegeben wurde	2,9 mg
Rückgewinnung	103%
Protein in hochmolekularer Form (Gefäße 1523)	> 2,0 mg (68%)
Verhältnis BSA: DEXTRAN für 2000 kDa Dextran	26

Die Säule hat das Dextran-BSA-Konjugat nicht sauber von dem unkonjugierten Protein getrennt. Dies ist nicht ungewöhnlich, da die hochmolekularen Polymere häufig eine Schwanzbildung (tailing) in Gelfiltrationssäulen verursachen. Darüber hinaus enthielt das T2000-Dextran, da es unfraktioniert war, ein Spektrum von verschiedenen Größen. Um die Menge an konjugiertem BSA in der Region, wo freies und gebundenes BSA überlappen, zu berechnen, haben wir ein konstantes Verhältnis von gebundenem BSA zu Dextran angenommen. Die Gesamtmenge an konjugiertem BSA, berechnet durch Multiplizieren des BSA : Dextran Verhältnisses x der gesamten molaren Menge an Dextran, wurde bestimmt als 2,55 mg. Dies zeigt, dass 87% des Proteins in die konjugierte Form umgewandelt wurden.
TABELLE 5
Die Ergebnisse dieses BSA-Dextran-Experimentes sind in Tabelle 5 (Zeile 1) zusammen mit drei weiteren Versuchen, welche verschiedene Mengen an CDAP und TEA verwendeten (Zeilen 2–4), zusammengefasst. Sowohl die Menge an TEA als auch die Menge an CDAP sind entscheidend, um hohe Protein zu Polysaccharid Verhältnisse über die direkte Konjugation zu erhalten. Die optimalen Reagensmengen können leicht bestimmt werden, da das Verfahren praktische Experimentation mit geringen Mengen erlaubt.
Es sollte betont werden, dass die direkte Konjugationsreaktion nicht das unkonjugierte Protein modifiziert, anders als Carbodiimid- oder Heteroligation-Kopplungsverfahren, noch verwendet es harte Bedingungen. Folglich könnte man das unkonjugierte Protein für weitere Verwendungen gewinnen. Da viele Proteinantigene wertvoll sind, ist dies ein Hauptvorteil des Verfahrens der direkten Konjugation.
BEISPIEL 2
Herstellung von PT-Pn14-Konjugaten
Das Ziel dieser Experimente ist es (1) zu zeigen, dass die Transformation des Proteins von einer niedrigmolekularen Form zu einer hochmolekularen Form ein Resultat der direkten Konjugation des Proteins mit dem Kohlenhydrat war und (2) unter einer besonderen Reihe von Bedingungen, die Minimummenge an cyanylierendem Reagens zu bestimmen, welche für die Konjugation des Proteins notwendig ist.
Pertussistoxoid (PT) (von Mass. Public Health Biol. Labs, Boston, MA) wurde zu 0,289 mg/ml in 0,5 M NaCl, 0,02 M NaPhosphat, pH 8,8, gelöst. 0,1 ml von 0,1 M Natriumborat pH 9,1 oder 0,75 M HEPES, pH 7,5, wurde pro Milliliter PT dazugegeben. Pneumococcen-Typ 14 (Pn14) (ATTC Charge 83909) wurde zu 5 mg/ml in 0,15 M Salzlösung mit 0,02% Azid gelöst. Triethylamin (TEA) wurde zu 0,2 M in Wasser gelöst. CDAP wurde zu 100 mg/ml oder 10 mg/ml in Acetonitril (hergestellt und gelagert bei -20°C) gelöst. Glycin wurde als 1,0 M, pH 5,0, hergestellt. Aminoethanol oder andere Aminoreagenzien können Glycin/HCl ersetzen.
Experiment 1 – Konjugation von Pertussistoxoid mit Pn14
Jedes Reaktionsgefäß enthielt 250 μg Pn14 (50 μl) auf Eis. Zum Zeitpunkt Null wurden verschiedene Mengen an CDAP wie in der Tabelle angegeben dazugegeben und 30 Sekunden später wurden 25 μl TEA dazugegeben. Zwei Minuten später wurde 1 ml PT dazugegeben. Nach etwa 1 Stunde wurden 100 μl Glycinlösung dazugegeben.
Die Proben wurden über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Am folgenden Tag wurden sie mit einem Costar 0,45 Mikron Spinfilter gefiltert und auf eine HPLC TSK-Gelfitrationssäule in 0,2 M KCl laufen gelassen. % HMW gibt den Bereich des hochmolekularen OD280-Konjugat-Peaks im Vergleich mit dem OD280-Peak, welcher die unkonjugierte Komponente anzeigt, an. Er ist definiert durch (Prozentbereich Leervolumen-Peak/(%-Bereich Leervolumen-Peak + %-Bereich Peak der unkonjugierten Komponente). Die Prozentbereiche, welche von den HPLC-Läufen erhalten wurden, waren wie folgt:
TABELLE 6 Direkte Konjugation von Pertussistoxoid mit Pn14
Da die PT-Kontrolle einen % HMW von 22% hat, kann eine geringe Menge von Aggregation des PT vorhanden sein, welche durch die Reaktionsbedingungen verursacht ist. Dieser Datensatz deutet außerdem darauf hin, dass es durch Variieren des Verhältnisses von CDAP zu Protein möglich ist, das Verhältnis von Protein zu Kohlenhydrat in dem Endkonjugat zu steuern.
Experiment 2 – Konjugation eines Monosaccharides mit PT
In dieser Serie wurde das Pn14 Polysaccharid durch 150 μl einer Lösung von 10 mg/ml Glucose, welche monomer ist, ersetzt. Es wurden Bedingungen verwendet, welche ähnlich denen in Experiment 1 sind, mit der Ausnahme, dass das PT in HEPES Puffer (pH 7,5, M 0,075) anstelle von Borat hergestellt wurde. Außerdem wurden 20 μl anstelle von 25 μl TEA verwendet. Diese Bedingungen ergaben folgendes:
Die Nummern 2 und 3 zeigen, dass CDAP das Pertussistoxoid selbst nicht polymerisiert und dass daher die Umwandlung des PT in eine hochmolekulare Form zurückzuführen ist auf dessen Kopplung mit dem hochmolekularen Polysaccharid und nicht zurückzuführen ist auf die Polymerisierung des Proteins. Es war von dem HPLC-Lauf offensichtlich, dass Glucose mit PT konjugiert wurde, da ein leichter Anstieg in dem Molekulargewicht von PT zu beobachten war.
Experiment 3 – Synthese eines nützlichen Impfstoffkonstruktes mit einem Spacer: Pertussistoxoid-Pn14
Mit Hexandiamin derivatisiertes Pn14 wurde wie folgt hergestellt. 10 μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) wurden dazugegeben (193 mol CDAP pro 100 kDa Polysaccharid). Dreißig Sekunden später wurden 20 μl TEA (0,2 M) dazugegeben. Nachdem eine Gesamtzeit von 2,5 Minuten verstrichen war, wurden 300 μl 0,5 M Hexandiamin in 0,1 M Natriumborat (pH 9,1) dazugegeben. Nach einer Stunde wurde die Lösung in Wasser dialysiert, gefiltert und in Salzlösung auf einer P6DG (BioRad)-Säule entsalzt. Das Leervolumen wurde vereinigt und mit einer Centricon 30 Vorrichtung (Amicon) konzentriert. Es wurde bestimmt, dass es 33 Aminogruppen pro 100 kDa Pn14-Polysaccharid enthält.
Pertussistoxoid wurde mit dem Amino-Pn14 unter Verwendung der Heteroligationschemie (Brunswick et al.) konjugiert. 50 μl von 0,75 M HEPES-Puffer (pH 7,5) wurde zu 0,44 ml des Amino-Pn14 gegeben. Es wurde mit 10 μl von 0,1 M Iodacetylpropionat-Nhydroxy-succinimid (SIAP) iodacetyliert. Pertussistoxoid wurde mit einem 20-fachen molaren Überschuss an SATA (Calbiochem, La Jolla, CA) thioliert. Jedes wurde in Salzlö sung entsalzt, gemischt und 1/9 Volumen an Puffer, welcher 0,75 M HEPES, 10 mM EDTA und 0,5 M Hydroxylamin enthielt, wurde dazugegeben. Das Endvolumen betrug 1,1 ml. Nach einer Übernachtinkubation wurde die Lösung 0,2 mM in Mercaptoethanol für eine Stunde hergestellt und anschließend 10 mM in lodacetamid für 10 Minuten, und anschließend wurde es auf einer S400SF-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) fraktioniert (siehe 6). Der Leervolumen-Peak wurde vereinigt und durch Druckfiltration auf einer PM10-Membran (Amicon) konzentriert. Etwa 50% des Pertussistoxoids wurde in konjugierter Form wiedergewonnen. Das Endkonjugat enthielt 0,7 mol PT pro 100 kDa Pn14-Polysaccarid. Die Proteinkonzentration in dem Konjugat wurde durch das Bradfordassay (BioRad) unter Verwendung von PT als Standard bestimmt.
Die Polysaccharidkonzentrationen wurden durch das Verfahren nach Monsigny et al. unter Verwendung von Pn14 als den Standard bestimmt.
CTEA bietet den Vorteil, dass es weniger Nebenreaktionen als CDAP aufweist und zu reineren Produkten führt, wie in Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981), beschrieben. Sein Nachteil ist, dass es empfindlich gegenüber Feuchtigkeit ist, in einem geschlossenen Gefäß ausgewogen werden muss und nicht leicht als Stammlösung herzustellen ist.
Direkte Konjugation eines Proteins mit Pn14 unter Verwendung von CTEA
1 ml von Pneumococcen-Typ 14 Polysaccharid (Pn14) (5 mg/ml in Salzlösung) wird bei 0°C gehalten. CTEA (erhältlich von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) wird unter trockenem Stickstoff gelagert. 2 mg CTEA wird in einem geschlossenen Wägegefäß ausgewogen und zu dem gekühlten, kräftig gemischten Pn14 gegeben. 20 μl TEA (0,2 M in Wasser) werden unmittelbar während des Mischens dazugegeben. Sechzig Sekunden später werden 5 mg Pertussistoxoid (1,5 mg/ml) zu der gerührten Lösung gegeben. Eine halbe Stunde später wird die Reaktion mit 200 μl 1 M Glycin (pH 5,0) gequenscht. Nach einer weiteren Stunde wird die Lösung gefiltert und über eine S400SF-Gelfiltrationssäule gegeben, welche mit Salzlösung äquilibriert wurde. Der Leervolumen Peak wird gesammelt und steril filtriert. Ein 1 : 1-Konjugat wird produziert.
Addition von Spacer-Reagens zu dem Pneumococcen-Typ 14-Polysaccharid unter Verwendung von CTEA
1 ml Pn14 (5 mg/ml in Salzlösung) wird bei 0°C gehalten. CTEA (erhältlich von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) wird unter trockenem Stickstoff gelagert. 1 mg CTEA wird in einem geschlossenen Wägegefäß ausgewogen und zu dem gekühlten, kräftig gemischten Pn14 gegeben. Gebe sofort 20 μl zu TEA (0,2 M in Wasser) während des Mischens. Sechzig Sekunden später werden 300 μl 0,5 M Hexandiamin in 0,1 M Borat (pH 9) während des Mischens dazugegeben. Nach einer Stunde wird die Lösung gründlich in Salzlösung dialysiert und steril filtriert. Da ein Verhältnis von 187 Mol CTEA pro 100 kDa Pn14 verwendet wird, wird ein Konjugat mit etwa 18 Aminen pro 100 kDa Pn14 produziert.
BEISPIEL 3
Direkte Konjugation von Pertussistoxoid mit Polysaccharid von Haemophilus Influenzae (PRP)
PRP, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 350 kDa, wurde von dem Massachusetts Public Health Biological Laboratory erhalten. Pertussistoxoid stammte von der gleichen Quelle. 15 μl CDAP (100 mg/ml) wurden zu 100 μl (2 mg) PRP auf Eis gegeben. Dreißig Sekunden später wurden 30 μl TEA dazugegeben. Dies repräsentiert 319 Mole CDAP pro 100 kDa PRP. Nach zusätzlichen zwei Minuten wurde 0,75 ml Pertussistoxoid (1,1 mg) dazugegeben. Vierzig Minuten später wurden 200 μl 1 M Glycin (pH 5,0) dazugegeben, um die Reaktion zu quenschen. Nach einer weiteren Stunde wurde die Lösung über eine S400SF-Gelfiltrationsäule, welche mit Salzlösung äquilibriert wurde, gegeben (siehe 7). Das Leervolumen wurde vereinigt und steril filtriert. Von dem Produkt wurde bestimmt, dass es 1,1 PT pro 100 kDa PRP mit einer Gesamtausbeute von 68% hat.
Der Impfstoff, welcher durch Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983) hergestellt wurde, verwendete 377 Mol Cyanogenbromid pro 100 kDa PRP und wies Verhältnisse von 1,4 bis 2,1 PT pro 100 kDa PRP mit Ausbeuten von weniger als 50 % auf. Folglich ergab das Verfahren der direkten Konjugation gemäß der Erfindung ein ähnliches Konjugat, jedoch verbunden mit weniger Arbeit, höherer Ausbeute und ohne die Verwendung eines toxischen Reagens.
Da viele publizierte Protokolle zur Herstellung von PRP-Konjugaten mit der PRP-Derivatisierung mit einem Spacer beginnen (Chu et al., Schneerson et al., J. Exp. Med., 152: 361 (1980), Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacertial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Herausgeber), Bd. 10, S. 48–114 (1989), wurde CDAP ebenfalls verwendet, um einen Spacer an PRP anzufügen.
Die verwendeten Bedingungen wurden oben beschrieben, jedoch wurde 100 μl 0,1 M Hexandiamin in 0,1 M Borat anstelle von Pertussistoxoid dazugegeben. Das Produkt wurde in Salzlösung dialysiert. Es wurde bestimmt, dass es 102 Aminogruppen pro 100 kDa PRP aufweist. Da dies ein höheres Verhältnis ist, als in den publizierten Verfahren verwendet wurde, hätte sogar weniger CDAP verwendet werden können.
BEISPIEL 4
Immunogene Konstrukte, welche nützlich sind als Impfstoffe, hergestellt unter Verwendung der CDAP-Chemie
A. Konjugation unter Verwendung von CDAP und eines bifunktionellen Reagens
Kurz dargestellt, wurde von Malaria stammendes Peptid P28, CNIGKPNVQDDQNK, von dem Gameten-spezifischen Protein pfs25 mit Tetanustoxoid (TT) konjugiert. Von P28 wurde gezeigt, dass es die Malariaübertragung blockierende Antikörper induziert. CDAP wurde anschließend verwendet, um P28-TT mit Polysaccharid an Pneumococcen-Typ 14 (Pn14) zu koppeln.
FDA-zugelassenes Tetanustoxoid wurde über Nacht in HEPES-Puffer dialysiert und mit einem 30-fachen molaren Überschuss an dem lodacetylierungsreagens (SIAP) zur Reaktion gebracht. Nach 3 Stunden wurden die Reagenzien durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Macrosep 30 (Filtron Technology) entfernt und in frischem HEPES Puffer, 0,15 M, pH 7,5, gewaschen. Mit Tritium markiertes P28 wurde als ein Feststoff zu dem derivatisierten TT während des vorsichtigen Mischens dazugegeben. Anschließend an eine Übernachreaktion bei 4°C wurde die Mischung mit 0,2 mM Mercaptoethanol behandelt, um alle übriggebliebenen aktiven Gruppen zu blockieren, und anschließend auf einer P6DG-Säule, welche mit HEPES-Puffer äquilibriert wurde, entsalzt. Von der spezifischen Aktivität des Peptids, wurde von dem Produkt bestimmt, dass es 20 Mole P28 Peptide/Mol TT enthält. Das Konjugat wurde in Salzlösung dialysiert und steril filtriert.
B. Direkte Konjugation unter Verwendung von CDAP Pn14 (erhalten von der American Tissue Type Collection) weist ein hohes Molekulargewicht auf (ca. 10⁶ Daltons). P28-TT wurde direkt mit Pn14 wie folgt konjugiert. CDAP (10 μl von einer 100 mg/ml Stammlösung in Acetonitril) wurde zu Pn14 (1,1 mg in 150 μl Salzlösung) gegeben. 30 Sekunden später wurden 20 μl Triethylamin (0,2 M) dazugegeben. Zwei Minuten später wurden 0,55 mg (in 0,8 ml Salzlösung) von P28-TT dazugegeben und eine Stunde später wurde die Reaktion für eine weitere Stunde mit 200 μl 1,0 M Glycin (pH 5) gequenscht. Das Konjugat wurde anschließend über eine S400SF-Gelfiltrationssäule, welche mit Salzlösung äquilibriert wurde, gegeben, und das Leervolumen, welches das Konjugat enthält, wurde vereinigt.
9 zeigt, dass praktisch das gesamte P28-TT in dem Leervolumen in konjugierter Form gefunden wurde.
C. Immunreaktivität von immunogenen Konstrukten
Gruppen von 5 DBA/2 Mäusen wurden i. v. mit 10 μg P28-TT oder (P28-TT)-Pn14-Konjugat in Salzlösung immunisiert, drei Wochen später geblutet, und die Sera durch ELISA auf Reaktivität gegen rekombinantes pfs25-Protein geprüft. Peptid P28 stammt von pfs25. Ein weiterer Satz von Mäusen wurde mit den gleichen Antigenen, welche mit dem Adjuvans, Alum (Imject, Pierce, Chemical Co., Rockford, IL) präzipitiert wurden, immunisiert.
Im Einklang mit den hiermit in Zusammenhang stehenden Anmeldungen zeigt Tabelle 7, dass nur das hochmolekulare Konjugat gute Anti-Proteintiter hervorgerufen hat.
TABELLE 7 Anti-pfs25 IgG1-Titer
Dieses zeigt, dass das CDAP-Verfahren verwendet werden kann, um nützliche Impfstoff-Konstrukte herzustellen. Es veranschaulicht außerdem die Leichtigkeit, mit welcher nützliche Konjugate hergestellt werden können.
BEISPIEL 5
Biologisch aktive multivalente Proteinkonstrukte, hergestellt unter Verwendung von CDAP
Um zu zeigen, dass Konjugate, welche unter Verwendung von CDAP zur direkten Kopplung von Proteinen mit Polysacchariden hergestellt wurden, ein multivalentes Produkt hervorbringen könnten (welches, wie in den hiermit in Zusammenhang stehenden Anmeldungen dargelegt, eine verstärkte Immunogenizität aufweist), und dass das Verfahren ausreichend schonend sein könnte, um die biologische Aktivität zu erhalten, wurden verschiedene Konjugate eines monoklonalen Antikörper mit Dextran hergestellt. Diese Experimente verwendeten monoklonalen Antikörper Hδ^a/I mit einem Anti-IgD-Antikörper, welcher membrangebundenes IgD auf B-Lymphozyten vernetzt und Proliferation induziert (Brunswick et al., Journal of Immunol., 140: 3364 (1988)). Wie von Brunswick et al beschrieben, induziert die Konjugation von mehreren Kopien Hδ^a/I mit einem hochmolekularen Polymer wie z. B. 2000 kDa Dextran (Hδ^a/I-AECM-Dextran) B-Zellproliferation bei 1000-fach niedrigeren Konzentrationen und induziert höhere Level an Proliferation als unkonjugierter Hδ^a/I. In Brunswick et al. war eine simple, direkte, jedoch mehrstufige, mehrtägige Prozedur ertorderlich, um das Konjugat herzustellen. Aminoethylcarboxymethyldextran (AECM-Dextran) wurde zunächst hergestellt wie in Brunswick et al. be schrieben und anschließend wurde Heteroligationschemie verwendet, um den Hδ^a/I mit dem Kohlenhydrat zu koppeln.
Hδ^a/I-Dextran wurde hergestellt sowohl durch direkte Konjugation unter Verwendung von CDAP, als auch durch indirekte Konjugation unter Verwendung eines Spacers und CDAP, wie im Folgenden dargelegt.
Direkte Konjugation: Zu einer gevortexten Lösung von 3,2 mg T2000-Dextran (Pharmacia) in 0,3 ml Salzlösung, wurden 15 μl CDAP dazugegeben (von einer 100 mg/ml Stammlösung in Acetonitril). 30 Sekunden später wurden 15 μl 0,2 M TEA während des Vortexens dazugegeben. Nach weiteren 2 Minuten wurden 6 mg Hδ^a/I (in 362 μl, 0,05 M Natriumborat und 0,075 M NaCl) während des behutsamen Vortexens dazugegeben. Nach 15 Minuten wurde die Reaktionsmischung durch die Zugabe von 100 μl 1,0 M Glycin, pH 5,0, gequenscht und über eine S400SF-Gelfiltrationsäule (1 x 59 cm), welche mit Salzlösung äquilibriert wurde, gegeben. Die Säulenelution ist 9 gezeigt. Der Peak des Leervolumens wurde vereinigt und mit einem Millex GV Filter sterilisiert. Das Produkt wird Hδ^a/I-(CDAP)-Dextran genannt. Dieses Verfahren dauerte etwa 3 Stunden.
Spacer: Dextran wurde mit CDAP wie oben aktiviert (31,5 mg T2000 Dextran in 3 ml Salzlösung und 25 μl CDAP, gefolgt von 25 μl TEA, 1 mol CDAP/0,06 mol Glucosemonomere). 3 ml 0,5 M 1,6-Diaminohexan in 0,1 M Natriumborat wurden dazugegeben. Die Lösung wurde gründlich in Wasser dialysiert und anschließend auf einer S400HR-Gelfiltrationssäule fraktioniert. Das Leervolumen wurde vereinigt und konzentriert. Von diesem Amino-Dextran wurde festgestellt, dass es 147 Aminogruppen pro 2000 kDa Dextran aufweist. Das Produkt wird NH₂-(CDAP)-Dextran genannt. Einschließlich der Dialyse, war dies ein zweitägiges Verfahren. AECM-Dextran dagegen erfordert für seine Herstellung gewöhnlich etwa eine Woche, wenn das Verfahren nach Brunswick et al. verwendet wird.
Hδ^a/I wurde mit AECM-Dextran und NH₂-(CDAP)-Dextran unter der Verwendung der Heteroligationsmethoden, wie in Brunswick et al. beschrieben, konjugiert. Die Konjugate werden Hδ^a/I-AECM-Dextran bzw. Hδ^a/I-NH₂-(CDAP)-Dextran genannt. Die Konjugation unter Verwendung von AECM-Dextran war ein zweitägiges Verfahren.
B-Zellproliferationsassays, welche 10000 Zellen/ Vertiefung verwenden, wurden wie durch Brunswick et al. beschrieben, durchgeführt. Tabelle 8 stellt die Resultate dieser Assays zur Verfügung, wobei der Einbau mit Tritium markiertem Thymidin in B-Zellen als counts per min (cpm) well (Impulse pro Minute/Vertiefung) spezifisch angegeben ist.
TABELLE 8 Hδ^A/I-Konzentration (μg/ml)
Nicht gezeigt: Wie in Brunswick et al. berichtet, verursacht Hδ^a/I allein bei diesen Konzentrationen keinen Einbau. Der maximale Einbau, bei 10–100 μg/ml Hδ^a/I, beträgt etwa 3000 cpm.
Diese Daten deuten darauf hin, dass die unter Verwendung von CDAP hergestellten Konjugate, mit und ohne Spacer, im Wesentlichen äquivalent mit Hδ^a/I-AECM-Dextran sind, was ihre Fähigkeit zur Induktion der Proliferation angeht. Da lediglich multivalente Antikörper hohe Level an Proliferation in niedrigen Dosen induzieren, müssen alle Konjugate multivalent sein. Folglich hat die direkte Konjugation mit CDAP die biologische Aktivität des Antikörpers nicht beeinträchtigt. Das Verfahren der direkten Konjugation war merklich schneller in der Herstellung, als Konjugate, welche mit einem Spacer hergestellt wurden. Weiterhin war das Addieren des Spacers und die Konjugation unter Verwendung von CDAP viel schneller als die Herstellung von AECM-Dextran.
Somit veranschaulicht dieses Experiment (1) die hohe Ausbeute an einem multivalenten Konstrukt unter Verwendung von CDAP und (2) die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Herstellung von Konjugaten, besonders von direkten Konjugaten. Die Konjugation unter Verwendung von CDAP und eines funktionellen Reagens erforderte weniger als 48 Stunden, und die direkte Konjugation erforderte weniger als drei Stunden.
Es wird für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und Variationen in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Konstruktion von immunogenen Konstrukten ausgeführt werden können, ohne von dem Umfang oder dem Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden den Fachleuten auf dem Gebiet aufgrund der Betrachtung der Beschreibung und der Praktizierung der hierin offenbarten Erfindung offensichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass die Beschreibung und Beispiele lediglich als exemplarisch betrachtet werden, wobei der wahre Umfang und Geist der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, welcher ein immunogenes Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, umfassend die Erzeugung des immunogenen Konstrukts durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Aktivierung von wenigstens einer ersten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einem organischen cyanylierenden Reagens, wobei das genannte organische cyanylierende Reagens ausgewählt ist aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) und N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA); und (b) kovalentes Verbinden der genannten aktivierten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einer zweiten Komponente.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, welcher ein immunogenes Konstrukt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, umfassend die Erzeugung des immunogenen Konstrukts durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Aktivierung von wenigstens einer ersten Kohlenhydrat-enthaltenden Komponente mit einem organischen cyanylierenden Reagenz, wobei das genannte organische cyanylierende Reagens ausgewählt ist aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium-tetrafluoroborat (CDAP) und N-Cyanotriethylammoniumtetrafluoroborat (CTEA); (b) kovalentes Verbinden der genannten ersten Komponente mit einem bifunktionellen Spacer-Reagens; und (c) kovalentes Verbinden einer zweiten Komponente mit dem bifunktionellen Spacer-Reagens aus Schritt (b).
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das immunogene Konstrukt ein Konstrukt mit einem dualen Träger ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das genannte bifunktionelle Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, 1,6-Hexandiamin, Adipinsäure-dihydrazid, Cystamin, Glycin und Lysin.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Polysaccharid von Pneumokokken, Polysaccharid von Haemophilus influenzae, einem viralen Polysaccharid und einem bakteriellen Polysaccharid.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die zweite Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus BSA, Pertussis Toxoid (PT), Tetanus Toxoid (TT), dem von Malaria stammenden Peptid P28 (P28), einem Antikörper, einem Toxoid und einem Toxin.