TWI718144B - Ｂ型鏈球菌多醣－蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於包含來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(通常稱為B型鏈球菌(GBS))之莢膜多醣(CP)和載體蛋白之免疫原性多醣-蛋白質軛合物，其中，CP係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及IX，以及其中，CP之唾液酸量高於約60%。本發明亦關於製造該軛合物以及包含該軛合物之免疫原性組成物的方法。本發明亦關於包含多醣-蛋白質軛合物之免疫原性組成物，其中，該軛合物包含來自GBS血清型IV及至少一種另外之血清型的CP。本發明進一步關於使用本文揭露之組成物來誘發個體對GBS之免疫反應及/或減少或預防個體之侵襲性GBS疾病的方法。所產生之抗體可藉由被動免疫療法而用於治療或預防GBS感染。

Description

B型鏈球菌多醣-蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途
本發明關於包含來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(通常稱為B型鏈球菌(GBS))之莢膜多醣(CP)和載體蛋白之免疫原性多醣-蛋白質軛合物，其中，CP係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX，以及其中，CP之唾液酸(sialic acid)量高於約60%。本發明亦關於製造該軛合物的方法以及包含該軛合物之免疫原性組成物。本發明亦關於包含多醣-蛋白質軛合物之免疫原性組成物，其中，該軛合物包含來自GBS血清型IV及至少一種另外之血清型的CP。本發明進一步關於使用本文揭露之組成物來誘發個體對GBS之免疫反應及/或減少或預防個體之侵襲性(invasive)GBS疾病的方法。所產生之抗體可藉由被動免疫療法(passive immunotherapy)而用於治療或預防GBS感染。
無乳鏈球菌為革蘭氏陽性多醣包封之有機體(Gram positive polysaccharide encapsulated organism)，亦稱為B型鏈球菌(GBS)。它們為人類胃腸道和生殖道常見的共生體(commensal)且亦為嬰兒和老年人之嚴重疾病的原因(Baker,C.J.,Vaccine,31(Suppl.4)：D3-D6(2013))。嬰兒之GBS感染的主要風險因素為母體定殖(maternal colonization)(Dillon,H.C.,et al.,J.Pediatr.,110(1)：31-36(1987))。多達四分之一之女性的直腸陰道中帶有GBS，此GBS可在分娩之前或分娩期間感染羊水或嬰兒而引起敗血症、肺炎、及腦膜炎(Baker 2013；Heath,P.T.,et al.,BMJ Clin.EVid.(Online),pii：0323(2014))。從GBS腦膜炎存活下來之嬰兒中有25%患有神經損傷，其中19%經歷認知遲緩(cognitive delay)、腦性麻痺、失明和聽力喪失(Libster,R.,et al.,Pediatrics,130(1)：e8-152012(2012))。GBS亦可引起流產和早產，且與死產有關(McDonald,H.M.,et al.,Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology,8(5-6)：220-227(2000)；Randis,T.M.,et al.,The Journal of Infectious Diseases,210(2)：265-273(2014)：Kessous,R.,et al.,J.Matern.Fetal Neonatal Med.,25(10)：1983-1986(2012))。極低出生體重嬰兒的感染風險更高出許多，感染率高達3%且死亡率高達30%(即使立即以抗生素治療)(Heath 2014)。
美國在1990年代後期引進之GBS篩選及於生產時投 予預防性抗生素(intrapartum antibiotic prophylaxis)(IAP)證明可降低出生第一週內發生新生兒疾病(早發性疾病(early onset disease)[EOD])的比率，但對之後在出生的首3個月內出現之遲發性疾病(late onset disease)(LOD)的比率則沒有可測量之影響。目前美國之EOD和LOD狀況之比率分別為每1000個出生兒0.25和0.27(疾病管制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)，活菌核心(ABC)監督報告(Active Bacterial Core Surveillance Report)(2013)，其可在http：//www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/gbs13.pdf取得)。在引入用於預防侵襲性肺炎球菌疾病(包括菌血症和腦膜炎)之肺炎球菌軛合物疫苗(pneumococcal conjugate vaccine)後，儘管IAP可用於預防GBS疾病，GBS已成為美國新生兒敗血症(EOD)和腦膜炎(<2mo)最常見的單一原因(Verani,J.R.,et al.,MMWR,59(RR10)：1-32(2010)；Thigpen,M.C.,et al.,New England Journal of Medicine,364(21)：2016-2025(2011))。不像在美國，引入用於侵襲性GBS疾病之防治準則及IAP並未降低荷蘭或英國之EOD發生率(Bekker,V.,et al.,The Lancet Infectious Diseases,14(11)：1083-1089(2014)；Lamagni,T.L.,et al.,Clin.Infect.Dis.,57(5)：682-688(2013))。此缺乏效果的情況可能是由於缺乏全面篩檢(universal screening)且IAP僅限於最高風險族群(例如發燒、延遲破水(prolonged ruptured membrane))的媽媽。未使用IAP之國家中的EOD比例明 顯較高，報導之平均發生率係每1000個活產兒為0.75(95% CI 0.58-0.89)(Edmond,K.M,et al.,Lancet,379(9815)：547-556(2012))。
處於GBS疾病之風險中的另一群體為老年人。風險因素包括慢性醫學問題，例如糖尿病、癌症、心臟衰竭、神經和泌尿系統狀況。根據CDC ABC監督數據，美國2013年之侵襲性GBS之年發生率為0.28/1,000名成年人或在
Figure 105113585-A0202-12-0004-26
65歲之成人中為每年12,400個病例。此比率接近老年人之侵襲性肺炎球菌疾病的發生率(相對於>65之0.30/1,000)。預計這些比率在美國和歐洲將持續增加(CDC 2013；Lamagni 2013)。
一種預防嬰兒和老年人之GBS疾病的方法係使用多醣系疫苗。在美國，施用母體GBS預防性疫苗具有預防嬰兒之GBS疾病的潛力，無論是否使用IAP。雖然多醣本身可為免疫原性(immunogenic)，多醣與蛋白質載體之軛合(conjugation)已被用來改善免疫原性(immunogenicity)，尤其是用於嬰兒和老年人。多醣-蛋白質軛合物疫苗係使用與蛋白質載體連接之多醣(通常來自細菌之表層)製造。多醣與蛋白質載體之化學鍵結可誘發對其表面顯示出該包含在疫苗中之多醣的細菌之免疫反應，從而預防疾病。因此，使用來自病原菌之多醣類的疫苗接種(vaccination)係加強宿主免疫的可能策略。
覆蓋細菌之多醣的變化很大，即使是在單一菌種中。例如，由於細菌多醣莢膜(bacterial polysaccharide capsule)之變異，GBS中有十種不同的血清型(serotype)。因此，希望多醣系疫苗係由一組多醣所組成，以確保對不同流行株(circulating strain)之覆蓋廣度。
載體蛋白(carrier protein)可為來自目標病原體的相關蛋白抗原(protein antigen)，加強對該病原體之特異性免疫反應，或者可為亦作為佐劑或一般免疫反應刺激劑(general immune response stimulant)之一般免疫原性蛋白(generally immunogenic protein)。
GBS血清型Ia、Ib、II、III、及V之個別單價多醣-蛋白質軛合物已在非懷孕成人的第1期和第2期臨床試驗中進行評估(Brigtsen,A.K.,et al.,Journal of Infectious Diseases,185(9)：1277-1284(2002)；Baker,C.J.,et al.,J.Infect.Dis.,188(1)：66-73(2003)；Baker,C.J.,et al.,J.Infect.Dis.,189(6)：1103-1112(2004)；Baker,C.J.,et al.,Vaccine,25(1)：55-63(2007))。二價II-TT和III-TT醣軛合物疫苗(glycoconjugate vaccine)以及包括Ia-CRM197、Ib-CRM197和III-CRM197醣軛合物之三價疫苗亦己有研究(Baker JID 2003；Clicaltrials.gov NCT01193920,NCT01412801,and NCT01446289)。然而，尚無GBS疫苗被核准。
再者，雖然該三價疫苗覆蓋>90%的引起南非新生兒疾病之侵襲性菌株(Madzivhandila,M.,et al.,PloS One,6(3)：e17861(2011))，根據最近對2004至2013從替加環素評估和監控試驗(Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial)(T.E.S.T.,http：//www.testsurveillance.com/)收集之全球901個收集樣本的新生兒分離株(neonatal isolate)之監控，這些相同血清型僅分別代表北美和歐洲地區62%及66%之侵襲性分離株。
從T.E.S.T.樣本取得之菌株的分析顯示出所收集之菌株中95%屬於五種有記錄的主要血清型之一(Ia、Ib、II、III、及V)，而另外3%為血清型IV。一系列出版物亦已確認過去十年美洲和歐洲出現血清型IV(Diedrick,M.J.,et al.,J.Clin.Microbiol.,48(9)：3100-3104(2010)；Teatero(2014)；Meehan,M.et al.,European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases,33(7)：1155-1162(2014)；Florindo,C.,et al.,Euro Surveillance：Bulletin European sur les Maladies Transmissibles(European Communicable Disease Bulletin),19(23)(2014)；Palmiero,J.K.,et al.,Journal of Clinical Microbiology,48(12)：4397-4403(2010))。調查成人直腸/陰道帶菌者(其為將GBS傳給嬰兒的危險因素)之研究亦發現97%之分離株屬於這六種血清型之一，而血清型IV代表~4%之頻率。這項研究係設計用來監測美國健康成人之β-溶血性鏈球菌(beta-hemolytic streptococci)(其包括GBS)、難養芽胞梭菌(Clostridium difficile)和金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)帶菌者(carriage)(參見Matson,M.A.,et al,ICAAC,Abstract I-306(Washington,DC,Sep.5-9,2014))。
類似地，T.E.S.T.樣本之分析顯示出來自
Figure 105113585-A0202-12-0006-27
65歲之年 長美國成人的血液分離株中有98%屬於相同六種主要血清群(serogroup)。老年人分離株與其他群體之間最明顯的差別為血清群分佈(serogroup distribution)。在來自老年患者之分離株方面，血清型V菌株構成最大群組(34%相對於新生兒帶菌株之18%、或成人帶菌株之18%)。
其他研究已發現血清型盛行率(serotype prevalence)存在有地區變異(geographic variance)。例如，血清型VI和VIII分離株已證實為日本健康孕婦之主要定殖者(colonizer)(Lachenauer,C.S.,et al.,JID 179(4)：1030-1033(1999))。
因此，需要多醣-蛋白質軛合物疫苗或單株抗體以賦予被動免疫力作為用來預防或治療全世界廣大人群中之GBS疾病(包括那些由新出現之血清型IV所引起者)的手段。
本發明關於新穎之免疫原性GBS多醣-蛋白質軛合物、製造該軛合物之方法及包含該軛合物之免疫原性組成物，且包括2015年5月4日申請之美國臨時申請案第62/156,500號、2015年5月4日申請之美國臨時申請案第62/237,813號、和2015年10月6日申請之美國臨時申請案第62/237,820號中所揭露之發明，其全部內容以引用方式併入本文。下列各項描述本發明之某些態樣和實施態樣。
於一態樣中，本發明關於免疫原性多醣-蛋白質軛合物，其包含來自B型鏈球菌(GBS)之莢膜多醣和載體蛋白，其中，該莢膜多醣之唾液酸量高於約60%、高於約95%、或約100%。於另一實施態樣中，該莢膜多醣可被去唾液酸化(desialylate)至高達約40%(唾液酸化程度(sialylation level)高於約60%)。於另一實施態樣中，該莢膜多醣係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及IX。
於另外之態樣中，免疫原性多醣-蛋白質軛合物(immunogenic polysaccharide-protein conjugate)包含莢膜多醣(capsular polysaccharide)，該莢膜多醣於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸(sialic acid)，諸如每mM多醣中具有至少約0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、或0.95mM之唾液酸。
於本發明之另一態樣中，免疫原性軛合物(immunogenic conjugate)包含其分子量為約5kDa至約1,000kDa、約25kDa至約750kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約200kDa、或約100kDa至約400kDa之莢膜多醣。
於另外之實施態樣中，本發明之免疫原性軛合物的分子量為約300kDa至約20,000kDa，諸如約1,000kDa至約15,000kDa、或約1,000kDa至約10,000kDa。
於一實施態樣中，免疫原性軛合物包含莢膜多醣，該莢膜多醣為約0%至約40% O-乙醯化(O-acetylation)，諸 如少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%、或少於約1% O-乙醯化。
於一實施態樣中，免疫原性軛合物包含莢膜多醣，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中具有至少約0.1、0.2、0.3、0.35、或約0.4mM O-醋酸酯(O-acetate)。於另一實施態樣中，免疫原性軛合物包含莢膜多醣，該莢膜多醣於每mM醣重複單元(saccharide repeating unit)中具有少於約0.01、0.02、0.03、0.04、或0.05mM O-醋酸酯。
於一實施態樣中，免疫原性軛合物包含CRM197或破傷風類毒素(tetanus toxoid)作為載體蛋白(carrier protein)。於一特定之實施態樣中，該載體蛋白為CRM197。
本發明之另外的態樣係關於分離莢膜多醣之方法，其包括使有機試劑與包含莢膜多醣製造細菌(capsular polysaccharide producing bacterium)之細胞培養液(cell broth)反應。於一實施態樣中，該方法進一步包括離心步驟。於另一實施態樣中，該方法進一步包括過濾步驟。於一特定之實施態樣中，該莢膜多醣製造細菌係選自由下列所組成之群組：無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、傷寒沙門桿菌(Salmonella typhi)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、 屎腸球菌(Enterococcus faecium)、及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。於一實施態樣中，羥胺係選自由表2中所列之胺所組成的群組。於另外之實施態樣中，羥胺係選自由下列所組成之群組：二苄基羥胺(dibenzyl hydroxylamine)；二乙基羥胺(diethyl hydroxylamine)；羥胺(hydroxylamine)；乙二胺(ethylenediamine)；三伸乙四胺(triethylenetetramine)；1,1,4,7,10,10六甲基三伸乙四胺(1,1,4,7,10,10 hexamethyl triethylene tetramine)；及2,6,10,三甲基2,6,10三氮雜十一烷(2,6,10,Trimethyl 2,6,10 triazaundecane)。再於另一實施態樣中，羥胺之濃度為約5mM至約200mM。於另一實施態樣中，反應之pH為約5.5至約9.5。於另外之實施態樣中，反應係在約20℃至約85℃之溫度進行。於另一實施態樣中，反應時間為約10小時至約90小時。
於一態樣中，本發明關於包括多醣-蛋白質軛合物之免疫原性組成物，其中，該軛合物包含來自B型鏈球菌(GBS)血清型IV及至少一種選自由下列所組成之群組的另外之血清型的莢膜多醣：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於另一實施態樣中，該軛合物包含GBS血清型IV及至少二種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於另一實施態樣中，該軛合物包含GBS血清型IV及至少三種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於另一 實施態樣中，該軛合物包含GBS血清型IV及至少四種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於一特定之實施態樣中，該軛合物包含來自血清型Ia、Ib、II、III、及IV之莢膜多醣。於另一實施態樣中，該組成物包括GBS血清型V。於一特定之實施態樣中，該軛合物包含來自血清型Ia、Ib、II、III、和V之莢膜多醣。再於另一實施態樣中，該免疫原性組成物包括六種多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自B型鏈球菌血清型Ia、Ib、II、III、IV、及V之莢膜多醣。本發明之一態樣係關於不具有免疫干擾(immune interference)之免疫原性組成物。
於一實施態樣中，免疫原性組成物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑、穩定劑、佐劑、冷凍保護劑(cryoprotectant)、鹽、二價陽離子、非離子性洗滌劑(non-ionic detergent)、自由基氧化抑制劑(inhibitor of free radical oxidation)、載體、或彼等之混合物。於另外之實施態樣中，包括緩衝劑。該緩衝劑可為HEPES、PIPES、MES、Tris(胺基丁三醇(trimethamine))、磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸、或琥珀酸鹽。於一較佳之實施態樣中，該緩衝劑為組胺酸。
於另一實施態樣中，免疫原性組成物進一步包括界面活性劑。該界面活性劑可為聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester)、聚山梨醇酯-80(polysorbate-80)、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、聚 山梨醇酯-20、或聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)。於一較佳之實施態樣中，該界面活性劑為聚山梨醇酯-80。
於另一實施態樣中，免疫原性組成物進一步包括賦形劑。該賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、棉子糖(raffinose)、水蘇糖(stachyose)、松三糖(melezitose)、聚葡萄糖(dextran)、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、巴糖醇(palatinit)、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯(glycerol monostearate)、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。於一較佳之實施態樣中，該賦形劑為氯化鈉。
再於另一實施態樣中，免疫原性組成物進一步包括佐劑。於一該等實施態樣中，該佐劑為鋁系佐劑(aluminum-based adjuvant)或QS-21。於一較佳之實施態樣中，該佐劑係選自由下列所組成之群組：磷酸鋁、羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyl phosphate)、及氫氧化鋁。於更佳之實施態樣中，該佐劑為磷酸鋁。
於本發明之一態樣中，該免疫原性組成物包括緩衝劑、界面活性劑、賦形劑、及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。於另一態樣中，免疫原性組成物包括組胺酸、聚山梨醇酯-80、氯化鈉、及視需要之磷酸鋁，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至 約7.0。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括約10mM至約25mM之組胺酸、約0.01%至約0.03%(v/w)之聚山梨醇酯-80、約10mM至約250mM之氯化鈉(NaCl)、及視需要之約0.25mg/ml至約0.75mg/ml之為磷酸鋁的鋁。於本發明之另一態樣中，免疫原性組成物包括約5mcg/ml至約50mcg/ml之劑量。
於本發明之另一態樣中，免疫原性組成物，視需要地在至少一種賦形劑的存在下，經冷凍乾燥(lyophilize)。於一實施態樣中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇、巴糖醇、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。於一較佳之實施態樣中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：蔗糖、甘露糖醇(mannitol)、及甘胺酸。於一特定之實施態樣中，該至少一種賦形劑為蔗糖。於一態樣中，該冷凍乾燥之組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之至少一種賦形劑，較佳為多於約5.5%(w/v)。於另一實施態樣中，該冷凍乾燥之組成物包括另外之賦形劑。於一該等實施態樣中，該另外之賦形劑為甘露糖醇或甘胺酸。於一較佳之實施態樣中，該冷凍乾燥之組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之另外之賦形劑。再於另一實施態樣中，該冷凍乾燥之組成物係以水、注射用水(WFI)、佐 劑懸浮液(adjuvant suspension)、或鹽水(saline)配置(reconstitute)。於一特定之實施態樣中，稀釋劑(diluent)為本文所描述之任何佐劑的懸浮液，諸如鋁系佐劑懸浮液，較佳為磷酸鋁懸浮液。
本發明之另一態樣係關於誘發對GBS之免疫反應的方法，其包括投予個體有效量之如本文所描述的免疫原性組成物。於一實施態樣中，本發明關於預防或減輕(reducing)個體之與GBS相關之疾病或狀況的方法，其包括投予個體有效量之如本文所描述的免疫原性組成物。於一特定之實施態樣中，該個體為計劃懷孕之女性或懷孕之女性。於一該等實施態樣中，懷孕之女性係在其懷孕後半期(second half of pregnancy)，諸如至少在妊娠(gestation)20週或至少在妊娠27週。於一較佳之實施態樣中，懷孕之女性係在妊娠27週至36週。於另一實施態樣中，該個體為較年長之成人，諸如50歲或更年長之成人、65歲或更年長之成人、及85歲或更年長之成人。於另一實施態樣中，該個體係免疫功能低下(immunocompromised)。於一態樣中，個體可具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況(medical condition)：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病、或肝臟疾病。於一較佳之實施態樣中，B型鏈球菌為無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)。
本發明之另外的態樣係關於結合本發明之免疫原性組成物中之莢膜多醣的抗體。於一些實施態樣中，該抗體係 在免疫原性組成物投予至個體時產生。於另一態樣中係關於包括本發明之抗體的組成物。
本發明之另一態樣係關於賦予個體被動免疫力(passive immunity)之方法，其包括下列步驟：(a)使用本文所描述之免疫原性組成物產生抗體製劑(antibody preparation)；及(b)投予個體該抗體製劑以賦予被動免疫力。
本發明之一態樣係關於製造本發明之免疫原性多醣-蛋白質軛合物的方法，其包括下列步驟：(a)使GBS莢膜多醣與氧化劑反應以產生經活化之多醣(activated polysaccharide)；以及(b)使經活化之多醣與載體蛋白(carrier protein)反應以產生多醣-蛋白質軛合物(polysaccharide-protein conjugate)，其中，步驟(b)係在極性非質子性溶劑(polar aprotic solvent)中進行。該溶劑可為二甲亞碸(dimethylsulfoxide)(DMSO)、環丁碸(sulfolane)、二甲基甲醯胺(dimethylformamide)(DMF)、及六甲基磷醯三胺(hexamethylphosporamide)(HMPA)。於一較佳之實施態樣中，該溶劑為二甲亞碸(DMSO)。
於一實施態樣中，多醣係與0.01至10.0莫耳當量之氧化劑反應。於一特定實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽(periodate)。於一該等實施態樣中，過碘酸鹽為過碘酸鈉。
於另一實施態樣中，氧化反應為1小時至50小時。於另一實施態樣中，氧化反應之溫度係保持在約2℃至約 25℃。再於另一實施態樣中，氧化反應係在選自由下列所組成之群組的緩衝劑中進行：磷酸鈉、磷酸鉀、2-(N-
Figure 105113585-A0202-12-0016-28
啉基)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)(MES)及Bis-Tris。於一該等實施態樣中，緩衝劑之濃度係約1mM至約500mM。於一特定之實施態樣中，氧化反應係在pH為約4.0至約8.0進行。
於本發明之另一態樣中，氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)(TEMPO)。於一該等實施態樣中，N-氯琥珀醯亞胺(N-chlorosuccinimide)(NCS)為共同氧化劑(cooxidant)。
於一實施態樣中，本發明之製造免疫原性多醣-蛋白質軛合物之步驟(a)進一步包含藉由加入淬滅劑(quenching agent)來淬滅(quenching)氧化反應。
於另一實施態樣中，多醣之濃度為約0.1mg/mL至約10.0mg/mL。
於另外之實施態樣中，經活化之多醣的氧化程度(degree of oxidation)(DO)為5至25。
於本發明之另一態樣中，該方法進一步包括冷凍乾燥(lyophilizing)該經活化之多醣(activated polysaccharide)的步驟。於一實施態樣中，該經活化之多醣係在選自由下列所組成之群組的醣(saccharide)之存在下被冷凍乾燥：蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇和巴糖醇。
於本發明之另一態樣中，本發明之製造免疫原性多醣 -蛋白質軛合物的步驟(b)包含：(1)混合該經活化之多醣與載體蛋白，以及(2)使經混合的經活化之多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物。於一實施態樣中，步驟(2)中之經活化之多醣的濃度為約0.1mg/mL至約10.0mg/mL。於另外之實施態樣中，經活化之多醣對載體蛋白之初始比率(重量/重量)為約5：1至0.1：1。於另一實施態樣中，還原劑係選自由下列所組成之群組：氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)(NaBH3CN)、三乙醯氧基硼氫化鈉(sodium triacetoxyborohydride)、在布忍斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)存在下的硼氫化鈉和硼氫化鋅、胺硼烷(amine borane)諸如吡啶硼烷(pyridine borane)、2-甲吡啶硼烷(2-picoline borane)、2,6-二硼烷-甲醇(2,6-diborane-methanol)、二甲胺-硼烷(dimethylamine-borane)、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3(benzylamine-BH3)或5-乙基-2-甲吡啶硼烷(5-ethyl-2-methylpyridine borane)(PEMB)。於一較佳之實施態樣中，還原劑為(NaBH3CN)。再於另一實施態樣中，還原劑之量為約0.1至約10.0莫耳當量。於另一實施態樣中，步驟(2)之還原反應的持續時間為1小時至60小時。於另一實施態樣中，還原反應之溫度係保持在10℃至40℃。
於本發明之另外的態樣中，製造免疫原性多醣-蛋白質軛合物之方法進一步包括藉由加人硼氫化物(borohydride)來將未反應之醛封端(capping)的步驟(步驟 (c))。於一實施態樣中，硼氫化物之量為約0.1至約10.0莫耳當量。於另一實施態樣中，硼氫化物係選自由下列所組成之群組：硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、四丁基硼氫化銨(tetrabutylammonium borohydride)、硼氫化鈣、及硼氫化鎂。於一較佳之實施態樣中，硼氫化物為硼氫化鈉(NaBH4)。於另一實施態樣中，封端(capping)步驟之持續時間為0.1小時至10小時。再於另一實施態樣中，封端步驟之溫度係保持在約15℃至約45℃。
於本發明之另一態樣中，該方法進一步包括純化(purifying)該多醣-蛋白質軛合物之步驟。於一實施態樣中，多醣-蛋白質軛合物包含與多醣之總量相較下為少於約40%之游離多醣(free polysaccharide)。於另一實施態樣中，軛合物中之多醣對載體蛋白之比率(重量/重量)為約0.5至約3.0。於另一實施態樣中，軛合物之軛合程度(degree of conjugation)為2至15。
再於本發明之另一態樣中係關於製造本發明之免疫原性多醣-蛋白質軛合物的方法，其包括下列步驟：(a)使經分離之GBS莢膜多醣與氧化劑反應；(b)藉由加入淬滅劑來淬滅步驟(a)之氧化反應以產生經活化之GBS莢膜多醣；(c)混合該經活化之GBS莢膜多醣與載體蛋白，(d)使經混合的經活化之GBS莢膜多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物，以及(e)藉由加入硼氫化鈉(NaBH4)來將未反應之醛(unreacted aldehyde) 封端(capping)，其中，步驟(c)、(d)和(e)係在DMSO中進行。
第1圖 比較來自以GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197單價疫苗(monovalent vaccine)免疫化(immunize)之小鼠的血清和經分離之IgG(isolated IgG)的調理素活性(opsonic activity)。
第2圖 GBS Ia-CRM197在50℃加速儲存(accelerated storage)(4週)後之穩定性(stability)(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第3圖 GBS Ib-CRM197在50℃加速儲存(4週)後之穩定性(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第4圖 GBS II-CRM197在50℃加速儲存(4週)後之穩定性(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第5圖 GBS III-CRM197在50℃加速儲存(4週)後之穩定性(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第6圖 GBS IV-CRM197在50℃加速儲存(4週)後之穩定性(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第7圖 GBS V-CRM197在50℃加速儲存(4週)後之穩定性(如分子量的%變化所示，使用SEC MALLS)。
第8圖 GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS III-CRM197、及GBS IV-CRM197在37℃儲存後之穩定性(如藉 由游離唾液酸(free sialic acid)所示)。
第9圖 使用琥珀酸鹽(succinate)作為緩衝劑之六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)之pH的穩定性。
第10圖 使用組胺酸(histidine)作為緩衝劑之六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)之pH的穩定性。
第11圖 六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中的組胺酸緩衝劑濃度對GBS軛合物與鋁結合之影響(劑量為10mcg/ml)。
第12圖 六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中的組胺酸緩衝劑濃度對GBS軛合物與鋁結合之影響(劑量為40mcg/ml)。
第13圖 六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之聚山梨醇酯-80濃度對在攪拌壓力(agitation stress)下之總抗原性(total antigenicity)的損失%(percent loss)之影響。
第14圖 六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV- CRM197、及GBS V-CRM197)中之鋁濃度對GBS軛合物與鋁結合之影響。
第15圖 10mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之5.5%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復(antigenicity recovery)的影響。
第16圖 10mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之7.0%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第17圖 10mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之8.5%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第18圖 50mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之5.5%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第19圖 50mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之7.0%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第20圖 50mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗 (GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之8.5%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第21圖 40mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之7.0%(w/v)蔗糖對各血清型之抗原性回復的影響。
第22圖 40mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之2.0%(w/v)蔗糖和4.0%(w/v)甘露糖醇(mannitol)對各血清型之抗原性回復的影響。
第23圖 40mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之3.0%(w/v)蔗糖和3.0%(w/v)甘露糖醇對各血清型之抗原性回復的影響。
第24圖 40mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之2.0%(w/v)蔗糖和4.0%(w/v)甘胺酸對各血清型之抗原性回復的影響。
第25圖 40mcg/ml劑量之冷凍乾燥的六價GBS疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)中之3.0%(w/v)蔗糖和3.0%(w/v)甘胺酸對各血清型之抗原性回復的影響。
應理解的是，本發明並不限於所描述之特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件可有變化。亦需理解的是，本文所使用之術語僅係為了描述特定之實施態樣，並不意圖成為限制。
雖然可使用任何類似或等同於本文所描述者之方法和材料來實行或測試本發明，現在描述較佳之方法和材料。本文提及之所有出版物的全部內容以引用方式併入本文。
本文所使用之用語具有本領域之技術熟習人士所瞭解和知道的含義，然而，為了方便和完整性，特定用語及其含義闡述於下文和說明書全文中。
除非上下文另有明確說明，本說明書及所附之申請專利範圍中所使用之單數形式“一(a、an)”及“該(the)”包括複數指稱。因此，例如，對“該方法”之指稱包括一或多個本文所描述之類型的方法及/或步驟、及/或本領域之技術熟習人士在閱讀本揭露內容等等時將能清楚明白者。
用語“約”或“大約”意指在一數值之統計學上有意義的範圍內。該等範圍可在給定數值或範圍之一數量級內，通常在20%之內，更常為在10%以內，甚至更常為在5%以內。用語“約”或“大約”所包含之可允許的變化係取決於所 研究之特定系統，且可被本領域之一般技術人士輕易地理解。每當本案中記載一範圍時，該範圍內的每個整數亦被考量為是本發明之一實施態樣。
需注意的是，本揭露內容中，用語諸如“包括(comprises、comprised、comprising)”、“含有(contains、containing)”等等可具有美國專利法中賦予它們的意義；例如，其可意指“包含(includes、included、including)”等等。該等用語係指含括特定之成分或成分組，但不排除任何其他成分。用語諸如“基本上由....組成(consisting essentially of及consists essentially of)”具有美國專利法中賦予它們的含義，例如其允許含括不會減損本發明之新穎性或基本特徵的另外之成分或步驟，即，其排除會減損本發明之新穎性或基本特徵的另外之未記載的成分或步驟，且其排除先前技術(諸如本文中所列舉或藉由引用併入本文中之文獻)之成分或步驟，尤其是此文獻之目標為定義可專利性(例如相較於先前技術(例如相較於本文中所列舉或以引用方式併入本文中之文獻)為新穎的、非顯而易知的、具進步性)的實施態樣。且，用語“由......組成(consists of及consisting of)”具有美國專利法中賦予它們的意義；亦即，這些用語是封閉式的。因此，這些用語係指含括特定之成分或成分組，且排除所有其他成分。
用語“抗原(antigen)”一般係指生物分子，通常為含有至少一個同源抗體(cognate antibody)可選擇性地與其結合之抗原決定部位(epitope)的蛋白質、肽(peptide)、多醣、 脂質或軛合物；或於某些情況中，“抗原”係指可刺激動物產生抗體或T細胞反應、或此二者的免疫原性物質，包括被注射入或吸收入動物中的組成物。免疫反應可對整個分子產生、或對該分子的一或多個不同部分(例如抗原決定部位或半抗原(hapten))產生。該用語可以用於指個別分子、或抗原分子(antigenic molecule)之同質(homogeneous)或異質(heterogeneous)群體(population)。抗原可被抗體、T細胞受體、或其他特異性體液(humoral)及/或細胞(cellular)免疫(immunity)的元件(element)識別(recognize)。用語“抗原”包括所有相關之抗原決定部位(antigenic epitope)。指定抗原之抗原決定部位可使用本領域所熟知之任何數量之抗原決定部位定位技術(epitope mapping technique)鑑別(參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,NJ)。例如，線性抗原決定部位(linear epitope)可藉由例如下述方法測定：在固體支撐物上同時合成大量的肽(該等肽對應於該蛋白質分子的部分)，以及在該等肽仍連接支撐物時使該等肽與抗體反應。該等技術為本領域所已知，且描述於，例如美國專利案第4,708,871號；Geysen,H.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：3998-4002(1984)；Geysen,H.M.,et al.,Molec.Immunol.,23(7)：709-715(1986)中，其全部內容以引用方式併入本文。類似地，構型抗原決定部位(conformational epitope)可藉由測定胺基酸之空間構型 (spatial conformation)鑑定，諸如藉由例如x-射線晶體學(x-ray crystallography)及2-維核磁共振(2-dimensional nuclear magnetic resonance)(參見，例如Epitope Mapping Protocols，同上)。此外，在本發明之目的方面，“抗原”亦可用於指包括對天然序列所進行之修飾(諸如刪除(deletion)、插入(addition)及取代(substitution)(性質上通常為保留性(conservative)，但其可為非保留性(non-conservative)))的蛋白質，只要該蛋白質保持誘發免疫反應的能力。這些修飾可為蓄意造成的，如透過定點突變(site-directed mutagenesis)、或透過特定之合成程序、或透過遺傳工程方法(genetic engineering approach)，或可為偶然的，諸如透過製造該抗原之宿主的突變。此外，抗原可自微生物(例如細菌)衍生、取得、或分離，或可為整個有機體(whole organism)。類似地，表現抗原之寡核苷酸(oligonucleotide)或多核苷酸(polynucleotide)(諸如在核酸免疫(nucleic acid immunization)應用中)亦包括在該定義中。亦包括合成之抗原，例如多抗原決定部位(polyepitope)、側翼抗原決定部位(flanking epitope)、及其他重組或合成衍生的抗原(Bergmann,C.,et al.,Eur.J.Immunol.,23(11)：2777-2781(1993)；Bergmann,C.C.,et al.,J.Immunol.,157(8)：3242-3249(1996)；Suhrbier,A.,Immunol.and Cell Biol.,75(4)：402-408(1997))。
用語“疫苗(vaccine)”或“疫苗組成物”(其可互換使用)係指包括至少一種可誘發動物之免疫反應的免疫原性組成 物的醫藥組成物。
莢膜多醣(Capsular Polysaccharide)
如本文所使用之術語“醣(saccharide)”係指單糖部分(single sugar moiety)或單醣單元(monosaccharide unit)、以及二或多個單糖部分或單醣單元共價連接以形成雙醣、寡醣、及多醣的組合。術語“醣”可與術語“碳水化合物(carbohydrate)”互換使用。多醣可為直鏈型或支鏈型。
如本文所使用之“單醣”係指寡醣中之單糖殘基。如本文所使用之術語“雙醣”係指由二個藉由糖苷鍵連接在一起的單醣單元或部分所組成的多醣。
於一實施態樣中，多醣為寡醣(OS)。如本文所用之“寡醣”係指含有二或多個單醣單元或部分之化合物。在寡醣之背景下，個別單體單元或部分係單醣其為(或可為)透過羥基結合另一單醣單元或部分。寡醣可從受保護之單一殘基糖藉由化學合成來製備或藉由生物製造之多醣(biologically produced polysaccharide)的化學降解(chemical degradation)來製備。或者，寡醣可藉由體外酵素法(in vitro enzymatic method)製造。
於一較佳之實施態樣中，多醣為多醣(PS)，此係指具有至少5個單醣單元或部分之直鏈型或支鏈型聚合物。為了清楚起見，較大量之重複單元(其中n大於約5，諸如大於約10)在本文中將被稱為多醣。
於一實施態樣中，多醣為細胞表面多醣(cell surface polysaccharide)。細胞表面多醣係指其至少有部分係位於最外面之細菌細胞膜或細菌細胞表面(包括肽聚醣層、細胞壁及莢膜)的多醣。通常，細胞表面多醣與活體內誘發免疫反應相關。細胞表面多醣可為“細胞壁多醣”或“莢膜多醣”。細胞壁多醣通常在細菌表面形成不連續層。
於一實施態樣中，多醣為莢膜多醣。莢膜多醣係指包括一或多個藉由糖苷鍵聯連接之單醣重複單元的醣聚合物(glycopolymer)。莢膜多醣通常在細菌細胞周圍形成莢膜狀層。“莢膜多醣(capsular polysaccharide或capsule polysaccharide)”係指在大多數鏈球菌分離株之細胞壁外部的多醣莢膜。例如，所有GBS莢膜多醣具有支鏈型重複結構，帶有細菌毒力(bacterial virulence)所必要之終端α2-3連接的唾液酸。來自體外培養之T.E.S.T.的侵襲性新生兒分離株中有>94%被檢測到莢膜相關之唾液酸(藉由HPLC分析量化)。
本案發明人已發現GBS莢膜多醣之唾液酸量為產生免疫反應之重要特徵。先前技術僅提供關於血清型V之唾液酸量的衝突資訊，發現去唾液酸化(desialylated)之血清型V為較佳者(國際專利申請案公開第WO 2012/035519號)且可使用唾液酸含量>50%之血清型V(國際專利申請案公開第WO 2014/053612號)。然而，這些參考文獻中無一描述唾液酸量對至少大部分GBS多醣之免疫原性的重要性。本案發明人意外發現GBS莢膜多醣在軛合前需要約60%或更多之唾液酸以提供與具有天然唾液酸量(即， 100%或多於約95%)之那些多醣相當的免疫反應。即使是唾液酸量58%(此在先前揭露之血清型V的範圍內)仍然負面地影響免疫原性。
因此，於本發明之一實施態樣中，莢膜多醣包括其天然唾液酸量(諸如約100%或多於約95%)。於另一實施態樣中，莢膜多醣可經去唾液酸化(desialylated)高達約40%(唾液酸化程度(sialylation level)高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、及高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
應注意的是，100%之唾液酸量相當於每mM之多醣中有約1.0mM之唾液酸。因此，莢膜多醣於每mM之多醣中可具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM之多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM之多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM之多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM之多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM之多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM之多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM之多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM之多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
某些莢膜多醣(CP)血清型之終端唾液酸殘基(terminal sialic residue)為部分O-乙醯化(O-acetylated)(OAc)(Lewis,A.L.,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,101(30)：11123-8(2004))。血清型Ib、III、IV、V、VI及IX為部分O-乙醯化(partially O-acetylated)(高達~40%)，而血清型Ia、II及VII僅有很少或沒有O-乙醯化(O-acetylation)(少於約5%)(Lewis 2004)。於本發明之一實施態樣中，莢膜多醣包括其天然O-乙醯化程度(natural O-acetylation level)(約0%至約40%)。於另一實施態樣中，莢膜多醣可為脫-O-乙醯化(de-O-acetylated)(少於約5%)。多醣或寡醣之O-乙醯化的程度可藉由本領域已知之任何方法測定，例如藉由質子NMR(Lemercinier,X.,et al.,Carbohydrate Research,296：83-96(1996)；Jones,C.,et al.,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,30：1233-1247(2002)；國際專利申請案公開第WO 2005/033148和WO 00/56357號)。另一種常用之方法為由Hestrin,S.,J.Biol.Chem.,180：249-261(1949)所描述者。
亦應注意的是，100% O-醋酸酯(O-acetate)相當於每mM之醣重複單元中有約1.0mM O-醋酸酯。因此，部分O-乙醯化(partially O-acetylated)之多醣於每mM醣重複單元中包括至少約0.1、0.2、0.3、0.35、或約0.4mM之O-醋酸酯。脫-O-乙醯化(de-O-acetylated)之多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.01、0.02、0.03、0.04、或0.05 mM O-醋酸酯。
能夠引起侵襲性疾病之鏈球菌微生物通常亦能製造包覆該細菌並增強其對被宿主先天免疫系統(innate immune system)清除(clearance)的抗性之CP。CP係用來掩護細菌細胞在保護性莢膜(protective capsule)中，該保護性莢膜使細菌可抵抗吞噬作用(phagocytosis)及細胞內滅殺作用(intracellular killing)。缺乏莢膜之細菌更易受吞噬。莢膜多醣常為許多細菌病原體(包括流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)及金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus))之重要毒力因子(virulence factor)。
莢膜多醣可用於將特定菌種血清分型。分型通常係藉由與針對該莢膜多醣之特定結構或獨特之抗原決定部位特徵(epitope characteristic)產生的特異性抗血清(antiserum)或單株抗體(monoclonal antibody)反應來完成。GBS血清型有十種：Ia、Ib、及II至IX(Ferrieri,P.,et al.,Emerg.Infect.Dis.[Internet],19(4)(2013)，其可在http：//wwwnc.cdc.gov/eid/article/19/4/12-1572_article取得)。
於本發明之一實施態樣中，多醣係從無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)分離出。多醣可從無乳鏈球菌(S.agalactiae)之任何包覆株(encapsulated strain)分離出，諸如090、A909(ATCC寄存編號BAA-1138)、515(ATCC寄存編號BAA-1177)、B523、CJB524、MB 4052(ATCC寄 存編號31574)、H36B(ATCC寄存編號12401)、S40、S42、MB 4053(ATCC寄存編號31575)、M709、133、7357、PFEGBST0267、MB 4055(ATCC寄存編號31576)、18RS21(ATCC寄存編號BAA-1175)、S16、S20、V8(ATCC寄存編號12973)、DK21、DK23、UAB、5401、PFEGBST0708、MB 4082(ATCC寄存編號31577)、M132、110、M781(ATCC寄存編號：BAA-22)、D136C(3)(ATCC寄存編號12403)、M782、S23、120、MB 4316(M-732；ATCC寄存編號31475)、M132、K79、COH1(ATCC寄存編號BAA-1176)、PFEGBST0563、3139(ATCC寄存編號49446)、CZ-NI-016、PFEGBST0961、1169-NT1、CJB111(ATCC寄存編號BAA-23)、CJB112、2603 V/R(ATCC寄存編號BAA-611)、NCTC 10/81、CJ11、PFEGBST0837、118754、114852、114862、114866、118775、B 4589、B 4645、SS1214、CZ-PW-119、7271、CZ-PW-045、JM9130013、JM9130672、IT-NI-016、IT-PW-62和IT-PW-64。
本文所描述之多醣可藉由本領域已知之方法(包括，例如本文所描述之方法)分離。如本文所使用的“經分離之(isolated)”係指從特定來源取得及從特定來源分離。“經分離之”一詞進一步指並非在其各別天然存在形式、狀態及/或環境。例如“從鏈球菌分離之”係指從鏈球菌細胞取得及從鏈球菌細胞分離之物質。經分離之多醣(isolated polysaccharide)並非天然存在的。術語“經分離之”係指該 物質從其原始環境(例如若其為天然存在的則為天然環境、或者若其為重組實體(recombinant entity)則為從其宿主生物體，或者從一個環境移至不同的環境)移出。例如“經分離之”莢膜多醣、蛋白質、或肽基本上不含細胞物質或其他污染蛋白質(contaminating protein)(來自衍生該蛋白質之細胞或組織來源)，或當彼等係經由化學合成時，其基本上不含化學先質(chemical precursor)或其他化學物，或存在於為化學反應之一部分的混合物。本發明中，蛋白質或多醣可從細菌細胞或從細胞碎片中分離出，從而使彼等以可用於製造免疫原性組成物之形式提供。術語“經分離之(isolated)”或“分離(isolating)”可包括純化(purifying或purification)，包括本領域已知之用於純化經分離之多醣的方法及/或本文中所描述之方法。“基本上不含細胞物質(substantially free of cellular material)”一詞包括其中該多肽/蛋白質與分離出彼等或重組製造彼等之細胞的細胞組分分開之多肽/蛋白質製備物。因此，基本上不含細胞物質之莢膜多醣、蛋白質或肽包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2.5%、或1%(按乾燥重量計)的污染蛋白質或多醣或其他細胞物質的莢膜多醣、蛋白質、或肽的製備物。當該多肽/蛋白質係經重組製造時，亦較佳為基本上不含培養基(culture medium)，即，蛋白質製備物之體積包括少於約20%、10%、或5%的培養基。當多肽/蛋白質或多醣係藉由化學合成製造時，較佳地，其基本上不含化學先質或其他化學物，即，其與涉及合成蛋白 質或多醣之化學先質或其他化學物分開。因此，該等多肽/蛋白質或多醣之製備物，除了所欲之多肽/蛋白質或多醣片段外，具有少於約30%、20%、10%、5%(按乾燥重量(dry weight)計)之化學先質或化合物。
於本發明之一實施態樣中，多醣係從細菌分離出。於本發明之另一實施態樣中，多醣係藉由重組產生。於另一實施態樣中，多醣係根據習知方法合成或化學合成。再於本發明之另一實施態樣中，多醣係藉由選殖後在替代宿主中表現及表現製造多醣之生物合成途徑(biosynthetic pathway)來製造。於一實施態樣中，多醣為免疫原性。例如，本案發明者發現本文所描述之各多醣能夠誘發或引出免疫反應。術語“免疫原性(immunogenic)”係指起始、觸發、引起、增強、改善、及/或擴大哺乳動物之由體液(humoral)及/或細胞介導之免疫反應的能力。於一實施態樣中，哺乳動物為人，靈長類動物、兔、豬、小鼠等等。
莢膜多醣之分子量為用於免疫原性組成物的一個考慮因素。高分子量莢膜多醣由於存在於抗原表面(antigenic surface)之抗原決定部位的價(valence)較高而能夠誘發某些抗體免疫反應。高分子量莢膜多醣之分離及純化為用於本發明之軛合物、組成物和方法所考慮的因素。
然而，於一實施態樣中，多醣的尺寸可被改變成小於天然莢膜多醣(native capsular polysaccharide)之分子量的分子量(MW)範圍(在與載體蛋白軛合之前)。經純化之莢膜多醣的尺寸被減小以產生具有有利之過濾力特性 (filterability characteristics)及/或產率(yield)的軛合物。
於一該等實施態樣中，經純化之莢膜多醣的尺寸係藉由高壓均質化(high pressure homogenization)縮小。高壓均質化係藉由將加工流泵送通過具有足夠小之大小(dimension)的流徑來達成高剪切速率(shear rate)。剪切速率係藉由使用較大之施加均質壓力來增加，而曝露時間(exposure time)可藉由將進料流再循環通過均質器(homogenizer)來增加。
於一實施態樣中，本文所描述之多醣能夠誘發調理素活性。於另一實施態樣中，本文所描述之多醣能夠誘發調理素活性及吞噬活性(phagocytic activity)(例如調理吞噬活性(opsonophagocytic activity))。
調理素活性(opsonic activity)或調理作用(opsonization)係指調理素(opsonin)(例如抗體或補體因子(complement factor))結合抗原(例如本文所描述之經分離的多醣)之過程，此促進抗原連接吞噬細胞(phagocyte)或吞噬性細胞(phagocytic cell)(例如巨噬細胞(macrophage)、樹突細胞(dendritic cell)及多形核白血球(polymorphonuclear leukocyte)(PMNL))。某些細菌(諸如，例如由於存有莢膜而通常不會被吞噬(phagocytose)的經包覆細菌(encapsulated bacteria))在以調理素抗體(opsonic antibody)塗覆時可變成更容易被吞噬細胞(phagocyte)識別。於一實施態樣中，多醣誘發免疫反應，諸如，例如調理素之抗體。於一實施態樣中，調理素活性係針對革蘭氏 陽性球菌(Gram positive coccus)，較佳為針對鏈球菌物種，更佳為針對至少一種無乳鏈球菌之菌株。
再於另一實施態樣中，本文所描述之多醣能夠誘發殺菌免疫反應(bactericidal immune response)。於一實施態樣中，殺菌活性(bactericidal activity)係針對革蘭氏陽性球菌，較佳為針對鏈球菌物種，更佳為針對至少一種無乳鏈球菌之菌株。
用於測量調理作用、吞噬作用(phagocytosis)及/或殺菌活性的方法為本領域所已知，諸如，例如藉由測量活體內細菌荷載(bacterial load)之減少(例如藉由測量以鏈球菌物種挑戰(challenge)之哺乳動物的菌血症水平(bacteremia level))及/或藉由測量體外細菌細胞滅殺情形(例如體外調理吞噬分析(in vitro opsonophagocytic assay))來進行。於一實施態樣中，與適當之對照組相比較(諸如，例如與針對經熱滅殺之革蘭氏陽性球菌產生的抗血清(antisera)相比較)，多醣能夠誘發調理素、吞噬、及/或殺菌活性。
血清型Ia
一實施態樣包括血清型Ia GBS莢膜多醣。血清型Ia之結構可描述如下： a)
Figure 105113585-A0202-12-0037-94
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0037-95
血清型Ia莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600 kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至450約kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約200kDa。於另一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約100kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭露內容之實施態樣。
於一特定之實施態樣中，使用高壓均質化過程將天然GBS莢膜多醣血清型Ia的尺寸縮小，但保留多醣之結構特徵，諸如唾液酸。
於本發明之一實施態樣中，血清型Ia莢膜多醣包括其天然唾液酸量(natural sialic acid level)，諸如約100% 或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化(desialylate)高達約40%(唾液酸化程度(sialylation level)高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型Ia莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型Ia莢膜多醣之O-乙醯化(O-acetylate)係少於約5%。本發明之血清型Ia莢膜多醣的一些例示性菌株包括090、A909(ATCC寄存編號BAA-1138)、515(ATCC寄存編號BAA-1177)、B523、CJB524、及MB 4052(ATCC寄存編號31574)。
血清型Ib
一實施態樣包括血清型Ib GBS莢膜多醣。血清型Ib之結構可描述如下：a)
Figure 105113585-A0202-12-0040-96
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0040-97
血清型Ib莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75 kDa至約400kDa、約75kDa至約.350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型Ib莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約 40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型Ib莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型Ib莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化(O-acetylated)。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫-O-乙醯化(de-O-acetylated)(即，少於約5% O-乙醯化)。本發明之血清型Ib莢膜多醣的一些例示性菌株包括H36B(ATCC寄存編號12401)、S40、S42、MB 4053(ATCC寄存編號31575)、M709、133、7357及PFEGBST0267。
血清型II
一實施態樣包括血清型II GBS莢膜多醣。血清型II之結構可描述如下：a)
Figure 105113585-A0202-12-0043-99
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0043-98
血清型II莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300 kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型II莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸 化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型II莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型II莢膜多醣之O-乙醯化係少於約5%。本發明之血清型II莢膜多醣的一些例示性菌株包括MB 4055(ATCC寄存編號31576)、18RS21(ATCC寄存編號BAA-1175)、S16、S20、V8(ATCC寄存編號12973)、DK21、DK23、UAB、5401、及PFEGBST0708。
血清型III
一實施態樣包括血清型III GBS莢膜多醣。血清型III之結構可描述如下： a)
Figure 105113585-A0202-12-0046-100
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0046-101
血清型III莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500 kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約200kDa。於另一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約100kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於一特定之實施態樣中，使用高壓均質化過程將天然GBS莢膜多醣血清型III的尺寸縮小，但保存多醣之結構特徵，諸如唾液酸。
於本發明之一實施態樣中，血清型III莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40% (唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型III莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，該莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型III莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型III莢膜多醣的一些例示性菌株包括MB 4082(ATCC寄存編號31577)、M132、110、M781(ATCC寄存編號BAA-22)、D136C(3)(ATCC寄存編號12403)、M782、S23、120、MB 4316(M-732；ATCC寄存編號31475)、M132、K79、COH1(ATCC寄存編號BAA-1176)、及PFEGBST0563。
血清型IV
一實施態樣包括血清型IV GBS莢膜多醣。血清型IV之結構可描述如下：a)
Figure 105113585-A0202-12-0049-102
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0049-103
血清型IV莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至 約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型IV莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型IV莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型IV莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型IV莢膜多醣的一些例示性菌株包括3139(ATCC寄存編號49446)、CZ-NI-016、及PFEGBST0961。
血清型V
一實施態樣包括血清型V GBS莢膜多醣。血清型V之結構可描述如下：a)
Figure 105113585-A0202-12-0052-104
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0052-105
血清型V莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約25kDa至約750kDa、約25kDa至約500kDa、約25kDa至約450kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約350kDa、約25kDa至約300kDa、約25kDa至約250kDa、約25kDa至約200kDa、約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75 kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。於一較佳之實施態樣中，莢膜多醣在軛合之前的分子量為約25kDa至約400kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型V莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施 態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型V莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型V莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型V莢膜多醣的一些例示性菌株包括1169-NT1、CJB111(ATCC寄存編號BAA-23)、CJB112、2603 V/R(ATCC寄存編號BAA-611)、NCTC 10/81、CJ11、及PFEGBST0837。
血清型VI
GBS血清型VI莢膜多醣係由von Hunolstein,C.,et al.,Infection and Immunity,6194)：1272-1280(1993)(其全部揭露內容在此以引用方式併入本文)描述。血清型VI之結構可描述如下：a)
Figure 105113585-A0202-12-0055-106
 或b)
Figure 105113585-A0202-12-0055-107
血清型VI莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750 kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型VI莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程 度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型VI莢膜多醣於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型VI莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型VI莢膜多醣的一些例示性菌株包括118754、114852、114862、114866、118775、B 4589、B 4645、SS1214、及CZ-PW-119。
血清型VII
GBS血清型VII莢膜多醣係由Kogan,G.,et al.,Carbohydrate Research,277(1)：1-9(1995)(其全部揭露內容在此以引用方式併入本文)描述。血清型VII之重複單元如下：
Figure 105113585-A0202-12-0058-108
血清型VII莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450 kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型VII莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型VII莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型VII莢膜多醣之O-乙醯化係少於約5%。本發明之血清型VII莢膜多醣的一些例示性菌株包括7271及CZ-PW-045。
血清型VIII
GBS血清型VIII莢膜多醣係由Kogan,G.,et al.,The Journal of Biological Chemistry,271(15)：8786-8790(1996)(其全部揭露內容在此以引用方式併入本文)描述。血清型VIII之重複單元如下：
Figure 105113585-A0202-12-0060-109
血清型VIII莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450 kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型VIII莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型VIII莢膜多醣在軛合前 於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型VIII莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型VIII莢膜多醣的一些例示性菌株包括JM9130013及JM9130672。
血清型IX
GBS血清型IX莢膜多醣係由Berti,F.,et al.,The Journal of Biological Chemistry,289(34)：23437-2348(2014)(其全部揭露內容在此以引用方式併入本文)描述。血清型IX之結構可描述如下：
Figure 105113585-A0202-12-0062-110
血清型IX莢膜多醣在軛合之前的分子量為約5kDa至約1,000kDa，諸如約50kDa至約750kDa、約50kDa 至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於本發明之一實施態樣中，血清型IX莢膜多醣包括其天然唾液酸量，諸如約100%或高於約95%。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前可去唾液酸化高達約40%(唾液酸化程度高於約60%)，諸如高達約35%(唾液酸化程度高於約65%)、高達約30%(唾液酸化程度高於約70%)、高達約25%(唾液酸化程度高於約75%)、高達約20%(唾液酸化程度高於約80%)、高達約15%(唾液酸化程度高於約85%)、高達約10%(唾液酸化程度高於約90%)、或高達約5%(唾液酸化程度高於約95%)。
於另一實施態樣中，血清型IX莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中具有約1.0mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。於另一實施態樣中，莢膜多醣在軛合前於每mM多醣中可具有至少約0.6mM之唾液酸，諸如每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸、每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸、或每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
血清型IX莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。於本發明之一實施態樣中，多醣為脫O-乙醯化(即，O-乙醯化少於約5%)。本發明之血清型IX莢膜多醣的一些例示性菌株包括IT-NI-016、IT-PW-62、及IT-PW-64。
多醣-蛋白質軛合物
如本文所使用之“軛合物(conjugate)”包括莢膜多醣(通常具有所需之分子量範圍)及載體蛋白，其中，該莢膜多醣係與載體蛋白軛合。軛合物可或可不含有一些量之游離莢膜多醣。如本文所使用之“游離莢膜多醣(free capsule polysaccharide)”係指與該軛合之莢膜多醣-載體蛋白為非共價聯結(non-covalently associated)(即，非共價(non-covalently)結合至、吸附至、或截留至或截留於(entrapped in or with)莢膜多醣-載體蛋白中)的莢膜多醣。術語“游離莢膜多醣”、“游離多醣(free polysaccharide)”及“游離醣(free saccharide)”可互換使用且欲傳達相同的含義。無論該載體分子之性質，其可直接或透過連接子(linker)與莢膜多醣軛合。如本文所使用之“軛合(to conjugate、conjugated和conjugating)”係指細菌莢膜多醣與載體分子共價連接的過程。軛合(conjugation)可增強細菌莢膜多醣之免疫原性(immunogenicity)。可根據下述方法或藉由本領域已知之製程進行軛合。
如本文所使用之“軛合物免疫原性組成物”係指免疫原性組成物，其中，免疫原性物質包括與載體蛋白共價連接之抗原性多醣(antigenic polysaccharide)以製造多醣-蛋白質軛合物。於一實施態樣中，本發明之多醣-蛋白質軛合物可配製成多價免疫原性組成物(multivalent immunogenic composition)。
如本文所使用者，多醣或載體蛋白-多醣軛合物之“分 子量”一詞係指藉由粒徑排阻層析法(size exclusion chromatography)(SEC)合併多角度雷射光散射檢測器(multiangle laser light scattering detector)(MALLS)計算之分子量。
如本文所使用之“多醣-蛋白質軛合物”係指多醣分子透過一或多個共價鍵與蛋白質載體分子軛合。可能欲將多醣與來自另一已知在目標宿主中具免疫原性之物種的蛋白質軛合。因此，於一實施態樣中，載體分子為載體蛋白(carrier protein)。如本文所定義者，此外來蛋白(foreign protein)係稱為“載體蛋白”。載體蛋白係用於加強多醣之抗原性(antigenicity)和免疫原性(immunogenicity)。如本文所使用者，術語“載體效果(carrier effect)”係指弱免疫原性(weakly immunogenic)或非免疫原性(non-immunogenic)分子之抗原性和免疫原性藉由被連接至作為載體之更具免疫原性的分子(例如異源蛋白質(heterologous protein))而增強的過程。在此情況中，組合之多醣-蛋白質軛合物中的多醣變得較單獨存在時更具免疫原性。載體蛋白含有用於刺激T細胞的T細胞抗原決定部位(T cell epitope)協助產生抗體反應。
如本文所使用之“載體蛋白(carrier protein)”或“蛋白質載體(protein carrier)”係指可與所需之免疫反應所對應之抗原(諸如莢膜多醣)軛合的任何蛋白質分子。抗原(諸如多醣)與載體蛋白之軛合可使抗原具免疫原性。載體蛋白較佳為非毒性和非反應原性(non-reactogenic)且可取得足 夠之量和純度的蛋白質。載體蛋白之實例為來自破傷風(tetanus)、白喉(diphtheria)、百日咳(pertussis)、假單胞菌類(Pseudomonas species)、大腸桿菌(E.coli)、葡萄球菌類(Staphylococcus species)、及鏈球菌類(Streptococcus species)的毒素(toxin)、類毒素(toxoid)、或毒素之任何突變體交叉反應物質(mutant cross-reactive material)(CRM197)。載體蛋白應能經受標準的軛合程序。於本發明之一特定實施態樣中，使用CRM197作為載體蛋白。
交叉反應物質(cross-reacting material)或CRM對本發明之一些實施態樣特別有用。可製造基因改變蛋白質(genetically altered protein)，此基因改變蛋白質的抗原性類似於某些細菌毒素，但無毒性者。這些被稱為“交叉反應物質(cross reacting material)”或CRM。CRM197(Wyeth/Pfizer Inc.,Sanford,NC)值得注意，因為其具有從天然白喉毒素(native diphtheria toxin)發生之單一胺基酸變化，而與其在免疫上無區隔(immunologically indistinguishable)。參見Pappenheimer,A.M.,et al.,Immunochem.,9(9)：891-906(1972)、美國專利第5,614,382號，其全部揭露內容以引用方式併入本文。CRM197為白喉毒素的非毒性變體(non-toxic variant)(即，類毒素(toxoid))，該白喉毒素係從生長在酪蛋白胺基酸(casamino acid)及酵母萃取物基底培養基之白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)菌株C7(β197)培養物(culture)中分離出。CRM197係透過超濾(ultra-filtration)、 硫酸銨沉澱(ammonium sulfate precipitation)及離子交換層析法(ion-exchange chromatography)純化。製造CRM197蛋白之白喉桿菌菌株C7(C.diphtheriae strain C7)(β197)的培養物已寄存於American Type Culture Collection(Rockville,Maryland)且已被指定寄存編號ATCC 53281。其他白喉類毒素亦適合用來作為載體蛋白。CRM3201為百日咳(pertussis)毒素之基因工程操作變體(genetically manipulated variant)。參見Black,W.J.,et al.,Science,240(4852)：656-659(1988)，其全部揭露內容以引用方式併入本文。
除了白喉類毒素(diphtheria toxoid)(DT)、CRM197、及百日咳類毒素(pertussis toxoid)外，載體蛋白之其他實例包括破傷風類毒素(tetanus toxoid)(TT)、霍亂類毒素(cholera toxoid)(例如，如國際專利申請案公開號WO 2004/083251中所描述者)、大腸桿菌不耐熱類毒素(E.coli heat labile toxoid)(LT)、大腸桿菌熱穩定類毒素(E.coli heat stable toxoid)(ST)、來自肺炎鏈球菌(S.pneumonia)(野生型或具有降低之毒性的突變種)之肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、肺炎球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A)(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白A(pneumococcal adhesin protein A)(PsaA)、來自鏈球菌之C5a肽酶(C5a peptidase)、來自金黃葡萄球菌之溶血素(hemolysin)、未分型之流感嗜血桿菌(Nontypeable Haemophilus influenzae)(NTHi)蛋白、流感嗜血桿菌蛋白 D、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)外毒素(exotoxin)/類毒素、B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen)、輪狀病毒VP 7蛋白質(rotavirus VP 7 protein)、及呼吸道融合細胞病毒(respiratory syncytial virus)F和G蛋白、卵白蛋白(ovalbumin)、匙孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin)(KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin)(BSA)、純化之結核菌素蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin)(PPD)，及假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或其衍生物，包括重組製造之非毒性突變種綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白(bacterial outer membrane protein)，諸如外膜蛋白混合物c(outer membrane protein complex c)(OMPC)、孔蛋白(porin)、運鐵蛋白結合蛋白(transferrin binding protein)、或難養芽胞梭菌腸毒素(C.difficile enterotoxin)(毒素A)和細胞毒素(毒素B)。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白質衍生物(PPD)亦可用來作為載體蛋白。於一較佳之實施態樣中，載體蛋白為白喉類毒素(diphtheria toxoid)。更佳地，載體蛋白為CRM197。於本發明之另一實施態樣中，載體蛋白為破傷風類毒素(tetanus toxoid)。
為了合成多價軛合物免疫原性組成物，多醣-蛋白質軛合物可藉由將從二種不同細菌物種純化之多醣的混合物與載體蛋白軛合來製造。或者，可藉由將從相同細菌之二 或多種不同血清型純化的多醣組合並將其以混合物形式與載體蛋白軛合來製造多價軛合物免疫原性組成物。或者，可藉由將單一類型之多醣與載體蛋白在獨立反應(使用不同多醣)中反應來製造多醣-蛋白質軛合物。因此，多價免疫原性組成物可包括帶有同質(homogeneous)或異質(heterogeneous)群體(population)之連接多醣的載體蛋白。
將莢膜多醣與載體蛋白軛合後，藉由各種技術純化多醣-蛋白質軛合物(就多醣-蛋白質軛合物之量而言為富含的(enriched))。這些技術包括，例如濃縮/濾析操作(concentration/diafiltration operation)、沉澱/洗提(precipitation/elution)、管柱層析法(column chromatography)及深層過濾(depth filtration)。
如上述，本發明關於包含與載體蛋白軛合之GBS莢膜多醣的軛合物。本發明之一實施態樣提供包括與載體蛋白軛合之GBS血清型IV莢膜多醣的軛合物及至少一種另外之軛合物，該另外之軛合物包括與載體蛋白軛合之GBS血清型Ia莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型Ib莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型II莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型III莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型V莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型VI莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型VII莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型VIII莢膜多醣、與載體蛋白軛合之GBS血清型IX莢膜多醣。於本發明之一態樣中，多醣之分子量為約5kDa至1,000kDa；軛合 物之分子量為約300kDa至約20,000kDa；且軛合物包括與多醣之總量相較下為少於約40%之游離多醣(free polysaccharide)。於一實施態樣中，軛合物包括與多醣之總量相較下為少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、或少於約5%之游離多醣。
於一實施態樣中，血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、及/或IX多醣在軛合前之分子量係約5kDa至約1,000kDa，諸如約50kDa至約750kDa、約50kDa至約500kDa、約50kDa至約450kDa、約50kDa至約400kDa、約50kDa至約350kDa、約50kDa至約300kDa、約50kDa至約250kDa、約50kDa至約200kDa、約75kDa至約750kDa、約75kDa至約500kDa、約75kDa至約450kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約350kDa、約75kDa至約300kDa、約75kDa至約250kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約750kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約650kDa、約100kDa至約600kDa、約100kDa至約550kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約450kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約350kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約750kDa、約200kDa至約700kDa、約200kDa至約650kDa、約200kDa至約600kDa、約200kDa至約550kDa、約200kDa至約500kDa、約200kDa至約450kDa、約200kDa至約400kDa、約250kDa至約750 kDa、約250kDa至約700kDa、約250kDa至約650kDa、約250kDa至約600kDa、約250kDa至約550kDa、約250kDa至約500kDa、約250kDa至約450kDa、約250kDa至約400kDa、約300kDa至約750kDa、約300kDa至約700kDa、約300kDa至約650kDa、約300kDa至約600kDa、約300kDa至約550kDa、或約300kDa至約500kDa。在任何上述範圍內之任何整數均被考慮作為本揭示內容之實施態樣。
於一實施態樣中，軛合物之分子量為約300kDa至約20,000kDa，諸如約300kDa至約15,000kDa、約300kDa至約10,000kDa、約300kDa至約9,000kDa、約300kDa至約8,000kDa、約300kDa至約7,000kDa、約300kDa至約6,000kDa、約300kDa至約5,000kDa、約300kDa至約4,000kDa、約300kDa至約3,000kDa、約300kDa至約2,000kDa、約300kDa至約1,000kDa、約500kDa至約20,000kDa、約500kDa至約15,000kDa、約500kDa至約10,000kDa、約500kDa至約9,000kDa、約500kDa至約8,000kDa、約500kDa至約7,000kDa、約500kDa至約6,000kDa、約500kDa至約5,000kDa、約500kDa至約4000kDa、約500kDa至約3,000kDa、約500kDa至約2,000kDa、約500kDa至約1,000kDa、約1,000kDa至約20,000kDa、約1,000kDa至約15,000kDa、約1,000kDa至約10,000kDa、約1,000kDa至約9,000kDa、約1,000kDa至約8,000kDa、約1,000kDa 至約7,000kDa、約1,000kDa至約6,000kDa、約1,000kDa至約5,000kDa、約1,500kDa至約20,000kDa、約1,500kDa至約15,000kDa、約1,500kDa至約10,000kDa、約1,500kDa至約9,000kDa、約1,500kDa至約8,000kDa、約1,500kDa至約7,000kDa、約1,500kDa至約6,000kDa、約1500kDa至約5,000kDa、約2,000kDa至約20,000kDa、約2,000kDa至約15,000kDa、約2,000kDa至約10,000kDa、約2,000kDa至約9,000kDa、約2,000kDa至約8,000kDa、約2,000kDa至約7,000kDa、約2,000kDa至約6,000kDa、約2,500kDa至約20,000kDa、約2,500kDa至約15,000kDa、約2,500kDa至約10,000kDa、約2,500kDa至約9,000kDa、約2,500kDa至約8,000kDa、約2,500kDa至約7,000kDa、約2,500kDa至約6,000kDa、約3,000kDa至約20,000kDa、約3,000kDa至約15,000kDa、約3,000kDa至約10,000kDa、約3,000kDa至約9,000kDa、約3,000kDa至約8,000kDa、約3,000kDa至約7,000kDa、或約3,000kDa至約6,000kDa。
於一實施態樣中，GBS血清型IV莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ia莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ib莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型II莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型III莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型V莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型VI莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型VII莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型VIII莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，GBS血清型IX莢膜多醣軛合物具有任何上述範圍之分子量。
於一實施態樣中，本發明之軛合物於每mM多醣中具有至少約0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.97或0.98mM之唾液酸。於一較佳之實施態樣中，軛合物於每mM多醣中具有至少約0.9或0.95mM之唾液酸。
於一實施態樣中，GBS血清型IV莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ia莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ib莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型II莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型III莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型V莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VI莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VII莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VIII莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，GBS血清型IX莢膜多醣軛合物具有至少為任一上述數值之唾液酸含量。
於一實施態樣中，本發明之軛合物於每mM醣重複單元(saccharide repeating unit)中具有少於約0.01、0.02、0.03、0.04、或0.05mM O-醋酸酯(O-acetate)。於另一實施態樣中，軛合物於每mM醣重複單元中包括至少約0.1、0.2、0.3、0.35、或約0.4mM O-醋酸酯。
於一實施態樣中，GBS血清型IV莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ia莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型Ib莢膜多醣軛合物具 有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型II莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型III莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型V莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VI莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VII莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型VIII莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於一實施態樣中，GBS血清型IX莢膜多醣軛合物具有上述任一數值之O-醋酸酯含量。
於另一實施態樣中，免疫原性軛合物包括，與GBS莢膜多醣之總量相比較，少於約40%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、或少於約5%之游離GBS莢膜多醣。於一較佳之實施態樣中，免疫原性軛合物包括，與GBS莢膜多醣之總量相比較，少於約5%之未反應的游離醣(unreacted free saccharide)。
再於另一實施態樣中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白之比例(重量對重量)為約0.5至約3.0。於一態樣 中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白之比例為約0.5至約2.0、約0.5至約1.5、約0.5至約1.0、約1.0至約1.5、或約1.0至約2.0。於一較佳之實施態樣中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白之比例為約0.8至約1.0。
於另一實施態樣中，軛合物之軛合程度(degree of conjugation)為2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或10至12。於較佳之實施態樣中，軛合物之軛合程度為2至5。
軛合(Conjugation)
軛合可為直接的(direct)，其中，來自多醣之原子與來自蛋白質表面之原子共價鍵結。或者，軛合可透過連接子分子(linker molecule)，該連接子分子同時與多醣和蛋白質反應並連接此二者，將碳水化合物繫在蛋白質上。
當載體與一或更多抗原(諸如多醣)軛合(即，共價結合)時，軛合可藉由本領域已知之任何化學方法、製程、或基因技術進行。例如，載體多肽與一或更多選自包含碳水化合物、寡醣(oligosaccharide)、脂質、脂寡醣(lipooligosaccharide)、多醣、寡醣-蛋白質軛合物(oligosaccharide-protein conjugate)、多醣-蛋白質軛合物、肽-蛋白質軛合物、寡醣-肽軛合物、多醣-肽軛合物、蛋白質-蛋白質軛合物、脂寡醣-蛋白質軛合物、多醣-蛋白 質軛合物、或彼等之任何組合的群組之抗原，可藉由多種技術軛合，包括，但不限於：(1)藉由蛋白質官能基直接耦合(direct coupling)(例如氫硫基-氫硫基鍵聯(thiol-thiol linkage)、胺-羧基鍵聯(amine-carboxyl linkage)、胺-醛鍵聯(amine-aldehyde linkage)；酶直接耦合(enzyme direct coupling))；(2)胺之同雙官能耦合(homobifunctional coupling)(例如使用雙-醛(bis-aldehydes))；(3)氫硫基之同雙官能耦合(homobifunctional coupling of thiols)(例如使用雙-馬來亞醯胺(bis-maleimides))；(4)藉由光活化試劑(photoactivated reagent)之同雙官能耦合(homobifunctional coupling)；(5)胺與氫硫基之異雙官能耦合(heterobifunctional coupling)(例如使用馬來亞醯胺)；(6)藉由光活化試劑之異雙官能耦合(例如β-羰基重氮族(β-carbonyidiazo family))；(7)藉由溴化氰活化(cyanogen bromide activation)或羧甲基化(carboxymethylation)將胺反應性基團引入多醣或寡醣中；(8)藉由異雙官能化合物(heterobifunctional compound)(諸如馬來亞醯胺基-醯肼(maleimido-hydrazide))將氫硫基反應性基團引入多醣或寡醣中；(9)藉由將疏水性基團引入蛋白質之蛋白質-脂質軛合及(10)藉由將反應性基團納入脂質之蛋白質-脂質軛合。此外，異雙官能“非共價耦合(non-covalent coupling)”技術(諸如生物素-抗生物素蛋白交互作用(Biotin-Avidin interaction))在考慮之中。本領域熟知之其他用於使寡醣和多醣與免疫原性載體蛋白軛合的 方法亦在本發明之某些實施態樣的範圍內。
於一實施態樣中，GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物之獲得係藉由以1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓四氟硼酸鹽(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate)(CDAP)活化多醣來形成氰酸酯(cyanate ester)。經活化之多醣可與載體蛋白上之胺基直接耦合或者透過間隔子(spacer)(連接子(linker))。例如，間隔子可為胱胺(cystamine)或半胱胺(cysteamine)以產生氫硫基化多醣(thiolated polysaccharide)，氫硫基化多醣可藉由與馬來亞醯胺活化之載體蛋白(例如使用GMBS)或鹵乙醯化(haloacetylated)載體蛋白(例如使用碘乙醯胺(iodoacetimide)、SIB、SIAB、磺基-SIAB(sulfo-SIAB)、SIA、或SBAP)反應之後取得之硫醚鍵聯來與載體耦合。
於一態樣中，氰酸酯(視需要地藉由CDAP化學製造)與己烷二胺(hexane diamine)或己二酸二醯肼(adipic acid dihydrazide)(ADH)耦合，而胺基衍生醣(amino-derivatised saccharide)係使用碳二亞胺(carbodiimide)(例如EDAC或EDC)化學物，透過蛋白載體上之羧基與載體蛋白軛合。該等軛合物描述於例如國際專利申請案公開號WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094中。
其他合適之技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯(active ester)、降冰片烷(norborane)、對-硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)、S--NHS、EDC及TSTU。國際專利 申請案公開號WO 98/42721中有很多說明。軛合可能涉及羰基連接子，其可藉由使醣之游離羥基與1,1-羰基二咪唑(1,1 carbonyldiimidazole)(CDI)或1,1-羰基二-1,2,4-三唑(1,1 carboyl di 1,2,4 triazole)(CDT)反應來形成(參見Bethell,et al.,J.Biol.Chem.,254：2572-2574(1979)；Hearn,et al.,J.Chromatogr.,218：509-518(1981))，接著再與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵聯(carbamate linkage)。這可能涉及將變旋異構端(anomeric terminus)還原成一級羥基(primary hydroxyl group)，視需要的一級羥基之保護/去保護，使一級羥基與CDI/CDT反應以形成CDI/CDT胺基甲酸酯中間體，以及使CDI/CDT胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基耦合。
於較佳之實施態樣中，本發明之GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物係利用還原性胺化(reductive amination)製造。還原性胺化涉及二個步驟：(1)將多醣氧化以從個別六醣單元中之相鄰二醇(vicinal diol)產生醛官能(aldehyde functionality)及(2)將經活化之多醣及載體蛋白還原以形成軛合物。
於一實施態樣中，GBS莢膜多醣係藉由包括下列步驟之方法活化(氧化)：(a)使經分離之GBS莢膜多醣與氧化劑反應；以及(b)藉由加入淬滅劑(quenching agent)來淬滅氧化反應以產生經活化之GBS莢膜多醣。
於本發明之一態樣中，經分離之莢膜多醣的濃度為約 0.1mg/mL至約10.0mg/mL，諸如約0.5mg/mL至約5.0mg/mL、約1.0mg/mL至約3.0mg/mL、或約2.0mg/mL。
於一特定之實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽(periodate)。過碘酸鹽將相鄰羥基氧化以形成羰基或醛基並引起C-C鍵斷裂。術語“過碘酸鹽”包括過碘酸鹽和過碘酸(periodic acid)二者。該術語亦同時包括偏過碘酸鹽(metaperiodate)(IO4 -)及原過碘酸鹽(orthoperiodate)(IO6 5-)。術語“過碘酸鹽”亦包括各種過碘酸鹽，包括過碘酸鈉和過碘酸鉀。於一較佳之實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。於一較佳之實施態樣中，用於氧化GBS莢膜多醣的過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。於一較佳之實施態樣中，用於氧化血清型莢膜多醣的過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
於另一實施態樣中，多醣係與0.01至10.0、0.05至5.0、0.1至1.0、0.5至1.0、0.7至0.8、0.05至0.5、或0.1至0.3莫耳當量之氧化劑反應。於一特定之實施態樣中，多醣係與約0.05、約0.1、約0.15、約0.2、約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.65、約0.7、約0.75、約0.8、約0.85、約0.9、或約0.95莫耳當量之氧化劑反應。於另一實施態樣中，多醣係與約0.1莫耳當量之氧化劑反應。於另一實施態樣中，多醣係與約0.15莫耳當量之氧化劑反應。於另外之實施態樣中，多醣係與約0.25莫耳當量之氧化劑反應。再於另一實施態樣中，多醣係與約0.5莫耳 當量之氧化劑反應。於一替換之實施態樣中，多醣係與約0.6莫耳當量之氧化劑反應。於另一實施態樣中，多醣係與約0.7莫耳當量之氧化劑反應。
於本發明之一態樣中，氧化反應之持續時間為約1小時至約50小時、約10小時至約30小時、約15小時至約20小時、約15小時至約17小時、或約16小時。
於本發明之另一態樣中，氧化反應之溫度係保持在約2℃至約25℃、約2℃至約8℃、或約20℃至約25℃。於一較佳之實施態樣中，反應之溫度係保持在約23℃。於另一較佳之實施態樣中，反應之溫度係保持在約5℃。
於另一態樣中，氧化反應係在選自由下列所組成之群組的緩衝劑中進行：磷酸鈉、磷酸鉀、2-(N-
Figure 105113585-A0202-12-0082-29
啉基)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)(MES)、及Bis-Tris。於一較佳之實施態樣中，緩衝劑為磷酸鉀。
於另外之態樣中，緩衝劑之濃度為約1mM至約500mM、約1mM至約300mM、或約50mM至約200mM。於一較佳之實施態樣中，緩衝劑之濃度為約100mM。
於一態樣中，氧化反應係在約4.0至約8.0、約5.0至約7.0、或約5.5至約6.5的pH進行。於一較佳之實施態樣中，pH為約6.0。
於一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣係藉由使約0.5mg/L至約5.0mg/mL之經分離的莢膜多醣與約0.05至約0.3莫耳當量之過碘酸鹽在約20℃至25℃之溫度反應來取得。
於另一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣係藉由使約0.5mg/L至約5.0mg/mL之經分離的莢膜多醣與約0.05至約0.3莫耳當量之過碘酸鹽在約2℃至8℃的溫度反應來取得。
於另一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣係根據本領域之技術熟習人士已知的方法(諸如凝膠滲透層析法(gel permeation chromatography)(GPC)、透析(dialysis)、或超濾(ultrafiltration)/濾析(diafiltration))純化。例如，經活化之莢膜多醣係使用超濾裝置，藉由濃縮和濾析來純化。
於一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣的氧化程度(degree of oxidation)為5至25，例如5至15、5至10、10至25、10至20、10至15。於一較佳之實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣的氧化程度為10至20、11至19、12至18、13至17、或14至16。
於另一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣的分子量為約5kDa至約1,000kDa、諸如約50kDa至約300kDa、約75kDa至約400kDa、約75kDa至約200kDa、約100kDa至約700kDa、約100kDa至約500kDa、約100kDa至約400kDa、約100kDa至約300kDa、約200kDa至約400kDa、約300kDa至約700kDa。於一較佳之實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣的分子量為約75kDa至約400kDa。
於一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣係視需要 地在醣的存在下經冷凍乾燥。於一較佳之實施態樣中，醣係選自蔗糖、海藻糖(trehalose)、棉子糖、水蘇糖(stachyose)、松三糖(melezitose)、聚葡萄糖(dextran)、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、及巴糖醇(palatinit)。於一較佳之實施態樣中，醣為蔗糖。然後，可將冷凍乾燥的經活化之莢膜多醣與包含載體蛋白之溶液混合。
於另一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣係視需要地在醣的存在下與載體蛋白混合並冷凍乾燥。於一態樣中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇和巴糖醇。於一較佳之實施態樣中，醣為蔗糖。然後，可將經共同冷凍乾燥之多醣與載體蛋白重新懸浮於溶液中並與還原劑反應。
經活化之GBS莢膜多醣可藉由包括下列步驟之方法與載體蛋白軛合：(a)混合該經活化之GBS莢膜多醣與載體蛋白，(b)將經混合的經活化之GBS莢膜多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物。
例如，與在水溶液中之還原性胺化(reductive amination)(其中，未反應(游離)之多醣的量明顯提升)相比較，藉由在極性非質子性溶劑中進行還原性胺化使經活化之GBS莢膜多醣與載體蛋白軛合係適於維持較低量的游離多醣量。於一較佳之實施態樣中，步驟(a)和步驟(b)係在極性非質子性溶劑(polar aprotic solvent)中進行。
於一實施態樣中，步驟(a)包括將經冷凍乾燥的GBS 莢膜多醣溶於包含載體蛋白和極性非質子性溶劑的溶液中。於另一實施態樣中，步驟(a)包括將經共同冷凍乾燥的GBS莢膜多醣與載體蛋白溶於極性非質子性溶劑中。
於一實施態樣中，極性非質子性溶劑係選自由下列所組成之群組：二甲亞碸(DMSO)、環丁碸(sulfolane)、二甲基甲醯胺(DMF)、及六甲基磷醯三胺(hexamethylphosporamide)(HMPA)。於一較佳之實施態樣中，極性非質子性溶劑為DMSO。
當步驟(a)和(b)在水溶液中進行時，步驟(a)和(b)係在水性介質中之緩衝劑中進行，該緩衝劑較佳為選自PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、Bicine、或HEPB，pH為約6.0至約8.5、約7.0至約8.0、或約7.0至約7.5。於一較佳之實施態樣中，緩衝劑為PBS。於一較佳之實施態樣中，pH為約7.3。
於一實施態樣中，經活化之GBS莢膜多醣在步驟(b)中之濃度為約0.1mg/mL至約10.0mg/mL、約0.5mg/mL至約5.0mg/mL、或約0.5mg/mL至約2.0mg/mL。於一較佳之實施態樣中，步驟(b)中之經活化的血清型GBS莢膜多醣之濃度為約0.1mg/mL、約0.2mg/mL、約0.3mg/mL、約0.4mg/mL、約0.5mg/mL、約0.6mg/mL、約0.7mg/mL、約0.8mg/mL、約0.9mg/mL、約1.0mg/mL、約1.1mg/mL、約1.2mg/mL、約1.3mg/mL、約1.4mg/mL、約1.5mg/mL、約1.6mg/mL、約1.7 mg/mL、約1.8mg/mL、約1.9mg/mL、約2.0mg/mL、約2.1mg/mL、約2.2mg/mL、約2.3mg/mL、約2.4mg/mL、約2.5mg/mL、約2.6mg/mL、約2.7mg/mL、約2.8mg/mL、約2.9mg/mL、或約3.0mg/mL。
於較佳之實施態樣中，經活化之血清型GBS莢膜多醣對載體蛋白之初始比例(重量對重量)為5：1至0.1：1、2：1至0.1：1、2：1至1：1、1.5：1至1：1、0.1：1至1：1、0.3：1至1：1、0.6：1至1：1。於一較佳之實施態樣中，經活化之血清型GBS莢膜多醣對載體蛋白之初始比例為約0.4：1、0.5：1、0.6：1、0.7：1、0.8：1、0.9：1、1：1、1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1、2：1。
於一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)、三乙醯氧基硼氫化鈉(sodium triacetoxyborohydride)、在布忍斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)存在下的硼氫化鈉和硼氫化鋅、胺硼烷(amine borane)諸如吡啶硼烷(pyridine borane)、2-甲吡啶硼烷(2-picoline borane)、2,6-二硼烷-甲醇(2,6-diborane-methanol)、二甲胺-硼烷(dimethylamine-borane)、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3(benzylamine-BH3)、或5-乙基-2-甲吡啶硼烷(5-ethyl-2-methylpyridine borane)(PEMB)。於一較佳之實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
於另一實施態樣中，步驟(b)中所使用之還原劑的量為約0.1至約10.0莫耳當量、約0.5至約5.0莫耳當量、 或約1.0至約2.0莫耳當量。於一較佳之實施態樣中，步驟(b)中所使用之還原劑的量為約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或2.0莫耳當量。
於一較佳之實施態樣中，步驟(b)之持續時間為1小時至60小時、10小時至50小時、40小時至50小時、或42小時至46小時。於一較佳之實施態樣中，步驟(b)之持續時間為約44小時。
於另一實施態樣中，步驟(b)之反應溫度係保持在10℃至40℃、15℃至30℃、或20℃至26℃。於一較佳之實施態樣中，步驟(b)中之反應溫度係保持在約23℃。
於另外之實施態樣中，用於製造包括與載體蛋白共價連接之GBS莢膜多醣的免疫原性軛合物之方法進一步包括藉由添加硼氫化物來將未反應之醛封端(capping)(淬滅(quenching))的步驟(步驟(c))。
於一實施態樣中，封端試劑(capping reagent)為選自由下列所組成之群組的硼氫化物：硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、四丁基硼氫化銨(tetrabutylammonium borohydride)、硼氫化鈣及硼氫化鎂。於一較佳之實施態樣中，封端試劑為硼氫化鈉。
再於另一實施態樣中，步驟(c)中所使用之硼氫化物的量為約0.1至約10.0莫耳當量、約0.5至約5.0莫耳當量、或約1.0至約3.0莫耳當量。於一較佳之實施態樣中，步驟(c)中所使用之硼氫化物的量為約2.0莫耳當量。
於一較佳之實施態樣中，步驟(c)中所使用之硼氫化物 為NaBH4，其濃度為約2.0莫耳當量。
於一實施態樣中，步驟(c)之持續時間為0.1小時至10小時、0.5小時至5小時、2小時至4小時。於一較佳之實施態樣中，步驟(c)之持續時間為約3小時。
於另一實施態樣中，步驟(c)中之反應溫度係保持在約15℃至約45℃、約15℃至約30℃、或約20℃至約26℃。於一較佳之實施態樣中，步驟(c)之反應溫度係保持在約23℃。
GBS莢膜多醣與載體蛋白軛合並封端後，該多醣-蛋白質軛合物可藉由本領域之技術熟習人士已知的各種技術純化(就多醣-蛋白質軛合物之量而言為富含的(enriched))。這些技術包括透析(dialysis)、濃縮/濾析操作(concentration/diafiltration operation)、切向流過濾(tangential flow filtration)、沉澱/洗提(precipitation/elution)、管柱層析法(DEAE或疏水交互作用層析法(hydrophobic interaction chromatography))及深層過濾(depth filtration)。
於另一實施態樣中，免疫原性軛合物包括與GBS莢膜多醣之總量相較下為少於約40%、少於約35%、少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、或少於約5%之游離GBS莢膜多醣。於一較佳之實施態樣中，免疫原性軛合物包括與GBS莢膜多醣之總量相較下為少於約5%之未反應的游離醣(unreacted free saccharide)。
於一較佳之實施態樣中，GBS多醣-蛋白質軛合物之分子量為約300kDa至約20,000kDa，諸如約1,000kDa至約15,000kDa、或約1,000kDa至約10,000kDa。
再於另一實施態樣中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白之比例(重量/重量)為約0.5至約3.0。於一態樣中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白之比例為約0.5至約2.0、約0.5至約1.5、約0.5至約1.0、約1.0至約1.5、或約1.0至約2.0。於一較佳之實施態樣中，軛合物中之GBS莢膜多醣對載體蛋白的比例為約0.8至約1.0。
於另一實施態樣中，軛合物之軛合程度(degree of conjugation)為2至15、2至13、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、3至15、3至13、3至10、3至8、3至6、3至5、3至4、5至15、5至10、8至15、8至12、10至15、或10至12。於較佳之實施態樣中，軛合物之軛合程度為2至5。
於本發明之一態樣中，GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物係藉由上述之還原性胺化方法(reductive amination method)取得。例如，於一態樣中，本揭露內容提供GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物，其包含可藉由包括下列步驟之方法製造或取得之與載體蛋白軛合的多醣：(a)使經分離之GBS莢膜多醣與氧化劑反應；(b)藉由加入淬滅劑來淬滅氧化反應以產生經活化之GBS莢膜多醣；(c)混合該經活化之GBS莢膜多醣與載體蛋白， (d)將經混合的經活化之GBS莢膜多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物，以及，視需要地(e)藉由加入硼氫化鈉(NaBH4)來將未反應之醛封端(capping)。
於一較佳之實施態樣中，步驟(c)和(d)係在DMSO中進行。
於本發明之另一態樣中，本發明之GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物係使用如上述之還原性胺化製造，但在活化/氧化步驟中則使用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)(TEMPO)游離基和N-氯琥珀醯亞胺(N-chlorosuccinimide)(NCS)作為共同氧化劑(cooxidant)。參見國際專利申請案公開號WO 2014/097099，其全部內容以引用方式併入本文。於該等實施態樣中，來自GBS莢膜多醣之糖軛合物(glycoconjugate)係使用TEMPO游離基將醣之一級醇(primary alcohol)氧化成醛(使用NCS作為共同氧化劑)(以下稱為“TEMPO/NCS氧化”)來製造，諸如實施例7和國際專利申請案公開號WO 2014/097099中所描述者。因此，於一態樣中，GBS莢膜多醣之軛合物係藉由包括下列步驟之方法取得：a)使GBS莢膜多醣與TEMPO和NCS在溶劑中反應以製造經活化之醣(activated saccharide)；及b)使該經活化之醣與包括一或多個胺基之載體蛋白反應(以下稱為“TEMPO/NCS-還原性胺化”)。於一實施態樣中，該溶劑可 為水性溶劑或DMSO。
於一態樣中，GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物係藉由所述方法取得。例如，於一態樣中，本揭露內容提供GBS莢膜多醣-蛋白質軛合物，其包含藉由包括下列步驟之方法製造或取得之與載體蛋白軛合的多醣：a)使醣與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物(TEMPO)和N-氯琥珀醯亞胺(NCS)在溶劑中反應，以製造經活化之醣；及b)使該經活化之醣與包含一或多個胺基的載體蛋白反應。於一實施態樣中，該溶劑可為水性溶劑或DMSO。
免疫原性組成物
將個別軛合物純化後，其可合併以配製本發明之免疫原性組成物，此免疫原性組成物可用於例如疫苗中。本發明之免疫原性組成物的調配物可使用本領域認可之方法完成。
對免疫原性組成物之“免疫反應”為個體對存在於所欲組成物中之分子(例如抗原，諸如蛋白質或多醣)發展出的體液及/或細胞介導之免疫反應。就本發明之目的，“體液免疫反應(humoral immune response)”為由抗體介導之免疫反應(antibody-mediated immune response)且涉及產生對存在於本發明之免疫原性組成物中的抗原具親和力之抗體，而“細胞介導之免疫反應(cell-mediated immune response)”為由T-淋巴細胞及/或其他白血球介導之免疫反應。“細胞介導之免疫反應”係藉由呈現與主要組織相容性複合體 (major histocompatibility complex)(MHC)之第I類(Class I)或第II類(Class II)分子聯結的抗原性抗原決定部位(antigenic epitope)引起。這會活化抗原特異性CD4+ T輔助細胞或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ cytotoxic T lymphocyte cell)(CTL)。CTL對與MHC或CD1所編碼之蛋白質關聯呈現且表現在細胞表面之肽或脂質抗原具特異性。CTL協助誘發並促進細胞內破壞胞內微生物或溶解被該等微生物感染之細胞。細胞免疫之另一態樣涉及由輔助T細胞產生之抗原特異性反應。輔助T細胞作用於協助刺激非特異性作用細胞(nonspecific effector cell)對抗顯示出肽抗原(與在其表面之典型或非典型MHC分子聯結)的細胞之功能且集中其活性。“細胞介導之免疫反應”亦指產生細胞介素(cytokine)、趨化介素(chemokine)及其他由活化之T細胞及/或其他白血球細胞製造的該等分子，包括那些源自CD4+和CD8+ T細胞者。特定抗原或組成物刺激由細胞介導之免疫反應的能力可藉由多種分析測定，諸如藉由淋巴增生(lymphoproliferation)(淋巴細胞活化(lymphocyte activation))分析、CTL細胞毒性細胞分析(CTL cytotoxic cell assay)、藉由分析對致敏個體中之抗原有特異性的T淋巴細胞、或藉由測量T細胞回應抗原再刺激時所製造的細胞介素。該等分析為本領域所熟知。參見，例如，Erickson,A.L.,et al.,J.Immunol.,151(8)：4189-4199(1993)；Doe,B.,et al.,Eur.J.Immunol.24(10)：2369-2376(1994)。
用語“免疫原性(immunogenic)”係指抗原或疫苗引起免疫反應(由體液或細胞、或此二者所介導者)之能力。
本文中，“免疫原性量(immunogenic amount)”、或“免疫有效量(immunologically effective amount)”、或“劑量(dose)”各可互換使用，通常係指足以誘發免疫反應(為細胞(T細胞)、或體液(B細胞或抗體)反應、或此二者)之抗原或免疫原性組成物的量(藉由本領域之技術熟習人士已知的標準分析法所測量)。
本文所使用之“免疫干擾(immune interfence)”或“顯著之免疫干擾(significant immune interfence)”係指，相較於對以單價疫苗投予之相同抗原所產生的免疫反應，對在多價(multivalent)或多組分(multicomponent)疫苗中之個別抗原所產生的免疫反應為統計學上顯著減少。
“保護性(protective)”免疫反應係指免疫原性組成物引起用來保護個體免於感染的免疫反應(體液或細胞介導者)之能力。若與對照個體群(例如未投服該疫苗或免疫原性組成物之受感染的動物)相比較時具有統計學上顯著的改善，所提供之保護不必是完全的(absolute)，即，不需要完全防止或根除感染。保護作用可能侷限於減輕感染症狀發作的嚴重程度或速度。本領域中已知數種分析可用於測定免疫反應是否顯示為“保護性免疫反應(protective immune response)”。例如，抗體量增加可藉由結合分析(binding assay)測量，諸如下文中進一步描述之全細胞ELISA分析(whole cell ELISA assay)。其他分析包括測量 功能性抗體反應(functional antibody response)，諸如促進滅殺細菌，此可以如下述之調理吞噬分析(opsonophagocytosis assay)(OPA)進行測試。在特定情況中，“保護性免疫反應”可包括在至少50%之個體中誘發專對特定抗原之抗體量增加二倍或抗體量增加四倍。於另一情況中，“保護性免疫反應”可包括細菌數減少至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、或更多。
組成物中之特定軛合物的量通常係根據用於該軛合物之全部多醣(軛合及未軛合的)計算。例如，在100mcg/ml之GBS莢膜多醣劑量中，具有20%游離多醣的GBS莢膜多醣軛合物將具有約80mcg/ml之軛合的GBS莢膜多醣及約20mcg/ml之未軛合的GBS莢膜多醣。計算軛合物的劑量時，通常不考慮蛋白質載體對軛合物之貢獻。軛合物之量可根據鏈球菌血清型而變化。通常，各劑量將包括約0.01mg/ml至約100mcg/ml之各多醣，尤其是約1mcg/ml至約70mcg/ml，更特別的為約5mcg/ml至約50mcg/ml。免疫原性組成物中之不同多醣組分的“免疫原性量”可有不同且各可包括約0.01mcg/ml、約0.1mcg/ml、約0.25mcg/ml、約0.5mcg/ml、約1mcg/ml、約2mcg/ml、約3mcg/ml、約4mcg/ml、約5mcg/ml、約6mcg/ml、約7mcg/ml、約8mcg/ml、約9mcg/ml、約10mcg/ml、約15mcg/ml、約20mcg/ml、約25mcg/ml、約30mcg/ml、約40mcg/ml、約50mcg/ml、約60mcg/ml、 約70mcg/ml、約80mcg/ml、約90mcg/ml、或約100mcg/ml之任何特定多醣抗原。除非另有說明，多價免疫原性組成物之劑量或免疫原性量將指各多醣之劑量。例如，10mcg/ml之六價免疫原性組成物劑量將含10mcg/ml之六種多醣中的各者。
作為免疫原(immunogen)之抗原的效力(effectiveness)可藉由測量B細胞活性水平(藉由使用免疫分析(immunoassay)、免疫沉澱分析(immunoprecipitation assay)、功能性抗體分析(functional antibody assay)(諸如體外調理素分析(in vitro opsonic assay))和本領域中已知之許多其他分析來測量血清中特異於(specific)該抗原的循環抗體量)來測定。另一測量作為T細胞免疫原的抗原之效力的方法可藉由增生分析(proliferation assay)、藉由細胞溶解分析(cytolytic assay)(諸如鉻釋出分析(chromium release assay)以測量T細胞溶解其特異性標的細胞的能力)來測定。此外，本發明中，“免疫原性量”亦可藉由測量投予抗原後所誘發之抗原特異性抗體的血清水平(serum level)來界定，或藉由測量由此誘發之抗體增強如本文所描述之特定白血球的調理吞噬能力(opsonophagocytic ability)的能力來界定。免疫反應之保護水平(level of protection)可使用已注射之抗原挑戰(challenging)經免疫化的宿主(immunized host)來測量。例如，若免疫反應所需之抗原為細菌，由該抗原之“免疫原性量”所誘發之保護水平可藉由檢測以該細菌細胞挑戰動 物後的存活百分比或死亡百分比來測量。於一實施態樣中，保護量可藉由測量與細菌感染相關的至少一種症狀(例如與感染相關之發燒)來測定。在多抗原或多組分疫苗或免疫原性組成物中的各抗原之量將相關於其他各組分而變化，並可藉由本領域之技術熟習人士已知的方法測定。該等方法可包括例如用於測量免疫原性及/或活體內效力(in vivo efficacy)的程序。
用語“免疫原性組成物”係關於任何含有抗原(例如微生物或其組分)之醫藥組成物，該組成物可用於引起個體之免疫反應。本發明之免疫原性組成物可藉由透過全身性經皮或黏膜途徑投予該免疫原性組成物而用於治療易罹患GBS感染的人。這些投予可包括經由肌肉內(i.m.)、腹膜內(i.p.)、皮內(i.d.)、或皮下途徑注射；藉由貼劑或其他經皮投遞裝置施用；或藉由黏膜投予至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。於一實施態樣中，免疫原性組成物可用於製造疫苗或用於引出可用於被動保護或治療動物之多株或單株抗體。
於一態樣中，本發明關於包括有效量之至少一種如本文所描述的多醣、寡醣、多醣-蛋白質軛合物、或彼等之生物等效物的免疫原性組成物。例如，於一實施態樣中，免疫原性組成物包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該莢膜多醣係選自由下列所組成之群組：B型鏈球菌血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及IX，且其中，該莢膜多醣之唾液酸量高於約60%。於另一實例中，免疫原 性組成物包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型IV及至少一種另外的血清型之莢膜多醣，該另外的血清型係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於另一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型IV及至少二種另外的血清型之莢膜多醣，該另外的血清型係選自由下列所組成的群組：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。再於另一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型IV及至少三種另外的血清型之莢膜多醣，該另外的血清型係選自由下列所組成的群組：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於另一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物。其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型IV及至少四種另外的血清型之莢膜多醣，該另外的血清型係選自由下列所組成的群組：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於一特定之實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型Ia、Ib、II、III、及V之莢膜多醣。於另一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型Ia、Ib、II、III和IV之莢膜多醣。再於另一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，其中該軛合物包括來自B型鏈球菌血清 型IV及至少五種另外的血清型之莢膜多醣，該另外的血清型係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。於一該等實施態樣中，免疫原性組成物包含六種多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌血清型Ia、Ib、II、III、IV及V之莢膜多醣。
於一實施態樣中，本發明之免疫原性組成物包括2至10種不同血清型之無乳鏈球菌。因此，於一實施態樣中，本發明之免疫原性組成物為2、3、4、5、6、7、8、9或10價之GBS軛合物組成物。於一該等實施態樣中，免疫原性組成物為5價GBS軛合物組成物。於另一實施態樣中，免疫原性組成物為6價GBS軛合物組成物。再於另一實施態樣中，免疫原性組成物為7價GBS軛合物組成物。於另一實施態樣中，免疫原性組成物為8價GBS軛合物組成物。
儘管先前技術教示在組成物中使用少於六、少於五、或少於四之GBS抗原(參見國際專利申請案公開號WO 2006/082527和WO 2006/082530)及免疫干擾(immune interference)的經驗，尤其是關於在多價組成物中使用血清型V(參見國際專利申請案公開號WO 2012/035519)，本發明在多價組成物中使用四或更多GBS抗原時並未顯示任何顯著的免疫干擾，使用血清型V時亦無。因此，本發明關於包括多醣-蛋白質軛合物之多價免疫原性組成物，該多醣-蛋白質軛合物包含至少四種GBS莢膜多醣血 清型，諸如至少五種GBS莢膜多醣血清型、至少六種GBS莢膜多醣血清型、至少七種GBS莢膜多醣血清型、至少八種GBS莢膜多醣血清型、或至少九種GBS莢膜多醣血清型，其中，該組成物不具有顯著的免疫干擾。於一特定之實施態樣中，免疫原性組成物包括GBS莢膜多醣血清型V。
多醣-蛋白質軛合物可包括相同或不同的蛋白質載體(protein carrier)。於一實施態樣中，軛合物包括相同的蛋白質載體且醣類係與相同的蛋白質載體分子軛合(載體分子具有2或更多不同多醣與其軛合)[參見，例如國際專利申請案公開號WO 2004/083251]。於另一實施態樣中，多醣係各自獨立地與不同的蛋白質載體分子軛合(蛋白質載體的各分子僅具有一類多醣與其軛合)。於該實施態樣中，莢膜醣係個別與載體蛋白軛合。
特定之免疫原性組成物的最佳組分量可藉由標準研究確定，該標準研究涉及觀察個體的適當免疫反應。初次接種疫苗(initial vaccination)後，個體可接受一或多個適當隔開的追加免疫(booster immunization)。
除了多個莢膜多醣蛋白質軛合物外，本發明之免疫原性組成物可進一步包括一或多種防腐劑。FDA要求在多劑量(multiple-dose)(multi-dose)小瓶中的生物產品含有防腐劑，只有少數例外。本發明考慮使用該等多劑量小瓶(multi-dose vial)。含有防腐劑之疫苗產品包括含有苄索氯銨(benzethonium chloride)(anthrax)、2-苯氧基乙醇 (DTaP、HepA、Lyme、小兒麻痺(Polio)(腸胃道外的(parenteral)))及酚(Pneumo、傷寒(腸胃道外的))的疫苗。經核准用於注射藥物之防腐劑包括，例如氯丁醇、間甲酚(m cresol)、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、2-苯氧基乙醇(2-phenoxyethanol)、氯化本索寧(benzethonium chloride)、氯化卞二甲烴銨(benzalkonium chloride)、苄酸(benzoic acid)、苄醇(benzyl alcohol)、酚(phenol)、及硝酸苯汞(phenylmercuric nitrate)。
於另一態樣中，本發明關於包括至少一種本文所描述的任何多醣及醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑、穩定劑、佐劑、冷凍保護劑(cryoprotectant)、鹽、二價陽離子、非離子性洗滌劑(non-ionic detergent)、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載體、或彼等之混合物的組成物。
免疫原性組成物視需要可包括一或更多生理學上可接受之緩衝劑，該緩衝劑係選自，但不限於HEPES，PIPES，MES，Tris(胺基丁三醇(trimethamine))、磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸、及琥珀酸鹽。於一較佳之實施態樣中，緩衝劑為組胺酸。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包括緩衝劑，其濃度為約5mM至約50mM、約5mM至約40mM、約5mM至約30mM、約5mM至約20mM、約5mM至約10mM、約10mM至約50mM、約10mM至約40mM、約10mM至約35mM、約10mM至約30mM、約10mM至 約25mM、約10mM至約20mM、約10mM至約15mM、約15mM至約50mM、約15mM至約40mM、約15mM至約35mM、約15mM至約30mM、約15mM至約25mM、或約15mM至約20mM。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括緩衝劑，其濃度為約10mM至約25mM，且最佳為約20mM。
於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括濃度為約20mM之組胺酸。
於一些實施態樣中，調配物係緩衝成pH在約5.0至約7.1的範圍內，諸如約5.3至約7.1、約5.5至約7.0、約6.0至約7.0、約6.0至約6.5、約6.3至約7.0、或約6.5至約7.0。於另一實施態樣中，調配物係緩衝成pH為約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、或7.0。於一較佳之實施態樣中，調配物係緩衝成pH範圍為約6.0至約7.0，最佳為約6.5。
免疫原性組成物視需要可包括一或多種非離子性界面活性劑(non-ionic surfactant)，包括，但不限於聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester)、聚山梨醇酯-80(TWEEN 80)、聚山梨醇酯-60(TWEEN 60)、聚山梨醇酯-40(TWEEN 40)、聚山梨醇酯-20(TWEEN 20)、及聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)，包括，但不限於BRIJ 58、BRIJ 35，以及其他者諸如TRITON X-100；TRITON X-114、NP40、SPAN 85、及非離子性界面活性劑之PLURONIC系列(例如 PLURONIC 121)。於一實施態樣中，免疫原性組成物包括聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯40，較佳為聚山梨醇酯-80(PS80)。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包括界面活性劑，其濃度為約0.001%至約2%(v/w)、約0.001%至約1%、約0.001%至約0.5%、約0.001%至約0.1%、約0.001%至約0.05%、約0.001%至約0.01%、約0.001%至0.005%、約0.005%至約2%、約0.005%至約1%、約0.005%至約0.5%、約0.005%至約0.1%、約0.005%至約0.05%、約0.005%至約0.01%、約0.01%至約2%、約0.01%至約1%、約0.01%至約0.5%、約0.01%至約0.1%、約0.01%至約0.05%、約0.01%至約0.04%、約0.01%至約0.03%、約0.015%至約2%、約0.015%至約1%、約0.015%至約0.5%、約0.015%至約0.1%、約0.015%至約0.05%、約0.015%至約0.04%、約0.015%至約0.03%、約0.02%至約2%、約0.02%至約1%、約0.02%至約0.5%、約0.02%至約0.1%、約0.02%至約0.05%、約0.02%至約0.04%、約0.02%至約0.03%、約0.05%至約2%、約0.05%至約1%、約0.05%至約0.5%、約0.05%至約0.1%、約0.1%至約2%、約0.1%至約1%、約0.1%至約0.5%、或約0.1%至約0.25%。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括濃度為約0.01%至約0.03%之界面活性劑，且最佳為約0.02%。
於另一實施態樣中，免疫原性組成物包括濃度為約 0.001%至約2%(較佳為高達約0.25%)之聚山梨醇酯-80或濃度為約0.001%至1%(較佳為高達約0.5%)之聚山梨醇酯40。
於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括濃度為約0.02%之PS80。
醫藥上可接受之載體(pharmaceutically acceptable carrier)不與“載體蛋白(carrier protein)”混淆，載體蛋白係用於連接本發明之碳水化合物與蛋白質，並修飾對該碳水化合物的免疫反應。為了避免與本文所描述之載體蛋白混淆，術語醫藥上可接受之稀釋劑(pharmaceutically acceptable diluent)將優於醫藥上可接受之載體，但這些術語可偶爾會互換使用。術語“醫藥上可接受之載體”意指由聯邦、州政府之管理機構、或其他管理機構核准的載體，或美國藥典或其他公認之藥典中所列出的可用於動物(包括人類及非人類之哺乳動物)之載體。術語“載體”係指稀釋劑、佐劑、賦形劑、或載劑(使用其而投予了醫藥組成物)。合適之醫藥上可接受之稀釋劑包括任何及所有習知溶劑、分散介質(dispersion media)、填充劑、固體載體、水溶液、塗覆物(coating)、抗菌劑和抗真菌劑(antifungal agent)、等張和吸收延遲劑(isotonic and absorption delaying agent)、以及類似物。該等醫藥上可接受之稀釋劑可為無菌液體，諸如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源者。水、注射用水(WFI)、無菌等張鹽水溶液(sterile isotonic saline solution)、磷酸鹽緩衝鹽水 (phosphate buffered saline)、佐劑懸浮液、葡萄糖水溶液和甘油溶液、以及彼等之組合，可用來作為液體載體，尤其是用於注射用溶液。醫藥上可接受之稀釋劑可進一步包括少量之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其可增強儲存壽命(shelf life)或體內之效力。醫藥上可接受之稀釋劑的製備和使用為本領域已知。合適之藥藥載體的實例描述於E.W.Martin之"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。於一實施態樣中，稀釋劑為水、注射用水(WFI)、佐劑懸浮液、或鹽水(saline)。於一特定之實施態樣中，稀釋劑為任何本文所描述之佐劑的懸浮液。於一較佳之實施態樣中，稀釋劑為鋁系佐劑懸浮液(aluminum-based adjuvant suspension)，諸如磷酸鋁懸浮液。
合適之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、棉子糖、水蘇糖(stachyose)、松三糖(melezitose)、聚葡萄糖(dextran)、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、巴糖醇(palatinit)、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯(glycerol monostearate)、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉(dried skim milk)、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。於一個較佳之實施態樣中，賦形劑為NaCl。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包括賦形劑，其濃度為約10mM至約500mM、約10mM至約450mM、約10mM至約400mM、約10mM至約350mM、約10mM 至約300mM、約10mM至約250mM、約10mM至約200mM、約10mM至約150mM、約10mM至約100mM、約10mM至約50mM、約10mM至約30mM、約10mM至約20mM、20mM至約500mM、約20mM至約450mM、約20mM至約400mM、約20mM至約350mM、約20mM至約300mM、約20mM至約250mM、約20mM至約200mM、約20mM至約150mM、約20mM至約100mM、約20mM至約50mM、約20mM至約30mM、50mM至約500mM、約50mM至約450mM、約50mM至約400mM、約50mM至約350mM、約50mM至約300mM、約50mM至約250mM、約50mM至約200mM、約50mM至約150mM、約50mM至約100mM、約100mM至約500mM、約100mM至約450mM、約100mM至約400mM、約100mM至約350mM、約100mM至約300mM、約100mM至約250mM、約100mM至約200mM、約100mM至約150mM、約150mM至約500mM、約150mM至約450mM、約150mM至約400mM、約150mM至約350mM、約150mM至約300mM、約150mM至約250mM、約150mM至約200mM、約200mM至約500mM、約200mM至約450mM、約200mM至約400mM、約200mM至約350mM、約200mM至約300mM、約200mM至約250mM、約250mM至約500mM、約250mM至約450mM、約250mM至約400 mM、約250mM至約350mM、約250mM至約300mM、約300mM至約500mM、約300mM至約450mM、約300mM至約400mM、約300mM至約350mM、約350mM至約500mM、約350mM至約450mM、約350mM至約400mM、約400mM至約500mM、約400mM至約450mM、或約450mM至約500mM。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括賦形劑，其濃度為約10mM至約250mM，最佳為約150mM。
於一較佳之實施態樣中，賦形劑為濃度約150mM之NaCl。
若需要時，組成物亦可含有少量之濕潤劑、增積劑(bulking agent)、乳化劑、或pH緩衝劑。這些組成物可為溶液、懸浮液、乳劑、冷凍乾燥(lyophilized)粉末(powder)或塊(cake)等形式。調配物(formulation)應適合投予模式。除了與活性成分不相容者外，任何常規介質或試劑可考慮用於本發明之免疫原性組成物中。
於一實施態樣中，免疫原性組成物係經冷凍乾燥(視需要地在至少一種賦形劑的存在下)。於一較佳之實施態樣中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇、巴糖醇、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫 脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。於一較佳之實施態樣中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：蔗糖、甘露醇及甘胺酸。於一特定之實施態樣中，該至少一種賦形劑為蔗糖。於另一實施態樣中，冷凍乾燥之組成物包括另外之賦形劑。於一該等實施態樣中，另外之賦形劑為甘露糖醇或甘胺酸。
於另一實施態樣中，冷凍乾燥組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之至少一種醣，諸如約1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、或10.0%。於一較佳之實施態樣中，冷凍乾燥之組成物包括多於約5.5%(w/v)之至少一種賦形劑，諸如多於約7.0%(w/v)。於另一實施態樣中，冷凍乾燥之組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之另外的賦形劑，諸如約1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、或10.0%。於較佳之實施態樣中，冷凍乾燥之組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之至少一種賦形劑及約1%(w/v)至約10%(w/v)之另外的賦形劑。
再於另一實施態樣中，冷凍乾燥之組成物係以水、注射用水(WFI)、佐劑懸浮液、或鹽水(saline)配置(reconstitute)。於一較佳之實施態樣中，稀釋劑為鋁系佐劑懸浮液，諸如磷酸鋁懸浮液。
於一實施態樣中，組成物包括本文所描述之經分離的 多醣(isolated polysaccharide)和載體分子(carrier molecule)。合適之載體分子可包括蛋白質、多醣、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycollic acid)、聚合型胺基酸(polymeric amino acid)、胺基酸共聚物、脂質聚集物(lipid aggregate)(諸如油滴或脂質體(liposome))、及無活性病毒顆粒(inactive virus particle)。顆粒載體(particulate carrier)之實例包括那些源自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物者，以及源自聚(乳酸交酯)(poly(lactides))和聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolides))，稱為PLG之微粒。
本發明之免疫原性組成物可進一步包括一或多種另外之“免疫調節劑(immunomodulator)”，其為擾亂或改變免疫系統之作用劑，從而可觀察到體液及/或細胞介導之免疫作用的上調(up-regulation)或下調(down-regulation)。於一特定之實施態樣中，體液及/或細胞介導之免疫系統支線(arm)被上調較佳。其中，一些免疫調節劑之實例包括，例如美國專利案第5,254,339號所描述之佐劑或細胞介素(cytokine)、或ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)。術語“佐劑(adjuvant)”係指如本文進一步所述增強對抗原之免疫反應的化合物或混合物。
可用於本發明之組成物中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)；礦物凝膠(mineral gel)，諸如氫氧化鋁凝膠；油包水乳劑(water-in-oil emulsion)，諸如弗氏完全和不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvant)；嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)；SAF-M(Chiron,Emeryville,Calif.)；AMPHIGEN®佐劑；皂苷(saponin)；Quil A或其他皂苷部分(saponin fraction)；單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A)；及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。可作為本發明之疫苗中的佐劑之水包油乳劑(oil-in-water emulsion)的非限制性實例包括MF59(美國專利案第6,299,884號)(含有5%角鯊烯(Squalene)、0.5%聚山梨醇酯-80及0.5% Span 85(視需要含有各種量之MTP-PE)，其使用微射流器(microfluidizer)諸如型號110Y微射流器(Model 110Y microfluidizer)(Microfluidics,Newton,MA)配製成亞微米(submicron)顆粒)，及SAF(含有10%角鯊烯、0.4%聚山梨醇酯-80、5% pluronic嵌段聚合物L121(pluronic-blocked polymer L121)和thr-MDP，係經微射流化(microfluidize)成亞微米乳劑(submicron emulsion)或經震盪混合(vortex)以產生較大粒度之乳劑)；經改質之SEAM62(含有5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)SPAN®85洗滌劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80洗滌劑(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml膽固醇、和0.5%(v/v)卵磷脂)；及經改質之SEAM 1/2(含有5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)SPAN®85洗滌劑、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80洗滌劑、2.5%(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A、和50μg/ml膽固醇)。
用於增強免疫反應之合適的佐劑還包括，但不限於美 國專利案第4,912,094號中所描述之MPLTM(3-O-脫醯單磷醯脂質A(3-O-deacylated monophosphoryl lipid A)，Corixa，Hamilton，MT)。亦適合作為佐劑的有合成之脂質A類似物(lipid A analog)、或胺烷基葡糖胺磷酸酯(aminoalkyl glucosamine phosphate)化合物(AGP)、或其衍生物或類似物，其可從Corixa(Hamilton，MT)取得且描述於美國專利案第6,113,918號中。一種該等AGP為2-[(R)-3-十四烷醯氧基-十四烷醯-胺基]乙基2-脫氧基-4-O-膦醯-3-O-[(R)-3-十四烷醯氧基-十四烷醯]-2-[(R)-3-十四烷醯氧基-十四烷醯﹁胺基]-b-D-葡萄哌喃糖苷(2-[(R)-3-Tetradecanoyloxy﹁tetradecanoyl﹁amino]ethyl 2-Deoxy-4-O-phosphono-3-O-[(R)-3-tetra﹁decanoyoxy﹁tetrade﹁canoyl]-2-[(R)-3-tetradecanoyloxy﹁tetradecanoyl-amino]-b-D-glucopyranoside)，其亦稱為529(以前稱為RC529)。此529佐劑係調製為水溶液(aqueous form)(AF)或穩定之乳劑(stable emulsion)(SE)形式。
再有之其他佐劑包括環糊精衍生物(美國專利案第6,165,995號)；聚陰離子性聚合物(polyanionic polymer)(美國專利案第6,610,310號)；胞壁醯肽(muramyl peptide)，諸如N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine)(thr-MDP)、及N-乙醯基-正胞壁醯-L-丙胺酸-2-(1'-2'二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基﹁磷醯基﹁氧基)-乙胺(N-acetyl- normuramyl-L-alanine-2-(1'-2' dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy﹁phosphoryl﹁oxy)-ethylamine)(MTP-PE)；愛菲金(Amphigen)；阿夫立定(Avridine)；L121/角鯊烯；D-乳酸交酯-聚乳酸/醣苷(D-lactide-polylactide/glycoside)；pluronic多元醇(pluronic polyol)；經滅殺之博德氏桿菌(killed Bordetella)；皂苷，諸如美國專利案第5,057,540號中所描述之StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA.)；結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；細菌脂多醣(bacterial lipopolysaccharide)；合成之多核苷酸，諸如含有CpG基序(motif)之寡核苷酸(例如美國專利案第6,207,646號)；歐洲專利案第1,296,713和1,326,634號中所描述之IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)；百日咳毒素(pertussis toxin)(PT)或其突變體，霍亂毒素(cholera toxin)或其突變體(例如美國專利案第7,285,281，7,332,174,7,361,355和7,384,640號)；或大腸桿菌不耐熱毒素(E.coli heat-labile toxin)(LT)或其突變體，尤其是LT-K63、LT-R72(例如美國專利案第6,149,919、7,115,730和7,291,588號)。
可包括在疫苗中之其他“免疫調節劑”包括，例如一或多種介白素(interleukin)1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見，例如美國專利案第5,723,127號)、13、14、15、16、17、及18(和其突變體形式)；干擾素-α、β、及γ；粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)(GM-CSF)(參見，例 如美國專利案第5,078,996號和ATCC寄存編號39900)；巨噬細胞群落刺激因子(macrophage colony stimulating factor)(M-CSF)；粒細胞群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF)；或腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)α和β。還有之可用於本文所描述之免疫原性組成物的其他佐劑包括趨化介素(chemokine)，包括，但不限於MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；黏著分子(adhesion molecule)，諸如選滯蛋白(selectin)，例如L-選滯蛋白、P-選滯蛋白、及E-選滯蛋白；黏蛋白樣分子(mucin-like molecule)，例如CD34、GlyCAM-1、及MadCAM-1；整聯蛋白族(integrin family)之成員，諸如LFA-1、VLA-1、Mac-1、及p150.95；免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)之成員，諸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2、及LFA-3；共刺激分子(co-stimulatory molecule)，諸如B7-1、B7-2、CD40和CD40L；生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL-1、及血管內皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、及DR6；及半胱天冬酶(Caspase)(ICE)。
應理解的是，是否使用免疫調節劑及/或佐劑之決定，或將使用何種免疫調節劑及/或佐劑之選擇將取決於 欲投予疫苗或免疫原性組成物之個體、注射途徑、及欲給予之注射次數。例如，若該個體已天然暴露於病原體，則可能不需要佐劑，因疫苗抗原可有效地誘發記憶反應(memory response)。於一些實施態樣中，免疫原性組成物將包括一或多種佐劑。於一實施態樣中，免疫原性組成物包括鋁系佐劑。於一該等實施態樣中，鋁佐劑為氫氧化鋁、磷酸鋁、或羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyl phosphate)。於一特定之實施態樣中，佐劑為磷酸鋁。於本發明之另一實施態樣中，免疫原性組成物包括QS-21作為佐劑。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包括佐劑，其濃度為約0.1mg/ml至約1.0mg/ml、0.1mg/ml至約0.9mg/ml、0.1mg/ml至約0.8mg/ml、0.1mg/ml至約0.7mg/ml、0.1mg/ml至約0.6mg/ml、0.1mg/ml至約0.5mg/ml、0.1mg/ml至約0.4mg/ml、0.1mg/ml至約0.3mg/ml、0.1mg/ml至約0.2mg/ml、0.25mg/ml至約0.95mg/ml、0.25mg/ml至約0.85mg/ml、0.25mg/ml至約0.75mg/ml、0.25mg/ml至約0.65mg/ml、0.25mg/ml至約0.55mg/ml、0.25mg/ml至約0.45mg/ml、0.25mg/ml至約0.35mg/ml、0.5mg/ml至約1.0mg/ml、0.5mg/ml至約0.9mg/ml、0.5mg/ml至約0.8mg/ml、0.5mg/ml至約0.75mg/ml、0.5mg/ml至約0.7mg/ml、0.5mg/ml至約0.65mg/ml、0.5mg/ml至約0.6mg/ml、0.75mg/ml至約1.0mg/ml、0.75mg/ml至約0.95mg/ml、0.75mg/ml 至約0.9mg/ml、及0.75mg/ml至約0.85mg/ml。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括濃度為約0.25mg/ml至約0.75mg/ml之佐劑，最佳為約0.5mg/ml。
於一較佳之實施態樣中，佐劑為濃度約0.5mg/ml之鋁系佐劑。於一該等實施態樣中，鋁系佐劑為磷酸鋁或羥基磷酸鋁。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包括如本文所描述之多醣-蛋白質軛合物、緩衝劑、界面活性劑、賦形劑、及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。
於一該等實施態樣中，免疫原性組成物包括GBS多醣-蛋白質軛合物、緩衝劑、界面活性劑、賦形劑、及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0，且其中，莢膜多醣之唾液酸量高於約60%。
於一特定之實施態樣中，免疫原性組成物包括GBS多醣-蛋白質軛合物、組胺酸、聚山梨醇酯-80、氯化鈉、及視需要之磷酸鋁，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0，且其中，莢膜多醣之唾液酸量高於約60%。
於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括約5mcg/ml至約50mcg/ml之GBS多醣-蛋白質軛合物、約10mM至約25mM之組胺酸、約0.01%至約0.03%(v/w)之聚山梨醇酯-80、約10mM至約250mM之氯化鈉、及視需要之約0.25mg/ml至約0.75mg/ml的為磷酸鋁之鋁，其中，莢膜多醣之唾液酸量高於約60%。
於一該等實施態樣中，免疫原性組成物包括至少二種GBS多醣-蛋白質軛合物、緩衝劑、界面活性劑、賦形劑、及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0，且其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌(GBS)血清型IV及至少一選自由下列所組成之群組的另外之血清型的莢膜多醣：Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。
於一特定之實施態樣中，免疫原性組成物包括至少二種GBS多醣-蛋白質軛合物、組胺酸、聚山梨醇酯-80、氯化鈉、及視需要之磷酸鋁，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0，且其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌(GBS)血清型IV及至少一種選自由下列所組成之群組的另外之血清型的莢膜多醣：Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。
於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括各約5mcg/ml至約50mcg/ml之至少二種GBS多醣-蛋白質軛合物、約10mM至約25mM之組胺酸，約0.01%至約0.03%(v/w)之聚山梨醇酯-80，約10mM至約250mM之氯化鈉，及視需要之約0.25mg/ml至約0.75mg/ml的為磷酸鋁之鋁，其中，該軛合物包括來自B型鏈球菌(GBS)血清型IV及至少一種選自由下列所組成之群組的另外之血清型的莢膜多醣：Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。
免疫原性組成物之評估
使用各種體外試驗(in vitro test)來評估本發明之免疫原性組成物的免疫原性。例如，將鏈球菌細胞、含有針對所提之抗原的特異性抗體(specific antibody)之經熱滅活的血清(heat inactivated serum)、及外源補體來源(exogenous complement source)的混合物一起培育以進行體外調理素分析(in vitro opsonic assay)。在培育新鮮分離之多形核細胞(polymorphonuclear cell)(PMN)或分化之作用細胞(differentiated effector cell)諸如HL60及抗體/補體/鏈球菌細胞混合物期間進行調理吞噬(opsonophagocytosis)。在調理吞噬時，以抗體和補體塗層之細菌細胞被滅殺。從調理吞噬作用回收之倖存細菌的菌落形成單位(colony forming unit)(cfu)係藉由平皿接種(plating)該分析混合物來測定。報告之力價(titer)為與分析對照組相比較測定導致50%之細菌被滅殺的最高稀釋度之倒數(reciprocal)。
亦可使用全細胞ELISA分析(whole cell ELISA assay)以評估抗原之體外免疫原性(in vitro immunogenicity)及表面暴露(surface exposure)，其中，所欲之菌株(無乳鏈球菌)係塗在盤(例如96孔盤)上，來自免疫化之動物(immunized animal)的測試血清(test sera)係與細菌細胞反應。若對該測試抗原有特異性的抗體與抗原之表面暴露的抗原決定部位(surface exposed epitope)發生反應，此可藉由本領域之技術熟習人士已知的標準方法進行檢測。或者，可使用流式細胞術(flow cytometry)來測量莢膜多醣抗 原之表面暴露(surface exposure)及抗體(包括單株抗體(monoclonal antibody))之特異性(specificity)。
然後，可在活體內動物挑戰模型(in vivo animal challenge model)中測試顯示出所需之體外活性(in vitro activity)的抗原。於一些實施態樣中，藉由本領域之技術熟習人士已知的免疫化(immunization)方法和途徑(例如鼻內、腸胃道外(parenteral)、口服、直腸、陰道、經皮、腹膜內、靜脈內、皮下等等)，使用免疫原性組成物將動物(例如小鼠)免疫化。以GBS免疫原性組成物將動物免疫化後，以無乳鏈球菌菌株挑戰(challenge)該動物，並分析其對鏈球菌感染的抵抗力。
於一實施態樣中，以無乳鏈球菌免疫化並挑戰無病原體之小鼠。例如，以一或更多在免疫原性組成物中的所欲抗原之劑量將小鼠免疫化。隨後，以無乳鏈球菌挑戰小鼠並在挑戰後隨時間監測存活情形。
使用方法
如本文中所使用之“免疫功能低下(Immunocompromised)”係指個體在免疫系統之細胞及/或體液支線(cellular and/or humoral arm)方面有所不足。因此，考慮之免疫功能不足之程度為免疫過程從輕微損害至完全免疫抑制。
用語“個體”係指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物(reptile)、或任何其他動物。用語“個體”亦包括人類。術 語“個體”亦包括家庭寵物。家庭寵物之非限制性實例包括：狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、天竺鼠、雪貂(ferret)、鳥、蛇、蜥蜴、魚、烏龜及青蛙。用語“個體”亦包括家畜。家畜之非限制性實例包括：羊駝(alpaca)、美洲野牛(bison)、駱駝、牛、鹿、豬、馬、駱馬(llamas)、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、犛牛、雞、鵝、及火雞。
如本文所使用之“治療(treatment)”(包括其變化，例如“治療(treat或treated)”)係指下列之任何一或多項：(i)預防感染或再感染，如於傳統疫苗，(ii)減輕症狀之嚴重性或排除症狀，及(iii)實質上或完全排除所提之病原體或狀況。因此，治療可預防性地(感染前)或治療性地(感染後)起作用。本發明中，可使用預防性或治療性治療。根據本發明之一特定實施態樣，提供治療(包括預防性地及/或治療性地免疫化)宿主動物對抗微生物感染(例如細菌，諸如無乳鏈球菌)的組成物和方法。本發明之方法可用於賦予個體預防性及/或治療性免疫。本發明之方法亦可在個體中執行以用於生物醫學研究應用。
於另一態樣中，本發明關於藉由投予個體有效量之本文所描述的免疫原性組成物來誘發個體對GBS的免疫反應之方法。於一實施態樣中，本發明關於藉由投予個體有效量之本文所描述的免疫原性組成物來預防或減輕個體之與B型鏈球菌相關的疾病或狀況的方法。於一態樣中，本發明關於使用本文所描述之免疫原性組成物作為藥物。於 一態樣中，本發明關於本文所描述之免疫原性組成物於誘發個體對GBS之免疫反應的方法中之用途。於一特定之實施態樣中，該個體為計劃懷孕的女性或懷孕的女性。於一該等實施態樣中，該懷孕的女性係在其懷孕末三個月/後半期，諸如至少在妊娠20週或至少在妊娠27週。於一較佳之實施態樣中，懷孕的女性係在妊娠27週至36週。於另一實施態樣中，個體為年長之成人諸如50歲或更年長之成人、65歲或更年長之成人、及85歲或更年長之成人。於另一實施態樣中，個體係免疫功能低下。於一態樣中，個體具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況(medical condition)：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病或肝臟疾病。於一較佳之實施態樣中，B型鏈球菌為無乳鏈球菌(S.agalactiae)。
於一實施態樣中，免疫原性組成物包含多醣-蛋白質軛合物，該多醣-蛋白質軛合物包括GBS血清型IV及至少一種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。於另一實施態樣中，軛合物包括GBS血清型IV及至少二種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。於另外之實施態樣中，軛合物包括GBS血清型IV及至少三種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。再於另一實施態樣中，軛合物包括GBS血清型IV及至少四種選自由下列所組成之群組的 另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。於一特定之實施態樣中，軛合物包括GBS血清型Ia、Ib、II、III及IV。於另一實施態樣中，軛合物包括GBS血清型IV及至少五種選自由下列所組成之群組的另外之血清型：血清型Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII、及IX。於另一實施態樣中，組成物包括GBS血清型V。於一特定之實施態樣中，軛合物包括GBS血清型Ia、Ib、II、III、及V。於一較佳之實施態樣中，免疫原性組成物包括六種多醣-蛋白質軛合物，來自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、及V。本發明之一態樣關於不具有免疫干擾(immune interference)的免疫原性組成物。
免疫原性組成物之免疫原性或有效量可藉由執行劑量反應研究(dose response study)來測定，於該反應研究中，以逐步增加之免疫原性組成物量免疫化個體並分析免疫反應以測定最佳劑量。研究之起始點可從動物模型中之免疫數據推之。劑量可根據個體之特定情況而改變。該量可在例常試驗中藉由本領域之技術熟習人士已知的方式測定。
投予個體適當劑量數之免疫有效量(immunologically effective amount)的免疫原性組成物，以引起免疫反應。劑量可根據個體之特定狀況諸如年齡和體重而變化。此量可在例常試驗中藉由本領域之技術熟習人士已知的方式測定。
於一實施態樣中，投服本發明之免疫原性組成物的患者顯示出無乳鏈球菌帶菌率(carriage rate)降低。從醫療需 求觀點來看，該等帶菌率降低或投予免疫原性組成物後為非帶菌者的時間間隔延長是明顯的。例如，投予一劑本發明之免疫原性組成物後可評估帶菌者之總體無乳鏈球菌帶菌率的減少情形。例如，在投予免疫原性組成物前1天，可藉由鼻、喉、腋下、直腸、會陰、及陰道拭子(vaginal swab)對一組年齡在18至50歲的成人進行帶菌(carriage)之篩檢，隨後進行培養以測定其帶菌狀態(carriage state)。接著，投予該組本發明之免疫原性組成物，而另一組則接受對照組。在投予免疫原性組成物後的12週內持續每週進行鼻、喉、腋下、直腸、會陰、及陰道拭子，然後每月一次長達6個月，並與安慰劑組相比較。一個主要終點為在免疫化後3個月的期間比較投予免疫原性組成物和投予安慰劑後之患者的帶菌率(carriage rate)。
抗體
“抗體”為能夠透過至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區(variable region)的抗原識別位點(antigen recognition site)特異結合(specific binding)至目標(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等等)的免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecule)。除非上下文另有說明，如本文所使用之此術語旨在不僅包括完整之多株或單株抗體，亦包括經基因工程處理的抗體(例如嵌合型(chimeric)、人化(humanized)及/或衍生而來(derivatized)以改變作用功能(effector function)、穩定性及其他生物活性)和彼等之片 段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)和結構域(domain)抗體，包括鯊和駱駝抗體)、和包括抗體部分(antibody portion)之融合蛋白(fusion protein)、多價抗體、多特異性抗體(multispecific antibody)(例如雙特異性抗體(bispecific antibody)，只要其展現出期望之生物學活性)、及如本文所描述之抗體片段，以及包括抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾的構型。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA、或IgM(或彼等之子類別)，且該抗體不需為任何特定之類別。根據抗體重鏈(heavy chain)之恆定結構域(constant domain)的胺基酸序列，免疫球蛋白可歸為不同類別。人體之免疫球蛋白有五大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，其中有些可進一步分出子類別(同型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構和三維構型為眾所周知。
“抗體片段(antibody fragment)”僅包括完整抗體的一部分，其中，該部分較佳為保留至少一種、較佳為大部分或全部之通常與存在於完整抗體時之該部分相關的功能。
本文所使用之抗體的“功能性活性(functional activity)”或“功能性抗體(functional antibody)”係指抗體至少可特異結合(bind specifically)抗原。其他功能為本領域所已知且可包括能清除或滅殺病原體(諸如透過調理素作用(opsonization)、ADCC、或補體介導之細胞毒性)的免疫 系統之其他組分。抗原結合後，任何後續之抗體功能皆可透過抗體之Fc區介導。抗體調理吞噬分析(opsonophagocytosis assay)(OPA)為一種體外分析，其係設計用來在測量以作用細胞(白血球)進行體外Ig補體輔助的細菌滅殺，從而模仿生物過程。抗體結合作用亦可直接抑制其結合之抗原的生物學功能。於一些實施態樣中，“功能性抗體”係指在動物效力模型(animal efficacy model)或證明抗體滅殺細菌的調理吞噬滅殺分析(opsonophagocytic killing assay)中藉由滅殺細菌測量之具有功能的抗體。
於一態樣中，本發明關於特異結合本文所描述之多醣的經分離之抗體或其片段。如本文所使用之“經分離的(isolated)”抗體係指已辨識(identify)且從其天然環境之組分分開及/或回收的抗體。其天然環境之污染組分為會干擾該抗體之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素、及其他蛋白質性(proteinaceous)或非蛋白質性(nonproteinaceous)溶質。於例示性實施態樣中，抗體將純化至(1)超過抗體之95重量%(藉由Lowry法測定)，最佳為超過99重量%、(2)藉由使用轉杯式定序儀(spinning cup sequenator)時足以取得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度、或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳為銀染色(silver stain)時，藉由SDS-PAGE分析時為均質性(homogeneity)。經分離之抗體包括在重組細胞內之原位抗體(antibody in situ)，因為 抗體之天然環境(natural environment)的至少一組分將不會存在。然而，經分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟製造。
“特異性合(specifically bind)”或“特異於(specific)”特定多醣或特定多醣上之抗原決定部位的抗體為結合該特定多醣或特定多醣上之抗原決定部位而實質上不與任何其他多醣或多醣抗原決定部位結合之抗體。
本文所使用之“標記(label)”一字係指直接或間接地與抗體軛合從而產生“經標記之(labeled)”抗體的可檢測之化合物或組成物。標記可本身為可檢測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或者，在酶標記(enzymatic label)的情況下，可催化可檢測之受質化合物或組成物的化學改變。
本發明進一步提供特異地(specifically)及選擇性地(selectively)結合本發明的免疫原性組成物之一或更多抗原的抗體及抗體組成物。於一些實施態樣中，抗體係在投予個體本發明之免疫原性組成物時產生。於一些實施態樣中，本發明提供針對(direct against)本發明之免疫原性組成物的一或更多抗原的純化或分離之抗體。於一些實施態樣中，本發明之抗體藉由在動物效力模型中滅殺細菌或經由調理吞噬滅殺分析測量為具有功能性。於一些實施態樣中，本發明之抗體賦予個體被動免疫力(passive immunity)。本發明進一步提供編碼本發明之抗體或抗體片段的多核苷酸分子、和製造本發明之抗體或抗體組成物 的細胞或細胞株(諸如用於重組製造抗體之融合瘤細胞(hybridoma cell)或其他經基因工程處理之細胞株(engineered cell line))及基因轉殖動物(transgenic animal)(使用本領域之技術熟習人士所熟知之技術)。
本發明之抗體或抗體組成物可用於治療或預防個體之與無乳鏈球菌相關的鏈球菌感染、疾病或狀況，該方法包括產生多株或單株抗體製劑，及使用該抗體或抗體組成物賦予個體被動免疫力。本發明之抗體亦可用於診斷方法，例如檢測本發明之免疫原性組成物的一或更多抗原是否存在或進行定量。
對重複結構(例如本發明之多醣)的抗體反應可顯現出一些獨特的特性。例如，重複單元的規律性(regularity)可能意味分子量極不相同的抗原分子可結合至特異於該多醣之抗體。第二，較長之多醣的重複結構能夠誘發T細胞無關性抗體反應(T-cell independent antibody response)。因此，當使用與具有T輔助細胞抗原決定部位(T-cell helper epitope)的蛋白質載體軛合之多醣時可同時刺激T細胞無關性(T-cell independent)及T細胞依賴性(T-cell dependent)抗體反應。因此，可藉由適當選擇多醣尺寸及是否使用載體蛋白來修飾免疫反應。
多株抗體
於某些實施態樣中，抗多醣抗體(anti-polysaccharide antibody)為多株抗體(polyclonal antibody)。如本文所定義 之多株抗體係指具有不同特異性之衍生自血清製劑且源自不同B細胞殖株(B-cell clone)的抗體之混合物。多株抗體之製備方法和定性(characterization)為本領域已知。
多株抗體係藉由投予一或更多本文所描述之免疫原(immunogen)或免疫原性組成物的注射劑，及若需要時，佐劑、緩衝劑及/或稀釋劑，而在個體(例如哺乳動物)中引出。可用於製造特異性抗血清(specific antisera)之動物物種很多。通常，用於製造抗醣多株抗血清(anti-saccharide polyclonal antisera)之動物為非人靈長類、山羊、綿羊、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、或天竺鼠。通常，具有或不具有佐劑之免疫原或免疫原性組成物係藉由多次注射(multiple injections)來為哺乳動物注射。免疫原性物質可包括多醣、寡醣、本文所描述之多醣、多醣-蛋白質軛合物、或較大之免疫原組。通常，自第一次免疫化後2至6週開始從免疫化之動物收集血液，使其凝結並收取血清。該血清含有來自免疫化動物之抗醣多株抗體，通常稱為抗血清。
單株抗體
抗醣單株抗體(anti-saccharide monoclonal antibody)可透過使用已知之融合瘤技術(hybridoma technique)製造。通常，製造單株抗體涉及首先以選定的免疫原(包括多醣、寡醣、本發明之多醣或多醣-蛋白質軛合物)將合適之目標動物宿主免疫化(immunizing)。若需要時，可包括佐劑、緩衝劑及/或稀釋劑。免疫化(immunization)係以足以 誘發B淋巴細胞製造或表現特異結合多醣或其軛合物之抗體的方式進行。或者，淋巴細胞係在體外免疫化。
然後，使用合適之融合劑(fusing agent)(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與永生化細胞株(immortalized cell line)融合，以形成融合瘤細胞。淋巴細胞之來源決定該單株抗體為人或動物來源。一般而言，若需要人類來源之抗體和細胞時係使用周邊血液淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte)(“PBL”)，而若需要非人之哺乳動物來源時，則使用脾細胞或淋巴結細胞。
永生化細胞株(immortalized cell line)通常為轉形(transformed)之哺乳動物細胞，尤其是囓齒動物、牛和人類來源的骨髓瘤細胞(myeloma cell)。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。將融合瘤細胞培養在合適之培養基中，較佳為含有一或更多抑制未融合的、永生化之細胞的生長或存活的物質。例如，若親代細胞(parental cell)缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)(HGPRT或HPRT)，用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤(hypoxanthine)、胺基喋呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)(“HAT培養基”)，這些物質將防止HGPRT缺乏型細胞的生長。
永生化細胞株係根據實際考慮的問題選擇，諸如來源之物種、融合及生長特性。例如，合適之永生化細胞株為那些有效地融合、支持抗體穩定且高水準表現(藉由所選定的抗體製造細胞)、及對培養基(諸如HAT培養基)敏 感。永生化細胞株之實例包括：鼠骨髓瘤株(murine myeloma line)。人骨髓瘤及小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞株亦曾被描述用於製造人單株抗體。
單株抗體係由融合瘤細胞分泌到培養基中。然後，分析該培養基中是否存有能識別並結合多醣的單株抗體。由融合瘤細胞製造之特定單株抗體的抗多醣結合特異性(anti-polysaccharide binding specificity)係藉由本領域所熟知的眾多程序之一測定。例如，抗體結合特異性(antibody binding specificity)可藉由免疫沉澱法(immunoprecipitation)、放射免疫分析(radioimmunoassay)(RIA)、西方墨點法(western blot)、酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assay)(ELISA)、或表面電漿共振(surface plasmon resonance)(例如Biacore)測定。單株抗體所識別之精確抗原決定部位係藉由抗原決定部位定位(epitope mapping)測定。該等技術和分析為本領域所熟知。
鑑定具有所需特異性之融合瘤細胞製造抗體後，藉由有限稀釋法將該選殖株次選殖(subclone)並使用標準方法培養。用於此目的之合適的培養基包括，例如Dulbecco's Modified Eagle's Medium及RPMI-1640培養基。或者，該融和瘤細胞係於哺乳動物以腹水(ascite)形式在活體內生長。由次選殖株分泌之單株抗體係藉由習知之免疫球蛋白純化程序(諸如，例如蛋白質A-瓊脂糖(protein A-Sepharose)、羥磷灰石層析法(hydroxylapatite chromatography)、凝膠電泳(gel electrophoresis)、透析(dialysis)、或親和層析(affinity chromatography))從培養基或腹水液體分離或純化。
或者，具有所需之特異性和來自所欲之來源物種的抗體可透過使用噬菌體呈現基因庫(phage display librar)來取得。此外，特別適合用於產生和篩選抗體呈現基因庫(antibody display library)之方法和試劑的實例可在本領域中找到。
抗體用途
於一態樣中，本發明關於本文所描述之免疫原性組成物於製造GBS抗體及/或抗體片段的用途。本文所描述之多醣-蛋白質軛合物及/或由其產生之抗體可用於本領域之技術熟習人士已知的各種免疫診斷技術(immunodiagnostic technique)中，包括ELISA及微陣列(microarray)相關技術。此外，這些試劑可用於評估抗體反應，包括，例如針對免疫原性多醣軛合物的血清抗體量。本發明之分析方法學可涉及使用標記諸如螢光、化學發光(chemiluminescent)、放射性(radioactive)、酶性(enzymatic)標記，或染料分子，及/或用於直接或間接檢測生物樣本中之抗原或抗體與結合至固體支持物之對應抗體或抗原間的複合物的二級免疫試劑(secondary immunologic reagent)。
所製造之抗體或抗體片段亦可用於對抗鏈球菌感染的 被動免疫療法或預防療法中。
製造多醣的方法
再於另一態樣中，本發明關於用於製造本文所描述之多醣的方法。該方法包括培養GBS，並收集由該細菌製造之多醣。於一實施態樣中，該GBS包括無乳鏈球菌。該細菌可為無乳鏈球菌之任何菌株。於一較佳之實施態樣中，該細菌為無乳鏈球菌之包覆株(encapsulated strain)。用於本發明之無乳鏈球菌菌株包括090、A909(ATCC寄存編號BAA-1138)、515(ATCC寄存編號BAA-1177)、B523、CJB524、MB 4052(ATCC寄存編號31574)、H36B(ATCC寄存編號12401)、S40、S42、MB 4053(ATCC寄存編號31575)、M709、133、7357、PFEGBST0267、MB 4055(ATCC寄存編號31576)、18RS21(ATCC寄存編號BAA-1175)、S16、S20、V8(ATCC寄存編號12973)、DK21、DK23、UAB、5401、PFEGBST0708、MB 4082(ATCC寄存編號31577)、M132、110、M781(ATCC寄存編號BAA-22)、D136C(3)(ATCC寄存編號12403)、M782、S23、120、MB 4316(M-732；ATCC寄存編號31475)、M132、K79、COH1(ATCC寄存編號BAA-1176)、PFEGBST0563、3139(ATCC寄存編號49446)、CZ-NI-016、PFEGBST0961、1169-NT1、CJB111(ATCC寄存編號BAA-23)、CJB112、2603 V/R(ATCC寄存編號BAA-611)、NCTC 10/81、CJ11、PFEGBST0837、 118754、114852、114862、114866、118775、B 4589、B 4645、SS1214、CZ-PW-119、7271、CZ-PW-045、JM9130013、JM9130672、IT-NI-016、IT-PW-62、及IT-PW-64。
本文所描述之多醣可藉由在適當的培養基中培養GBS來製造。合適之培養基可包括哥倫比亞液(Columbia broth)。培養基可包括右旋糖(dextrose)、氯化血紅素(hemin)、及/或葡萄糖。較佳地，培養基包括哥倫比亞液和右旋糖。若無乳鏈球菌係使用哥倫比亞液和右旋糖培養，培養溫度較佳為20至40℃，較宜為37℃。於一較佳之實施態樣中，細菌係在有氧條件下培養。於另一較佳之實施態樣中，細菌係培養12至60小時。
可利用本領域已知之用來從培養中收集目標物質之方法(諸如，例如加熱、酶處理、離心、沉澱、以活性炭處理、及/或過濾)從所得之培養收集多醣。(參見，例如美國專利申請案公開號2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340和2008/0102498；國際專利申請案公開號WO 2008/118752)。於一實施態樣中，將含有細菌和多醣之培養物離心並以酶處理，諸如，例如以溶菌酶(lysozyme)、核糖核酸酶(RNase)、去氧核糖核酸酶(DNase)、鏈黴蛋白酶(Pronase)、變溶菌素(mutanolysin)、及彼等之組合處理。例如，於一實施態樣中，在所取得之上清液中加入適當之有機溶劑以沉澱蛋白質，並藉由離心除去沉澱。然後，藉 由進一步在上清液中加入適當之有機溶劑以使多醣沉澱並可藉由離心收集多醣。更具體地說，本文所描述之多醣可藉由下述步驟取得：在已除去細菌之上清液中加入最終濃度為約25體積%之乙醇，藉由離心移除含有蛋白質之沉澱物，進一步在其中加入最終濃度為約75體積%之乙醇，然後藉由離心收集沉澱物。所得沉澱物可以氮氣乾燥。將所得沉澱物再懸浮於Tris和0.05%疊氮化鈉中。
本發明之另一態樣提供使用有機試劑(諸如衍生之羥胺化合物)來分離大部分完整高分子量CP、並保留N-和O-乙醯基的新穎方法。由於此方法不會溶解細胞，藉由離心分離之CP受胞內組分最低限度地污染且可導致較高之總產率(overall yield)。再者，由於B型抗原雜質具有多個磷酸二酯鍵(phospodiester linkage)，這些試劑將B型抗原雜質裂解成可藉由濾析(diafiltration)輕易除去的非常小之片段。
於一實施態樣中，CP係藉由使羥胺(hydroxyl amine)與包括莢膜多醣製造細菌的細胞糊狀物反應來分離。於一特定之實施態樣中，該方法進一步包括離心步驟。於另一實施態樣中，該方法進一步包括過濾步驟。再於另一實施態樣中，該莢膜多醣製造細菌係選自由下列所組成之群組：無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、大腸桿菌、傷寒沙門桿菌、流感嗜血桿菌、克雷白氏肺炎桿菌、屎腸球菌、及糞腸球菌。
於本發明之一態樣中，羥胺可為實施例2中之表2中 所列出者。於一較佳之實施態樣中，羥胺係選自由下列所組成之群組：二苄基羥胺(dibenzyl hydroxylamine)；二乙基羥胺(diethyl hydroxylamine)；羥胺(hydroxylamine)；乙二胺(ethylenediamine)；三伸乙四胺(triethylenetetramine)；1,1,4,7,10,10六甲基三伸乙四胺(1,1,4,7,10,10 hexamethyl triethylene tetramine)；及2,6,10,三甲基2,6,10三氮雜十一烷(2,6,10,Trimethyl 2,6,10 triazaundecane)。
於本發明之一態樣中，羥胺之濃度為約5mM至約200mM，諸如約5mM至約150mM、約5mM至約100mM、約5mM至約75mM、約5mM至約50mM、約5mM至約25mM、約5mM至約10mM、10mM至約200mM、諸如約10mM至約150mM、約10mM至約100mM、約10mM至約75mM、約10mM至約50mM、約10mM至約25mM、約25mM至約200mM、約25mM至約150mM、約25mM至約100mM、約25mM至約75mM、約25mM至約50mM、約50mM至約200mM、約50mM至約150mM、50mM至約100mM、及約50mM至約75mM。
於另一態樣中，反應之pH係保持在約5.5至約9.5，諸如約5.5至約9.0、約5.5至約8.5、約5.5至約8.0、約5.5至約7.5、約5.5至約7.0、約5.5至約6.5、約6.0至約9.5、約6.0至約9.0、約6.0至約8.5、約6.0至約8.0、約6.0至約7.5、約6.0至約7.0、約6.5至約9.5、 約6.5至約8.5、約6.5至約8.0、約6.5至約7.5、約7.0至約9.5、約7.0至約9.0、7.0至約8.5、及約7.0至約8.0。
於本發明之另一態樣中，反應係在約20℃至約85℃之溫度發生，諸如約20℃至約80℃、約20℃至約75℃、約20℃至約70℃、約20℃至約65℃、約20℃至約60℃、約20℃至約55℃、約20℃至約50℃、約25℃至約85℃、約25℃至約80℃、約25℃至約75℃、約25℃至約70℃、約25℃至約65℃、約25℃至約60℃、約25℃至約55℃、約25℃至約50℃、約30℃至約85℃、約30℃至約80℃、約30℃至約75℃、約30℃至約70℃、約30℃至約65℃、約30℃至約60℃、約30℃至約55℃、約30℃至約50℃、約35℃至約85℃、約35℃至約80℃、約35℃至約75℃、約35℃至約70℃、約35℃至約65℃、約35℃至約60℃、約35℃至約55℃、約40℃至約85℃、約40℃至約80℃、約40℃至約75℃、約40℃至約70℃、約40℃至約65℃、約40℃至約60℃、約45℃至約85℃、約45℃至約80℃、約45℃至約75℃、約45℃至約70℃、約45℃至約65℃、約50℃至約85℃、約50℃至約80℃、約50℃至約75℃、約50℃至約70℃、約55℃至約85℃、約55℃至約80℃、約55℃至約75℃、約60℃至約85℃、及約65℃至約85℃。
再於另一態樣中，反應時間為約10小時至約90小時，諸如約10小時至約85小時、約10小時至約80小 時、約10小時至約75小時、約10小時至約70小時、約10小時至約60小時、約10小時至約50小時、約10小時至約40小時、約10小時至約30小時、約10小時至約25小時、約10小時至約20小時、約10個小時至約15小時、約15小時至約90小時、約15小時至約85小時、約15小時至約80小時、約15小時至約75小時、約15小時至約70小時、約15小時至約60小時、約15小時至約50小時、約15小時至約40小時、約15小時至約30小時、15小時至約20小時、諸如約20小時至約90小時、約20小時至約85小時、約20小時至約80小時、約20小時至約75小時、約20小時至約70小時、約20小時至約60小時、約20小時至約50小時、約20小時至約40小時、約20小時至約30小時、及約20小時至約25小時。
或者，於本發明之另一實施態樣中，多醣係經化學方式合成。多醣可根據習知方法藉由化學方法合成。
再於本發明之另一實施態樣中，多醣係在替代宿主(surrogate host)中選殖並表現用於製造多醣的生物合成途徑後藉由表現製造。例如，宿主細胞可經修飾以製造具有類似於本文所描述之多醣的結構之多醣，其中，在該宿主細胞中製造之多醣的重複單元與本文所描述之多醣的重複單元部分一致。例如，與本文所描述之多醣的重複單元相比較，若多醣之重複單元具有缺失分支(missing branch)、尺寸上為異質(heterogeneous)及/或在支化結構(branching arrangement)為異質(heterogeneous)，該多醣為結構上類似於本文所描述之多醣。較佳地，該宿主細胞為細菌宿主細胞。
實施例
下列實施例展示本發明之一些實施態樣。然而，應理解，這些實施例僅用於說明，並非意欲完全限定本發明之條件和範圍。應理解的是當已給定典型之反應條件(例如溫度、反應時間等等)時，亦可使用高於及低於所指定範圍之條件，雖然通常較不方便。除非另有指明，本文所提及之所有份數及百分比都是按重量計且所有溫度係以攝氏溫度表示。
此外，除非另有詳細說明，下列實施例係使用本領域之技術熟習人士所熟知及例行之標準技術進行。如上述，下列實施例係用於說明且不應以任何方式限制本發明之範圍。
實施例1：製造具脫-O-乙醯化多醣之多醣-蛋白質軛合物
在pH受控制之限定培養基中將各別血清型之無乳鏈球菌菌株在浸層培養(submerged culture)中發酵。所使用之程序和培養基係透過實驗優化且為先前von Hunolstein,C.et al.,Appl.Micro.Biotech.38(4)：458-462(1993)中所描述之基本技術的延伸。藉由NaOH處理從細胞移出莢膜多醣。澄清(clarification)後，進行一系列之UF/DF、沉澱 及碳濾(carbon filtration)步驟來產生純化之多醣。參見，例如美國專利案第8,652,480號。使用還原性胺化化學(reductive amination chemistry)來使經活化之多醣與CRM197軛合。參見，例如美國專利案第5,360,897號。
實施例2. 分離O-乙醯化多醣
將發酵液(fermentation broth)(1.2L)熱滅殺(heat killing)和離心後所取得之來自GBS莢膜多醣(CP)血清型Ia的細胞糊狀物重新懸浮於175mL之25mM磷酸鉀緩衝劑(25mM，pH 6.9)中。將該懸浮液與羥胺O-磺酸水溶液(aqueous hydroxyl amine O-sulfonic acid solution)混合，至最終濃度成為10mM。該懸浮液之pH經測定為約5.8。將該懸浮液在55℃攪拌72小時。之後，將懸浮液在約10,000rpm離心並收集上清液。分析含有經粗裂解之CP(crude cleaved CP)的上清液之分子量和產率。採用30kDa MWCO膜，使用注射用水(WFI)將剩餘部分藉由濾析(diafiltration)純化。藉由粒徑排阻層析法(size exclusion chromatography)合併多角度光散射檢測器(multiangle light scattering detector)(SEC-MALS)進一步分析該純化之多醣的分子量(表1)。
Figure 105113585-A0202-12-0138-26
使用上述方法篩選數種羥胺(經氮和氧取代之化合物二者)之活性。藉由未加工的上清液(crude supernatant)之凝膠滲透層析(gel permeation chromatography)合併多角度光散射檢測(multi-angle light scattering detection)(GPC-MALS)，使用折射率(RI)反應及特定折射率增量(specific refractive index increment)(dn/dc)值0.135之平方，來計算產率。產率係取決於羥胺之類型和條件(諸如濃度、溫度和反應時間)之優化(見表2)。一般而言，增加之羥胺濃度、較高之溫度及較長之反應時間可導致較高之產率。
Figure 105113585-A0202-12-0139-27
Figure 105113585-A0202-12-0140-28
Figure 105113585-A0202-12-0141-29
Figure 105113585-A0202-12-0142-30
結果發現經取代及未經取代之羥胺能非常有效地使GBS莢膜多醣從細胞壁中釋出。此方法使得分離出高分子量CPS並保存N-和O-乙醯基。在篩選之數種化合物中，二苄基羥胺被認為是最有效的。數據顯示於表3中([二苄基羥胺]-50mM；pH-7至8；溫度-50℃；時間-24小時)。
Figure 105113585-A0202-12-0142-32
NA-血清型Ia並未O-乙醯化
由於二苄基羥胺在水中之溶解度差，羥胺之易溶於水且具有類似二苄基羥胺或更高之活性的替代衍生物是想要的。篩選一些化合物後，二乙基羥胺被認為是好的選擇。數據顯示於表4中([二乙基羥胺]-100mM；pH-7至8；溫度-60℃；時間-19小時)。
Figure 105113585-A0202-12-0143-33
羥胺(NH2-OH)亦被發現能有效地使CPS從細胞壁裂解(cleavage)。數據顯示於表5中([羥胺]-100mM；pH-7至7.5；溫度-65℃；時間-17小時)。在血清型III方面，17小時後之產率為54%；然而，3天半後之產率增加高達70%。
Figure 105113585-A0202-12-0143-34
用於從細胞釋出GBS莢膜多醣之寡胺的篩選
羥胺及其經取代之化合物被發現能非常有效地使莢膜多醣從GBS細胞壁裂解。然而，它們被發現對血清型II 和V較不有效。因此，對寡胺(oligoamine)進行測試，因為相信它們由於具有多個胺官能(amine functionality)因而可更為活躍。
乙二胺(ethylene diamine)被發現能有效地使莢膜多醣從所有血清型釋出。數據顯示於表6中([乙二胺]-50或100mM；pH 8.0；16小時；80℃；25mM EDTA)。
Figure 105113585-A0202-12-0144-35
使用血清型Ia及V細胞糊狀物測試其他代表性寡胺之活性，但亦發現對血清型V較不有效。數據顯示於表7([三伸乙四胺(triethylenetetramine)]-100mM；pH-8.9；溫度-60℃；時間-15小時)、8([1,1,4,7,10,10六甲基三伸乙四胺]-10mM；pH-6.3；溫度-60℃；時間-20小時)、及9([2,6,10,三甲基2,6,10三氮雜十一烷]-10mM；pH-7至8；溫度-60℃；時間-19小時)。
Figure 105113585-A0202-12-0145-36
nd-未測定
Figure 105113585-A0202-12-0145-37
nd-未測定
Figure 105113585-A0202-12-0146-38
nd-未測定
實施例3. 藉由還原性胺化進行GBS莢膜多醣之軛合 活化多醣(Activating Polysaccharide)
藉由依序加入計算量之500mM磷酸鉀緩衝劑(pH 6.0)及注射用水(WFI)，在100mM磷酸鉀緩衝劑(pH 6.0±0.5)中進行多醣氧化反應以產生最終濃度為2.0g/L之多醣。若需要時，將反應pH調整為約pH 6.0。調節pH後，將反應溫度調節成23℃。藉由加入約0.25莫耳當量之過碘酸鈉來起始氧化反應。氧化反應係在5±3℃進行約16小時。
使用5K MWCO超濾匣(5K MWCO ultrafiltration cassette)將經活化之多醣濃縮和濾析(diafiltration)。對20倍濾析體積(diavolume)之注射用水(WFI)進行濾析。然後，將純化之經活化的多醣儲存於5±3℃。定性(characterize)純化之經活化的多醣可藉由(i)比色檢定(colorimetric assay)測定醣濃度；(ii)比色檢定測定醛濃度；(iii)氧化程度(degree of oxidation)；以及(iv)藉由 SEC-MALLS測定分子量，等等。
該經活化之多醣的氧化程度(DO=糖重複單元之莫耳數/醛之莫耳數)係依下述測定：藉由各種比色法(colorimetric method)測定糖重複單元之莫耳數，例如，藉由使用蒽酮(Anthrone)方法。藉由蒽酮方法，先藉由硫酸和熱之作用將多醣分解成單糖。蒽酮試劑與己糖(hexose)反應以形成黃綠色混合物，其之吸光度(absorbance)係在625nm以分光光度測量讀取(read spectrophotometrically)。在分析範圍內，吸光度與己糖的存在量成正比。
亦使用MBTH比色法同時測定醛的莫耳數。MBTH分析涉及藉由使醛基(來自給定之樣本)與3-甲基-2-苯並噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone)(MBTH分析試劑)反應來形成吖
Figure 105113585-A0202-12-0147-91
(azine)化合物。過量之3-甲基-2-苯並噻唑酮腙氧化形成反應性陽離子(reactive cation)。該反應性陽離子與吖
Figure 105113585-A0202-12-0147-93
反應以形成藍色發色團(chromophore)。然後在650nm以分光光度測量讀取所形成之發色團。
混合經活化之多醣與蔗糖賦形劑，並且冷凍乾燥
以每克經活化之多醣對25克蔗糖的比率將經活化之多醣與蔗糖混合。然後將經混合之混合物的瓶子冷凍乾燥。冷凍乾燥後，將含有冷凍乾燥之經活化的多醣的瓶子儲存在-20±5℃。將計算量之CRM197蛋白分別進行殼式冷凍(shell-frozen)和冷凍乾燥。將冷凍乾燥之CRM197儲存 在-20±5℃。
配置冷凍乾燥之經活化的多醣與載體蛋白
冷凍乾燥之經活化的多醣在無水二甲亞碸(DMSO)中配置(reconstitute)。在多醣完全溶解時，將等量之無水DMSO加入冷凍乾燥之CRM197中以進行配置(reconstitution)。
軛合(Conjugating)及封端(Capping)
將配置之經活化的多醣與配置之CRM197在反應容器中合併，接著使其充分混合以在使用氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)起始軛合之前取得澄清之溶液。在反應液中之最終多醣濃度為約1g/L。藉由在反應混合物中加入1.0至1.5MEq之氰基硼氫化鈉並在23±2℃溫育20至48小時來起始軛合反應(conjugation)。藉由加入2MEq之硼氫化鈉(NaBH4)將未反應之醛類封端以終止軛合反應。使封端反應在23±2℃持續進行3±1小時。
純化該軛合物
於準備藉由使用100-300K MWCO膜之切向流過濾(tangential flow filtration)純化時，以冷卻之5mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)將該軛合物溶液稀釋1：10。
將稀釋之軛合物溶液通過5μm過濾器，並使用5mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6.0)作為介質進行濾析。濾析完成 後，將軛合物滯留物(conjugate retentate)轉移通過0.22μm過濾器。以5mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6)進一步稀釋軛合物使達到約0.5mg/mL之目標醣濃度。或者，使用20mM組胺酸-0.9%鹽水(pH 6.5)，藉由利用100至300K MWCO膜之切向流過濾來純化該軛合物。完成最後之0.22μm過濾步驟，以取得免疫原性軛合物。
實施例4：改變軛合條件對GBS多醣-CRM 197 軛合物之影響
GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV及V軛合物之產生，係藉由刻意改變過碘酸鹽氧化(periodate oxidation)/還原性胺化化學(reductive amination chemistry)(PO/RAC)條件，包括用於試劑之溶劑(水性介質相對於DMSO)、改變初始多醣中之唾液酸量、及氧化程度/醣抗原決定部位修飾(saccharide epitope modification)。一般而言，使用DMSO作為溶劑所製造之軛合物被發現，相較於使用水性介質所製造的軛合物，具有較少量之未反應(游離)的多醣、較高之軛合物分子量、及較高之醣/蛋白質比率。
製造具有較少量之未反應(游離)的多醣之軛合物的軛合方法是有利且較佳的。眾所周知，大量未反應(游離)之多醣可能引起過度的T細胞無關性免疫反應(T-cell independent immune response)，這可能會稀釋由多醣-蛋白質軛合物產生之T細胞依賴性反應(T-cell dependent response)，藉此減低因軛合物產生之免疫原性反應。
藉由本領域已知之方法選擇的GBS多醣化學地去唾液酸化(chemically desialylate)(參見Chaffin,D.O,et al.,J Bacteriol 187(13)：4615-4626(2005))以生成軛合物變體(conjugate variant)，以測定去唾液酸化%對免疫原性之影響。去唾液酸化超過約40%(即，唾液酸量少於約60%)對免疫原性具有負面影響。
同樣地，在大多數情況中，氧化程度低於約5、或醣抗原決定部位修飾(saccharide epitope modification)超過約20%對免疫原性有負面影響。因為氧化反應透過莢膜多醣上之唾液酸發生，結果似乎指出醣抗原決定部位修飾超過約20%會減少唾液酸含量，這導致免疫原性降低。
相反地，具有各種醣/蛋白質比或多醣分子量之軛合物可在小鼠中製造免疫原性反應，這表示關於這些特性之接受標準(acceptance criteria)的範圍相當寬。
亦使用替代之化學途徑生成另外的軛合物變體(conjugate variant)。一替代化學包括使多醣與羰基雙三唑(carbonylditriazole)(CDT)反應、並在DMSO中進行軛合反應，以生成軛合物。於另一替代化學中，藉由使用TEMPO[(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl)]試劑(代替過碘酸鈉)來氧化多醣，再在DMSO中利用還原性胺化化學(TEMPO/RAC)進行軛合，以生成軛合物，詳見上述實施例3。藉由這些替代化學所生成的全部軛合物被證明在小鼠體內具免疫原性，這表明該除了PO/RAC外之替代化學途徑的合適 性。然而，一些軛合化學使用某些血清型執行時較其他血清型好。
按照Nanra,J.S.,et al.,Hum.Vaccin.Immunother.,9(3)：480-487(2013)進行OPA，但以金黃葡萄球菌分離株(Staphylococcus aureus isolate)代替B型鏈球菌分離株(group B streptococcal isolate)，並省略預調理(preopsonization)步驟。給藥後，提供三(PD3)OPA力價(OPA titer)，此為來自一組10至20小鼠(以每劑各別軛合物為1mcg/ml來免疫化)之幾何平均(geomean)。
GBS血清型Ia多醣-CRM197軛合物
使用PO/RAC及DO為16至17(約6%醣抗原決定部位修飾)之活化多醣生成的軛合物顯示出具免疫原性(軛合物1和3)。然而，使用DO為5.4之活化多醣(約19%醣抗原決定部位修飾)對免疫原性具有負面影響(軛合物2)。同樣地，50%之唾液酸量幾乎不產生免疫原性反應(軛合物4)。結果顯示於表10中。
Figure 105113585-A0202-12-0152-39
使用替代之軛合化學和軛合物分子特性生成另外之軛合物變體(結果顯示於表11中)。軛合物5係藉由使多醣與羰基雙三唑(carbonylditriazole)(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。軛合物6係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將多醣氧化，再在DMSO中利用還原性胺化化學進行軛合來生成，詳見上述實施例3。軛合物7係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來生成，以製造具有高醣/蛋白質比(SPR)之軛合物。軛合物8係使用具有低MW(40kDa)的多醣，藉由PO/RAC生成。所有這些軛合物均證明在小鼠中具免疫原性，這表示除了過碘酸鹽氧化(periodate oxidation)/還原性胺化化學(reductive amination chemistry)外之替代(alternative)軛合化學(conjugation chemistry)以及替代(alternative)軛合物特性(conjugate attribute)(諸如初始多醣之SPR及低MW)的合適性。
Figure 105113585-A0202-12-0153-40
GBS血清型Ib多醣-CRM197軛合物
在DMSO中，使用PO/RAC及DO為15.8(約6%醣抗原決定部位修飾)之活化多醣生成的軛合物顯示出在小鼠中具免疫原性(軛合物9和11)。當所有其他軛合分子特性相似(軛合物9和11，分別地)時，在DMSO中藉由PO/RAC生成之軛合物較在水性介質中藉由PO/RAC生成之軛合物稍微更具有免疫原性。然而，使用DO為4.7(約21%醣抗原決定部位修飾)之活化多醣對免疫原性具有負面影響(軛合物10)。在使用PO/RAC及95%去唾液酸化(5% 唾液酸量)多醣所生或之軛合物(軛合物12)中，免疫原性幾乎完全被廢除，只有極少數有反應。結果顯示於表12中。
Figure 105113585-A0202-12-0154-41
使用替代之軛合化學和軛合分子特性生成另外之軛合物變體(結果顯示於表13中)。軛合物13係使用在初始多醣(initial polysaccharide)中具有低唾液酸化(65%)的多醣藉由PO/RAC生成。軛合物14係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來生成，以製造具有高醣/蛋白質比(saccharide/protein ratio)(SPR)之軛合物。軛合物15係藉由使多醣與羰基雙三唑(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。軛合物16係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將 多醣氧化，再在DMSO中利用還原性胺化化學(TEMPO/RAC)進行軛合來生成，詳見上述實施例3。所有這些軛合物均證明在小鼠中具免疫原性，這表示除了過碘酸鹽氧化/還原性胺化化學外之替代軛合化學以及替代軛合物特性(諸如初始多醣之SPR及低MW)的合適性。
Figure 105113585-A0202-12-0155-42
GBS血清型II多醣-CRM197軛合物
使用PO/RAC及DO為4至15(約7至23%之醣抗原決定部位修飾)之活化多醣生成的軛合物顯示出於小鼠具免疫原性(軛合物17至20)。使用PO/RAC及唾液酸化程度為74%(26%去唾液酸化)之多醣所生成的軛合物亦顯示出具免疫原性(軛合物20)。結果顯示於表14。
Figure 105113585-A0202-12-0156-43
使用替代之軛合化學和軛合分子特性生成另外之軛合物變體(結果顯示於表15中)。軛合物21和22係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來生成，以分別製造具有低的和高的醣/蛋白質比(SPR)之軛合物。軛合物23係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將多醣氧化，再在DMSO中利用還原性胺化化學進行軛合來生成，詳見上述實施例3。軛合物24係藉由使多醣與羰基雙三唑(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。所有這些軛合物均證明在小鼠中具免疫原性，這表示除了過碘酸鹽氧化/還原性胺化化學外之替代的(alternative)軛合化學(conjugation chemistry)以及替代的(alternative)軛合物特性(conjugate attribute)(諸如SPR)的合適性。
Figure 105113585-A0202-12-0157-44
GBS血清型III多醣-CRM197軛合物
在DMSO中使用PO/RAC及DO為10至17(約6至10%醣抗原決定部位修飾)之活化多醣生成的軛合物顯示出在小鼠中具免疫原性(軛合物25及30)。其DO為2.9(約34%醣抗原決定部位修飾)或具有高的醣/蛋白質比(2.1)的軛合物(分別為軛合物26和27)顯示出免疫原性相對低。使用PO/RAC及唾液酸化程度(sialylation level)為81%(19%去唾液酸化(desialylated))之多醣所生成的軛合物顯示出具免疫原性(軛合物30)。然而，使用唾液酸化程度為58%(42%去唾液酸化)之多醣所生成之軛合物顯示出免疫原性較差(軛合物29)。當所有其他軛合物分子之特性相 似(分別，軛合物25和28)時，在DMSO中藉由PO/RAC生成的軛合物比起在水性介質中藉由PO/RAC生成之軛合物，稍微更具有免疫原性。結果顯示於表16。
Figure 105113585-A0202-12-0158-45
使用替代之軛合化學和軛合分子特性生成另外之軛合物變體(結果顯示於表17中)。軛合物31至35係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來製造具不司MW的軛合物而生成。軛合物36係藉由使多醣與羰基雙三唑(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。軛合物37係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將多醣氧化，再在DMSO中利用還原性胺化化學進行軛合來生成，詳見上述實施例3。所有這些軛合物均證明在小鼠中具免疫原性，這表示 除了過碘酸鹽氧化/還原性胺化化學外之替代軛合化學以及替代軛合物特性(諸如MW)的合適性(suitability)。與以DO為2.9(約34%醣抗原決定部位修飾)者生成的軛合物(上述表16中之軛合物26)相比較，使用其DO低至5(約20%醣抗原決定部位修飾)者生成的軛合物在小鼠中仍具免疫原性(表17中，軛合物32)。
Figure 105113585-A0202-12-0159-46
GBS血清型IV多醣-CRM197軛合物
使用PO/RAC及其DO為6.9至14.2(約7至14%醣抗原決定部位修飾(saccharide epitope modification))之活化多醣(activated polysaccharide)生成的軛合物顯示出在小鼠 中具免疫原性(immunogenic)(軛合物38至41)。使用PO/AC及其唾液酸化程度為60%(40%去唾液酸化)之多醣所生成之軛合物亦顯示出具免疫原性(軛合物41)。結果顯示於表18中。
Figure 105113585-A0202-12-0160-47
使用替代之軛合化學和軛合物分子特性生成另外之軛合物變體(conjugate variant)。結果顯示於表19中。軛合物42和45係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來生成，以製造分別具有高DO(較低氧化水平(oxidation level))及高SPR之軛合物。軛合物43係藉由使多醣與羰基雙三唑(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。軛合物44係係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將多醣氧化， 再在DMSO中利用還原性胺化化學進行軛合來生成，詳見上述實施例3。所有血清型IV軛合物均顯示出在小鼠中具免疫原性，這表示除了過碘酸鹽氧化/還原性胺化化學外之替代軛合化學以及軛合物特性諸如SPR的合適性。以DO(較低氧化)高達至少20(約5%醣抗原決定部位修飾)者生成的軛合物在小鼠中仍具有免疫原性。
Figure 105113585-A0202-12-0161-48
GBS血清型V多醣-CRM197軛合物
使用PO/RAC及其DO為4.4至14.6(約7至23%醣抗原決定部位修飾)之活化多醣生成的軛合物顯示出在小鼠中具免疫原性(軛合物46和47)。去唾液酸化(5%唾液酸化程度)之軛合物不具免疫原性(軛合物49)，而使用水性溶 劑，利用PO/RAC方法生成之軛合物產生弱免疫反應(軛合物48)。結果顯示於表20中。
Figure 105113585-A0202-12-0162-49
使用替代之軛合化學和軛合分子特性生成另外之軛合物變體。結果顯示於表21中。軛合物50和53係藉由PO/RAC並刻意改變軛合參數來生成，以製造分別具有較低唾液酸化程度(81%唾液酸化)和低分子量(MW)之軛合物。軛合物51係藉由使多醣與羰基雙三唑(CDT)反應並在DMSO中進行軛合反應來生成。軛合物52係藉由使用TEMPO試劑(代替過碘酸鈉)將多醣氧化，再在DMSO中利用還原性胺化化學進行軛合來生成，詳見上述實施例3。所有血清型V軛合物(除了使用CDT化學生成之軛合 物)均顯示出在小鼠中具免疫原性，這表示除了過碘酸鹽氧化/還原性胺化化學外之替代軛合化學以及軛合物特性諸如MW之合適性。與藉由RAC生成之其他軛合物相比較，使用CDT化學生成之軛合物顯示出明顯較弱之免疫原性。與>95%唾液酸化之軛合物(軛合物53)相比較，81%唾液酸化之軛合物(軛合物50)提供之免疫反應較弱，但較5%唾液酸化之軛合物(上述表20中之軛合物49)的反應強。
Figure 105113585-A0202-12-0163-50
實施例5：GBS III-CRM 197 和GBS V-CRM 197 單價軛合物疫苗在小鼠中產生OPA反應
在第0、3和6週經由皮下途徑以1微克(mcg)、0.1 微克或0.01微克之與CRM197軛合的B型鏈球菌(GBS)血清型III(GBS III-CRM197)、或與CRM197軛合之GBS血清型V(GBS V-CRM197)將雌性CD-1小鼠免疫化(immunize)三次。藉由調理吞噬分析(opsonophagocytic assay)(OPA)評估給藥三後(Post dose three)(PD3)血清。依實施例4中之描述進行OPA。二種軛合物均在小鼠中誘發OPA反應(表22)。不具有可檢測之OPA反應的樣本被指派為數值50。
Figure 105113585-A0202-12-0164-51
實施例6：GBS Ia-CRM 197 、GBS Ib-CRM 197 、GBS Ⅱ-CRM 197 、GBS Ⅲ-CRM 197 、GBS IV-CRM 197 、及GBS V-CRM 197 單價軛合物疫苗(Monovalent Conjugate Vaccine)在小鼠中產生OPA反應
在第0、3和6週經由皮下途徑以含有1微克與CRM197軛合的個別GBS莢膜多醣(CP)之疫苗為六組雌性CD-1小鼠進行免疫化三次。初步研究顯示出小鼠對所測試之六種血清型的任一型均不具有預先存在的OPA力價(pre-existing OPA titer)。藉由針對包含在該疫苗中之同源(cognate)GBS血清型的OPA分析來自PD3之血清。依實 施例4中之描述進行OPA。結果顯示於下列表23和24中。
Figure 105113585-A0202-12-0165-52
Figure 105113585-A0202-12-0165-53
注意：倍數上升(fold rise)之計算係假定小鼠不具有預先存在之力價。
實施例7：與從以GBS Ia-CRM 197 、GBS Ib-CRM 197 、GBS Ⅱ-CRM 197 、GBS Ⅲ-CRM 197 、GBS IV-CRM 197 和GBS V-CRM 197 單價軛合物疫苗免疫化的小鼠分離出之IgG相比較的血清調理素活性
在第0、3和6週經由皮下途徑以1微克之與CRM197軛合的個別GBS CP將雌性CD-1或BALB/c小鼠免疫化三次。使用AlPO4或QS-21作為佐劑。藉由血清型特異性OPA(serotype-specific OPA)測試PD3血清，然後分離出免疫球蛋白G部分(immunoglobulin G fraction)並測試OPA活性。將純化之IgG OPA活性標準化(normalize)為5mg/ml(在正常小鼠血清之IgG量的範圍內)。所有六種GBS CPS軛合物均誘發具有調理素活性(opsonic activity)的IgG抗體(第1圖)。
實施例8：GBS Ia-TT，GBS Ib-TT，GBS II-TT，GBS Ⅲ-TT，GBS IV-TT及GBS V-TT單價軛合物疫苗在兔子中產生OPA反應
以50mcg/ml之與破傷風類毒素軛合之GBS血清型Ia多醣、10mcg/ml之與破傷風類毒素(tetanus toxoid)軛合之GBS血清型Ib多醣、50mcg/ml之與破傷風類毒素軛合之GBS血清型Ⅱ多醣、50mcg/ml之與破傷風類毒素軛合之GBS血清型Ⅲ多醣、50mcg/ml之與破傷風類毒素軛合之GBS血清型IV多醣、或50mcg/ml之與破傷風類毒素軛合之GBS血清型V多醣將兔子免疫化三次，其中第一劑中係佐以(adjuvant)完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)，而第二和第三劑中係佐以(adjuvant)不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund’s Adjuvant)。該軛合物係使用其唾液酸量>95%之多醣及CDAP(四氟硼酸1-氰 基-4-二甲胺基吡啶(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate))化學製造。依實施例4中之描述藉由OPA測量PD3免疫反應。血清力價顯示於表25中，而純化之IgG力價顯示於下列表26中。與TT軛合之GBS血清型Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、IV及V多醣在兔子中具高度免疫原性。
Figure 105113585-A0202-12-0167-54
Figure 105113585-A0202-12-0167-55
實施例9：六價GBS軛合物疫苗在非人靈長類動物中產生OPA反應
在第0、4和8週經由肌肉內途徑(intramuscularly)以六價(hexavalent)B型鏈球菌(GBS6)疫苗將三組恆河猴(rhesus macaque)免疫化三次。GBS6疫苗包括GBS Ia- CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197。二組包括磷酸鋁(AlPO4)作為佐劑且投予5mcg之各軛合物或投予50mcg之各軛合物。第三組投予5mcg之各軛合物且不含佐劑。下列表27描述免疫化計劃表(immunization schedule)。
Figure 105113585-A0202-12-0168-56
藉由OPA分析免疫前血清(preimmune serum)及來自PD3之血清的包含於疫苗中之所有六種GBS血清型。依實施例4中之描述進行OPA。結果顯示於下列表28和29中。在所有六種血清型方面，添加磷酸鋁(AlPO4)佐劑之調配物引起可檢測之OPA反應(免疫前(pre)到PD3，力價增加；或上升倍數，免疫前/PD3(pre/PD3)>1)。未添加佐劑之5mcg/軛合物劑量引起對6種血清型中之5種血清型的可檢測之OPA反應。
Figure 105113585-A0202-12-0169-57
Figure 105113585-A0202-12-0169-58
實施例10：六價GBS軛合物疫苗在大鼠中產生OPA反應
經由皮下途徑(subcutaneously)，以5mcg/ml之在GBS6多醣軛合物疫苗(如實施例9中所調配，具有或不具有磷酸鋁(AlPO4))中的各軛合物將雌性史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)免疫化二次。評估免疫前(preimmune)(基線(baseline))和給藥後(post-dose)的二血清之針對所有六種同源(cognate)GBS血清型的OPA分析力價(OPA assay titer)。在GBS 384孔分析程序(GBS 384 well assay format)中測量各血清型之OPA力價並計算上升倍數(fold rise)。投予GBS6疫苗之大鼠在第二劑後具有對每種血清型之強大的功能性抗體反應(functional antibody response)；當無AlPO4存在時，在血清型間可見到增加7至205倍，而存有AlPO4時，此範圍係在11至294倍(表 30)。
Figure 105113585-A0202-12-0170-59
實施例11：以單價或六價GBS糖軛合物疫苗免疫化之懷孕雌親顯示出使其後代在出生後免於GBS Ⅲ或V感染的保護作用
經由皮下途徑以如實施例9中所描述之含有5mcg/ml各軛合物及100mcg/ml AlPO4的GBS6疫苗、GBS III或V單價糖軛合物疫苗(monovalent glycoconjugate vaccine)(各含有10mcg/ml之軛合物及100mcg/ml之AlPO4)、或單獨之載劑對照組(vehicle control alone)將雌性CD-1小鼠免疫化三次。在第三次免疫化前孕育(breed)小鼠。根據所接受之疫苗，以GBS血清型Ⅲ或GBS血清型V細菌之致死劑量(lethal dose)挑戰(challenge)免疫化之小鼠的後代，並監控存活情況90小時。以GBS6+AlPO4或GBS III-CRM197+AlPO4免疫化之雌親(dam)提供其幼鼠顯著的保護(p<0.0001)來對抗致命之GBS血清型Ⅲ挑戰。同樣地，以GBS V-CRM197+AlPO4免疫化之雌親(dam)提供其幼鼠顯著的保護(p<0.0001)對抗致命之GBS血清型V挑戰 (lethal GBS serotype V challenge)。結果顯示於表31中。
Figure 105113585-A0202-12-0171-60
實施例12：GBS III單株抗體在幼鼠內之被動免疫(Passive Immunization)顯示出保護作用
以包括血清型Ia、Ib、II、III、及V之五價疫苗將小鼠免疫化以生成B型鏈球菌血清型III(GBS III)單株抗體(mAb)。選擇GBS III-特異性mAb選殖株(GBS III-specific mAb clone)，並使用標準程序生成識別GBS III之CP的mAb。以臨床GBS III分離株(clinical GBS III isolate)挑戰前16小時，將GBS血清型III mAb被動投予幼鼠(每組n=10；顯示2個獨立實驗)。挑戰後四小時採血並計算所餘CFU(remaining CFU)。以GBS III mAb治療可降低幼鼠中回收之CFU(recovered CFU)達4 log或更高(見表32)。
Figure 105113585-A0202-12-0172-61
實施例13：GBS Ib、III和V單株抗體在懷孕小鼠內之被動免疫顯示出對其出生後之後代的保護作用
使用標準程序從以五價疫苗(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197和GBS V-CRM197)免疫化之小鼠產生單株抗體(mAb)。然後，確認mAb可特異識別(specifically recognizing)該5種血清型中各血清型之莢膜多醣。在懷孕小鼠分娩前約24至48小時，將500mcg/ml劑量之GBS血清型Ib(GBS Ib)mAb、GBS血清型III(GBS III)mAb、GBS血清型V(GBS V)mAb、或同型匹配(isotype-matched)之對照mAb被動投予該懷孕小鼠。出生後24至48小時，以GBS Ib、GBS III或GBS V細菌之致死劑量挑戰經免疫化之雌親鼠的後代。監控存活情況96小時。與以對照mAb免疫化者相比較，以GBS Ib mAb、GBS III mAb、或GBS V mAb免疫化之雌親所生育之幼鼠在以GBS挑戰後的存活率顯著較高(見表33)。
Figure 105113585-A0202-12-0173-62
實施例14：GBS軛合物之穩定性
於不同pH水平，在10mM琥珀酸鹽-磷酸鹽和155mM NaCl中個別配製GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197，以測試軛合物在加速儲存條件(accelerated storage condition)下之穩定性。分子量之百分比變化(藉由SEC MALLS測定)係在50℃儲存4週後測量。結果顯示於第2至7圖中。
在表34中顯示各種緩衝條件下測試GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS III-CRM197、及GBS IV-CRM197軛合物之唾液酸化穩定性。在37℃儲存1個月後，使用HPLC測量游離唾液酸(free sialic acid)(N-乙醯基神經胺酸(N acetyl neuraminic acid)；NANA)。結果顯示於第8圖中。
二個研究表明該軛合物在pH 6.0以上表現較佳，且最理想係在約pH 6.5。
Figure 105113585-A0202-12-0174-63
實施例15：GBS6調配物
為了測定緩衝劑之選擇，使用如上述表33所示之相同緩衝條件一起調配GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197(GBS6)。在下列時間點測試該等調配物之實際pH：0(製造調配物時)、在5℃ 1個月後、在25℃ 1個月後、及在37℃ 1個月後。可於使用琥珀鹽作為緩衝劑的調配物見到pH轉變，而於使用組胺酸作為緩衝劑的調配物則未見到轉變。結果顯示於第9至10圖中。
亦測試組胺酸緩衝劑濃度對GBS軛合物與鋁結合之效果。以二種不同濃度之軛合物(10mcg/ml和40mg/ml之各血清型)和數種不同濃度之組胺酸測試包括150mM NaCl、pH 6.5之0.01%聚山梨醇酯-80及0.5mg/ml之為AlPO4的鋁之調配物。藉由測量疫苗中各軛合物之總量及與鋁結合之各軛合物的量來測定與鋁結合之軛合物的百分比。藉由下述步驟測量經結合的軛合物：將疫苗調配物離心，重新懸浮鋁團塊(aluminum pellet)，溶解鋁，並使用比濁法(nephelometry)以抗各血清型之血清型特異性多株抗體(serotype-specific polycolonal antibody)測量經結合的軛合物。結果顯示於第11至12圖中。結果發現組胺酸緩衝劑之濃度會影響各血清型與鋁結合之百分比，此影響在較低劑量時比較高劑量時更為明顯。
進行攪拌研究(agitation study)以測定理想之聚山梨醇酯-80(PS80)的量。測試包括20mM組胺酸，150mM NaCl，0.5mg/ml AlPO4(若存在時)，及或者不含PS80、或者含0.01% PS80、0.02% PS80、或0.03% PS80(pH 6.5)的GBS6調配物在攪拌壓力(agitation stress)下之總抗原性損失(total antigenicity lost)百分比。將預先填充了調配物之注射器(syringe)在室溫、500RPM下攪拌72小時。對照組樣本(未經攪拌)係在室溫儲存72小時。結果顯示於第13圖中。
亦研究GBS6調配物中之鋁濃度以測定其對GBS軛合物結合至鋁的影響。對包括10mM組胺酸，150mM NaCl，0.02% PS80，及0.25mg/ml、或0.5mg/ml、或0.75mg/ml、或1.0mg/ml之為磷酸鋁(AlPO4)的鋁(pH 6.5)之GBS6調配物測試與鋁結合的軛合物之百分比。與 AlPO4結合之百分比隨著AlPO4濃度的增加而增加。結果顯示於第14圖中。
實施例16：GBS6冷凍乾燥調配物
測試GBS6之各種冷凍乾燥調配物(GBS Ia-CRM197、GBS Ib-CRM197、GBS II-CRM197、GBS III-CRM197、GBS IV-CRM197、及GBS V-CRM197)的穩定性(stability)。將包括20mM組胺酸(pH 6.5)、0.02% PS80、約28mM NaCl，及5.5%、或7.0%、或8.5%(w/v)之蔗糖的低(10mcg/ml)和高(50mcg/ml)劑量調配物冷凍乾燥。在5℃ 4個月、在37℃ 4個月、及在50℃ 1個月後，測量pH及水分(moisture)以測試冷凍乾燥調配物之穩定性。根據pH和水分(未顯示出數據)判斷，所有調配物均穩定。此外，測試所有調配物在5℃和37℃ 1、4和9個月後以及在50℃ 1、2和4週後各血清型之抗原性回復(antigenicity recovery)百分比。結果顯示於第15至20圖中。
亦製備並評估用於40mcg/ml劑量的GBS6調配物之賦形劑的下列變化：1)7%(w/v)蔗糖，2)2%(w/v)蔗糖和4%(w/v)甘露糖醇，3)3%(w/v)蔗糖和3%(w/v)甘露糖醇，4)2%(w/v)蔗糖和4%(w/v)甘胺酸，或5)3%(w/v)蔗糖和3%(w/v)甘胺酸。所有五種調配物在5℃ 3個月、25℃ 3個月、37℃ 3個月、及50℃ 1個月後其pH和水分(moisture)均穩定(數據未顯示)。此外，測試所有調配物在52-8℃、25℃和37℃ 1、3和7個月後，及在50℃ 1、2 和4週後之各血清型之抗原性回復的百分比。結果顯示於第21至25圖中。
使用比濁法測試在配置之冷凍乾燥調配物(reconstituted lyophilized formulation)和液體調配物(liquid formulation)中的GBS6疫苗之與磷酸鋁佐劑結合的抗原之百分比。製備低劑量(10mcg/ml)和高劑量(50mcg/ml)之含有20mM組胺酸、0.02% PS80、7.0%(w/v)蔗糖、及500mcg/ml為磷酸鋁的鋁之冷凍乾燥和液體調配物。亦測試改變之氯化鈉(NaCl)濃度以測定對抗原結合(antigen binding)的影響。冷凍乾燥調配物和液體調配物的結果分別顯示於表35和36中。當使用約150mM或更高之NaCl濃度時，冷凍乾燥和液體組成物兩者之低劑量調配物具有彼此相當的結果。
Figure 105113585-A0202-12-0177-64
Figure 105113585-A0202-12-0178-65
本發明之態樣
下列各項描述本發明之另外的實施態樣：
C1. 免疫原性多醣-蛋白質軛合物，其包含B型鏈球菌(GBS)莢膜多醣和載體蛋白，其中，該莢膜多醣之唾液酸量高於約60%。
C2. 如C1之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣係選自由下列所組成之群組：血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及IX。
C3. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型Ia。
C4. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型Ib。
C5. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型II。
C6. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型III。
C7. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型IV。
C8. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型V。
C9. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型VI。
C10. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型VII。
C11. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型VIII。
C12. 如C2之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣為血清型IX。
C13. 如C1至C12中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之唾液酸量高於約95%。
C14. 如C1至C13中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之唾液酸量為約100%。
C15. 如C1至C14中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.6mM之唾液酸。
C16. 如C1至C15中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.65mM之唾液酸。
C17. 如C1至C16中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.7mM之唾 液酸。
C18. 如C1至C17中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.75mM之唾液酸。
C19. 如C1至C18中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.8mM之唾液酸。
C20. 如C1至C19中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.85mM之唾液酸。
C21. 如C1至C20中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.9mM之唾液酸。
C22. 如C1至C21中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.95mM之唾液酸。
C23. 如C1至C22中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之分子量為約5kDa至約1,000kDa。
C24. 如C1至C23中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之分子量為約25kDa至約750kDa。
C25. 如C1至C24中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之分子量為約25kDa至約400kDa。
C26. 如C1至C25中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之分子量為約25kDa至約200kDa。
C27. 如C1至C25中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之分子量為約100kDa至約400kDa。
C28. 如C1至C27中任一項之免疫原性軛合物，其中，該軛合物之分子量為約300kDa至約20,000kDa。
C29. 如C1至C28中任一項之免疫原性軛合物，其中，該軛合物之分子量為約1,000kDa至約15,000kDa。
C30. 如C1至C29中任一項之免疫原性軛合物，其中，該軛合物之分子量為約1,000kDa至約10,000kDa。
C31. 如C1至C30中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣係約0%至約40% O-乙醯化。
C32. 如C1至C31中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約5%。
C33. 如C1至C32中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約4%。
C34. 如C1至C33中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約3%。
C35. 如C1至C34中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約2%。
C36. 如C1至C35中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約1%。
C37. 如C1至C36中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括至少約0.1mM O-醋酸酯。
C38. 如C1至C37中任一項之免疫原性軛合物，其 中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括至少約0.2mM O-醋酸酯。
C39. 如C1至C38中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括至少約0.3mM O-醋酸酯。
C40. 如C1至C39中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括至少約0.35mM O-醋酸酯。
C41. 如C1至C40中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括約0.4mM O-醋酸酯。
C42. 如C1至C41中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.01mM O-醋酸酯。
C43. 如C1至C42中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.05mM O-醋酸酯。
C44. 如C1至C43中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.04mM O-醋酸酯。
C45. 如C1至C44中任一項之免疫原性軛合物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.03mM O-醋酸酯。
C46. 如C1至C45中任一項之免疫原性軛合物，其 中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中包括少於約0.02mM O-醋酸酯。
C47. 如C1至C46中任一項之免疫原性軛合物，其中，該多醣各自獨立地與載體蛋白軛合。
C48. 如C1至C47中任一項之免疫原性軛合物，其中，該載體蛋白為CRM197或破傷風類毒素。
C49. 如C1至C48中任一項之免疫原性軛合物，其中，該載體蛋白為CRM197。
C50. 分離莢膜多醣之方法，其包括使有機試劑與包含莢膜多醣製造細菌之細胞培養液(cell broth)反應。
C51. 如C50之方法，其中，該細菌係未經溶解(not lysed)的。
C52. 如C50或51之方法，其中，該細菌係經熱滅殺的(heat killed)。
C53. 如C50至52中任一項之方法，其中，該方法進一步包括離心步驟以提供細胞糊狀物(cell paste)。
C54. 如C50至53中任一項之方法，其中，該方法進一步包括過濾步驟。
C55. 如C54之方法，其中，該過濾步驟為濾析(diafiltration)。
C56. 如C50至55中任一項之方法，其中，該莢膜多醣製造細菌係選自由下列所組成之群組：無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腦 膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、傷寒沙門桿菌(Salmonella typhi)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
C57. 如C56之方法，其中，該細菌為無乳鏈球菌。
C58. 如C50至57中任一項之方法，其中，該有機試劑為衍生之羥胺化合物(derivatized hydroxyl amine compound)。
C59. 如C50至58中任一項之方法，其中，羥胺為實施例2之表2中所列之任何羥胺。
C60. 如C50至59中任一項之方法，其中，羥胺係選自由下列所組成之群組：二苄基羥胺(dibenzyl hydroxylamine)；二乙基羥胺(diethyl hydroxylamine)；羥胺(hydroxylamine)；乙二胺(ethylenediamine)；三伸乙四胺(triethylenetetramine)；1,1,4,7,10,10六甲基三伸乙四胺(1,1,4,7,10,10 hexamethyl triethylene tetramine)；及2,6,10,三甲基2,6,10三氮雜十一烷(2,6,10,Trimethyl 2,6,10 triazaundecane)。
C61. 如C50至C60中任一項之方法，其中，羥胺之濃度為約5mM至約200mM。
C62. 如C50至C61中任一項之方法，其中，反應之pH為約5.5至約9.5。
C63. 如C50至C62中任一項之方法，其中，反應係 在約20℃至約85℃之溫度進行。
C64. 如C50至C63中任一項之方法，其中，反應時間為約10小時至約90小時。
C65. 製造如C1至C49中任一項之免疫原性多醣-蛋白質軛合物之方法，其中，該莢膜多醣係根據如C50至C64中任一項之方法分離。
C66. 免疫原性多醣-蛋白質軛合物，其包括藉由如C50至C64中任一項之方法製造之莢膜多醣。
C67. 免疫原性組成物，其包括如C1至C49或C66中任一項之免疫原性多醣-蛋白質軛合物。
C68. 免疫原性組成物，其包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自B型鏈球菌(GBS)血清型IV及至少一種另外之血清型的莢膜多醣，該另外之血清型係選自由下列所組成之群組：Ia、Ib、II、III、V、VI、VII、VIII及IX。
C69. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為Ia。
C70. 如C69之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型Ib之莢膜多醣的軛合物。
C71. 如C69或C70之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型II之莢膜多醣的軛合物。
C72. 如C69至C71中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型III之莢膜 多醣的軛合物。
C73. 如C69至C72中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型V之莢膜多醣的軛合物。
C74. 如C69至C73中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VI之莢膜多醣的軛合物。
C75. 如C69至C74中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C76. 如C69至C75中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C77. 如C69至C76中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C78. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為Ib。
C79. 如C78之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型II之莢膜多醣的軛合物。
C80. 如C78或C79之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型III之莢膜多醣的軛合物。
C81. 如C78至C80中任一項之免疫原性組成物，其 中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型V之莢膜多醣的軛合物。
C82. 如C78至C81中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VI之莢膜多醣的軛合物。
C83. 如C78至C82中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C84. 如C78至C83中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C85. 如C78至C84中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C86. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為II。
C87. 如C86之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型III之莢膜多醣的軛合物。
C88. 如C86或C87之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型V之莢膜多醣的軛合物。
C89. 如C86至C88中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VI之莢膜多醣的軛合物。
C90. 如C86至C89中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C91. 如C86至C90中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C92. 如C86至C91中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C93. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為III。
C94. 如C93之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型V之莢膜多醣的軛合物。
C95. 如C93或C94之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VI之莢膜多醣的軛合物。
C96. 如C93至C95中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C97. 如C93至C96中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C98. 如C93至C97中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜 多醣的軛合物。
C99. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為V。
C100. 如C99之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VI之莢膜多醣的軛合物。
C101. 如C99或C100中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C102. 如C99至C101中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C103. 如C99至C102中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C104. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為VI。
C105. 如104之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VII之莢膜多醣的軛合物。
C106. 如C104或C105中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C107. 如C104至C106中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX 之莢膜多醣的軛合物。
C108. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為VII。
C109. 如C108之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型VIII之莢膜多醣的軛合物。
C110. C108或C109中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C111. 如C68之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為VIII。
C112. 如C111之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括含有來自GBS血清型IX之莢膜多醣的軛合物。
C113. 如C112之免疫原性組成物，其中，該至少一種另外之血清型為IX。
C114. 免疫原性組成物，其包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自GBS血清型Ia、Ib、II、III及IV之莢膜多醣。
C115. 免疫原性組成物，其包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自GBS血清型Ia、Ib、II、III及V之莢膜多醣。
C116. 免疫原性組成物，其包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自GBS血清型Ia、Ib、II、 III、IV及V之莢膜多醣。
C117. 包括多醣-蛋白質軛合物之免疫原性組成物，該多醣-蛋白質軛合物包含至少四種選自由下列所組成之群組的GBS莢膜多醣血清型：Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及IX。
C118. 如C117之免疫原性組成物，其中，該組成物包括至少五種GBS莢膜多醣血清型。
C119. 如C117或C118之免疫原性組成物，其中，該組成物包括至少六種GBS莢膜多醣血清型。
C120. 如C117至C119中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括至少七種GBS莢膜多醣血清型。
C121. 如C117至C120中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括至少八種GBS莢膜多醣血清型。
C122. 如C117至C121中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括至少九種GBS莢膜多醣血清型。
C123. 如C117至C122中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括GBS莢膜多醣血清型V。
C124. 如C117至C123中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物不具有免疫干擾(immune interference)。
C125. 如C67至C124中任一項之免疫原性組成物， 其中，該組成物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑、穩定劑、佐劑、冷凍保護劑(cryoprotectant)、鹽、二價陽離子、非離子性洗滌劑、自由基氧化抑制劑、載體、或彼等之混合物。
C126. 如C67至C125中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括緩衝劑。
C127. 如C126之免疫原性組成物，其中，該緩衝劑係選自由下列所組成之群組：HEPES、PIPES、MES、Tris(胺基丁三醇(trimethamine))、磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸及琥珀酸鹽。
C128. 如C127之免疫原性組成物，其中，該緩衝劑為組胺酸。
C129. 如C67至C128中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括界面活性劑。
C130. 如C129之免疫原性組成物，其中，該界面活性劑係選自由下列所組成之群組：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-20、及聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)。
C131. 如C130之免疫原性組成物，其中，該界面活性劑為聚山梨醇酯-80。
C132. 如C67至C131中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括賦形劑。
C133. 如C132之免疫原性組成物，其中，該賦形劑 係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、棉子糖、水蘇糖(stachyose)、松三糖(melezitose)、聚葡萄糖(dextran)、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、巴糖醇(palatinit)、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。
C134. 如C133之免疫原性組成物，其中，該賦形劑為氯化鈉。
C135. 如C67至C134中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括佐劑。
C136. 如C135之免疫原性組成物，其中，該佐劑為鋁系佐劑或QS-21。
C137. 如C136之免疫原性組成物，其中，該鋁系佐劑係選自由下列所組成之群組：磷酸鋁、羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyl phosphate)及氫氧化鋁。
C138. 如C137之免疫原性組成物，其中，該佐劑為磷酸鋁。
C139. 如C138之免疫原性組成物，其中，該佐劑為羥基磷酸鋁。
C140. 如C67至C139中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括緩衝劑、界面活性劑、賦形劑及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。
C141. 如C67至C140中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括組胺酸、聚山梨醇酯-80、NaCl、及視需要之磷酸鋁，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。
C142. 如C67至C141中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約10mM至約25mM之組胺酸、約0.01%至約0.03%(v/w)之聚山梨醇酯-80、約10mM至約250mM之NaCl、及視需要之約0.25mg/ml至約0.75mg/ml之為磷酸鋁的鋁。
C143. 如C67至C142中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約5mcg/ml至約50mcg/ml之劑量。
C144. 如C67至C143中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物視需要地在至少一種賦形劑的存在下，經冷凍乾燥。
C145. 如C144之免疫原性組成物，其中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇、巴糖醇、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。
C146. 如C145之免疫原性組成物，其中，該至少一種賦形劑為蔗糖。
C147. 如C144至C146中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之至少一種賦形劑。
C148. 如C144至C147中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括另外之賦形劑。
C149. 如C148之免疫原性組成物，其中，該另外之賦形劑為甘露糖醇或甘胺酸。
C150. 如C148或C149之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之另外的賦形劑。
C151. 如C143至C150中任一項之免疫原性組成物，其中，該組成物係以水、注射用水(WFI)、佐劑懸浮液、或鹽水配置。
C152. 如C67至C151中任一項之免疫原性組成物，用於作為藥物。
C153. 如C67至C152中任一項之免疫原性組成物，用於誘發個體對GBS之免疫反應的方法中。
C154. 如C153之免疫原性組成物，其中，該個體為計劃懷孕的女性或懷孕的女性。
C155. 如C154之免疫原性組成物，其中，該女性係在其懷孕後半期。
C156. 如C155之免疫原性組成物，其中，該懷孕女性至少在妊娠20週。
C157. 如C156之免疫原性組成物，其中，該懷孕女性係在妊娠27週至36週。
C158. 如C157之免疫原性組成物，其中，該個體為50歲或更年長之成人。
C159. 如C158之免疫原性組成物，其中，該個體為65歲或更年長之成人。
C160. 如C159之免疫原性組成物，其中，該個體為85歲或更年長之成人。
C161. 如C153至C160中任一項之免疫原性組成物，其中，該個體係免疫功能低下(immunocompromised)。
C162. 如C161之免疫原性組成物，其中，該個體具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病或肝臟疾病。
C163. 如C153至C162中任一項之免疫原性組成物，其中，該B型鏈球菌為無乳鏈球菌。
C164. 誘發對B型鏈球菌之免疫反應的方法，其包含投予個體有效量之如C67至C150中任一項之免疫原性組成物。
C165. 預防或減少個體中與B型鏈球菌相關之疾病或狀況的方法，其包含投予個體有效量之如67至C151中任一項之免疫原性組成物。
C166. 如C164或C165之方法，其中，該個體為計劃懷孕的女性或懷孕的女性。
C167. 如C166之方法，其中，該女性係在其懷孕後半期。
C168. 如C166或C167之方法，其中，該懷孕女性 至少在妊娠20週。
C169. 如C166至C168中任一項之方法，其中，該懷孕女性係在妊娠27週至36週。
C170. 如C164或C165之方法，其中，該個體為50歲或更年長之成人。
C171. 如C170之方法，其中，該個體為成人65歲或更年長之成人。
C172. 如C170或C171之方法，其中，該個體為85歲或更年長之成人。
C173. 如C164至C172中任一項之方法，其中，該個體係免疫功能低下。
C174. 如C173之方法，其中，該個體具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病、或肝臟疾病。
C175. 如C164至C174中任一項之方法，其中，該B型鏈球菌為無乳鏈球菌。
C176. 抗體，其係結合至如C1至C49或C66中任一項之免疫原性軛合物中之莢膜多醣。
C177. 組成物，其包括如C176之抗體。
C178. 製造抗體之方法，其包括投予個體如C67至C151中任一項之免疫原性組成物。
C179. 抗體，其係藉由如C178之方法產生。
C180. 賦予個體被動免疫力之方法，其包括下列步驟： (a)使用如C67至C151中任一項之免疫原性組成物產生抗體製劑；以及(b)投予個體該抗體製劑以賦予被動免疫力。
C181. 製造如C1至C49或C66中任一項之免疫原性多醣-蛋白質軛合物的方法，其包括下列步驟：(a)使GBS莢膜多醣與氧化劑反應，以產生經活化之多醣；(b)使該經活化之多醣與載體蛋白反應以產生多醣-蛋白質軛合物。
C182. 如C181之方法，其中，步驟(b)係在極性非質子性溶劑中進行。
C183 如C182之方法，其中，該溶劑係選自由下列所組成之群組：二甲亞碸(DMSO)、環丁碸(sulfolane)、二甲基甲醯胺(DMF)及六甲基磷醯三胺(hexamethylphosporamide)(HMPA)。
C184. 如C183之方法，其中，該溶劑為二甲基亞碸(DMSO)。
C185. 如C181至C184中任一項之方法，其中，該多醣係與0.01至10.0莫耳當量之氧化劑反應。
C186. 如C181至C185中任一項之方法，其中，該氧化劑為過碘酸鹽。
C187. 如C186之方法，其中，該過碘酸鹽為過碘酸鈉。
C188. 如C181至C187中任一項之方法，其中，該 步驟(a)之氧化反應為1小時至50小時。
C189. 如C181至C188中任一項之方法，其中，氧化反應之溫度係保持在約2℃至約25℃。
C190. 如C181至C189中任一項之方法，其中，氧化反應係在選自由下列所組成之群組的緩衝劑中進行：磷酸鈉、磷酸鉀、2-(N-味啉基)乙磺酸(MES)及Bis-Tris。
C191. 如C190之方法，其中，該緩衝劑之濃度係約1mM至約500mM。
C192. 如C181至C191中任一項之方法，其中，氧化反應係在pH約4.0至約8.0進行。
C193. 如C181之方法，其中，該氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物(TEMPO)。
C194. 如C193之方法，其中N-氯琥珀醯亞胺(NCS)為共同氧化劑。
C195. 如C181至C194中任一項之方法，其中，步驟(a)進一步包含藉由加入淬滅劑來淬滅氧化反應。
C196. 如C182至C195中任一項之方法，其中，該多醣之濃度為約0.1mg/mL至約10.0mg/mL。
C197. 如C181至C196中任一項之方法，其中，該經活化之多醣的氧化程度為5至25。
C198. 如C181至C197中任一項之方法，其中，該方法進一步包括冷凍乾燥該經活化之多醣的步驟。
C199. 如C188之方法，其中，該經活化之多醣係在選自由下列所組成之群組的醣之存在下被冷凍乾燥：蔗 糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇和巴糖醇。
C200. 如C181至C199中任一項之方法，其中，步驟(b)包含：(1)混合該經活化之多醣與載體蛋白，以及(2)使經混合的經活化之多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物。
C201. 如C200之方法，其中，步驟(2)中之經活化之多醣的濃度為約0.1mg/mL至約10.0mg/mL。
C202. 如C200或C201之方法，其中，該經活化之多醣對載體蛋白之初始比率(重量/重量)為約5：1至0.1：1。
C203. 如C200至C202中任一項之方法，其中，該還原劑係選自由下列所組成之群組：氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)、三乙醯氧基硼氫化鈉(sodium triacetoxyborohydride)、在布忍斯特酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)存在下的硼氫化鈉和硼氫化鋅、吡啶硼烷(pyridine borane)、2-甲吡啶硼烷(2-picoline borane)、2,6-二硼烷-甲醇(2,6-diborane-methanol)、二甲胺-硼烷(dimethylamine-borane)、t-BuMeiPrN-BH3、苄胺-BH3或5-乙基-2-甲吡啶硼烷(5-ethyl-2-methylpyridine borane)(PEMB)。
C204. 如C203之方法，其中，該還原劑為氰基硼氫化鈉。
C205. 如C200至C204中任一項之方法，其中，該還原劑之量為約0.1至約10.0莫耳當量。
C206. 如C200至C205中任一項之方法，其中，步驟(2)之還原反應的持續時間為1小時至60小時。
C207. 如C200至C206中任一項之方法，其中，還原反應之溫度係保持在10℃至40℃。
C208. 如C181至C207中任一項之方法，其中，該方法進一步包括藉由添加硼氫化物來將未反應之醛封端的步驟(步驟(c))。
C209. 如C208之方法，其中，該硼氫化物之量為約0.1至約10.0莫耳當量。
C210. 如C208之方法，其中，該硼氫化物係選自由下列所組成之群組：硼氫化鈉(NaBH4)、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、四丁基硼氫化銨(tetrabutylammonium borohydride)、硼氫化鈣及硼氫化鎂。
C211. 如C292之方法，其中，該硼氫化物為硼氫化鈉(NaBH4)。
C212. 如C207至C211中任一項之方法，其中，封端步驟之持續時間為0.1至10小時。
C213. 如C207至C212中任一項之方法，其中，封端步驟之溫度係保持在約15℃至約45℃。
C214. 如C181至C213中任一項之方法，其中，該方法進一步包括純化該多醣-蛋白質軛合物之步驟。
C215. 如C181至C214中任一項之方法，其中，該多醣-蛋白質軛合物包含與多醣之總量相較下為少於約40%之游離多醣。
C216. 如C181至C215中任一項之方法，其中，該軛合物中之多醣對載體蛋白之比率(重量/重量)為約0.5至約3.0。
C217. 如C181至C216中任一項之方法，其中，該軛合物之軛合程度為2至15。
C218. 製造多醣-蛋白質軛合物之方法，其包括下列步驟：(a)使經分離之GBS莢膜多醣與氧化劑反應；(b)藉由加入淬滅劑來淬滅步驟(a)之氧化反應以產生經活化之GBS莢膜多醣；(c)混合該經活化之GBS莢膜多醣與載體蛋白，(d)使經混合的活化之GBS莢膜多醣和載體蛋白與還原劑反應以形成GBS莢膜多醣-載體蛋白軛合物，以及(e)藉由加入硼氫化鈉(NaBH4)來將未反應之醛封端，其中，步驟(c)和(d)係在DMSO中進行。

Claims (53)

  1. 一種免疫原性組成物，其包括多醣-蛋白質軛合物，其中，該軛合物包含來自B型鏈球菌(GBS)血清型Ia、Ib、II、III、IV及V之莢膜多醣和載體蛋白，其中，各莢膜多醣之唾液酸量為約60%至100%。
  2. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該GBS莢膜多醣於每mM多醣中具有至少約0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95mM之唾液酸。
  3. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該GBS莢膜多醣之分子量係約5kDa至約1,000kDa、約25kDa至約750kDa、約25kDa至約400kDa、約25kDa至約200kDa、或約100kDa至約400kDa。
  4. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，各該軛合物之分子量係約300kDa至約20,000kDa、約1,000kDa至約15,000kDa、或約1,000kDa至約10,000kDa。
  5. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化(O-acetylated)係約0%至約40%。
  6. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該莢膜多醣之O-乙醯化係少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%、或少於約1%。
  7. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中具有至少約0.1、0.2、0.3、0.35或約0.4mM O-醋酸酯(O-acetate)。
  8. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該莢膜多醣於每mM醣重複單元中具有少於約0.01、0.02、0.03、0.04、或0.05mM O-醋酸酯。
  9. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該載體蛋白為CRM197、或破傷風類毒素(tetanus toxoid)。
  10. 如申請專利範圍第9項之免疫原性組成物，其中，該載體蛋白為CRM197。
  11. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑、緩衝劑、穩定劑、佐劑、冷凍保護劑(cryoprotectant)、鹽、二價陽離子、非離子性洗滌劑、自由基氧化抑制劑、載體、或彼等之混合物。
  12. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括緩衝劑。
  13. 如申請專利範圍第12項之免疫原性組成物，其中，該緩衝劑係選自由下列所組成之群組：HEPES、PIPES、MES、Tris(胺基丁三醇(trimethamine))、磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸及琥珀酸鹽。
  14. 如申請專利範圍第13項之免疫原性組成物，其中，該緩衝劑為組胺酸。
  15. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括界面活性劑。
  16. 如申請專利範圍第15項之免疫原性組成物，其 中，該界面活性劑係選自由下列所組成之群組：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-20、及聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)。
  17. 如申請專利範圍第16項之免疫原性組成物，其中，該界面活性劑為聚山梨醇酯-80。
  18. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括賦形劑。
  19. 如申請專利範圍第18項之免疫原性組成物，其中，該賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、棉子糖、水蘇糖(stachyose)、松三糖(melezitose)、聚葡萄糖(dextran)、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、巴糖醇(palatinit)、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯(glycerol monostearate)、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。
  20. 如申請專利範圍第19項之免疫原性組成物，其中，該賦形劑為氯化鈉。
  21. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物進一步包括佐劑。
  22. 如申請專利範圍第21項之免疫原性組成物，其中，該佐劑為鋁系佐劑或QS-21。
  23. 如申請專利範圍第22項之免疫原性組成物，其中，該鋁系佐劑係選自由下列所組成之群組：磷酸鋁、羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyl phosphate)及氫氧化鋁。
  24. 如申請專利範圍第23項之免疫原性組成物，其中，該佐劑為磷酸鋁。
  25. 如申請專利範圍第23項之免疫原性組成物，其中，該佐劑為羥基磷酸鋁。
  26. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括緩衝劑、界面活性劑、賦形劑、及視需要之佐劑，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。
  27. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括組胺酸、聚山梨醇酯-80、氯化鈉、及視需要之磷酸鋁，其中，該組成物係緩衝成pH為約6.0至約7.0。
  28. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約10mM至約25mM之組胺酸、約0.01%至約0.03%(v/w)之聚山梨醇酯-80、約10mM至約250mM之氯化鈉、及視需要之約0.25mg/ml至約0.75mg/ml之為磷酸鋁的鋁。
  29. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約5mcg/ml至約50mcg/ml之劑量。
  30. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物，視需要地在至少一種賦形劑的存在下，經 冷凍乾燥。
  31. 如申請專利範圍第30項之免疫原性組成物，其中，該至少一種賦形劑係選自由下列所組成之群組：澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露糖醇、乳糖醇、巴糖醇、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、甘胺酸、精胺酸、離胺酸、氯化鈉(NaCl)、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、及乙醇。
  32. 如申請專利範圍第31項之免疫原性組成物，其中，該至少一種賦形劑為蔗糖。
  33. 如申請專利範圍第30項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之至少一種賦形劑。
  34. 如申請專利範圍第30項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括另外之賦形劑。
  35. 如申請專利範圍第34項之免疫原性組成物，其中，該另外之賦形劑為甘露糖醇、或甘胺酸。
  36. 如申請專利範圍第34項之免疫原性組成物，其中，該組成物包括約1%(w/v)至約10%(w/v)之另外之賦形劑。
  37. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，其中，該組成物係以水、注射用水(WFI)、佐劑懸浮液或鹽水配置(reconstitute)。
  38. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，用於 作為藥物。
  39. 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物，用於誘發個體對GBS之免疫反應的方法中。
  40. 如申請專利範圍第39項之免疫原性組成物，其中，該個體為計劃懷孕的女性或懷孕的女性。
  41. 如申請專利範圍第40項之免疫原性組成物，其中，該女性係在其懷孕後半期，至少在妊娠20週、或在妊娠27週至36週。
  42. 如申請專利範圍第39項之免疫原性組成物，其中，該個體為50歲或更年長之成人、65歲或更年長之成人、或85歲或更年長之成人。
  43. 如申請專利範圍第39項之免疫原性組成物，其中，該個體係免疫功能低下(immunocompromised)。
  44. 如申請專利範圍第43項之免疫原性組成物，其中，該個體具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病、或肝臟疾病。
  45. 如申請專利範圍第39項之免疫原性組成物，其中，該B型鏈球菌為無乳鏈球菌。
  46. 一種如申請專利範圍第1至37項中任一項之免疫原性組成物之用途，係用於製造用於誘發個體對B型鏈球菌之免疫反應的藥物。
  47. 一種如申請專利範圍第1至37項中任一項之免疫原性組成物之用途，係用於製造用於預防或減輕個體之與 B型鏈球菌相關之疾病或狀況的藥物。
  48. 如申請專利範圍第46或47項之用途，其中，該個體為計劃懷孕的女性或懷孕的女性。
  49. 如申請專利範圍第48項之用途，其中，該女性係在其懷孕後半期，至少在妊娠20週、或在妊娠27週至36週。
  50. 如申請專利範圍第46或47項之用途，其中，該個體為50歲或更年長之成人、65歲或更年長之成人、或85歲或更年長之成人。
  51. 如申請專利範圍第46或47項之用途，其中，該個體係免疫功能低下。
  52. 如申請專利範圍第51項之用途，其中，該個體具有選自由下列所組成之群組的醫學狀況：肥胖、糖尿病、HIV感染、癌症、心血管疾病、或肝臟疾病。
  53. 如申請專利範圍第46或47項之用途，其中，該B型鏈球菌為無乳鏈球菌。
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