ES2933027T3

ES2933027T3 - Purificación de polisacáridos secretados de S. agalactiae

Info

Publication number: ES2933027T3
Application number: ES15720977T
Authority: ES
Inventors: Evita Balducci; Francesco Berti; Valdemar Janulczyk; Y Ros Immaculada Margarit; Chiara Toniolo
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2035-05-05
Also published as: EP3140414A1; BE1022780B1; WO2015169774A1; BE1022780A1; SG11201609132TA; US10150979B2; US20170073716A1; EP3140414B1

Abstract

La invención se refiere a mutantes bacterianos, particularmente de Streptococcus agalactiae, en los que CpsA o CpsD están mutados o eliminados y que secretan polisacáridos capsulares y métodos para purificar los polisacáridos capsulares bacterianos secretados del medio de cultivo. Los polisacáridos extraídos son útiles para producir vacunas que comprenden los polisacáridos solos o conjugados con proteínas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de polisacáridos secretados de S. agalactiae

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con mutantes bacterianos, particularmente de Streptococcus agalactiae, que secretan polisacárido capsular y métodos para purificar los polisacáridos capsulares bacterianos secretados del medio de cultivo. Los polisacáridos extraídos son útiles para producir vacunas que comprenden los polisacáridos solos o conjugados con proteínas.

Antecedentes de la invención

En los últimos 25 años, se han desarrollado vacunas conjugadas, que comprenden polisacáridos capsulares bacterianos (CPS, por sus siglas en inglés) conjugados con proteínas vehículo. Los polisacáridos capsulares son importantes inmunógenos que se encuentran en la superficie de las bacterias involucradas en diversas enfermedades bacterianas. Esta característica los ha llevado a ser un componente importante en el diseño de vacunas. Como los sacáridos son antígenos independientes de T, por lo general, las CPS son poco inmunogénicas. La conjugación con un vehículo puede convertir antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, mejorando así las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle una inmunidad protectora.

Por tanto, las vacunas de sacáridos más eficaces se basan en glicoconjugados. Los ejemplos incluyen, entre otros, la vacuna conjugada de Haemophilus influenzae tipo b (Hib), las vacunas conjugadas contra Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis del serogrupo C (MenC). Otra bacteria para la que se han descrito vacunas conjugadas es Streptococcus agalactiae, también conocida como "Streptococcus del grupo B" o simplemente "GBS" (por sus siglas en inglés). La "B" en "GBS" se refiere a la clasificación de Lancefield, que se basa en la antigenicidad de un carbohidrato que es soluble en ácido diluido y se denomina carbohidrato C. Lancefield identificó 13 tipos de carbohidratos C (designados de la A a la O) que podían diferenciarse serológicamente. Los organismos que infectan a los seres humanos más comúnmente se encuentran en los grupos A, B, D y G. Dentro del grupo B, las cepas de Streptococcus agalactiae se dividen en 10 serotipos (la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX) basados en la estructura de su cápsula de polisacáridos.

El Streptococcus agalactiae del grupo B causa una enfermedad grave, bacteriemia y meningitis, en individuos inmunocomprometidos y en neonatos. Hay dos tipos principales de infección neonatal por GBS. La enfermedad de inicio temprano se produce dentro de los 5 días posteriores al nacimiento y se manifiesta por bacteriemia (sepsis o infección de la sangre) y neumonía (infección de los pulmones). La enfermedad de inicio tardío se produce desde la primera semana de nacimiento hasta aproximadamente tres meses después del nacimiento. La enfermedad de inicio tardío se caracteriza comúnmente por meningitis (infección del líquido y revestimiento que rodea el cerebro), aunque también pueden producirse bacteriemia y neumonía. El GBS coloniza la vagina de aproximadamente el 25 por ciento de las mujeres jóvenes y se contrae verticalmente cuando el bebé pasa por el canal de parto. Aproximadamente el 1 por ciento de los bebés nacidos por parto vaginal de madres colonizadas se infectarán con una tasa de mortalidad de entre un 50-70 por ciento.

Se han realizado investigaciones sobre el desarrollo de vacunas contra el SGB basadas en proteínas y polisacáridos. Se ha demostrado que los conjugados de cada una de las vacunas de polisacáridos capsulares de los serotipos de GBS la, Ib, II, III y V son seguros e inmunogénicos en seres humanos. Por ejemplo, se ha demostrado que la vacunación de mujeres embarazadas con CPS de tipo III reduce la incidencia de meningitis de aparición tardía (los bebés adquieren anticuerpos protectores a través de la transferencia placentaria y se inmunizan pasivamente).

La producción a gran escala de vacunas de polisacáridos capsulares requiere suministros adecuados de polisacáridos capsulares purificados. Existen en la técnica métodos para aislar polisacáridos capsulares de células bacterianas. Por ejemplo:

El documento EP0038265 desvela un método para preparar polisacáridos antigénicos que comprende fenolizar el caldo de fermentación para lisar bacterias y liberar polisacáridos en el caldo de fermentación.

El documento EP0302887 desvela la extracción del polisacárido de GBS tipo III mediante la técnica general de Jennings et al. (Canadá J. Biochem. 58:112-120 (1980)).

El documento EP1664319 describe un método para producir el polisacárido que comprende: a) usar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido; b) usar alcohol para precipitar el polisacárido de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido; c) someter a la segunda fracción de polisacárido a una precipitación con alcohol en presencia de un detergente aniónico, por lo que el alcohol está presente en una concentración que está por debajo de la concentración a la que precipita el polisacárido; d) precipitar el polisacárido de la fracción soluble usando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido; e) disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y a diafiltración.

El documento EP1828230 describe un proceso para la expresión heteróloga y la secreción de polisacáridos complejos en bacterias Gram positivas no patógenas y no invasivas.

Los documentos EP1951887 y EP2004223 se refieren a cepas novedosas de Staphylococcus aureus que producen el polisacárido capsular de tipo 5 a mayores niveles que las bacterias de tipo silvestre.

El documento EP1051506 desvela un método para purificar polisacáridos capsulares a partir de componentes celulares de bacterias y sobrenadantes de cultivo. El método utiliza un tratamiento alcalino para lisar las bacterias, pero esto también provoca la hidrólisis del enlace lábil de base que conecta el polisacárido capsular con los componentes celulares, también desacetila los grupos N-acetilo.

Hanson et al. (Journal of Bacteriology, 194(7), 1668-1678) desvela un medio de cultivo que comprende bacterias, polisacáridos capsulares (con una longitud de cadena aumentada de la cadena de bacterias) y otros componentes del medio de Streptococcus agalactiae y desvela que la producción de una CpsA truncada que carece del dominio LytR disminuye la producción de cápsulas. Hanson et al. no desvelan el aumento de la longitud de la cadena de los polisacáridos capsulares, ni la secreción en el medio.

Sin embargo, los métodos anteriores requieren muchas etapas de purificación, se hacen más complejos por la unión del polisacárido capsular a la pared celular. Por tanto, el objeto de la invención es proporcionar métodos mejorados para producir polisacáridos capsulares sin necesidad de lisis bacteriana o tratamiento enzimático para liberar el polisacárido, simplificando así la purificación y aumentando el rendimiento.

Sumario de la invención

Los inventores proporcionan un método de producción simplificado que permite obtener polisacárido capsular a partir del medio de cultivo en cantidades significativamente mayores de lo que era posible anteriormente. Al extraer el polisacárido capsular del medio de cultivo, el método evita la necesidad de inactivación y lisis bacteriana, reduciendo así la complejidad del método y el tiempo requerido. Ventajosamente, los mutantes de CpsA y CpsD muestran una virulencia reducida, de modo que se reducen los riesgos asociados con la manipulación de las bacterias. De forma similar, evitar el uso de la extracción de bases da como resultado un aumento en la seguridad del operador, al tiempo que se mantiene la inmunogenicidad de los polisacáridos extraídos porque el método evita la desacetilación de los grupos N-acetilo.

Por tanto, en un primer aspecto de la invención se proporciona un método para producir un polisacárido capsular a partir de Streptococcus agalactiae que comprende: cultivar un mutante de CpsA o CpsD en un medio de cultivo adecuado que muestre una mayor secreción de polisacárido capsular en comparación con la cepa de tipo silvestre y recuperar el polisacárido del medio de cultivo, en donde el mutante de CpsA o CpsD se selecciona de

- una mutación puntual o una deleción en fase del gen CpsA que da como resultado una actividad alterada del polipéptido CpsA de modo que la unión del polisacárido capsular a la pared celular se reduce, al tiempo que la secreción o liberación del polisacárido capsular en el entorno externo aumenta en comparación con la cepa de tipo silvestre,

- deleción de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido CpsA completo,

- una mutación puntual o deleción en fase del gen CpsD que da como resultado una actividad alterada del polipéptido CpsD de modo que la unión del polisacárido capsular a la pared celular se reduce, al tiempo que la secreción o liberación del polisacárido capsular en el entorno externo aumenta en comparación con la cepa de tipo silvestre y - deleción de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido CpsD completo.

La invención también proporciona un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae purificado obtenido mediante el proceso de la invención.

La invención también proporciona una composición inmunogénica, particularmente una composición de vacuna, que comprende el polisacárido capsular de la invención.

La presente descripción también proporciona un polisacárido aislado de Streptococcus agalactiae, en donde el polisacárido tiene un peso molecular, particularmente un peso molecular promedio, mayor de 800kDa, mayor de 900kDa, mayor de 1000kDa, mayor de 1100kDa, mayor de 1200kDa, mayor de 1300kDa, mayor de 1400kDa, mayor de 1500kDa, mayor de 1600kDa, aproximadamente 1700kDa, particularmente aproximadamente 1758kDa o cualquier intervalo entre ellos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Transferencia puntual con anticuerpo monoclonal anti polisacárido capsular Ia de polisacárido capsular secretado. Los mutantes de CpsA secretaron cantidades significativamente mayores de polisacárido en comparación con las bacterias de tipo silvestre (cepa 515).

Figura 2: Los mutantes de CpsA tienen significativamente menos polisacáridos capsulares unidos a la superficie celular bacteriana en comparación con las bacterias de tipo silvestre (cepa 515).

Figura 3: Los mutantes de CpsA secretan cantidades significativamente mayores de polisacáridos capsulares teniendo una gama más amplia de tamaños (kDa).

Figura 4: Transferencia puntual con anticuerpo monoclonal anti polisacárido capsular Ia de polisacárido capsular secretado. Los mutantes de CpsD secretaron mayores cantidades de polisacárido en comparación con las bacterias de tipo silvestre (cepa 515). De los mutantes ejemplificados, el K49 y el AP-tyr secretaron mayores cantidades que el tipo silvestre y que ACpsD. Por tanto, las mutaciones preferidas ocurren en el sitio activo de la autoquinasa.

Figura 5: Los mutantes de CpsD secretan cantidades significativamente mayores de polisacárido capsular teniendo un tamaño mayor que el secretado por la cepa de tipo silvestre 515 (kDa).

Descripción detallada de la invención

Al introducir mutaciones en la secuencia del polinucleótido y/o de la proteína CpsA o CpsD, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que tales bacterias producen mayores cantidades de polisacárido capsular y que el polisacárido capsular se secreta en el medio de cultivo.

Las cepas recombinantes de Streptococcus agalactiae secretan una cantidad de polisacárido capsular, en mg/l, como se determina por los métodos descritos en los Ejemplos, que es mayor que la secretada por la cepa de tipo silvestre cultivada en las mismas condiciones de cultivo. Particularmente, tales mutantes muestran un aumento en el nivel o cantidad de polisacárido capsular secretado en el medio de cultivo. Particularmente, la cantidad o el nivel es al menos un 10 por ciento, al menos un 20 por ciento, al menos un 30 por ciento, al menos un 40 por ciento, al menos un 50 por ciento, al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos el 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, al menos un 100 por ciento o más que una célula de tipo silvestre del mismo serotipo. Aún más particularmente, tales mutantes muestran una cantidad reducida de polisacárido capsular unido a la pared celular. Particularmente, una cantidad o nivel de menos de un 10 por ciento, menos de un 20 por ciento, menos de un 30 por ciento, menos de un 40 por ciento, menos de un 50 por ciento, menos de un 60 por ciento, menos de un 70 por ciento o menos de un 80 por ciento que la de una célula de tipo silvestre del mismo serotipo.

En el contexto de la presente invención, la expresión "polisacárido capsular" pretende significar los polisacáridos capsulares de Streptococcus agalactiae. En los GBS, uno de los factores de virulencia más importantes es el polisacárido capsular. Hasta la fecha, se han encontrado diez serotipos de cápsula de polisacáridos capsulares: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX.

Sacáridos capsulares

El sacárido capsular de Streptococcus agalactiae está unido covalentemente a la cadena principal de peptidoglicano de GBS y es distinto del antígeno del grupo B, que es otro sacárido que se une a la cadena principal de peptidoglicano. Los sacáridos capsulares de GBS están relacionados químicamente, pero son muy diferentes desde un punto de vista antigénico. Todos los polisacáridos capsulares de GBS comparten el siguiente núcleo de trisacárido:

B-D-GlcpNAc(1 ^3)P-D-Galp(1 ^4)p-D-G lcp

Los diversos serotipos de GBS se diferencian por la forma en que se modifica este núcleo. La diferencia entre los serotipos Ia y III, por ejemplo, surge del uso de GlcNAc (Ia) o Gal (III) en este núcleo para unir núcleos de trisacáridos consecutivos. Los serotipos Ia e Ib tienen un disacárido [a D NeupNAc(2^-3)p D Galp (1 unido a la GlcNAc en el núcleo, pero el enlace es 1 ^ 4 (Ia) o 1 ^ 3 (Ib). Las enfermedades relacionadas con g Bs surgen principalmente de los serotipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, con más del 85 % causado por cinco serotipos: la, Ib, II, III y V. La invención se refiere preferiblemente a un sacárido de uno o más de estos cinco serotipos, particularmente de uno o más de los serotipos II y V. Los sacáridos capsulares generalmente incluyen: (a) un residuo terminal de ácido N-acetil-neuramínico (NeuNAc) (comúnmente denominado ácido siálico), que en todos los casos está unido 2 ^ 3 a un residuo de galactosa; y (b) un residuo de N-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido.

Cuando el sacárido de GBS se ha purificado por extracción de bases, a continuación, la O-acetilación normalmente se pierde. Particularmente, los polisacáridos capsulares extraídos mediante los métodos de la invención están completamente O-acetilados y/o N-acetilados y no están desacetilados (parcial o completamente). El efecto de la desacetilación, etc., puede evaluarse mediante ensayos rutinarios.

Particularmente, el grado de oxidación del ácido siálico del polisacárido capsular de GBS no es menos de un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % y particularmente, el contenido de ácido N-acetil-neuramínico (NeuNAc o ácido siálico) del polisacárido capsular de GBS serotipo V es superior a un 50 %, superior a un 60 %, superior al 70 %, superior al 75 %, superior a un 80 %, superior a un 85 %, superior a un 90 %, superior a un 95 %, en comparación con el polisacárido del serotipo GBS nativo en el que el contenido de NeuNAc se considera que es de aproximadamente un 100 %. Particularmente, el polisacárido ^gB^ses un polisacárido completamente sialilado o "polisacárido nativo". Por ejemplo, con un contenido de ácido siálico de aproximadamente un 100 %, un 99 %, un 98 %, un 97 %, un 96 %, un 95 %, un 94 %, un 93 %, un 92 %, un 91 %, aproximadamente un 90 % (o cualquier intervalo entre estos valores), en comparación con el polisacárido GBS nativo.

El sacárido purificado de acuerdo con la invención puede ser más corto o largo que el polisacárido de GBS que se encuentra en la naturaleza o aislado de una bacteria de tipo silvestre. Los polisacáridos más largos se pueden despolimerizar para dar fragmentos más cortos, por ejemplo, por hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, por cromatografía de tamaño, etc.

CpsA

Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de CpsA de longitud completa incluye el número de registro de Uniprot Q9RPC7, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2):

MSNHSRRQQKKHSHTPLRVINLFLLVIFILLSWSLFLMYRHHFLAFRHLNVIYGV

VIVLIILASLFLCIKNKARIFTTIILVLASIFVATTLYGFKSTIDLTNNLNKTASYSEIEM

SVIVPKDSKITNIEAVSKLAAPVKNDTSNITDLIEHIKSEKGISITPQKTDSYQDAYN

RIKNGDSQAMVLNNAYVSLIELSTPDFKSQIKTIYTYKIKKKINRKNTNHKEGVFNI

YISGIDTFGSISTVSRSDVNIIMTVNTNTHKVLLTTTPRDAYVKIPDGGGNQYDKL

THAGLYGVETSMKTLENLYDINLDYYARINFSSFLKLIDLLGGVTVYNDQAFTSK

HGNFDFPVGQVTLNSEQALGFVRERYSLQGGDNDRGRNQEKVIAAIINKLASSQ

SVTKLNSITSQLQTSVQTNMTIDNINDLINNQLSTGQRFTVESQALTGHGSTGEL

PSYAMPGAQLYMMSIDQSSLSNAKSKIKNTMEE-

En algunas realizaciones, la presente invención se basa en la mutación del gen CpsA mediante deleción en fase u otra mutación, tales como sustituciones. Una deleción en fase del gen CpsA puede incluir cualquier truncamiento de cualquier parte del gen CpsA. Las deleciones en fase, de acuerdo con la presente invención, incluyen deleciones que eliminan un segmento de la secuencia codificante de la proteína, sin embargo, conserva el marco de lectura adecuado después de la deleción. Algunas realizaciones de la presente invención pueden incluir deleciones que son "deleciones limpias", es decir, que no contienen secuencias de ADN exógenas insertadas en el gen o que una deleción en fase del gen CpsA puede incluir la eliminación en cualquier sitio de 1 a 485 aminoácidos. Por tanto, los inventores han identificado residuos dentro de la SEQ ID NO: 2 que pueden modificarse para alterar la actividad de CpsA de modo que la unión del polisacárido capsular a la pared celular se reduce, al tiempo que aumenta la secreción o liberación del polisacárido capsular en el entorno externo, por ejemplo, en el medio de cultivo. Además, la mutación de estos residuos se puede combinar con otras modificaciones tales como deleciones.

Los mutantes de CpsA comprenden una mutación en la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 1) que codifica la secuencia polipeptídica de CpsA expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde la mutación da como resultado una secreción aumentada de polisacárido capsular en el medio de cultivo. Particularmente, la mutación se selecciona del grupo que consiste en una deleción en fase, una mutación puntual, tal como una sustitución, una deleción y una inserción.

En ciertas realizaciones, la mutación da como resultado la deleción de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido CpsA completo. En otras realizaciones, la mutación comprende una deleción, en donde la proteína correspondiente de la mutación por deleción carece de al menos 2 aminoácidos. Más particularmente, la mutación comprende una deleción de la parte de la secuencia polinucleotídica que codifica la región LytR y/o PFAM del polipéptido CpsA. El dominio LytR puede comprender los aminoácidos 236 a 458 de la SEQ ID NO: 2, particularmente, los aminoácidos 248 a 395 de la SEQ ID NO: 2, particularmente, el dominio LytR puede consistir en la SEQ ID NO: 40. La región o dominio PFAM del polipéptido CpsA puede comprender o consistir en los aminoácidos 72 a 187 de la SEQ ID NO: 2, particularmente el dominio PFAM puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 41. En ciertas realizaciones, el gen CpsA comprende una mutación puntual, particularmente una mutación puntual de uno o más de los siguientes residuos numerados de acuerdo con la proteína CpsA de la SEQ ID NO: 2, que provoca la pérdida o reducción de la actividad de CpsA y un aumento en la secreción de polisacárido capsular: D238, R248, D250, K263, R271, R366, R368, R271, D375, ^r378, Q382, T437 y E439. Aún más particularmente, el gen CpsA comprende una o más mutaciones puntuales del grupo que consiste en D238, R248, R271 y R366 numerados según la proteína CpsA de la SEQ ID NO: 2. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que estos residuos, que generalmente se conservan, pueden ser relevantes para la unión y/o el reconocimiento del sustrato. Los polisacáridos capsulares producidos por Streptococcus agalactiae de tipo silvestre tienen un peso molecular de aproximadamente 367kDa. Los polisacáridos capsulares secretados por los mutantes de CpsA descritos en el presente documento tienen un peso molecular superior a 800kDa. Por tanto, la invención también puede proporcionar un polisacárido capsular purificado que tiene un peso molecular, particularmente un peso molecular promedio, mayor de 800kDa, mayor de 900kDa, mayor de 1000kDa, mayor de 1100kDa, mayor de 1200kDa, mayor de 1300kDa, mayor de 1400kDa, mayor de 1500kDa, mayor de 1600kDa, aproximadamente 1700kDa, particularmente aproximadamente 1758kDa o cualquier intervalo entre ellos.

El análisis de los mutantes de CpsA ha revelado que algún polisacárido capsular se une a la pared celular bacteriana, es decir, no se secreta todo. El análisis de tal polisacárido capsular indica que tiene un peso molecular de aproximadamente 210kDa. Por tanto, en ciertas realizaciones, el polisacárido capsular puede extraerse de la pared celular de mutantes de CpsA usando métodos de la técnica anterior para obtener un polisacárido capsular que tenga un peso molecular inferior a 300kDa, menos de 250kDa, particularmente aproximadamente 210kDa.

CpsD

Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de CpsD de longitud completa incluye el número de registro K0JNC2 de Uniprot, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11):

MTRLEIVDSKLRQAKKTEEYFNAIRTNIQFSGKENKILAITSVREGEGKSTTSTSL

ALSLAQAGFKTLLIDADTRNSVMSGTFKATGTIKGLTNYLSGNADLGDIICETNVP

RLMVVPSGKVPPNPTALLQNAYFNKMIEAIKNIFDYIIIDTPPIGLWDAAIISNACD

GFILVTQAGRIKRNYVEKAKEQMEQSGSKFLGIILNKVSESVATYGDYGDYGNY

GKRDRKRK

En algunas realizaciones, la presente invención se basa en la mutación del gen CpsD mediante deleción en fase u otra mutación, tal como sustituciones. Una deleción en fase del gen CpsD puede incluir cualquier truncamiento de cualquier parte del gen CpsD. Las deleciones en fase, de acuerdo con la presente invención, incluyen deleciones que eliminan un segmento de la secuencia codificante de la proteína, sin embargo, conserva el marco de lectura adecuado después de la deleción. Algunas realizaciones de la presente invención pueden incluir deleciones que son "deleciones limpias", es decir, que no contienen secuencias de ADN exógenas insertadas en el gen o que una deleción en fase del gen CpsD puede incluir la deleción de entre 1 y 232 aminoácidos. Por tanto, los inventores han identificado residuos dentro de la SEQ ID NO: 10 que pueden modificarse para alterar la actividad de CpsD de modo que la unión del polisacárido capsular a la pared celular se reduce, al tiempo que aumenta la secreción o liberación del polisacárido capsular en el entorno externo, por ejemplo, en el medio de cultivo. Además, la mutación de estos residuos se puede combinar con otras modificaciones tales como deleciones.

Los mutantes de CpsD comprenden una mutación en la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 10) que codifica la secuencia polipeptídica de CpsD expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde la mutación da como resultado una secreción aumentada de polisacárido capsular en el medio de cultivo. Particularmente, la mutación se selecciona del grupo que consiste en una deleción en fase, una mutación puntual, tal como una sustitución, una deleción y una inserción.

En ciertas realizaciones, la mutación da como resultado la deleción de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido CpsD completo. En otras realizaciones, la mutación comprende una deleción, en donde la proteína correspondiente de la mutación por deleción carece de al menos 2 aminoácidos. Más particularmente, la mutación comprende una deleción de la parte de la secuencia polinucleotídica que codifica el sitio fosfoaceptor (región P-tyr) del polipéptido CpsD. Otras mutaciones incluyen una deleción de la región de Tyr C-terminal a Phe. En ciertas realizaciones, el gen CpsD comprende una o más mutaciones puntuales seleccionadas del grupo que consiste en K49, S50, D73 y P154, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, K49M y/o S50A. Particularmente, son útiles las mutaciones en el sitio activo de la autoquinasa, particularmente una mutación puntual en la posición K49 numerada según la proteína CpsD de la SEQ ID NO: 11, que causan la pérdida o reducción de la actividad de CpsD y un aumento en la secreción de polisacárido capsular. Los polisacáridos capsulares producidos por Streptococcus agalactiae de tipo silvestre tienen un peso molecular de aproximadamente 367kDa. Los polisacáridos capsulares secretados por mutantes de CpsD descritos en el presente documento tienen un peso molecular superior a 800kDa. Por tanto, la invención también puede proporcionar un polisacárido capsular purificado que tiene un peso molecular, particularmente un peso molecular promedio, mayor de 800kDa, mayor de 900kDa, mayor de 1000kDa, mayor de 2000kDa, mayor de 3000kDa, mayor de 4000kDa, mayor de 5000kDa, mayor de 6000kDa, mayor de 7000kDa, mayor de 8000kDa, superior a 9000kDa o cualquier intervalo entre ellos.

Variantes

Se conocen variantes de CpsA y CpsD de otras cepas de Streptococcus agalactiae y pueden identificarse fácilmente mediante, por ejemplo, el uso de búsquedas de BLAST de la secuencia anterior. Las variantes de CpsA incluyen a modo de ejemplo no limitativo, los números de registro de Uniprot: M1Y5W8, S9KSV2, S9JM66 y S8YXF5, también denominadas regulador transcripcional de la familia LytR, proteína reguladora CpsX, proteína de biosíntesis de polisacáridos capsulares CpsX y similares. Las variantes de CpsD incluyen a modo de ejemplo no limitativo, los números de registro de Uniprot: V6H970, S9NRN3, S9PP30, S9E9Q3, también denominadas proteína tirosina quinasa y transportador de polisacáridos capsulares y similares.

Por tanto, la invención también se aplica a variantes alélicas de las proteínas CpsA y CpsD desveladas de Streptococcus agalactiae. En algunas realizaciones, el grado de identidad de secuencia es superior a un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 97,5 %, un 98 %, un 98,5 %, un 99 %, un 99,5 % o más. Estos polipéptidos incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Normalmente, una identidad de un 50 % o más entre dos polipéptidos se considera una indicación de equivalencia funcional.

Purificación

Material de partida: Los mutantes CpsA y CpsD secretan y liberan grandes cantidades de polisacárido capsular en el medio de cultivo durante el crecimiento bacteriano, por lo que el material de partida para la purificación suele ser el sobrenadante de un cultivo bacteriano centrifugado. Mediante el uso de mutantes CpsA o CpsD, no es necesario tratar las propias bacterias encapsuladas para liberar el sacárido capsular. Ventajosamente, dado que el método de la invención no requiere el uso de reactivos base, tales como NaOH, el sacárido producido por los métodos de la invención no está parcial o totalmente desacetilado en N y los métodos de la invención no comprenden o requieren una etapa de N-reacetilación.

Precipitación alcohólica e intercambio catiónico: El sacárido capsular de GBS obtenido después del cultivo será generalmente impuro y puede contaminarse con ácidos nucleicos y proteínas bacterianos. El proceso de la invención utiliza la precipitación alcohólica. Dado que no se utiliza la extracción de bases, no se necesitará neutralizar los materiales antes de la precipitación, disminuyendo de nuevo el tiempo necesario para purificar el polisacárido capsular.

El alcohol utilizado para precipitar ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes es preferiblemente un alcohol inferior, tal como metanol, etanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc. La selección de un alcohol adecuado puede probarse empíricamente, sin demasiado trabajo, pero se prefieren los alcoholes tales como el etanol y el isopropanol (propan-2-ol), en lugar de alcoholes tales como el fenol.

El alcohol se añade preferiblemente a la suspensión de polisacáridos para dar una concentración de alcohol final de entre un 10 y un 50 por ciento (por ejemplo, alrededor de un 30 por ciento). Las concentraciones más útiles son aquellas que consiguen una precipitación adecuada de los contaminantes sin precipitar también el polisacárido. La concentración de alcohol final óptima puede depender del serotipo de GBS del que se obtiene el polisacárido y puede determinarse mediante experimentos rutinarios sin demasiado trabajo. Se ha observado una precipitación de polisacáridos en concentraciones de etanol >50 por ciento.

El alcohol puede añadirse en forma pura o puede añadirse en forma diluida con un disolvente miscible (por ejemplo, agua). Las mezclas de disolventes preferidas son mezclas de etanol:agua, con una proporción preferida de entre alrededor de 70:30 y alrededor de 95:5 (por ejemplo, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10).

El sacárido también se trata con un catión metálico acuoso. Se prefieren los cationes metálicos monovalentes y divalentes y se prefieren particularmente los cationes divalentes, tales como Mg++, Mn++, Ca++, etc., ya que son más eficaces en la formación de complejos. Los iones de calcio son particularmente útiles y por tanto, la mezcla de alcohol incluye preferiblemente iones de calcio solubles. Estos pueden añadirse a una mezcla de sacárido/alcohol en forma de sales de calcio, añadidos como un sólido o en una forma acuosa. Los iones de calcio se proporcionan preferentemente mediante el uso de cloruro de calcio.

Los iones de calcio están preferiblemente presentes en una concentración final de entre 10 y 500 mM, por ejemplo, aproximadamente 0,1 M. La concentración final óptima de Ca++ puede depender del serotipo de GBS del que se obtiene el polisacárido y puede determinarse mediante experimentos rutinarios sin demasiado trabajo.

El alcohol y el catión juegan papeles diferentes (el alcohol se usa para precipitar contaminantes, si bien el catión estabiliza y forma complejos con el sacárido en forma soluble), pero producen un efecto combinado. Aunque el objetivo es preparar una mezcla del sacárido, el alcohol y el catión, no se necesita mezclar estos tres componentes simultáneamente. Por tanto, el alcohol y el catión se pueden usar secuencial o simultáneamente. Se prefiere el tratamiento secuencial y un proceso particularmente preferido implica la adición del catión al sacárido, seguido de la adición del alcohol a la mezcla de catión/sacárido, aunque el alcohol puede usarse antes que el catión si se desea.

Después de la precipitación alcohólica de proteínas y/o ácidos nucleicos contaminantes, el polisacárido capsular de GBS se deja en solución. El material precipitado se puede separar del polisacárido por cualquier medio adecuado, tal como por centrifugación. El sobrenadante puede someterse a microfiltración y en particular, a filtración sin salida (filtración perpendicular) para eliminar las partículas que pueden obstruir los filtros en etapas posteriores (por ejemplo, partículas precipitadas con un diámetro superior a 0,22 micrómetros). Como alternativa a la filtración sin salida, puede utilizarse la microfiltración tangencial.

Diafiltración: El proceso de la invención puede implicar una etapa de diafiltración después de la precipitación de proteínas y/o ácidos nucleicos. Puede usarse la diafiltración de flujo tangencial. Por tanto, la membrana de filtración debe ser una que permita el paso de impurezas al tiempo que retenga el polisacárido capsular. Un valor límite en el intervalo de 10kDa-30kDa es normal. Se pueden usar valores límite más pequeños, pero unos tamaños límite mayores permiten ventajosamente la eliminación de otros contaminantes sin conducir a la pérdida del sacárido capsular. Se puede realizar al menos 1 ciclo de diafiltración, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o más.

En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de eliminación de ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes. Los ácidos nucleicos y/o proteínas particularmente contaminantes pueden eliminarse mediante el uso de precipitación. Todavía más particularmente, los ácidos nucleicos y/o las proteínas contaminantes pueden eliminarse del polisacárido capsular en forma acuosa mediante el uso de precipitación alcohólica. Cuando se incluye una etapa de precipitación alcohólica, se puede usar un alcohol y un catión metálico acuoso para precipitar los ácidos nucleicos y/o las proteínas dejando el polisacárido en solución. Cuando se incluye una etapa de precipitación alcohólica, el método puede incluir una etapa adicional de separación del material precipitado del polisacárido. Particularmente, el material precipitado se puede separar del polisacárido por filtración y todavía más particularmente, el método puede comprender una etapa de diafiltración después de la precipitación de ácidos nucleicos y/o proteínas. En algunas realizaciones, el alcohol es etanol o isopropanol. En algunas realizaciones, el catión metálico acuoso es el ion calcio. Particularmente, los métodos de la invención comprenderán una o más etapas de filtración, por ejemplo, ultrafiltración y/o filtración en gel. En realizaciones particulares, se realiza la filtración en gel utilizando Sephacryl®, por ejemplo, utilizando el gel Sephacryl® S-500.

Tratamiento adicional del polisacárido capsular: El polisacárido puede tratarse adicionalmente para eliminar los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones donde no es aceptable incluso una contaminación menor (por ejemplo, para la producción de vacunas para seres humanos). Por ejemplo, se pueden usar etapas de precipitación adicionales. Cuando se realizó una resolubilización acuosa, a continuación, esta precipitación normalmente utilizará un alcohol, como se ha descrito en la sección anterior; por el contrario, cuando se realizó una resolubilización alcohólica, a continuación, esta precipitación normalmente utilizará una solución catiónica acuosa, como se ha descrito en la sección anterior. A continuación, el sacárido precipitado se puede separar de cualquier contaminante acuoso restante, por ejemplo, por centrifugación. El material precipitado es estable y puede almacenarse para un uso futuro. También se pueden realizar más rondas de precipitación y filtración. La filtración profunda también se puede utilizar, por ejemplo, como alternativa a la centrifugación. La filtración profunda se utilizará normalmente después de la solubilización en alcohol.

El material precipitado puede someterse a secado al vacío. Este tratamiento normalmente no se utilizará para estabilizar el sacárido para su almacenamiento, sino para secar el sacárido y eliminar cualquier alcohol residual. El método produce un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae purificado. Particularmente, el polisacárido capsular es un polisacárido capsular sialilado, en otras palabras, no está ni parcial ni totalmente des-N-acetilado. Todavía más particularmente, aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % a aproximadamente un 100 % de las unidades repetitivas del polisacárido capsular purificado comprenden cadenas laterales terminadas en ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico; Neu5Ac) a2,3 unido a galactosa (Gal).

El polisacárido capsular purificado de la invención se puede usar como antígeno sin modificaciones adicionales, por ejemplo, para usar en ensayos de diagnóstico in vitro, para usar en inmunización, etc. Para fines de inmunización, sin embargo, se prefiere conjugar el sacárido a una molécula vehículo, tal como una proteína. En general, la conjugación covalente de sacáridos a vehículos mejora la inmunogenicidad de los sacáridos, ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo así la sensibilización para la memoria inmunológica. La conjugación es una técnica bien conocida. Por tanto, los métodos de la invención pueden incluir la etapa adicional de conjugar el sacárido purificado con una molécula vehículo. La invención también puede proporcionar procesos para preparar composiciones farmacéuticas, que comprenden las etapas de mezclar (a) un polisacárido de la invención (opcionalmente en forma de conjugado) con (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición individual. Los vehículos adecuados normalmente son grandes, macromoléculas de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, lactosa y agregados lipídicos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y similares. La solución salina fisiológica tamponada con fosfato estéril libre de pirógenos es un vehículo habitual. Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse en viales o en jeringas. Las jeringas pueden suministrarse con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis única de la composición, si bien un vial puede incluir una dosis única o dosis múltiples. Las composiciones acuosas de sacáridos de la invención son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando se vaya a utilizar una composición de la invención para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un proceso para reconstituir dicha vacuna liofilizada, que comprende la etapa de mezclar el material liofilizado con una composición acuosa de la invención. El material reconstituido se puede utilizar para inyección.

General

La expresión "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste en", por ejemplo, una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y. El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura puede incluir ingredientes adicionales, etapas y/o partes, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicadas. La expresión "que consiste en" generalmente se entiende que significa que la invención como se reivindica se limita a los elementos enumerados específicamente en la reivindicación (y puede incluir sus equivalentes, en la medida en que la doctrina de los equivalentes sea aplicable).

El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de un ± 20 % o ± 10 %, más preferentemente ±5 %, incluso más preferentemente ± 1 % y aún más preferentemente ± 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son adecuadas para realizar los métodos desvelados.

La expresión "sustancialmente" no excluye "completamente"; por ejemplo, una composición que está "sustancialmente exenta" de Y puede estar completamente exenta de Y. Cuando sea necesario, "sustancialmente libre" de Y puede entenderse como una composición que no contiene más de Y a un 5 %, no más de Y a un 4 %, no más de Y a un 3 %, no más de Y a un 2 %, no más de Y a un 1 % o no más de Y a un 0,1 %. Cuando sea necesario, el término "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, a menos que se aclare lo contrario del contexto, se entiende que el término "o" es inclusivo y se puede usar indistintamente con la expresión "y/o".

El término "mutante" se refiere a un gen o producto génico que muestra modificaciones en la secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o el producto génico de tipo silvestre.

El término "recuperación" significa el aislamiento del polisacárido capsular en diferentes purezas, por ejemplo entre un 5 % y un 100 % de pureza, las purezas preferidas están en el intervalo de un 10 % y un 99 %, un 20 % y un 99 %, un 30 % y un 99 %, un 40 % y un 99 %, un 50 % y un 99 %, un 60 % y un 99 %, un 70 % y un 99 %, un 80 % y un 99 %, un 90 % y un 99 %. Las purezas particulares son superiores a un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %. La recuperación también puede denominarse extracción o purificación. El término "pureza" adopta el significado general utilizado en la técnica para referirse al porcentaje de la muestra aislada definitiva que es, en realidad, polisacárido capsular.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben interpretar como limitantes.

Ejemplos

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento.

El GBS 515 (Wessels, et al. 1993) y sus derivados isogénicos se cultivaron en caldo Todd-Hewitt (medio THB; Laboratorios Difco) a 37 °C, CO2 al 5 %. Se utilizó caldo de soja tríptico (Laboratorios Difco), 15 g/l de agar (TSA) como medio sólido. Las cepas se almacenaron a -80 °C en medio THB glicerol al 15 %. Se utilizaron células competentes MAX Efficiency® DH5a™ (Invitrogen) y células de E. coli HK100 competentes preparadas propias para la transformación, propagación y preparación de plásmidos. E. coli se cultivó a 37 °C con agitación (180 rpm) en caldo Luria-Bertani (LB, laboratorios Difco) o en placas de 15 g/l de agar (LBA). Se usó eritromicina (Erm) para la selección de GBS (1 pg/ml) o de E. coli (100 pg/ml), que contenía los plásmidos derivados de pJRS233 (Perez-Casal et al. 1993) utilizados para mutagénesis. Se usó kanamicina (Kan) para la selección de E. coli (50 pg/ml) que contenía los plásmidos derivados de pET24b (Novagen) utilizados para la mutagénesis inicial de insertos, antes de la transferencia a pJRS233.

Construcción de plásmidos de CpsA para mutagénesis y complementación cromosómica

Para preparar cada cepa mutante, se construyó el vector lanzadera de pJRS233 (Perez-Casal J, et al. 1993) que contiene el locus del gen con una deleción en fase o una sustitución de codones. Las cepas mutantes desarrolladas se describen en la Tabla 1:

Nombre del mutante Descripción Proteína mutada

A cpsA Deleción de cpsA Deleción de aa 11-452 (total=458) CpsA(Aext dominio) Deleción del dominio extracelular de CpsA Deleción de aa 96-458 (total=458) CpsA(ALyt-R) Deleción del dominio CpsA LytR Deleción de aa 236-458

Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2 a continuación:

Nombre Secuencia Descripción

amplificación del gen cpsA + regiones flanqueantes

NotA5Fsoe TAAAGCGGCCGCCTCTATCACTGACAACAATGG Directo, 894 pb dirección 5’ del inicio de cpsA, Notl RS XhA3Rsoe T ATCCTCGAGGAAGAAGT AT ATT GTGGCGTA Inverso, 916 pb dirección 3’ del final de cpsA, Xhol RS

mutagénesis de AcpsA

KOA5Rsoe TT GTT GACGGCGCGAAT GATT AGACATT GT AA Inverso, solapante KOA3Fsoe

KOA3Fsoe TCGCGCCGTCAACAAAAGAACACAATGGAGGAATAAC Directo, solapante KOA5Rsoe

mutagénesis de CpsA(Aext_dominio)

M1A5Rsoe TCCATATAAAGTAGTAGCAACGAAAATAGAAGC Inverso, solapante M1A3Fsoe

M1A3 Fsoe ACT ACTTTAT AT GG AT AAC AAG AAT GATT G AT ATT C ATT C Directo, solapante M1A5Rsoe

mutagénesis de CpsA(ALyt-R)

M2A5Rsoe ACCGCTAATATAGATATTAAATACCCCTTCTTTATG Inverso, M2A3Fsoe solapante

M2A3Fsoe TCTAT ATT AGCG GTTAAC AAG AAT GATT G AT ATT C ATT CTC Directo, M2A5Rsoe solapante

qRT-PCR

SAN_1047F AGGTTT ACTT GT GGCGCTT G Directo, hibridación con gyrA SAN_1047R T CT GCTT GAGCAAT GGTGTC Inverso, hibridación con gyrA SAK_1262F T CAACT GGACAACGCTT CAC Directo, hibridación con cpsA SAK_1262R AAGTT GAGCTCCT GGCATT G Inverso, hibridación con cpsA SAK_1258F TGCT CAT AT GT GGCATT GT G Directo, hibridación con cpsE SAK 1258R AGAAAAGAT AGCCGGTCCAC Inverso, hibridación con cpsE

Se prepararon construcciones para genes con sustituciones de codones utilizando una estrategia de PCR de corte y empalme por elongación solapante (PCR de SOE, por sus siglas en inglés). En resumen, las dos partes del gen en dirección 5’ y en dirección 3’ de la sustitución de codones se amplificaron a partir del ADNg 515 utilizando la ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS (Agilent Technologies). Se añadieron a los insertos 900-1000 pb en dirección 5’ y en dirección 3’ de la secuencia codificante del gen. Los cebadores utilizados para amplificar las dos partes de los genes tienen colas solapantes de 15 pb e introducen la sustitución de codones en los dos productos de PCR que, a continuación, se unen mediante PCR de SOE. El fragmento resultante se ligó a pJRS233 utilizando los sitios de restricción BamHI y XhoI.

Se prepararon construcciones para genes con deleciones en fase utilizando el método de elongación de cebadores incompleta de la polimerasa (PIPE, por sus siglas en inglés). En resumen, el gen, junto con 900-1000 pb en dirección 5’ y en dirección 3’ de la secuencia codificante, se amplificó a partir del ADNg 515 y se clonó a pET24b usando los sitios de restricción Notl y Xhol (insertos de cpsA) o BamHI y Xhol (insertos de cpsD). Las deleciones en fase de los genes se desarrollaron amplificando el plásmido usando cebadores con colas solapantes de 15 pb que hibridan en los dos lados de la región a eliminar. Los plásmidos lineales se transformaron en células competentes HK100 capaces de recircularizar el plásmido. A continuación, los insertos resultantes se transfirieron al plásmido pJRS233 mediante digestión por restricción y unión.

Se prepararon construcciones para la complementación cromosómica transfiriendo a pJRS233 los insertos de tipo silvestre clonados a pET24b.

Construcción de plásmidos CpsD para mutagénesis y complementación cromosómica

Para preparar cada cepa mutante, se construyó el vector lanzadera de pJRS233 (Perez-Casal J, et al. 1993) que contiene el locus del gen con una deleción en fase o una sustitución de codones. Las cepas mutantes desarrolladas se describen en la Tabla 3:

Nombre del

_mutanteDescripción Proteína mutada

Deleción de cpsD

A cpsD Mutación puntual en el sitio activo de la Deleción de aa 11-225 (total=232) CpsD(K49A) autoquinasa Lisina a alanina en la posición 49 (total=232) CpsD(AP-Tyr) Deleción del terminal C del sitio del Deleción de aa 213-224 (total=232)

fosfoaceptor

Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2 a continuación:

Nombre Secuencia Descripción

amplificación del gen cpsD + regiones flanqueantes

BaD5Fsoe TTTAGGATCCCAAAAAGAACGGGTGAAGGAA Directo, 1018 pb dirección 5’ del inicio de cpsA, BamHI RS XhD3Rsoe TCTACTCGAGCTACCATTACGACCTACTCTA Inverso, 966 pb dirección 3’ del final de cpsA, Xhol RS

mutagénesis de AcpsD

KOD5Rsoe GCTATCAACTATTTCTAAACGAGTCATTATATTCTC Inverso, KOD3Fsoe solapante KOD3Fsoe______ GAAATAGTTGATAGCAAAAGGGATAGAAAAAGGAAGTAA Directo, KOD5Rsoe solapante Mutagénesis de CpsD(K49A)

M1 DmutF GGAAGGGGAAGGAGCATCCACTACTTCA Inverso, M1 DmutR solapante

M1 DmutR TGAAGTAGTGGATGCTCCTTCCCCTTCC Directo, M1 DmutF solapante

mutagénesis de CpsD(AP-Tyr)

M 2 D5 Rsoe AACAG ATT CACT AACTTT ATT AAGAAT AAT ACCT AAG AAC Inverso, M2D3Fsoe solapante M 2 D3 Fsoe GTT AGT GAAT CT GTT GGAAAAAGGGAT AGAAAAAGG Directo, M2D5Rsoe solapante qRT-PCR

SAN_1047F AGGTTTACTTGTGGCGCTTG Directo, hibridación con gyrA SAN_1047R TCTGCTTGAGCAATGGTGTC Inverso, hibridación con gyrA SAK_1262F TCAACTGGACAACGCTTCAC Directo, hibridación con cpsA SAK_1262R AAGTTGAGCTCCTGGCATTG Inverso, hibridación con cpsA SAK_1258F TGCT CAT AT GT GGCATT GT G Directo, hibridación con cpsE SAK 1258R AGAAAAGATAGCCGGTCCAC Inverso, hibridación con cpsE Se prepararon construcciones para genes con sustituciones de codones utilizando una estrategia de PCR de corte y empalme por elongación solapante (PCR de SOE, por sus siglas en inglés). En resumen, las dos partes del gen en dirección 5’ y en dirección 3’ de la sustitución de codones se amplificaron a partir del ADNg 515 utilizando la ADN polimerasa PfuUltra II Fusion HS (Agilent Technologies). Se añadieron a los insertos 900-1000 pb en dirección 5’ y en dirección 3’ de la secuencia codificante del gen. Los cebadores utilizados para amplificar las dos partes de los genes tienen colas solapantes de 15 pb e introducen la sustitución de codones en los dos productos de PCR que, a continuación, se unen mediante PCR de SOE. El fragmento resultante se ligó a pJRS233 utilizando los sitios de restricción BamHI y Xhol.

Construcción de mutantes isogénicos y cepas cromosómicamente complementadas

Se usó una estrategia de mutagénesis de inserción/duplicación y escisión tanto para obtener la deleción en fase/sustitución de codones en los genes como para reemplazar las mutaciones para obtener las cepas complementadas cromosómicamente. En resumen, se usaron plásmidos derivados de pJRS233 purificados a partir de E. coli para transformar células 515 electrocompetentes por electroporación. Los transformantes se seleccionaron por crecimiento en TSA Erm a 30 °C durante 48 horas. La integración se realizó mediante el crecimiento de transformantes a 37 °C (temperatura no permisiva para el vector lanzadera suicida) con selección de Erm. La escisión del plásmido integrado se realizó mediante pases en serie en THB a 30 °C y detección paralela de colonias sensibles a Erm en la placa. Los mutantes se verificaron mediante secuenciación por PCR de los loci.

Para obtener las cepas cromosómicamente complementadas, los plásmidos derivados de pJRS233 que contenían la versión de tipo silvestre de los genes y los 900-1000 pb flanqueantes en dirección 5’ y en dirección 3’ se purificaron a partir de E. coli y la complementación de las respectivas cepas mutantes se realizó como se describe para la mutagénesis.

Análisis por RT-PCR

Las bacterias se recogieron en dos momentos: a DO⁶⁰⁰=0,4 (fase logarítmica) y a DO⁶⁰⁰=1,7 (fase estacionaria temprana). Para detener rápidamente la transcripción, se enfriaron 10 ml de bacterias en hielo y se añadieron a 10 ml de medio THB congelado en un tubo cónico de 50 ml. A continuación, las células de GBS se recogieron por centrifugación durante 15 min a 4000 rpm, 4 °C y se resuspendieron en 800 pl de TRIzol (Invitrogen). Las bacterias se rompieron mecánicamente mediante agitación con Lysing matrix B en tubos de 2 ml (DBA Italia) utilizando un homogeneizador (Fastprep-24, Millipore) durante 60 segundos a 6,5 m/s durante dos ciclos y se mantuvieron en hielo durante 2 minutos entre los ciclos. A continuación, las muestras se centrifugaron durante 5 min a 8000 x g, 4 °C y se extrajo el ARN con el kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se trataron con ADNasa (Roche) durante 2 h a 37 °C y se purificaron aún más con el kit RNA MiniPrep (Qiagen), incluyendo un segundo tratamiento con ADNasa en la columna durante 30 min a temperatura ambiente (TA), según las instrucciones del fabricante. El ADNc se preparó utilizando el Sistema de transcripción inversa (Promega) utilizando 500 ng de ARN por reacción. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en 50 ng de ADNc, que se amplificó con LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master, (Roche). Las reacciones se controlaron usando un instrumento y software de LightCycler® 480 (Roche). Se controlaron tres réplicas técnicas para cada cepa/condición analizada. Para cuantificar el nivel de transcripción del operón de CPS se utilizó la hibridación de los cebadores en cpsA y cpsE respectivamente para los mutantes de cpsA. Las cantidades de transcritos en cada condición se estandarizaron respecto a un gen de control interno (gyrA) y se compararon con la expresión estandarizada en la cepa de tipo silvestre (método AAC^t).

Cuantificación del polisacárido capsular adherido a la superficie celular

Se utilizó un cultivo durante la noche para inocular (1:1000) 50 ml de THB fresco y se cultivaron bacterias a 37 °C durante 8 horas. Las células de GBS se recogieron por centrifugación durante 15 min a 4000 rpm a 4 °C, se resuspendieron en 1,1 ml de PBS NaOH 0,8 M y se incubaron a 37 °C durante 36 horas. Las muestras se neutralizaron y sedimentaron mediante centrifugación durante 10 min a 4000 rpm, 4 °C. Se diluyeron 850 pl del sobrenadante en 7,15 ml de agua y se centrifugaron durante 10 min a 4000 rpm a 4 °C. Se cargaron 7,2 gl del sobrenadante en un tubo Vivaspin 10 (Sartorius Stedim Biotech) que se centrifugó a 4000 rpm hasta que la mayor parte de la solución atravesó la membrana. Después de dos lavados con 1 ml de agua, el extracto de CPS se recuperó de la membrana y se resuspendió en 1,6 ml de agua. La cantidad de CPS presente en el extracto se estimó midiendo el contenido de ácido siálico mediante el método colorimétrico de resorcinol-ácido clorhídrico (Svennerholm y otros, 1957). En resumen, se mezclaron 120 gl de extracto con 380 gl de agua y 500 gl de solución R3 recién preparada (resorcinol 0,2 %, sulfato de cobre 0,3 mM, HCI al 30 % en H²O). Las muestras se hirvieron durante 20 min y a continuación, se enfriaron a temperatura ambiente antes de transferirlas a cubetas de 1 ml para medir su absorbancia a 564 nm. A continuación, se calculó el contenido de ácido siálico de las muestras utilizando una curva estándar preparada conjuntamente utilizando diluciones en serie de ácido siálico purificado. Los extractos de CPS se prepararon tres veces a partir de crecimientos independientes para minimizar la variabilidad biológica.

Cuantificación del polisacárido capsular liberado en el medio de cultivo

Se utilizó un cultivo durante la noche para inocular (1:1000) 10 ml de THB fresco y se cultivaron bacterias a 37 °C durante 8 horas. Las células de GBS se sedimentaron mediante centrifugación durante 15 min a 4000 rpm a 4 °C y el medio de cultivo se recogió y filtró con un filtro de jeringa Nalgene de 0,22 gm (Thermo Scientific). La cantidad de polisacárido capsular liberado en el medio de cultivo se estimó mediante transferencia puntual. Se utilizó como un estándar 10 mg/ml de CPS de serotipo la purificado. Se prepararon ocho diluciones en serie en una placa de 96 pocillos diluyendo los medios estándar y de cultivo en PBS (proporción de dilución 1:2 para los medios, 1:4 para el estándar). Se colocaron 2 gl de cada dilución en serie sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se secó durante 20 min y se bloqueó sumergiéndola en leche desnatada al 5 % (p/v) en PBS-Tween al 0,05 %. A continuación, la membrana se sondeó con un anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-serotipo la CPS-CRM conjugado (30E9/B11) utilizado a 1:2000, se lavó 3 veces en PBS-Tween al 0,05 % y se incubó en 1:15000 de anticuerpo anti ratón de cabra secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La detección se realizó con el sustrato de transferencia Western Pierce ECL de Thermo Scientific, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Transferencia Western sobre el polisacárido capsular liberado en el medio de crecimiento

Se mezclaron 20 gl de medio con 10 gl de tampón de muestra NuPAGE® LDS 3x agente reductor y se hirvieron durante 5 min. A continuación, se cargaron 20 gl en un gel NuPage Bis-Tris al 4-12 % 1,0 mm, 12 pocillos (Life Technologies) (tampón de ejecución: MOPS 1x) y se ejecutó a 150V hasta que la banda correspondiente a 28 kDa del estándar de proteína preteñida SeeBlue® Plus2 (Life Technologies) alcanzó el final del gel. Las muestras separadas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia de 7 minutos iBlot® (Life Technologies). La membrana se bloqueó sumergiéndola en leche desnatada al 5 % (p/v) en PBS-Tween al 0,05 %. A continuación, la membrana se sondeó con un anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-serotipo la CPS-CRM conjugado (30E9/B11) utilizado a 1:2000, se lavó 3 veces en PBS-Tween al 0,05 % y se incubó en 1:15000 de anticuerpo anti ratón de cabra secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La detección se realizó con el sustrato de transferencia Western Pierce ECL de Thermo Scientific, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Purificación de sacárido capsular a partir de medios de cultivo

El sobrenadante del medio de cultivo se recogió por centrifugación tras el cultivo de los mutantes de CpsA del Streptococcus del grupo B. Se añadió al medio de cultivo una mezcla de etanol acuoso (30 %) y CaCl2 (0,1M). Rápidamente se formó un precipitado, que se eliminó por centrifugación. Los ensayos de ácido siálico mostraron que el sacárido capsular permaneció en el sobrenadante. El sobrenadante se sometió a microfiltración sin salida en filtros de celulosa regenerada (límite de 0,22gm). A continuación, el sobrenadante se sometió a una filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) utilizando una membrana de celulosa de límite de 30kDa frente a Tris 50mM/NaCl 500mM pH8,8, seguido de diafiltración frente a NaPi 10mM, pH7,2. El precipitado se eliminó nuevamente por centrifugación. Se utilizó una etapa adicional de filtración en gel usando resina Sephacryl S-500. El polisacárido se puede recuperar como un grupo de fracciones, que en algunos casos, se secan, por ejemplo, mediante secado al vacío.

REFERENCIAS

Wessels, M. R., Paoletti, L. C., Rodewald, A. K., Michon, F., DiFabio, J., Jennings, H. J. y Kasper, DL (1993) Infect. Immun. 61,4760-4766.

Perez-Casal J, Price JA, Maguin E, Scott JR. (1993) Mol Microbiol 8:809-819.

Svennerholm L., (1957) Biochim Biophys Acta. 24(3), 604-611.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un polisacárido capsular a partir de Streptococcus agalactiae que comprende: cultivar en un medio de cultivo adecuado un mutante de CpsA o CpsD que muestre secreción aumentada de polisacárido capsular en comparación con la cepa de tipo silvestre y recuperar el polisacárido del medio de cultivo, en donde el mutante de CpsA o CpsD se selecciona de

- una mutación puntual o deleción en fase del gen CpsD que da como resultado una actividad alterada del polipéptido CpsD de modo que la unión del polisacárido capsular a la pared celular se reduce, al tiempo que la secreción o liberación del polisacárido capsular en el entorno externo aumenta en comparación con la cepa de tipo silvestre y

- deleción de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido CpsD completo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el mutante de CpsA comprende:

(a) una proteína CpsA alterada en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la proteína CpsA (SEQ ID NO: 2) se elimina o se elimina parcialmente; o

(b) una proteína CpsA alterada en donde se elimina la secuencia de nucleótidos que codifica (i) el dominio LytR de la SEQ ID NO: 40 o de la SEQ ID NO: 3 y/o (ii) el dominio PFAM de la SEQ ID NO: 41; o

(c) una proteína CpsA alterada, teniendo la proteína CpsA alterada una sustitución de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: R271, R366, D375, R378 y Q382 numerados de acuerdo con la proteína CpsA (SEQ ID NO: 2); y/o

(d) una proteína CpsA alterada, teniendo la proteína CpsA alterada una sustitución de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: D238, R248, D250, R271 y R368 numerados de acuerdo con la proteína CpsA (SEQ ID NO: 2).

3. El método de la reivindicación 1, en donde el mutante CpsD comprende:

(a) una proteína CpsD alterada en donde se elimina la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 13 en Streptococcus agalactiae de tipo silvestre; o

(b) una proteína CpsD alterada, comprendiendo la proteína CpsD alterada una sustitución de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K49, S50, D73 y P154 numerados de acuerdo con la SEQ ID NO: 11; o

(c) una proteína CpsD alterada codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:16;

en donde el mutante CpsD muestra una secreción aumentada de polisacárido capsular en comparación con la cepa de tipo silvestre.

4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el mutante muestra un aumento en el nivel de polisacárido secretado que es de al menos un 10 por ciento, al menos un 20 por ciento, al menos un 30 por ciento, al menos un 40 por ciento, al menos un 50 por ciento, al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos un 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, al menos un 100 por ciento o más de un 100 por ciento más que una célula de tipo silvestre del mismo serotipo.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el polisacárido es de un serotipo de Streptococcus agalactiae seleccionado del grupo que consiste en la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII o VIII, particularmente de los serotipos la, Ib, II, III o V.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el polisacárido tiene un peso molecular superior a 800kDa.

7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el sacárido no está ni parcial ni totalmente des-N-acetilado.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de eliminar ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes mediante el uso de precipitación.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el proceso comprende las etapas de: (a) eliminar ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes del polisacárido capsular en forma acuosa mediante el uso de precipitación alcohólica, en donde se utilizan un alcohol y un catión metálico acuoso para precipitar los ácidos nucleicos y/o las proteínas dejando el polisacárido en solución; (b) separar el material precipitado del polisacárido.

10. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde el proceso comprende además una etapa de diafiltración después de la precipitación de ácidos nucleicos y/o proteínas.

11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde el alcohol es etanol o isopropanol.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el catión metálico acuoso es ion calcio.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende además una o más etapas de filtración.

14. Un polisacárido capsular de Streptococcus agalactiae purificado obtenido por el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

15. Una composición inmunogénica, particularmente una composición de vacuna, que comprende el polisacárido capsular de la reivindicación 14.