JP2021132644A - 糖の精製 - Google Patents

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Abstract

【課題】発酵後に細菌多糖の大規模生産において使用することができるロバストで有効な精製プロセスを提供すること。【解決手段】本発明は、細菌多糖を精製するため、特に、多糖を産生する細菌の細胞溶解物から不純物を除去するための方法に関する。【選択図】図１

Description

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に出願され、．ｔｘｔ形式で電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０２１年１月２９日に作成され、３４ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ７２５９２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、細菌多糖を精製するため、特に、多糖を産生する細菌の細胞溶解物から不純物を除去するための方法に関する。
細菌多糖、特に、莢膜多糖は、様々な細菌疾患に関与する細菌の表面上に見出される重要な免疫原である。これは、それらをワクチンの設計における重要な成分であるとしてきた。それらは、特に、担体タンパク質に連結された場合、免疫応答を惹起するのに有用であることがわかっている。
細菌多糖は、典型的には、細菌（例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはＣおよびＧ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））の発酵によって生産される。
典型的には、細菌多糖は、複合培地中でのバッチ式培養、フェドバッチ式培養または連続式培養を使用して生産される。
ＷＯ２００７／０５２１６８ ＷＯ２００９／０８１２７６ ＷＯ２０１０１５１５４４ ＷＯ２０１１／０５１９１７ ＷＯ２００７０８４８５６ ＷＯ２００８／１１８７５２、１３頁、１４行〜１４頁、１０行 ＷＯ２００６／１１０３８１ ＷＯ２００７１１６０２８、１７〜２２頁 ＷＯ２０１５１１０９４１ ＷＯ２０１５１１０９４０ ＷＯ２０１４０９７０９９ ＷＯ９３／１５７６０ ＷＯ９５／０８３４８ ＷＯ９６／１２９０９４ ＷＯ２０１１０４１００３ ＷＯ２０１４０２７３０２ ＷＯ２０１５１２１７８３ ＷＯ００／１０５９９ 米国特許第４，６７３，５７４号 米国特許第４，８０８，７００号 米国特許第４，４５９，２８６号 米国特許第４，７０９，０１７号 米国特許第４，９５０，７４０号 米国特許第５，９１７，０１７号 米国特許第６，４５５，６７３号 米国特許第５，８４３，７１１号 ＷＯ２００４／０８１５１５ ＷＯ２００６／０３２４９９ ＷＯ００／３７１０５ ＷＯ００／３９２９９ ＷＯ０１／９８３３４ ＷＯ０３／０５４００７ ＷＯ２００９／０００８２６ ＥＰ０３７２５０１ ＥＰ０５９４６１０Ｂ ＥＰ０３７８８８１ ＥＰ０４２７３４７ ＷＯ９３／１７７１２ ＷＯ９４／０３２０８ ＷＯ９８／５８６６８ ＥＰ０４７１１７７ ＷＯ９１／０１１４６ ＷＯ０２／０９１９９８ ＷＯ０１／７２３３７ ＷＯ００／６１７６１ ＷＯ２００４／０８３２５１ ＷＯ０１／９８３３４ ＷＯ０３／０５４００７ ＥＰ０５９４６１０Ｂ 米国特許第５，６１４，３８２号 ＣＮ１０３４９５１６１ ＷＯ００／０７６２１ ＷＯ９９／４４６３６ ＷＯ００／５６３５８ ＧＢ−２２２０２２１ ＥＰ０６８９４５４ ＥＰ０８３５３１８ ＥＰ０７３５８９８ ＥＰ０７６１２３１ ＷＯ９９／５２５４９ ＷＯ０１／２１２０７ ＷＯ０１／２１１５２ ＷＯ００／６２８００ ＷＯ００／２３１０５ ＷＯ９９／１１２４１ ＷＯ９８／５７６５９
Ｆａｔｔｏｍら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ．５８（７）：２３６７〜７４ Ｕｃｈｉｄａら（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８〜３８４４ ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．（１９９２） Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６〜２７１３ Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６〜３８２４ Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４〜４８８７ Ｄｏｕｇｌａｓら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９（１１）：４９６７〜４９７１ Ｕｃｈｉｄａら（１９７１）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８〜１１
発酵後に細菌多糖の大規模生産において使用することができるロバストで有効な精製プロセスが必要である。
かくして、ワクチンへの組込みにとって好適な実質的に精製された細菌糖を生産するためには、細菌溶解物中の可溶性タンパク質レベルを低減し、現在の精製プロセスの非効率性を除去するための単純化された精製プロセスも必要である。
本発明は、細菌由来の糖を、発酵後の前記糖および夾雑物を含む溶液から精製するための方法であって、以下のステップ：（ａ）酸加水分解；（ｂ）１回目の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）；（ｂ）炭素濾過；（ｃ）クロマトグラフィー；および（ｄ）２回目の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）を含む、方法を提供する。
一実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の酸加水分解後に凝集ステップをさらに含む。
上記方法の別の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。一態様では、細菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のうちのいずれか１つである。さらなる態様では、細菌は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ＣおよびＧ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のうちのいずれか１つである。
上記方法の別の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。一態様では、細菌は、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のうちのいずれか１つである。別の態様では、細菌は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
Ｏ１Ｖ１バリアントに関するブロス（上）および精製されたＫｐ Ｏ−Ａｇ（下）中での遊離後のＫｐ Ｏ−ＡｇのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを描写する図である。 Ｏ１Ｖ２バリアントに関するブロス（上）および精製されたＫｐ Ｏ−Ａｇ（下）中での遊離後のＫｐ Ｏ−ＡｇのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを描写する図である。 Ｏ２Ｖ１バリアントに関するブロス（上）および精製されたＫｐ Ｏ−Ａｇ（下）中での遊離後のＫｐ Ｏ−ＡｇのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを描写する図である。 Ｏ２Ｖ２バリアントに関するブロス（上）および精製されたＫｐ Ｏ−Ａｇ（下）中での遊離後のＫｐ Ｏ−ＡｇのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを描写する図である。
本発明は、細菌由来の糖を、発酵後の前記糖および夾雑物を含む溶液から精製するための方法であって、以下のステップ：（ａ）酸加水分解；（ｂ）１回目の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）；（ｂ）炭素濾過；（ｃ）クロマトグラフィー；および（ｄ）２回目の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）を含む、方法を提供する。
一実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の酸加水分解後に凝集ステップをさらに含む。
上記方法の別の実施形態では、ステップ（ｃ）のクロマトグラフィーは、ＩＥＸ膜クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）またはその両方を含む。
上記方法の別の実施形態では、細菌は、グラム陽性細菌である。一態様では、細菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のうちのいずれか１つである。さらなる態様では、細菌は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはＣおよびＧ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のうちのいずれか１つである。
上記方法の別の実施形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。一態様では、細菌は、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のうちのいずれか１つである。別の態様では、細菌は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
さらなる態様では、細菌は、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式０１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６または式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
別の態様では、細菌は、式Ｋ．Ｏ１．１、式Ｋ．Ｏ１．２、式Ｋ．Ｏ１．３、式Ｋ．Ｏ１．４、式Ｋ．Ｏ２．１、式Ｋ．Ｏ２．２、式Ｋ．Ｏ２．３、式Ｋ．Ｏ２．４、式Ｋ．Ｏ３、式Ｋ．Ｏ４、式Ｋ．Ｏ５、式Ｋ．Ｏ７、式Ｋ．Ｏ１２または式Ｋ．Ｏ８のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含むクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
１．細菌多糖の精製プロセス
１．１ 出発材料
本発明の方法を使用して、夾雑物と一緒に細菌多糖を含む溶液から前記多糖を精製することができる。
１．１．１．細菌細胞
本発明に従って精製される細菌多糖の供給源は、細菌細胞、特に、病原性細菌である。
本発明による使用のためのグラム陽性細菌の非限定例は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはＣおよびＧ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ））、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）である。本発明と共に使用するためのグラム陰性細菌の非限定例としては、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））が挙げられる。
ある実施形態では、本発明による使用のための細菌多糖の供給源は、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）および他の種（ｓｐｐ．）；バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のボツリヌス菌（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒産生種；ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）；ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）；ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）；バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（以前は、シュードモナス・マレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ））；バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（以前は、シュードモナス・シュードマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）；クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）；クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ）；クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）；コクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ）；コウドリア・ルミナンチウム（Ｃｏｗｄｒｉａ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）（心水病）；コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）；腸管毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）−Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、および腸管細胞侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ）などの腸毒性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）群（ＥＥＣ群）；エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｊｆｅｅｎｓｉｓ）などのエールリヒア種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；リベロバクター・アフリカヌス（Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）；リベロバクター・アジアティクス（Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）；リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）などの雑多な腸内細菌；マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）；マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；マイコプラズマ・カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）；マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｓｐ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）；ペロノスクレロスポラフィリピネシス（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）；さび病菌（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）；プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）；ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）レース３、次亜種２；リケッチア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）；リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）；サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）；スクレロフトラ・レイジア・バル・ゼア（Ｓｃｈｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｙｓｓｉａｅ ｖａｒ ｚｅａｅ）；シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；ジャガイモがんしゅ病菌（Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ）；ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ｎｏｎ−０１；ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）０１； ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）および他のビブリオ属；ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）；キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）；ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）（柑橘類の斑入り萎黄病菌株）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；ならびにエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）からなる群から選択される。
精製にとって望ましい多糖を、細胞壁などの細胞成分と結合させることができる。細胞壁との結合とは、多糖が、細胞壁自体の成分である、および／または直接的、もしくは中間分子を介して間接的に、細胞壁に付着する、または細胞壁の一過的なコーティングである（例えば、ある特定の細菌株は、当業界では「エキソ多糖」としても知られる、莢膜多糖を発散する）ことを意味する。
一部の実施形態では、細菌から抽出される多糖は、莢膜多糖、莢膜下多糖、またはリポ多糖である。好ましい実施形態では、多糖は、莢膜多糖である。
ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。さらなる実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、腸管毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）−Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、または腸管細胞侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ）などの腸毒性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）群（ＥＥＣ群）の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）部分である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、尿路病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）である。
別の実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ１１１：Ｈ−およびＯ１０３：Ｈ２からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、血清型Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１およびＯ１８：Ｋ１：Ｈ７からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、血清型Ｏ４５：Ｋ１、Ｏ１７：Ｋ５２：Ｈ１８、Ｏ１９：Ｈ３４およびＯ７：Ｋ１からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１０４：Ｈ４である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１：Ｋ１２：Ｈ７である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｈ６である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１３９：Ｈ２８である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２８：Ｈ２である。
別の実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）である。
さらなる実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ１（Ｏ１）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２（Ｏ２）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２ａｃ（Ｏ２ａｃ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ３（Ｏ３）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ４（Ｏ４）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ５（Ｏ５）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ７（Ｏ７）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ８（Ｏ８）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ９（Ｏ９）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ１（Ｏ１）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２（Ｏ２）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２ａｃ（Ｏ２ａｃ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ３（Ｏ３）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ４（Ｏ４）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ５（Ｏ５）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ７（Ｏ７）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ８（Ｏ８）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ９（Ｏ９）である。
１．１．２．細菌細胞増殖
典型的には、多糖を、細菌を培地（例えば、固体または好ましくは、液体培地）中で増殖させることによって産生させる。次いで、細菌細胞を処理することによって、多糖を調製する。
したがって、ある実施形態では、本発明の方法のための出発材料は、細菌培養物、好ましくは、液体細菌培養物（例えば、発酵ブロス）である。
細菌培養物は、典型的には、バッチ式培養、フェドバッチ式培養または連続式培養によって得られる（例えば、ＷＯ２００７／０５２１６８またはＷＯ２００９／０８１２７６を参照されたい）。連続培養中に、新鮮な培地を、固定速度で培養物に添加し、細胞および培地を、一定の培養物容量を維持する速度で除去する。
生物の集団は、種バイアルから種ボトルへとスケールアップされることが多く、生産規模の発酵容量に達するまで、大容量の１または複数の種発酵器を介して継代される。
１．１．３ 出発材料を得るための細菌細胞の予備処理
一般には、少量の多糖が、細菌増殖中に培養培地中に放出され、したがって、出発材料は、遠心分離された細菌培養物に由来する上清であってもよい。しかしながら、典型的には、出発材料は、多糖が放出されるように、細菌自体を処理することによって調製されるであろう。
場合により、細胞増殖後、細菌細胞を不活化する。これは、特に、病原性細菌が使用される場合に当てはまる。不活化のための好適な方法は、例えば、Ｆａｔｔｏｍら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ．５８（７）：２３６７〜７４に記載されたような、例えば、フェノール：エタノールを用いた処理である。以下の実施形態では、細菌細胞を予め不活化するか、または不活化しなくてもよい。
多糖を、化学的、物理的または酵素的処理を含む様々な方法によって、細菌から放出させることができる（例えば、ＷＯ２０１０１５１５４４、ＷＯ２０１１／０５１９１７またはＷＯ２００７０８４８５６を参照されたい）。
ある実施形態では、細菌細胞（不活化された、または不活化されていない）を、その元の培養培地中の懸濁液中で処理する。プロセスは、したがって、その元の培養培地中の懸濁液中の細胞から始まってもよい。
別の実施形態では、細菌細胞を、莢膜多糖の放出の前に遠心分離する。プロセスは、したがって、湿った細胞ペーストの形態にある細胞から始まってもよい。あるいは、細胞を、乾燥形態で処理する。しかしながら、典型的には、遠心分離後、細菌細胞を、プロセスにおける次のステップにとって好適である水性媒体、例えば、緩衝剤または蒸留水中に再懸濁する。細胞を、再懸濁の前にこの媒体で洗浄してもよい。
ある実施形態では、細菌細胞（例えば、その元の培養培地中の懸濁液中にある、湿った細胞ペーストの形態にある、乾燥形態にある、または遠心分離後に水性媒体中に再懸濁された）を、溶解剤で処理する。「溶解剤」は、細胞壁破壊を助ける任意の薬剤である。ある実施形態では、溶解剤は、洗剤である。本明細書で使用される用語「洗剤」とは、細菌細胞の溶解を誘導することができる任意の陰イオン性または陽イオン性洗剤を指す。本発明の方法の中での使用のためのそのような洗剤の代表的な例としては、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｎ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム、およびサポニンが挙げられる（ＷＯ２００８／１１８７５２、１３頁、１４行〜１４頁、１０行を参照されたい）。本発明の一実施形態では、細菌細胞を溶解するために使用される溶解剤は、ＤＯＣである。
ある実施形態では、溶解剤は、非動物由来溶解剤である。一実施形態では、非動物由来溶解剤は、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシ５ポリ（オキシエチレン）エタノール（例えば、ＩＧＥＰＡＬ、ＣＡ−６３０、ＣＡＳ番号９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、オクチルフェノールエチレンオキシド凝縮物（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコレート、ヒオデオキシコレート、グリコデオキシコレート、タウロデオキシコレート、タウロケノデオキシコレート、およびコレートからなる群から選択される。ある実施形態では、非動物由来溶解剤は、ＮＬＳである。
ある実施形態では、細菌細胞（例えば、その元の培養培地中の懸濁液中にある、湿った細胞ペーストの形態にある、乾燥形態にある、または遠心分離後に水性媒体中に再懸濁された）を、多糖が放出されるように酵素的に処理する。ある実施形態では、細菌細胞を、リソスタフィン、ムタノリシン、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびムタノリシンと、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとの組合せからなる群から選択される酵素によって処理する。これらのものは、細菌ペプチドグリカンに作用して、本発明と共に使用するための莢膜糖を放出させるが、群特異的炭水化物抗原の放出をももたらす。ある実施形態では、細菌細胞を、ＩＩ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ２）によって処理する。
場合により、多糖の放出後、酵素を不活化する。不活化のための好適な方法は、例えば、熱処理または酸処理である。
ある実施形態では、細菌細胞（例えば、その元の培養培地中の懸濁液中にある、湿った細胞ペーストの形態にある、乾燥形態にある、または遠心分離後に水性媒体中に再懸濁された）を、多糖が放出されるようにオートクレーブする。
さらなる実施形態では、細菌細胞（例えば、その元の培養培地中の懸濁液中にある、湿った細胞ペーストの形態にある、乾燥形態にある、または遠心分離後に水性媒体中に再懸濁された）を、多糖が放出されるように化学的に処理する。そのような実施形態では、化学的処理は、例えば、塩基または酸を使用する加水分解であってもよい（例えば、ＷＯ２００７０８４８５６を参照されたい）。
ある実施形態では、細菌細胞の化学的処理は、塩基抽出（例えば、水酸化ナトリウムを使用する）である。塩基抽出は、莢膜糖と、ペプチドグリカン骨格との間のホスホジエステル結合を切断することができる。ある実施形態では、塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＫｚＣＯ３、ＫＣＮ、Ｅｔ３Ｎ、ＮＨ３、ＨｚＮ２Ｈ２、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔおよびＫＯｔＢｕからなる群から選択される。塩基処理後、反応混合物を中和することができる。これを、酸の添加によって達成することができる。ある実施形態では、塩基処理後、反応混合物を、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、クエン酸、酢酸、亜硝酸、および硫酸からなる群から選択される酸によって中和する。
ある実施形態では、細菌細胞の化学的処理は、酸処理（例えば、硫酸）である。ある実施形態では、酸は、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、クエン酸、酢酸、亜硝酸、および硫酸からなる群から選択される。酸処理後、反応混合物を中和することができる。これを、塩基の添加によって達成することができる。ある実施形態では、酸処理後、反応混合物を、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＫｚＣＯ３、ＫＣＮ、Ｅｔ３Ｎ、ＮＨ３、ＨｚＮ２Ｈ２、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔおよびＫＯｔＢｕからなる群から選択される塩基によって中和する。
１．２ 凝集
本発明の方法は、凝集ステップを含む。本発明者らは、このプロセスが迅速かつ単純であり、夾雑物が少ない精製された多糖をもたらすことを見出した。
したがって、本発明の方法では、上記のセクション１．１の方法のいずれかによって得られた溶液を、凝集によって処理する。
本発明では、用語「凝集」とは、コロイドが、凝集剤の添加のため、フロックまたはフレークの形態で懸濁液から出てくるプロセスを指す。
凝集ステップは、「凝集剤」を、夾雑物と共に細菌多糖を含む溶液に添加することを含む。ある実施形態では、夾雑物は、細菌細胞の破片、細菌細胞のタンパク質および核酸を含む。ある実施形態では、夾雑物は、細菌細胞のタンパク質および核酸を含む。
以下にさらに開示されるように、凝集ステップは、凝集剤の添加の前または後に、ｐＨの調整をさらに含んでもよい。特に、溶液を酸性化することができる。
さらに、凝集剤の添加および／またはｐＨの調整を、所望のレベルに調整された温度で実施することができる。
以下のステップを、任意の順序で実施することができる：
−凝集剤の添加、次いで、ｐＨの調整、次いで、温度の調整または；
−凝集剤の添加、次いで、温度の調整、次いで、ｐＨの調整または；
−ｐＨの調整、次いで、凝集剤の添加、次いで、温度の調整または；
−ｐＨの調整、次いで、温度の調整、次いで、凝集剤の添加または；
−温度の調整、次いで、凝集剤の添加、次いで、ｐＨの調整または；
−温度の調整、次いで、ｐＨの調整、次いで、凝集剤の添加。
さらに、凝集剤の添加および／またはｐＨの調整の後、溶液を、いくらかの時間にわたって保持して、下流のプロセシングの前にフロックを沈降させることができる。
本発明では、「凝集剤」とは、夾雑物と一緒に目的の多糖を含む溶液中で、目的の多糖を、溶液中に留まらせながら、コロイドおよび他の懸濁された粒子の、フロックまたはフレークの形態での凝集を引き起こすことによって凝集を許容または促進することができる薬剤を指す。
本発明のある実施形態では、凝集剤は、多価陽イオンを含む。ある実施形態では、凝集剤は、多価陽イオンである。好ましい実施形態では、前記多価陽イオンは、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される。ある実施形態では、凝集剤は、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される少なくとも２つの多価陽イオンの混合物である。ある実施形態では、凝集剤は、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される少なくとも３つの多価陽イオンの混合物である。ある実施形態では、凝集剤は、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される４つの多価陽イオンの混合物である。
ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される薬剤を含む。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。ある実施形態では、凝集剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバンを含む。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバンである。ある実施形態では、凝集剤は、カリウムミョウバンを含む。ある実施形態では、凝集剤は、カリウムミョウバンである。ある実施形態では、凝集剤は、ナトリウムミョウバンを含む。ある実施形態では、凝集剤は、ナトリウムミョウバンである。ある実施形態では、凝集剤は、アンモニウムミョウバンを含む。ある実施形態では、凝集剤は、アンモニウムミョウバンである。
ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される薬剤の混合物（例えば、２、３または４つの薬剤）である。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。
ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される２つの薬剤の混合物である。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも３つの薬剤の混合物である。
ある実施形態では、凝集剤は、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される薬剤を含む。ある実施形態では、凝集剤は、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される。
凝集剤の濃度は、使用される薬剤、目的の多糖および凝集ステップのパラメータ（例えば、温度）に依存し得る。
凝集剤がミョウバンを含むか、またはミョウバンである実施形態では、約０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度を使用することができる。好ましくは、約０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度を使用する。さらにより好ましくは、約１〜５％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度を使用する。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．２５％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１．０％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２．０％（ｗ／ｖ）、約２．５％（ｗ／ｖ）、約３．０％（ｗ／ｖ）、約３．５％（ｗ／ｖ）、約４．０％（ｗ／ｖ）、約４．５％（ｗ／ｖ）、約５．０％（ｗ／ｖ）、約５．５％（ｗ／ｖ）、約６．０％（ｗ／ｖ）、約６．５％（ｗ／ｖ）、約７．０％（ｗ／ｖ）、約７．５％（ｗ／ｖ）、約８．０％（ｗ／ｖ）、約８．５％（ｗ／ｖ）、約９．０％（ｗ／ｖ）、約９．５％（ｗ／ｖ）または約１０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度が使用される。ある実施形態では、約１０．５％（ｗ／ｖ）、約１１．０％（ｗ／ｖ）、約１１．５％（ｗ／ｖ）、約１２．０％（ｗ／ｖ）、約１２．５％（ｗ／ｖ）、約１３．０％（ｗ／ｖ）、約１３．５％（ｗ／ｖ）、約１４．０％（ｗ／ｖ）、約１４．５％（ｗ／ｖ）、約１５．０％（ｗ／ｖ）、約１５．５％（ｗ／ｖ）、約１６．０％（ｗ／ｖ）、約１６．５％（ｗ／ｖ）、約１７．０％（ｗ／ｖ）、約１７．５％（ｗ／ｖ）、約１８．０％（ｗ／ｖ）、約１８．５％（ｗ／ｖ）、約１９．０％（ｗ／ｖ）、約１９．５％（ｗ／ｖ）または約２０．０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度が使用される。ある実施形態では、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１．０％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２．０％（ｗ／ｖ）、約２．５％（ｗ／ｖ）、約３．０％（ｗ／ｖ）、約３．５％（ｗ／ｖ）、約４．０％（ｗ／ｖ）、約４．５％（ｗ／ｖ）または約５．０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度が使用される。ある実施形態では、約１．０％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２．０％（ｗ／ｖ）、約２．５％（ｗ／ｖ）、約３．０％（ｗ／ｖ）、約３．５％（ｗ／ｖ）または約４．０％（ｗ／ｖ）の凝集剤濃度が使用される。
本発明の一部の実施形態では、凝集剤は、ある特定の期間にわたって添加される。本発明の一部の実施形態では、凝集剤は、数秒（例えば、１〜１０秒）〜約１カ月の期間にわたって添加される。本発明の一部の実施形態では、凝集剤は、約２秒〜約２週間の期間にわたって添加される。本発明の一部の実施形態では、凝集剤は、約１分〜約１週間の期間にわたって添加される。一部の実施形態では、凝集剤は、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間〜約２日の期間にわたって添加される。
したがって、ある特定の実施形態では、凝集剤は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の期間にわたって添加される。
好ましくは、凝集剤は、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の期間にわたって添加される。
ある特定の実施形態では、凝集剤は、約１５分〜約３時間の期間にわたって添加される。ある特定の実施形態では、凝集剤は、約３０分〜約１２０分の期間にわたって添加される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、凝集剤を、約２秒、約１０秒、約３０秒、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日または約１５日の期間にわたって添加してもよい。
ある実施形態では、凝集剤は、撹拌せずに添加される。別の実施形態では、凝集剤は、撹拌下で添加される。別の実施形態では、凝集剤は、穏やかな撹拌下で添加される。別の実施形態では、凝集剤は、激しい撹拌下で添加される。
本発明者らはさらに驚くべきことに、凝集が酸性ｐＨで実施した場合に改善されることに気付いた。
したがって、本発明の実施形態では、凝集ステップは、７．０、６．０、５．０または４．０より下のｐＨで実施される。本発明の特定の実施形態では、凝集ステップは、７．０〜１．０のｐＨで実施される。ある実施形態では、凝集ステップは、５．５〜２．５、５．０〜２．５、４．５〜２．５、４．０〜２．５、５．５〜３．０、５．０〜３．０、４．５〜３．０、４．０〜３．０、５．５〜３．５、５．０〜３．５、４．５〜３．５または４．０〜３．５のｐＨで実施される。ある実施形態では、凝集ステップは、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、約３．０、約２．５、約２．０、約１．５または約１．０のｐＨで実施される。ある実施形態では、凝集ステップは、約４．０、約３．５、約３．０または約２．５のｐＨで実施される。ある実施形態では、凝集ステップは、約３．５のｐＨで実施される。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、前記酸性ｐＨは、上記のセクション１．１の方法のいずれかによって得られたか、または酸を用いてセクション１．２に開示されたようにさらに明澄化された溶液を酸性化することによって得られる。ある実施形態では、前記酸は、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、クエン酸、酢酸、亜硝酸、および硫酸からなる群から選択される。ある実施形態では、前記酸は、アミノ酸である。ある実施形態では、前記酸は、グリシン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸である。ある実施形態では、前記酸は、ＨＣｌ（塩酸）である。ある実施形態では、前記酸は、硫酸である。
ある実施形態では、酸は、撹拌せずに添加される。好ましくは、酸は、撹拌下で添加される。ある実施形態では、酸は、穏やかな撹拌下で添加される。ある実施形態では、酸は、激しい撹拌下で添加される。
本発明の一部の実施形態では、凝集剤の添加（および任意選択の酸性化）の後、溶液を、いくらかの時間にわたって保持して、下流のプロセシングの前にフロックを沈降させる。
本発明の一部の実施形態では、凝集ステップは、数秒（例えば、２〜１０秒）〜約１分の沈降時間を用いて実施される。好ましくは、沈降時間は、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約９５分、少なくとも約１００分、少なくとも約１０５分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１１５分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１２５分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１３５分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１４５分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１５５分または少なくとも約１６０分である。好ましくは、沈降時間は、１週間未満であるが、沈降時間は、より長くてもよい。
したがって、ある特定の実施形態では、沈降時間は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１２０分、約１４０分、約１６０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分、約１３８０分、約１４４０分、約２日、約３日、約４日、約５日または約６日〜１週間である。
本発明の一部の実施形態では、沈降時間は、数秒（例えば、１〜１０秒）〜約１カ月である。一部の実施形態では、沈降時間は、約２秒〜約２週間である。本発明の一部の実施形態では、沈降時間は、約１分〜約１週間である。一部の実施形態では、沈降時間は、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間〜約２日である。
したがって、ある特定の実施形態では、沈降時間は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日である。
好ましくは、沈降時間は、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日である。
ある特定の実施形態では、沈降時間は、約１５分〜約３時間である。ある特定の実施形態では、沈降時間は、約３０分〜約１２０分である。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある特定の実施形態では、沈降時間は、約２秒、約１０秒、約３０秒、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日または約１５日である。
好ましくは、沈降時間は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約６０分、約９０分、約１２０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分、約１３８０分または約１４４０分〜２日である。ある特定の実施形態では、沈降時間は、約５分〜約１日である。ある特定の実施形態では、沈降時間は、約５分〜約１２０分である。
沈降時間は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分または約１６０分であってもよい。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、任意選択の沈降ステップは、撹拌せずに行われる。ある実施形態では、任意選択の沈降ステップは、撹拌下で行われる。別の実施形態では、任意選択の沈降ステップは、穏やかな撹拌下で行われる。別の実施形態では、任意選択の沈降ステップは、激しい撹拌下で行われる。
本発明のある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約４℃〜約３０℃の温度で実施される。ある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃で実施される。ある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約２０℃の温度で実施される。本発明者らは驚くべきことに、凝集が、高温で実施した場合にさらに改善され得ることに気付いた。したがって、本発明の特定の実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される。ある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。ある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、凝集剤の添加、溶液の沈降および／またはｐＨの調整は、約５０℃の温度で実施される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、凝集剤の添加は、上記の温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、凝集剤の添加後の溶液の沈降は、上記の温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、ｐＨの調整は、上記の温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、凝集剤の添加および凝集剤の添加後の溶液の沈降は、上記温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、凝集剤の添加およびｐＨの調整は、上記の温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、凝集剤の添加、凝集剤の添加後の溶液の沈降およびｐＨの調整は、上記の温度のいずれかで実施される。
ある実施形態では、凝集ステップは、ｐＨを調整せずに凝集剤を添加すること（上記で開示されたように）を含む。
ある実施形態では、凝集ステップは、ｐＨを調整せずに、凝集剤を添加すること、および溶液を沈降させること（上記で開示されたように）を含む。
ある実施形態では、凝集ステップは、凝集剤を添加すること、ｐＨを調整すること、および溶液を沈降させること（上記で開示されたように）を含む。ある実施形態では、凝集剤は、ｐＨを調整する前に添加される。別の実施形態では、ｐＨは、凝集剤を添加する前に調整される。
ある実施形態では、凝集ステップは、凝集剤を添加すること、溶液を沈降させること、およびｐＨを調整すること（上記で開示されたように）を含む。ある実施形態では、凝集剤の添加および溶液の沈降は、ｐＨを調整する前に行われる。別の実施形態では、ｐＨは、凝集剤を添加し、溶液を沈降させる前に調整される。ある実施形態では、凝集剤の添加およびｐＨの調整は、溶液を沈降させる前に行われる。別の実施形態では、ｐＨは、凝集剤を添加し、溶液を沈降させる前に調整される。
ある実施形態では、凝集ステップは、凝集剤を添加すること、ｐＨを調整すること、および温度を調整すること（上記で開示されたように）を含む。
これらのステップを、任意の順序で実施することができる：
−凝集剤の添加、次いで、ｐＨの調整、次いで、温度の調整または；
−凝集剤の添加、次いで、温度の調整、次いで、ｐＨの調整または；
−ｐＨの調整、次いで、凝集剤の添加、次いで、温度の調整または；
−ｐＨの調整、次いで、温度の調整、次いで、凝集剤の添加または；
−温度の調整、次いで、凝集剤の添加、次いで、ｐＨの調整または；
−温度の調整、次いで、ｐＨの調整、次いで、凝集剤の添加。
さらに、凝集剤の添加および／またはｐＨの調整の後、溶液を、いくらかの時間にわたって保持して、下流のプロセシングの前にフロックを沈降させることができる。
１．３．固体／液体分離
凝集した材料を、任意の好適な固体／液体分離法によって目的の多糖から分離することができる。
したがって、本発明の実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、デカンテーション、沈降化、濾過または遠心分離によって明澄化する。ある実施形態では、次いで、多糖含有溶液を、保存および／またはさらなるプロセシングのために収集する。
本発明の実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、デカンテーションによって明澄化する。フロックを沈降させるために液体間に十分な密度差がある場合、液体を分離するためにデカンターが使用される。操作するデカンターにおいて、３つの異なるゾーンが存在するであろう：透明な重い液体、分離している分散した液体（分散ゾーン）、および透明な軽い液体。清浄な溶液を産生するために、一般的には、少量の溶液を容器中に残す必要がある。デカンターを、連続的操作のために設計することができる。
本発明の実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、沈降化によって明澄化する（沈降）。沈降化は、重力沈降による液体混合物から透明な流体およびより高い固体含量のスラリーへの懸濁された固体粒子の分離である。沈降化を、増粘剤、明澄化剤または分級器中で行うことができる。増粘および明澄化は、大量の液体の処理のために使用される場合、比較的安価なプロセスであるため、それらを、濾過に対する供給原料の予備濃縮のために使用することができる。
本発明の実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、遠心分離によって明澄化する。ある実施形態では、前記遠心分離は、連続遠心分離である。ある実施形態では、前記遠心分離は、バケット遠心分離である。ある実施形態では、次いで、多糖含有上清を、保存および／またはさらなるプロセシングのために収集する。
一部の実施形態では、懸濁液を、約１，０００ｇ、約２，０００ｇ、約３，０００ｇ、約４，０００ｇ、約５，０００ｇ、約６，０００ｇ、約８，０００ｇ、約９，０００ｇ、約１０，０００ｇ、約１１，０００ｇ、約１２，０００ｇ、約１３，０００ｇ、約１４，０００ｇ、約１５，０００ｇ、約１６，０００ｇ、約１７，０００ｇ、約１８，０００ｇ、約１９，０００ｇ、約２０，０００ｇ、約２５，０００ｇ、約３０，０００ｇ、約３５，０００ｇ、約４０，０００ｇ、約５０，０００ｇ、約６０，０００ｇ、約７０，０００ｇ、約８０，０００ｇ、約９０，０００ｇ、約１００，０００ｇ、約１２０，０００ｇ、約１４０，０００ｇ、約１６０，０００ｇまたは約１８０，０００ｇで遠心分離する。一部の実施形態では、懸濁液を、約８，０００ｇ、約９，０００ｇ、約１０，０００ｇ、約１１，０００ｇ、約１２，０００ｇ、約１３，０００ｇ、約１４，０００ｇ、約１５，０００ｇ、約１６，０００ｇ、約１７，０００ｇ、約１８，０００ｇ、約１９，０００ｇ、約２０，０００ｇまたは約２５，０００ｇで遠心分離する。
一部の実施形態では、懸濁液を、約５，０００ｇ〜約２５，０００ｇで遠心分離する。一部の実施形態では、懸濁液を、約８，０００ｇ〜約２０，０００ｇで遠心分離する。一部の実施形態では、懸濁液を、約１０，０００ｇ〜約１５，０００ｇで遠心分離する。一部の実施形態では、懸濁液を、約１０，０００ｇ〜約１２，０００ｇで遠心分離する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
一部の実施形態では、懸濁液を、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも６５分間、少なくとも７０分間、少なくとも７５分間、少なくとも８０分間、少なくとも８５分間、少なくとも９０分間、少なくとも９５分間、少なくとも１００分間、少なくとも１０５分間、少なくとも１１０分間、少なくとも１１５分間、少なくとも１２０分間、少なくとも１２５分間、少なくとも１３０分間、少なくとも１３５分間、少なくとも１４０分間、少なくとも１４５分間、少なくとも１５０分間、少なくとも１５５分間または少なくとも１６０分間、遠心分離する。好ましくは、遠心分離時間は、２４時間未満である。
したがって、ある特定の実施形態では、懸濁液を、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２２０、約２４０、約３００、約３６０、約４２０、約４８０、約５４０、約６００、約６６０、約７２０、約７８０、約８４０、約９００、約９６０、約１０２０、約１０８０、約１１４０、約１２００、約１２６０、約１３２０または約１３８０分〜１４４０分間、遠心分離する。
好ましくは、懸濁液を、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１８０、約２４０、約３００、約３６０、約４２０、約４８０または約５４０分〜約６００分間、遠心分離する。ある特定の実施形態では、懸濁液を、約５分〜約３時間、遠心分離する。ある特定の実施形態では、懸濁液を、約５分〜約１２０分、遠心分離する。
懸濁液を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分〜約１６０分間、遠心分離してもよい。
懸濁液を、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分または約５５分〜約６０分間、遠心分離してもよい。
懸濁液を、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２２０、約２４０、約３００、約３６０、約４２０、約４８０、約５４０、約６００、約６６０、約７２０、約７８０、約８４０、約９００、約９６０、約１０２０、約１０８０、約１１４０、約１２００、約１２６０、約１３２０分、約１３８０分または約１４４０分間、遠心分離してもよい。
懸濁液を、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分または約１６０分間、遠心分離してもよい。
懸濁液を、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分または約６０分間、遠心分離してもよい。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
本発明の実施形態では、遠心分離は、連続遠心分離である。前記実施形態では、供給速度は、５０〜５０００ｍｌ／ｍｉｎ、１００〜４０００ｍｌ／ｍｉｎ、１５０〜３０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎ、２５０〜２０００ｍｌ／ｍｉｎ、３００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、３００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、４００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜２０００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎまたは１０００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎであってもよい。
ある実施形態では、供給速度は、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１６５０、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３２５０、約３５００、約３７５０、約４０００、約４２５０、約４５００または約５０００ｍｌ／ｍｉｎであってもよい。
本発明の実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、濾過によって明澄化する。濾過においては、粒子を保持し、透明な濾液を通過させる多孔性媒体に混合物を通過させることによって、液体中の懸濁された固体粒子を除去する。濾過は、重力によりスクリーン上または真空、圧力もしくは遠心分離によりフィルター上で実施される。固体を、脱水濾過である、フィルター媒体の表面上に保持するか、または深層濾過である、フィルター媒体内に捕捉することができる。ある実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、精密濾過によって明澄化する。ある実施形態では、精密濾過は、接線流精密濾過である。別の実施形態では、精密濾過は、デッドエンド濾過（垂直濾過）である。ある実施形態では、精密濾過は、ＤＥダイアトマイトとしても知られる、珪藻土（ＤＥ）をフィルター補助剤として使用して、固体／液体分離を容易にし、その効率を増強するデッドエンド濾過である。したがって、ある実施形態では、凝集後、懸濁液（上記のセクション１．２で得られたもの）を、珪藻土（ＤＥ）を含むデッドエンド精密濾過によって明澄化する。ＤＥを、深層フィルターの不可欠な部分としてデッドエンドフィルター中に含浸させる（または含有させる）ことができる。
別の形式では、ＤＥを、凝集溶液（セクション１．２の後に得られたもの）に粉末形態で添加することができる。後者の場合、ＤＥで処理された凝集溶液を、深層濾過によってさらに明澄化することができる。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．４５〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、または約１．７５〜２μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．４５〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．４５μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜５０００Ｌ／ｍ２、２００〜５０００Ｌ／ｍ２、３００〜５０００Ｌ／ｍ２、４００〜５０００Ｌ／ｍ２、５００〜５０００Ｌ／ｍ２、７５０〜５０００Ｌ／ｍ２、１０００〜５０００Ｌ／ｍ２、１５００〜５０００Ｌ／ｍ２、２０００〜５０００Ｌ／ｍ２、３０００〜５０００Ｌ／ｍ２または４０００〜５０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜２５００Ｌ／ｍ２、２００〜２５００Ｌ／ｍ２、３００〜２５００Ｌ／ｍ２、４００〜２５００Ｌ／ｍ２、５００〜２５００Ｌ／ｍ２、７５０〜２５００Ｌ／ｍ２、１０００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５００〜２５００Ｌ／ｍ２、または２０００〜２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１５００Ｌ／ｍ２、２００〜１５００Ｌ／ｍ２、３００〜１５００Ｌ／ｍ２、４００〜１５００Ｌ／ｍ２、５００〜１５００Ｌ／ｍ２、７５０〜１５００Ｌ／ｍ２または１０００〜１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１２５０Ｌ／ｍ２、２００〜１２５０Ｌ／ｍ２、３００〜１２５０Ｌ／ｍ２、４００〜１２５０Ｌ／ｍ２、５００〜１２５０Ｌ／ｍ２、７５０〜１２５０Ｌ／ｍ２または１０００〜１２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜７５０Ｌ／ｍ２、２００〜７５０Ｌ／ｍ２、３００〜７５０Ｌ／ｍ２、４００〜７５０Ｌ／ｍ２または５００〜７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜６００Ｌ／ｍ２、２００〜６００Ｌ／ｍ２、３００〜６００Ｌ／ｍ２、４００〜６００Ｌ／ｍ２または４００〜６００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１５５０、約１６００、約１６５０、約１７００、約１７５０、約１８００、約１８５０、約１９００、約１９５０、約２０００、約２０５０、約２１００、約２１５０、約２２００、約２２５０、約２３００、約２３５０、約２４００、約２４５０または約２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の固体／液体分離法を、独立形式で、または任意の順序で２つの組合せで、または任意の順序で３つの組合せで使用することができる。
１．４ 濾過（例えば、深層濾過）
一度、上記のセクション１．２の凝集ステップおよび／または上記のセクション１．３の固体／液体分離ステップによって溶液を処理したら、多糖含有溶液（例えば、上清）を、場合によりさらに明澄化することができる。
ある実施形態では、溶液を濾過し、それによって、さらに明澄化された溶液を産生する。ある実施形態では、濾過を、上記のセクション１．２の方法のいずれかによって得られた溶液に直接適用する。ある実施形態では、濾過を、上記のセクション１．３に記載の固体／液体分離ステップによってさらに明澄化された溶液に適用する。
ある実施形態では、深層濾過、活性炭を通す濾過、サイズ濾過、透析濾過および限外濾過からなる群から選択される濾過ステップによって、溶液を処理する。ある実施形態では、透析濾過ステップ、特に、接線流濾過によって、溶液を処理する。ある実施形態では、深層濾過ステップによって溶液を処理する。
深層フィルターは、多孔性濾過媒体を使用して、媒体の表面上だけというよりもむしろ、媒体全体にわたって粒子を保持する。濾過媒体の複雑かつチャネル様の性質のため、粒子は、表面上とは反対に、その構造内で媒体全体にわたって保持される。
ある実施形態では、深層フィルター設計が、カセット、カートリッジ、ディープベッド（例えば、サンドフィルター）およびレンズ状フィルターからなる群から選択される深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜１００μｍ、約０．０５〜１００μｍ、約０．１〜１００μｍ、約０．２〜１００μｍ、約０．３〜１００μｍ、約０．４〜１００μｍ、約０．５〜１００μｍ、約０．６〜１００μｍ、約０．７〜１００μｍ、約０．８〜１００μｍ、約０．９〜１００μｍ、約１〜１００μｍ、約１．２５〜１００μｍ、約１．５〜１００μｍ、約１．７５〜１００μｍ、約２〜１００μｍ、約３〜１００μｍ、約４〜１００μｍ、約５〜１００μｍ、約６〜１００μｍ、約７〜１００μｍ、約８〜１００μｍ、約９〜１００μｍ、約１０〜１００μｍ、約１５〜１００μｍ、約２０〜１００μｍ、約２５〜１００μｍ、約３０〜１００μｍ、約４０〜１００μｍ、約５０〜１００μｍまたは約７５〜１００μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜７５μｍ、約０．０５〜７５μｍ、約０．１〜７５μｍ、約０．２〜７５μｍ、約０．３〜７５μｍ、約０．４〜７５μｍ、約０．５〜７５μｍ、約０．６〜７５μｍ、約０．７〜７５μｍ、約０．８〜７５μｍ、約０．９〜７５μｍ、約１〜７５μｍ、約１．２５〜７５μｍ、約１．５〜７５μｍ、約１．７５〜７５μｍ、約２〜７５μｍ、約３〜７５μｍ、約４〜７５μｍ、約５〜７５μｍ、約６〜７５μｍ、約７〜７５μｍ、約８〜７５μｍ、約９〜７５μｍ、約１０〜７５μｍ、約１５〜７５μｍ、約２０〜７５ｍ、約２５〜７５μｍ、約３０〜７５μｍ、約４０〜７５μｍまたは約５０〜７５μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜５０μｍ、約０．０５〜５０μｍ、約０．１〜５０μｍ、約０．２〜５０μｍ、約０．３〜５０μｍ、約０．４〜５０μｍ、約０．５〜５０μｍ、約０．６〜５０μｍ、約０．７〜５０μｍ、約０．８〜５０μｍ、約０．９〜５０μｍ、約１〜５０μｍ、約１．２５〜５０μｍ、約１．５〜５０μｍ、約１．７５〜５０μｍ、約２〜５０μｍ、約３〜５０μｍ、約４〜５０μｍ、約５〜５０μｍ、約６〜５０μｍ、約７〜５０μｍ、約８〜５０μｍ、約９〜５０μｍ、約１０〜５０μｍ、約１５〜５０μｍ、約２０〜５０μｍ、約２５〜５０μｍ、約３０〜５０μｍ、約４０〜５０μｍ、約５０〜５０μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜２５μｍ、約０．０５〜２５μｍ、約０．１〜２５μｍ、約０．２〜２５μｍ、約０．３〜２５μｍ、約０．４〜２５μｍ、約０．５〜２５μｍ、約０．６〜２５μｍ、約０．７〜２５μｍ、約０．８〜２５μｍ、約０．９〜２５μｍ、約１〜２５μｍ、約１．２５〜２５μｍ、約１．５〜２５μｍ、約１．７５〜２５μｍ、約２〜２５μｍ、約３〜２５μｍ、約４〜２５μｍ、約５〜２５μｍ、約６〜２５μｍ、約７〜２５μｍ、約８〜２５μｍ、約９〜２５μｍ、約１０〜２５μｍ、約１５〜２５μｍまたは約２０〜２５μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜１０μｍ、約０．０５〜１０μｍ、約０．１〜１０μｍ、約０．２〜１０μｍ、約０．３〜１０μｍ、約０．４〜１０μｍ、約０．５〜１０μｍ、約０．６〜１０μｍ、約０．７〜１０μｍ、約０．８〜１０μｍ、約０．９〜１０μｍ、約１〜１０μｍ、約１．２５〜１０μｍ、約１．５〜１０μｍ、約１．７５〜１０μｍ、約２〜１０μｍ、約３〜１０μｍ、約４〜１０μｍ、約５〜１０μｍ、約６〜１０μｍ、約７〜１０μｍ、約８〜１０μｍまたは約９〜１０μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０１〜８μｍ、約０．０５〜８μｍ、約０．１〜８μｍ、約０．２〜８μｍ、約０．３〜８μｍ、約０．４〜８μｍ、約０．５〜８μｍ、約０．６〜８μｍ、約０．７〜８μｍ、約０．８〜８μｍ、約０．９〜８μｍ、約１〜８μｍ、約１．２５〜８μｍ、約１．５〜８μｍ、約１．７５〜８μｍ、約２〜８μｍ、約３〜８μｍ、約４〜８μｍ、約５〜８μｍ、約６〜８μｍまたは約７〜８μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが約０．０１〜５μｍ、約０．０５〜５μｍ、約０．１〜５μｍ、約０．２〜５μｍ、約０．３〜５μｍ、約０．４〜５μｍ、約０．５〜５μｍ、約０．６〜５μｍ、約０．７〜５μｍ、約０．８〜５μｍ、約０．９〜５μｍ、約１〜５μｍ、約１．２５〜５μｍ、約１．５〜５μｍ、約１．７５〜５μｍ、約２〜５μｍ、約３〜５μｍまたは約４〜５μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、約１．７５〜２μｍ、約２〜２μｍ、約３〜２μｍまたは約４〜２μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約０．０５〜５０μｍ、０．１〜２５μｍ、０．２〜１０μｍ、０．１〜１０μｍ、０．２〜５μｍまたは０．２５〜１μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、深層フィルターが、1〜２５００Ｌ／ｍ２、５〜２５００Ｌ／ｍ２、１０〜２５００Ｌ／ｍ２、２５〜２５００Ｌ／ｍ２、５０〜２５００Ｌ／ｍ２、７５〜２５００Ｌ／ｍ２、１００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５０〜２５００Ｌ／ｍ２、２００〜２５００Ｌ／ｍ２、３００〜２５００Ｌ／ｍ２、４００〜２５００Ｌ／ｍ２、５００〜２５００Ｌ／ｍ２、７５０〜２５００Ｌ／ｍ２、１０００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５００〜２５００Ｌ／ｍ２または２０００〜２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約１〜１０００Ｌ／ｍ２、５〜１０００Ｌ／ｍ２、１０〜１０００Ｌ／ｍ２、２５〜１０００Ｌ／ｍ２、５０〜１０００Ｌ／ｍ２、７５〜１０００Ｌ／ｍ２、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、１５０〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、約１〜７５０Ｌ／ｍ２、５〜７５０Ｌ／ｍ２、１０〜７５０Ｌ／ｍ２、２５〜７５０Ｌ／ｍ２、５０〜７５０Ｌ／ｍ２、７５〜７５０Ｌ／ｍ２、１００〜７５０Ｌ／ｍ２、１５０〜７５０Ｌ／ｍ２、２００〜７５０Ｌ／ｍ２、３００〜７５０Ｌ／ｍ２、４００〜７５０Ｌ／ｍ２または５００〜７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、1〜５００Ｌ／ｍ２、５〜５００Ｌ／ｍ２、１０〜５００Ｌ／ｍ２、２５〜５００Ｌ／ｍ２、５０〜５００Ｌ／ｍ２、７５〜５００Ｌ／ｍ２、１００〜５００Ｌ／ｍ２、１５０〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、１〜４００Ｌ／ｍ２、５〜４００Ｌ／ｍ２、１０〜４００Ｌ／ｍ２、２５〜４００Ｌ／ｍ２、５０〜４００Ｌ／ｍ２、７５〜４００Ｌ／ｍ２、１００〜４００Ｌ／ｍ２、１５０〜４００Ｌ／ｍ２、２００〜４００Ｌ／ｍ２または３００〜４００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、１〜３００Ｌ／ｍ２、５〜３００Ｌ／ｍ２、１０〜３００Ｌ／ｍ２、２５〜３００Ｌ／ｍ２、５０〜３００Ｌ／ｍ２、７５〜３００Ｌ／ｍ２、１００〜３００Ｌ／ｍ２、１５０〜３００Ｌ／ｍ２または２００〜３００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、１〜２００Ｌ／ｍ２、５〜２００Ｌ／ｍ２、１０〜２００Ｌ／ｍ２、２５〜２００Ｌ／ｍ２、５０〜２００Ｌ／ｍ２、７５〜２００Ｌ／ｍ２、１００〜２００Ｌ／ｍ２または１５０〜２００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、1〜１００Ｌ／ｍ２、５〜１００Ｌ／ｍ２、１０〜１００Ｌ／ｍ２、２５〜１００Ｌ／ｍ２、５０〜１００Ｌ／ｍ２または７５〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、深層フィルターが、１〜５０Ｌ／ｍ２、５〜５０Ｌ／ｍ２、１０〜５０Ｌ／ｍ２または２５〜５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、供給速度が１〜１０００ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）、１０〜１０００ＬＭＨ、２５〜１０００ＬＭＨ、５０〜１０００ＬＭＨ、１００〜１０００ＬＭＨ、１２５〜１０００ＬＭＨ、１５０〜１０００ＬＭＨ、２００〜１０００ＬＭＨ、２５０〜１０００ＬＭＨ、３００〜１０００ＬＭＨ、４００〜１０００ＬＭＨ、５００〜１０００ＬＭＨ、６００〜１０００ＬＭＨ、７００〜１０００ＬＭＨ、８００〜１０００ＬＭＨまたは９００〜１０００ＬＭＨである深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、供給速度が１〜５００ＬＭＨ、１０〜５００ＬＭＨ、２５〜５００ＬＭＨ、５０〜５００ＬＭＨ、１００〜５００ＬＭＨ、１２５〜５００ＬＭＨ、１５０〜５００ＬＭＨ、２００〜５００ＬＭＨ、２５０〜５００ＬＭＨ、３００〜５００ＬＭＨまたは４００〜５００ＬＭＨである深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、供給速度が１〜４００ＬＭＨ、１０〜４００ＬＭＨ、２５〜４００ＬＭＨ、５０〜４００ＬＭＨ、１００〜４００ＬＭＨ、１２５〜４００ＬＭＨ、１５０〜４００ＬＭＨ、２００〜４００ＬＭＨ、２５０〜４００ＬＭＨまたは３００〜４００ＬＭＨである深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、供給速度が１〜２５０ＬＭＨ、１０〜２５０ＬＭＨ、２５〜２５０ＬＭＨ、５０〜２５０ＬＭＨ、１００〜２５０ＬＭＨ、１２５〜２５０ＬＭＨ、１５０〜２５０ＬＭＨまたは２００〜２５０ＬＭＨである深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、供給速度が約１、約２、約５、約１０、約２５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０または約１０００ＬＭＨである、深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
１．５ 任意選択のさらなる濾過
一度、上記のセクション１．４の濾過ステップによって溶液を処理したら、得られた溶液（すなわち、濾液）を、場合によりさらに明澄化することができる。
ある実施形態では、溶液を、精密濾過にかける。ある実施形態では、精密濾過は、デッドエンド濾過（垂直濾過）である。ある実施形態では、精密濾過は、接線流精密濾過である。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．４５〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、または約１．７５〜２μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．４５〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する深層濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．４５μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜５０００Ｌ／ｍ２、２００〜５０００Ｌ／ｍ２、３００〜５０００Ｌ／ｍ２、４００〜５０００Ｌ／ｍ２、５００〜５０００Ｌ／ｍ２、７５０〜５０００Ｌ／ｍ２、１０００〜５０００Ｌ／ｍ２、１５００〜５０００Ｌ／ｍ２、２０００〜５０００Ｌ／ｍ２、３０００〜５０００Ｌ／ｍ２または４０００〜５０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜２５００Ｌ／ｍ２、２００〜２５００Ｌ／ｍ２、３００〜２５００Ｌ／ｍ２、４００〜２５００Ｌ／ｍ２、５００〜２５００Ｌ／ｍ２、７５０〜２５００Ｌ／ｍ２、１０００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５００〜２５００Ｌ／ｍ２、または２０００〜２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１５００Ｌ／ｍ２、２００〜１５００Ｌ／ｍ２、３００〜１５００Ｌ／ｍ２、４００〜１５００Ｌ／ｍ２、５００〜１５００Ｌ／ｍ２、７５０〜１５００Ｌ／ｍ２または１０００〜１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１２５０Ｌ／ｍ２、２００〜１２５０Ｌ／ｍ２、３００〜１２５０Ｌ／ｍ２、４００〜１２５０Ｌ／ｍ２、５００〜１２５０Ｌ／ｍ２、７５０〜１２５０Ｌ／ｍ２または１０００〜１２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜７５０Ｌ／ｍ２、２００〜７５０Ｌ／ｍ２、３００〜７５０Ｌ／ｍ２、４００〜７５０Ｌ／ｍ２または５００〜７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜６００Ｌ／ｍ２、２００〜６００Ｌ／ｍ２、３００〜６００Ｌ／ｍ２、４００〜６００Ｌ／ｍ２または４００〜６００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１５５０、約１６００、約１６５０、約１７００、約１７５０、約１８００、約１８５０、約１９００、約１９５０、約２０００、約２０５０、約２１００、約２１５０、約２２００、約２２５０、約２３００、約２３５０、約２４００、約２４５０または約２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
１．６ 限外濾過および／または透析濾過
一度、上記のセクション１．４に記載の方法のいずれかによって、および／または上記のセクション１．５に記載の濾過ステップによって溶液を濾過したら、得られた溶液（すなわち、濾液）を、場合により、限外濾過および／または透析濾過によってさらに明澄化してもよい。
限外濾過（ＵＦ）は、薄い生成物流を濃縮するためのプロセスである。ＵＦは、膜の孔径または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）に基づいて溶液中の分子を分離する。
本発明の実施形態では、溶液（例えば、上記のセクション１．５または１．６で得られた濾液）を、限外濾過によって処理する。
ある実施形態では、限外濾過によって溶液を処理し、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａまたは約７５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜５００ｋＤａまたは約４００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａまたは約２００ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１００ｋＤａまたは約７５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約７５０ｋＤａまたは約１０００ｋＤａである。
ある実施形態では、限外濾過ステップの濃縮係数は、約１．５〜１０である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２〜８である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２〜５である。
ある実施形態では、濃縮係数は、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０．０である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２、約３、約４、約５、または約６である。
本発明の実施形態では、溶液（例えば、上記のセクション１．４または１．５で得られた濾液）を、透析濾過によって処理する。
本発明の実施形態では、本セクションの上記に開示された限外濾過（ＵＦ）後に得られた溶液を、透析濾過によってさらに処理する（ＵＦ／ＤＦ処理）。
透析濾過（ＤＦ）は、生成物を、所望の緩衝溶液（または水のみ）中で交換するために使用される。ある実施形態では、透析濾過は、一定の容量下で保持された溶液の化学的特性を変化させるために使用される。望ましくない粒子は膜を通過するが、供給原料流の組成は、置換液（緩衝溶液、塩水溶液、緩衝塩水溶液または水）の添加によって、より望ましい状態に変化する。
ある実施形態では、置換液は、水である。
ある実施形態では、置換液は、塩水である。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。一実施形態では、置換液は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭまたは約５００ｍＭの塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、置換液は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭまたは約３００ｍＭの塩化ナトリウムである。
ある実施形態では、置換液は、緩衝溶液である。ある実施形態では、置換液は、緩衝剤が、Ｎ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、酢酸の塩（酢酸塩）、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、タウリン）、アンモニア、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ、アメジオール）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、炭酸水素ナトリウム（重炭酸塩）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（ビシン）、［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）（ビス−トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス−プロパン）、ホウ酸、ジメチルアルシン酸（カコジル酸塩）、３−（シクロヘキシルアミノ）−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、炭酸ナトリウム（炭酸塩）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、イミダゾール、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、リン酸の塩（リン酸塩）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、ピリジン、コハク酸の塩（コハク酸塩）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（トリシン）およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）からなる群から選択される、緩衝溶液である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、酢酸の塩（酢酸塩）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、リン酸の塩（リン酸塩）およびコハク酸の塩（コハク酸塩）からなる群から選択される。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、クエン酸の塩（クエン酸塩）である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、コハク酸の塩（コハク酸塩）である。ある実施形態では、前記塩は、ナトリウム塩である。ある実施形態では、前記塩は、カリウム塩である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約４．０〜１１．０、約５．０〜１０．０、約５．５〜９．０、約６．０〜８．０、約６．０〜７．０、約６．５〜７．５、約６．５〜７．０または約６．０〜７．５である。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５または約１１．０である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５または約９．０である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．５、約７．０または約７．５である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約７．０である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約３ｍＭ〜１００ｍＭ、約４ｍＭ〜１００ｍＭ、約５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６ｍＭ〜１００ｍＭ、約７ｍＭ〜１００ｍＭ、約８ｍＭ〜１００ｍＭ、約９ｍＭ〜１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、約１１ｍＭ〜１００ｍＭ、約１２ｍＭ〜１００ｍＭ、約１３ｍＭ〜１００ｍＭ、約１４ｍＭ〜１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１６ｍＭ〜１００ｍＭ、約１７ｍＭ〜１００ｍＭ、約１８ｍＭ〜１００ｍＭ、約１９ｍＭ〜１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜１００ｍＭ、約５５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜１００ｍＭ、約６５ｍＭ〜１００ｍＭ、約７０ｍＭ〜１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜１００ｍＭ、約８０ｍＭ〜１００ｍＭ、約８５ｍＭ〜１００ｍＭ、約９０ｍＭ〜１００ｍＭまたは約９５ｍＭ〜１００ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、約２ｍＭ〜５０ｍＭ、約３ｍＭ〜５０ｍＭ、約４ｍＭ〜５０ｍＭ、約５ｍＭ〜５０ｍＭ、約６ｍＭ〜５０ｍＭ、約７ｍＭ〜５０ｍＭ、約８ｍＭ〜５０ｍＭ、約９ｍＭ〜５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、約１１ｍＭ〜５０ｍＭ、約１２ｍＭ〜５０ｍＭ、約１３ｍＭ〜５０ｍＭ、約１４ｍＭ〜５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１６ｍＭ〜５０ｍＭ、約１７ｍＭ〜５０ｍＭ、約１８ｍＭ〜５０ｍＭ、約１９ｍＭ〜５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜５０ｍＭ、約３５ｍＭ〜５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜５０ｍＭ、約４５ｍＭ〜５０ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１ｍＭ〜２５ｍＭ、約２ｍＭ〜２５ｍＭ、約３ｍＭ〜２５ｍＭ、約４ｍＭ〜２５ｍＭ、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、約６ｍＭ〜２５ｍＭ、約７ｍＭ〜２５ｍＭ、約８ｍＭ〜２５ｍＭ、約９ｍＭ〜２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜２５ｍＭ、約１１ｍＭ〜２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜２５ｍＭ、約１３ｍＭ〜２５ｍＭ、約１４ｍＭ〜２５ｍＭ、約１５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１６ｍＭ〜２５ｍＭ、約１７ｍＭ〜２５ｍＭ、約１８ｍＭ〜２５ｍＭ、約１９ｍＭ〜２５ｍＭまたは約２０ｍＭ〜２５ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１５ｍＭ、約１ｍＭ〜１５ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１５ｍＭ、約４ｍＭ〜１５ｍＭ、約５ｍＭ〜１５ｍＭ、約６ｍＭ〜１５ｍＭ、約７ｍＭ〜１５ｍＭ、約８ｍＭ〜１５ｍＭ、約９ｍＭ〜１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜１５ｍＭ、約１１ｍＭ〜１５ｍＭ、約１２ｍＭ〜１５ｍＭ、約１３ｍＭ〜１５ｍＭまたは約１４ｍＭ〜１５ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１０ｍＭ、約２ｍＭ〜１０ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜１０ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約６ｍＭ〜１０ｍＭ、約７ｍＭ〜１０ｍＭ、約８ｍＭ〜１０ｍＭまたは約９ｍＭ〜１０ｍＭである。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭである。
ある実施形態では、置換液は、キレート剤を含む。ある実施形態では、置換液は、ミョウバンキレート剤を含む。一部の実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸ジヒドロクロリド（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン−テトラキス（メチレンスルホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、イミノ−二酢酸（ＩＤＡ）、ヒドロキシアミノ−二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ−三酢酸（ＮＴＰ）、トリエチレンテトラミン−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、アルファリポ酸（ＡＬＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、チアミンテトラヒドロフルフリルジスルフィド（ＴＴＦＤ）、ジメルカプロール、ペニシラミン、デフェロキサミン（ＤＦＯＡ）、デフェラシロクス、ホスホネート、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
一部の実施形態では、キレート剤は、クエン酸の塩（クエン酸塩）である。一部の実施形態では、キレート剤は、クエン酸ナトリウムである。
一般に、キレート剤は、１〜５００ｍＭの濃度で用いられる。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、２〜４００ｍＭである。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、１０〜４００ｍＭである。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、１０〜２００ｍＭである。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、１０〜１００ｍＭである。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、１０〜５０ｍＭである。ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、１０〜３０ｍＭである。
ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである。
ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである。
ある実施形態では、置換液中のキレート剤の濃度は、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝溶液は、塩を含む。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。ある実施形態では、透析濾過緩衝溶液は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０または約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。１つの特定の実施形態では、透析濾過緩衝溶液は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０または約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
本発明の実施形態では、透析容量の数は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０である。本発明の実施形態では、透析容量の数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００である。本発明の実施形態では、透析容量の数は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。
本発明の実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
本発明の実施形態では、透析濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、透析濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、透析濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
ある実施形態では、限外濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、限外濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
１．７ 活性炭濾過
一度、上記のセクション１．２の凝集ステップによって溶液を処理したら、多糖を含有する溶液を、場合により、活性炭濾過ステップによってさらに明澄化することができる。
ある実施形態では、セクション１．３の固体／液体分離ステップによってさらに処理されたセクション１．２の溶液（例えば、上清）を、活性炭濾過ステップによってさらに明澄化する。ある実施形態では、上記のセクション１．４に記載の方法のいずれかによって、および／または上記のセクション１．５に記載の濾過ステップによってさらに濾過された溶液を、活性炭濾過ステップによってさらに明澄化する。ある実施形態では、上記のセクション１．６に記載の限外濾過および／または透析濾過ステップによってさらに明澄化された溶液を、活性炭濾過ステップによってさらに明澄化する。
活性炭濾過のステップは、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のさらなる除去を可能にする（ＷＯ２００８／１１８７５２を参照されたい）。
ある実施形態では、活性炭（アクティブチャコールとも呼ばれる）を、タンパク質および核酸の夾雑物の大部分を吸着させるのに十分な量で溶液に添加した後、夾雑物が活性炭上に吸着されたら、それを除去する。ある実施形態では、活性炭を、粉末の形態で、顆粒活性炭層として、圧縮炭素ブロックまたは押出し炭素ブロックとして添加する（例えば、Ｎｏｒｉｔのアクティブチャコールを参照されたい）。ある実施形態では、活性炭を、約０．１〜２０％（重量）、１〜１５％（重量）、１〜１０％（重量）、２〜１０％（重量）、３〜１０％（重量）、４〜１０％（重量）、５〜１０％（重量）、１〜５％（重量）または２〜５％（重量）の量で添加する。次いで、混合物を撹拌し、静置する。ある実施形態では、混合物を、約５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０分またはそれより長く静置する。次いで、活性炭を除去する。活性炭を、例えば、遠心分離または濾過によって除去することができる。
好ましい実施形態では、溶液を、マトリックス中に固定された活性炭を介して濾過する。マトリックスは、溶液にとって浸透性の任意の多孔性フィルター媒体であってもよい。マトリックスは、支持材料および／または結合剤材料を含んでもよい。支持材料は、合成ポリマーまたは天然起源のポリマーであってもよい。好適な合成ポリマーは、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびポリメチルメタクリレートを含んでもよいが、天然起源のポリマーは、セルロース、多糖およびデキストラン、アガロースを含んでもよい。典型的には、ポリマー支持材料は、機械的剛性を提供するための繊維ネットワークの形態にある。結合剤材料は、樹脂であってもよい。マトリックスは、膜シートの形態を有してもよい。ある実施形態では、マトリックス中に固定された活性炭は、フロースルー炭素カートリッジの形態にある。カートリッジは、マトリックス中に固定され、膜シートの形態で調製された粉末状活性炭を含有する自己含有性実体である。膜シートをプラスチック製の浸透性支持体中に捕捉して、ディスクを形成することができる。
あるいは、膜シートを、らせん状に巻いてもよい。フィルター表面積を増大させるために、いくつかのディスクを互いに積み重ねることができる。特に、互いに積み重ねられたディスクは、フィルターから炭素処理された試料を収集し、除去するための中心コアパイプを有する。積み重ねられたディスクの構成は、レンズ状であってもよい。
炭素フィルター中の活性炭は、様々な生材料、例えば、泥炭、褐炭、木材またはヤシ殻に由来するものであってもよい。
蒸気または化学処理などの、当業界で公知の任意のプロセスを使用して、炭を活性化することができる（例えば、木材ベースのリン酸活性炭）。
本発明では、マトリックス中に固定された活性炭を、筺体中に入れて、独立フィルターユニットを形成させることができる。それぞれのフィルターユニットは、精製しようとする溶液のためのそれ自身の注入口および排水口を有する。本発明において使用可能であるフィルターユニットの例は、Ｃｕｎｏ Ｉｎｃ．（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）またはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）からの炭素カートリッジである。特に、ＣＵＮＯ ｚｅｔａｃａｒｂｏｎフィルターは、本発明における使用にとって好適である。これらの炭素フィルターは、活性炭粉末が所定の位置に捕捉され、樹脂に結合したセルロースマトリックスを含む。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜１００μｍ、約０．０５〜１００μｍ、約０．１〜１００μｍ、約０．２〜１００μｍ、約０．３〜１００μｍ、約０．４〜１００μｍ、約０．５〜１００μｍ、約０．６〜１００μｍ、約０．７〜１００μｍ、約０．８〜１００μｍ、約０．９〜１００μｍ、約１〜１００μｍ、約１．２５〜１００μｍ、約１．５〜１００μｍ、約１．７５〜１００μｍ、約２〜１００μｍ、約３〜１００μｍ、約４〜１００μｍ、約５〜１００μｍ、約６〜１００μｍ、約７〜１００μｍ、約８〜１００μｍ、約９〜１００μｍ、約１０〜１００μｍ、約１５〜１００μｍ、約２０〜１００μｍ、約２５〜１００μｍ、約３０〜１００μｍ、約４０〜１００μｍ、約５０〜１００μｍまたは約７５〜１００μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜５０μｍ、約０．０５〜５０μｍ、約０．１〜５０μｍ、約０．２〜５０μｍ、約０．３〜５０μｍ、約０．４〜５０μｍ、約０．５〜５０μｍ、約０．６〜５０μｍ、約０．７〜５０μｍ、約０．８〜５０μｍ、約０．９〜５０μｍ、約１〜５０μｍ、約１．２５〜５０μｍ、約１．５〜５０μｍ、約１．７５〜５０μｍ、約２〜５０μｍ、約３〜５０μｍ、約４〜５０μｍ、約５〜５０μｍ、約６〜５０μｍ、約７〜５０μｍ、約８〜５０μｍ、約９〜５０μｍ、約１０〜５０μｍ、約１５〜５０μｍ、約２０〜５０μｍ、約２５〜５０μｍ、約３０〜５０μｍ、約４０〜５０μｍまたは約５０〜５０μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜２５μｍ、約０．０５〜２５μｍ、約０．１〜２５μｍ、約０．２〜２５μｍ、約０．３〜２５μｍ、約０．４〜２５μｍ、約０．５〜２５μｍ、約０．６〜２５μｍ、約０．７〜２５μｍ、約０．８〜２５μｍ、約０．９〜２５μｍ、約１〜２５μｍ、約１．２５〜２５μｍ、約１．５〜２５μｍ、約１．７５〜２５μｍ、約２〜２５μｍ、約３〜２５μｍ、約４〜２５μｍ、約５〜２５μｍ、約６〜２５μｍ、約７〜２５μｍ、約８〜２５μｍ、約９〜２５μｍ、約１０〜２５μｍ、約１５〜２５μｍまたは約２０〜２５μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜１０μｍ、約０．０５〜１０μｍ、約０．１〜１０μｍ、約０．２〜１０μｍ、約０．３〜１０μｍ、約０．４〜１０μｍ、約０．５〜１０μｍ、約０．６〜１０μｍ、約０．７〜１０μｍ、約０．８〜１０μｍ、約０．９〜１０μｍ、約１〜１０μｍ、約１．２５〜１０μｍ、約１．５〜１０μｍ、約１．７５〜１０μｍ、約２〜１０μｍ、約３〜１０μｍ、約４〜１０μｍ、約５〜１０μｍ、約６〜１０μｍ、約７〜１０μｍ、約８〜１０μｍまたは約９〜１０μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜８μｍ、約０．０５〜８μｍ、約０．１〜８μｍ、約０．２〜８μｍ、約０．３〜８μｍ、約０．４〜８μｍ、約０．５〜８μｍ、約０．６〜８μｍ、約０．７〜８μｍ、約０．８〜８μｍ、約０．９〜８μｍ、約１〜８μｍ、約１．２５〜８μｍ、約１．５〜８μｍ、約１．７５〜８μｍ、約２〜８μｍ、約３〜８μｍ、約４〜８μｍ、約５〜８μｍ、約６〜８μｍまたは約７〜８μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜５μｍ、約０．０５〜５μｍ、約０．１〜５μｍ、約０．２〜５μｍ、約０．３〜５μｍ、約０．４〜５μｍ、約０．５〜５μｍ、約０．６〜５μｍ、約０．７〜５μｍ、約０．８〜５μｍ、約０．９〜５μｍ、約１〜５μｍ、約１．２５〜５μｍ、約１．５〜５μｍ、約１．７５〜５μｍ、約２〜５μｍ、約３〜５μｍまたは約４〜５μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、約１．７５〜２μｍ、約２〜２μｍ、約３〜２μｍまたは約４〜２μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
ある実施形態では、上記に開示された活性炭フィルターは、、約０．０５〜５０μｍ、０．１〜２５μｍ、０．２〜１０μｍ、０．１〜１０μｍ、０．２〜５μｍまたは０．２５〜１μｍの名目ミクロンレーティングを有する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜５００ＬＭＨ、１０〜５００ＬＭＨ、１５〜５００ＬＭＨ、２０〜５００ＬＭＨ、２５〜５００ＬＭＨ、３０〜５００ＬＭＨ、４０〜５００ＬＭＨ、５０〜５００ＬＭＨ、１００〜５００ＬＭＨ、１２５〜５００ＬＭＨ、１５０〜５００ＬＭＨ、２００〜５００ＬＭＨ、２５０〜５００ＬＭＨ、３００〜５００ＬＭＨまたは４００〜５００ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜２００ＬＭＨ、１０〜２００ＬＭＨ、１５〜２００ＬＭＨ、２０〜２００ＬＭＨ、２５〜２００ＬＭＨ、３０〜２００ＬＭＨ、４０〜２００ＬＭＨ、５０〜２００ＬＭＨ、１００〜２００ＬＭＨ、１２５〜２００ＬＭＨまたは１５０〜２００ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜１５０ＬＭＨ、１０〜１５０ＬＭＨ、１５〜１５０ＬＭＨ、２０〜１５０ＬＭＨ、２５〜１５０ＬＭＨ、３０〜１５０ＬＭＨ、４０〜１５０ＬＭＨ、５０〜１５０ＬＭＨ、１００〜１５０ＬＭＨまたは１２５〜１５０ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜１００ＬＭＨ、１０〜１００ＬＭＨ、１５〜１００ＬＭＨ、２０〜１００ＬＭＨ、２５〜１００ＬＭＨ、３０〜１００ＬＭＨ、４０〜１００ＬＭＨまたは５０〜１００ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜７５ＬＭＨ、５〜７５ＬＭＨ、１０〜７５ＬＭＨ、１５〜７５ＬＭＨ、２０〜７５ＬＭＨ、２５〜７５ＬＭＨ、３０〜７５ＬＭＨ、３５〜７５ＬＭＨ、４０〜７５ＬＭＨ、４５〜７５ＬＭＨ、５０〜７５ＬＭＨ、５５〜７５ＬＭＨ、６０〜７５ＬＭＨ、６５〜７５ＬＭＨまたは７０〜７５ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、１〜５０ＬＭＨ、５〜５０ＬＭＨ、７〜５０ＬＭＨ、１０〜５０ＬＭＨ、１５〜５０ＬＭＨ、２０〜５０ＬＭＨ、２５〜５０ＬＭＨ、３０〜５０ＬＭＨ、３５〜５０ＬＭＨ、４０〜５０ＬＭＨまたは４５〜５０ＬＭＨの供給速度で行われる。
上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップは、約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約９５０または約１０００ＬＭＨの供給速度で行われる。
ある実施形態では、フィルターが、５〜１０００Ｌ／ｍ２、１０〜７５０Ｌ／ｍ２、１５〜５００Ｌ／ｍ２、２０〜４００Ｌ／ｍ２、２５〜３００Ｌ／ｍ２、３０〜２５０Ｌ／ｍ２、４０〜２００Ｌ／ｍ２または３０〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する活性炭フィルターによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する活性炭フィルターによって、溶液を処理する。
夾雑物の含量が、１回目の活性炭濾過ステップの後に固定閾値よりも上である場合、前記ステップを反復してもよい。本発明の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の活性炭濾過ステップを実施する。本発明の実施形態では、１、２、または３回の活性炭濾過ステップを実施する。本発明の実施形態では、１または２回の活性炭濾過ステップを実施する。
ある実施形態では、溶液を、活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、２、３、４または５個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、２個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、３個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、４個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。ある実施形態では、溶液を、５個の活性炭フィルターによって連続的に処理する。
ある実施形態では、活性炭濾過ステップを、１回通過モードで実施する。
別の実施形態では、活性炭濾過ステップを、再循環モードで実施する。前記実施形態（再循環モード）では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０サイクルの活性炭濾過を実施する。別の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０サイクルの活性炭濾過を実施する。ある実施形態では、２または３サイクルの活性炭濾過を実施する。ある実施形態では、２サイクルの活性炭濾過を実施する。
１．８ 任意選択のさらなる濾過
一度、上記のセクション１．７の活性炭ステップによって溶液を処理したら、得られた溶液（すなわち、濾液）を、場合によりさらに濾過することができる。
ある実施形態では、溶液を、精密濾過にかける。ある実施形態では、精密濾過は、デッドエンド濾過（垂直濾過）である。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．４５〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、または約１．７５〜２μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．４５〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２．０μｍの名目保持レーティングを有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．２μｍの名目保持レーティングを有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜６０００Ｌ／ｍ２、２００〜６０００Ｌ／ｍ２、３００〜６０００Ｌ／ｍ２、４００〜６０００Ｌ／ｍ２、５００〜６０００Ｌ／ｍ２、７５０〜６０００Ｌ／ｍ２、１０００〜６０００Ｌ／ｍ２、１５００〜６０００Ｌ／ｍ２、２０００〜６０００Ｌ／ｍ２、３０００〜６０００Ｌ／ｍ２または４０００〜６０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜４０００Ｌ／ｍ２、２００〜４０００Ｌ／ｍ２、３００〜４０００Ｌ／ｍ２、４００〜４０００Ｌ／ｍ２、５００〜４０００Ｌ／ｍ２、７５０〜４０００Ｌ／ｍ２、１０００〜４０００Ｌ／ｍ２、１５００〜４０００Ｌ／ｍ２、２０００〜４０００Ｌ／ｍ２、２５００〜４０００Ｌ／ｍ２、３０００〜４０００Ｌ／ｍ２、３０００〜４０００Ｌ／ｍ２または３５００〜４０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３００〜３７５０Ｌ／ｍ２、４００〜３７５０Ｌ／ｍ２、５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、７５０〜３７５０Ｌ／ｍ２、１０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、１５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３０００〜３７５０Ｌ／ｍ２または３５００〜３７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、１００〜１２５０Ｌ／ｍ２、２００〜１２５０Ｌ／ｍ２、３００〜１２５０Ｌ／ｍ２、４００〜１２５０Ｌ／ｍ２、５００〜１２５０Ｌ／ｍ２、７５０〜１２５０Ｌ／ｍ２または１０００〜１２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが、約１００、約２００、約３００、約４００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約2２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、約５０００、約５２５０、約５５００、約５７５０または約６０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
１．９ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、以前の精製ステップから残った、残留脂質多糖（内毒素）などの、疎水特性を有していた不純物を除去する。
一度、上記のセクション１．２の凝集ステップによって溶液を処理したら、多糖を含有する溶液を、場合により、ＨＩＣステップによってさらに精製することができる。
ある実施形態では、セクション１．３の固体／液体分離ステップによってさらに処理されたセクション１．２の溶液（例えば、上清）を、ＨＩＣステップによってさらに精製する。ある実施形態では、上記のセクション１．５に記載の方法のいずれかによって、および／または上記のセクション１．４に記載の濾過ステップによってさらに濾過された溶液を、ＨＩＣステップによってさらに精製する。ある実施形態では、上記のセクション１．６に記載の限外濾過および／または透析濾過ステップによってさらに明澄化された溶液を、ＨＩＣステップによってさらに精製する。ある実施形態では、セクション１．７の活性炭濾過ステップによってさらに明澄化された溶液を、ＨＩＣステップによってさらに精製する。
ある実施形態では、上記のセクション１．６に記載の限外濾過および／または透析濾過ステップによってさらに明澄化された溶液を、イオン交換膜（ＩＥＸ）濾過ステップによってさらに精製した後、ＨＩＣステップによってさらに精製することができる。
ある実施形態では、ＨＩＣステップは、限定されるものではないが、フェニル膜、ブチル−、フェニル−、およびオクチル−アガロース、ブチル−、フェニル−、エーテル−、ポリプロピレングリコール−およびヘキシル−有機ポリマー樹脂からなる群から選択される疎水性吸着剤を使用して行われる。
ある実施形態では、ＨＩＣステップにおいて使用される疎水性吸着剤は、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｐｈｅｎｙｌ膜またはＣＹＴＩＶＡのＰｈｅｎｙｌ Ａｄｓｏｒｂｅｒ膜などのフェニル膜である。
ある実施形態では、ＨＩＣステップにおいて使用される疎水性吸着剤は、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｐｈｅｎｙｌ膜である。
ある実施形態では、以前のステップに由来する材料（例えば、炭素濾液）を、平衡化緩衝剤で処理して、精製しようとする材料および望ましい塩濃度を含む泳動緩衝剤を得る。ある実施形態では、平衡化緩衝剤は、塩を含み、最終塩濃度（すなわち、泳動緩衝剤中の）は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９または約７．０Ｍから選択される。一実施形態では、泳動緩衝剤は、約４．０〜約８．０のｐＨを有する。一実施形態では、泳動緩衝剤のｐＨは、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９または約８．０である。ある実施形態では、平衡化緩衝剤は、硫酸アンモニウム（好ましくは、０．５Ｍ〜３．０Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ６．０±２．０）、リン酸ナトリウム（好ましくは、０．５Ｍ〜３．０Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ７．０±１．５）、リン酸カリウム（好ましくは、０．５Ｍ〜３．０Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ７．０±１．５）、硫酸ナトリウム（好ましくは、０．１Ｍ〜０．７５Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ６．０±２．０）、クエン酸ナトリウム（好ましくは、０．１Ｍ〜１．５Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ６．０±２．０）または塩化ナトリウム（好ましくは、０．５Ｍ〜５．０Ｍの泳動緩衝剤中での最終濃度およびｐＨ７．０±１．５）から選択される塩を含む。
ある実施形態では、平衡化緩衝剤は、硫酸アンモニウムを含み、泳動緩衝剤中の最終塩濃度は、約１．０Ｍ〜約２．０Ｍ、好ましくは約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０Ｍである。
ある実施形態では、疎水性吸着剤を、泳動緩衝剤を使用して平衡化した後、泳動緩衝剤中の精製しようとする材料を、カラムまたは膜を通過させる。
ある実施形態では、疎水性吸着剤は、フェニル膜であり、流量は、約０．１〜約２０膜容量／ｍｉｎ、約０．１〜約１０膜容量／ｍｉｎ、約０．２〜約１０膜容量／ｍｉｎ、約０．２〜約５膜容量／ｍｉｎ、約０．１〜約１膜容量／ｍｉｎである。ある実施形態では、疎水性吸着剤は、フェニル膜であり、流量は、約０．１〜約１．０膜容量／ｍｉｎ、好ましくは約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９または約１．０膜容量／ｍｉｎである。
ある実施形態では、次いで、ＨＩＣ膜を、泳動緩衝剤でリンスし、水でさらに洗浄することもできる。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
１．１０ 限外濾過／透析濾過
一度、上記のセクション１．９に記載のＨＩＣステップによって、および／または上記のセクション１．８に記載のさらなる濾過ステップによって溶液を処理したら、得られた溶液（すなわち、濾液）を、場合により、限外濾過および／または透析濾過によってさらに明澄化してもよい。
本発明の実施形態では、溶液（例えば、上記のセクション1．9または１．８で得られたもの）を、限外濾過によって処理する。
ある実施形態では、限外濾過によって溶液を処理し、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲にある。ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａまたは約７５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜５００ｋＤａまたは約４００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａまたは約２００ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１００ｋＤａまたは約７５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある。
ある実施形態では、膜の分子量カットオフは、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約７５０ｋＤａまたは約１０００ｋＤａである。
ある実施形態では、限外濾過ステップの濃縮係数は、約１．５〜約１０．０である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２．０〜約８．０である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２．０〜約５．０である。
ある実施形態では、濃縮係数は、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０．０である。ある実施形態では、濃縮係数は、約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、または約６．０である。
本発明の実施形態では、溶液（例えば、上記のセクション１．９または１．８で得られた濾液）を、透析濾過によって処理する。
本発明の実施形態では、本セクションの上記に開示された限外濾過（ＵＦ）後に得られた溶液を、透析濾過によってさらに処理する（ＵＦ／ＤＦ処理）。
透析濾過（ＤＦ）は、生成物を、所望の緩衝溶液（または水のみ）中で交換するために使用される。ある実施形態では、透析濾過は、一定の容量下で保持された溶液の化学的特性を変化させるために使用される。望ましくない粒子は膜を通過するが、供給原料流の組成は、置換液（緩衝溶液、塩水溶液、緩衝塩水溶液または水）の添加によって、より望ましい状態に変化する。
ある実施形態では、置換液は、水である。
ある実施形態では、置換液は、塩水である。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。ある実施形態では、置換液は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０または約５００ｍＭの塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、置換液は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０または約３００ｍＭの塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、置換液は、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０または約１００ｍＭの塩化ナトリウムである。
ある実施形態では、置換液は、緩衝溶液である。ある実施形態では、置換液は、緩衝剤が、Ｎ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、酢酸の塩（酢酸塩）、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、タウリン）、アンモニア、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ、アメジオール）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、炭酸水素ナトリウム（重炭酸塩）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（ビシン）、［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）（ビス−トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス−プロパン）、ホウ酸、ジメチルアルシン酸（カコジル酸塩）、３−（シクロヘキシルアミノ）−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、炭酸ナトリウム（炭酸塩）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、イミダゾール、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、リン酸の塩（リン酸塩）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、ピリジン、コハク酸の塩（コハク酸塩）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（トリシン）およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）からなる群から選択される、緩衝溶液である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、酢酸の塩（酢酸塩）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、リン酸の塩（リン酸塩）およびコハク酸の塩（コハク酸塩）からなる群から選択される。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、クエン酸の塩（クエン酸塩）である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、コハク酸の塩（コハク酸塩）である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤は、リン酸の塩（リン酸塩）である。ある実施形態では、前記塩は、ナトリウム塩である。ある実施形態では、前記塩は、カリウム塩である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約４．０〜１１．０、約５．０〜１０．０、約５．５〜９．０、約６．０〜８．０、約６．０〜７．０、約６．５〜７．５、約６．５〜７．０または約６．０〜７．５である。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５または約１１．０である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５または約９．０である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．５、約７．０または約７．５である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．０である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約６．５である。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤のｐＨは、約７．０である。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約３ｍＭ〜１００ｍＭ、約４ｍＭ〜１００ｍＭ、約５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６ｍＭ〜１００ｍＭ、約７ｍＭ〜１００ｍＭ、約８ｍＭ〜１００ｍＭ、約９ｍＭ〜１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、約１１ｍＭ〜１００ｍＭ、約１２ｍＭ〜１００ｍＭ、約１３ｍＭ〜１００ｍＭ、約１４ｍＭ〜１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１６ｍＭ〜１００ｍＭ、約１７ｍＭ〜１００ｍＭ、約１８ｍＭ〜１００ｍＭ、約１９ｍＭ〜１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜１００ｍＭ、約５５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜１００ｍＭ、約６５ｍＭ〜１００ｍＭ、約７０ｍＭ〜１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜１００ｍＭ、約８０ｍＭ〜１００ｍＭ、約８５ｍＭ〜１００ｍＭ、約９０ｍＭ〜１００ｍＭまたは約９５ｍＭ〜１００ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、約２ｍＭ〜５０ｍＭ、約３ｍＭ〜５０ｍＭ、約４ｍＭ〜５０ｍＭ、約５ｍＭ〜５０ｍＭ、約６ｍＭ〜５０ｍＭ、約７ｍＭ〜５０ｍＭ、約８ｍＭ〜５０ｍＭ、約９ｍＭ〜５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、約１１ｍＭ〜５０ｍＭ、約１２ｍＭ〜５０ｍＭ、約１３ｍＭ〜５０ｍＭ、約１４ｍＭ〜５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１６ｍＭ〜５０ｍＭ、約１７ｍＭ〜５０ｍＭ、約１８ｍＭ〜５０ｍＭ、約１９ｍＭ〜５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜５０ｍＭ、約３５ｍＭ〜５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜５０ｍＭまたは約４５ｍＭ〜５０ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１ｍＭ〜２５ｍＭ、約２ｍＭ〜２５ｍＭ、約３ｍＭ〜２５ｍＭ、約４ｍＭ〜２５ｍＭ、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、約６ｍＭ〜２５ｍＭ、約７ｍＭ〜２５ｍＭ、約８ｍＭ〜２５ｍＭ、約９ｍＭ〜２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜２５ｍＭ、約１１ｍＭ〜２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜２５ｍＭ、約１３ｍＭ〜２５ｍＭ、約１４ｍＭ〜２５ｍＭ、約１５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１６ｍＭ〜２５ｍＭ、約１７ｍＭ〜２５ｍＭ、約１８ｍＭ〜２５ｍＭ、約１９ｍＭ〜２５ｍＭまたは約２０ｍＭ〜２５ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１５ｍＭ、約１ｍＭ〜１５ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１５ｍＭ、約４ｍＭ〜１５ｍＭ、約５ｍＭ〜１５ｍＭ、約６ｍＭ〜１５ｍＭ、約７ｍＭ〜１５ｍＭ、約８ｍＭ〜１５ｍＭ、約９ｍＭ〜１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜１５ｍＭ、約１１ｍＭ〜１５ｍＭ、約１２ｍＭ〜１５ｍＭ、約１３ｍＭ〜１５ｍＭまたは約１４ｍＭ〜１５ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１０ｍＭ、約２ｍＭ〜１０ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜１０ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約６ｍＭ〜１０ｍＭ、約７ｍＭ〜１０ｍＭ、約８ｍＭ〜１０ｍＭまたは約９ｍＭ〜１０ｍＭである。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約３０ｍＭである。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約２５ｍＭである。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約２０ｍＭである。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約１５ｍＭである。ある実施形態では、透析濾過緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭである。
ある実施形態では、透析濾過緩衝溶液は、塩を含む。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、透析濾過緩衝溶液は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０または約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
本発明の実施形態では、透析容量の数は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０である。本発明の実施形態では、透析容量の数は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００である。本発明の実施形態では、透析容量の数は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。
本発明の実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過および透析濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
本発明の実施形態では、透析濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、透析濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、透析濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、透析濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
ある実施形態では、限外濾過ステップは、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過ステップは、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される。上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、限外濾過ステップは、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される。ある実施形態では、限外濾過ステップは、約５０℃の温度で実施される。
１．１１ ホモジナイゼーション／サイジング
多糖は、精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。
ある実施形態では、本発明の精製された多糖の溶液（例えば、セクション１．１０に記載の限外濾過および／または透析濾過によって得られた）は、サイジングされない。
ある実施形態では、多糖を、サイジング技術によってホモジナイズすることができる。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、例えば、酢酸を使用して行うことができる。機械的サイジングを、高圧ホモジナイゼーション剪断を使用して行うことができる。
したがって、ある実施形態では、セクション１．１０に記載の限外濾過および／または透析濾過によって得られた精製された多糖の溶液を、標的分子量にサイジングする。
本明細書で使用される場合、多糖の「分子量」という用語は、例えば、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算される分子量を指す。
一部の実施形態では、精製された多糖は、約５ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる。他のそのような実施形態では、精製された多糖は、約１０ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる。他のそのような実施形態では、精製された多糖は、約５０ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる。さらなるそのような実施形態では、精製された多糖は、約５０ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；または約２００ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量にサイジングされる。さらなるそのような実施形態では、精製された多糖は、約２５０ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；または約５００ｋＤａ〜約６００ｋＤａの分子量にサイジングされる。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
一部の実施形態では、精製された多糖は、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約７５０ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約８５０ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約９５０ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、約１２５０ｋＤａ、約１５００ｋＤａ、約１７５０ｋＤａ、約２０００ｋＤａ、約２２５０ｋＤａ、約２５００ｋＤａ、約２７５０ｋＤａ、約３０００ｋＤａ、約３２５０ｋＤａ、約３５００ｋＤａ、約３７５０ｋＤａまたは約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる。
好ましい実施形態では、精製された多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆに由来する莢膜多糖であり、莢膜多糖は、上記の範囲の１つの中にあるか、またはおよその上記のサイズを有する分子量を有する。
１．１２ 滅菌濾過
ある実施形態では、本発明の精製された多糖の溶液は、滅菌濾過される。
したがって、ある実施形態では、セクション１．１０に記載の限外濾過および／または透析濾過の後、場合により、滅菌濾過ステップを行ってもよい。
ある実施形態では、行われる場合、セクション１．１１に記載のホモジナイゼーション／サイジングステップの後、場合により、滅菌濾過ステップを行ってもよい。
ある実施形態では、セクション１．２〜１．９に記載のステップのいずれかの後、場合により、滅菌濾過ステップを行ってもよい。
ある実施形態では、滅菌濾過は、デッドエンド濾過（垂直濾過）である。ある実施形態では、滅菌濾過は、接線流濾過である。
ある実施形態では、フィルターが、約０．０１〜０．２μｍ、約０．０５〜０．２μｍ、約０．１〜０．２μｍまたは約０．１５〜０．２μｍの名目保持範囲を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが約０．０５、約０．１、約０．１５または約０．２μｍの名目保持範囲を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが約０．２μｍの名目保持範囲を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、約２５〜１５００Ｌ／ｍ２、５０〜１５００Ｌ／ｍ２、７５〜１５００Ｌ／ｍ２、１００〜１５００Ｌ／ｍ２、１５０〜１５００Ｌ／ｍ２、２００〜１５００Ｌ／ｍ２、２５０〜１５００Ｌ／ｍ２、３００〜１５００Ｌ／ｍ２、３５０〜１５００Ｌ／ｍ２、４００〜１５００Ｌ／ｍ２、５００〜１５００Ｌ／ｍ２、７５０〜１５００Ｌ／ｍ２、１０００〜１５００Ｌ／ｍ２または１２５０〜１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、約２５〜１０００Ｌ／ｍ２、５０〜１０００Ｌ／ｍ２、７５〜１０００Ｌ／ｍ２、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、１５０〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、２５０〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、３５０〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、２５〜５００Ｌ／ｍ２、５０〜５００Ｌ／ｍ２、７５〜５００Ｌ／ｍ２、１００〜５００Ｌ／ｍ２、１５０〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、２５０〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２、３５０〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、２５〜３００Ｌ／ｍ２、５０〜３００Ｌ／ｍ２、７５〜３００Ｌ／ｍ２、１００〜３００Ｌ／ｍ２、１５０〜３００Ｌ／ｍ２または２５０〜３００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、２５〜２５０Ｌ／ｍ２、５０〜２５０Ｌ／ｍ２、７５〜２５０Ｌ／ｍ２、１００〜２５０Ｌ／ｍ２、または１５０〜２５０Ｌ／ｍ２、２００〜２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
ある実施形態では、フィルターが、２５〜１００Ｌ／ｍ２、５０〜１００Ｌ／ｍ２または７５〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する滅菌濾過ステップによって、溶液を処理する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
ある実施形態では、フィルターが約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００または約１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する精密濾過ステップによって、溶液を処理する。
１．１３ 最終材料
多糖を、最終的に液体溶液として調製することができる。多糖を、さらにプロセシングすることができる（例えば、乾燥粉末として凍結乾燥する、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。したがって、ある実施形態では、多糖は、乾燥粉末である。
ある実施形態では、多糖は、凍結乾燥ケーキである。
２．精製された多糖の使用
本発明の方法によって精製された多糖を、抗原として使用することができる。プレーン多糖を、ワクチンにおける抗原として使用する（２３価非コンジュゲート化肺炎球菌多糖ワクチンＰＮＥＵＭＯＶＡＸを参照されたい）。
本発明の方法によって精製された多糖を、担体タンパク質にコンジュゲートして、糖コンジュゲートを得ることもできる。
２．１．糖コンジュゲート
本発明の方法によって精製された多糖を、担体タンパク質にコンジュゲートして、糖コンジュゲートを得ることができる。
本発明の目的のために、用語「糖コンジュゲート」は、担体タンパク質に共有的に連結された糖を示す。一実施形態では、糖は、担体タンパク質に直接連結される。第２の実施形態では、糖は、スペーサー／リンカーを介して担体タンパク質に連結される。
一般に、糖の担体への共有的コンジュゲーションは、それが、それらをＴ細胞非依存的抗原からＴ細胞依存的抗原に変換するため、糖の免疫原性を増強し、かくして、免疫記憶のプライミングを可能にする。コンジュゲーションは、特に、小児用ワクチンにとって有用である。
本発明の方法によって精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応することができるように（例えば、リンカーを用いて、または担体タンパク質を用いて直接的に）した後、本明細書にさらに記載されるように、糖コンジュゲート中に組み込むことができる。
精製された多糖を、例えば、上記のセクション１．１１に開示された方法によって、コンジュゲーションの前に標的分子量にサイジングすることができる。したがって、ある実施形態では、精製された多糖は、コンジュゲーションの前にサイジングされる。ある実施形態では、本明細書に開示される精製された多糖を、コンジュゲーションの前にサイジングして、オリゴ糖を得ることができる。オリゴ糖は、少数の反復単位（典型的には、５〜１５の反復単位）を有し、典型的には、多糖のサイジング（例えば、加水分解）によって誘導される。
しかし好ましくは、コンジュゲーションのために使用される糖は、多糖である。高分子量の多糖は、抗原性表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量の多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲートにおける使用のために企図される。
したがって、ある実施形態では、多糖は、サイジングされるが、多糖のままである。
ある実施形態では、多糖は、サイジングされない。
一部の実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖（サイジング後またはサイジングされない）は、５ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、精製された多糖は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、精製された多糖は、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖は、５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜２，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜２，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖は、２５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜２，２５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜２，２５０ｋＤａ；５００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ；５００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ；５００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；または５００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。
上記の範囲のいずれかの中の任意の数が、本開示の実施形態として企図される。
一部の実施形態では、精製された多糖は、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約７５０ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約８５０ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約９５０ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、約１２５０ｋＤａ、約１５００ｋＤａ、約１７５０ｋＤａ、約２０００ｋＤａ、約２２５０ｋＤａ、約２５００ｋＤａ、約２７５０ｋＤａ、約３０００ｋＤａ、約３２５０ｋＤａ、約３５００ｋＤａ、約３７５０ｋＤａまたは約４，０００ｋＤａの分子量を有する。
ある実施形態では、精製された多糖は、莢膜糖（多糖またはオリゴ糖）である。
ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、腸管毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）−Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、または腸管細胞侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ）などの腸毒性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）群（ＥＥＣ群）の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）部分に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、尿路病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）に由来する莢膜多糖である。
ある実施形態では、精製された多糖は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ１１１：Ｈ−およびＯ１０３：Ｈ２からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、血清型Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１およびＯ１８：Ｋ１：Ｈ７からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、血清型Ｏ４５：Ｋ１、Ｏ１７：Ｋ５２：Ｈ１８、Ｏ１９：Ｈ３４およびＯ７：Ｋ１からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１０４：Ｈ４に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１：Ｋ１２：Ｈ７に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｈ６に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１３９：Ｈ２８に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２８：Ｈ２に由来する莢膜多糖である。
さらなる実施形態では、精製された多糖は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、精製された多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）に由来する莢膜多糖である。
別の実施形態では、精製された多糖は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する莢膜多糖である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ１（Ｏ１）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２（Ｏ２）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２ａｃ（Ｏ２ａｃ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ３（Ｏ３）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ４（Ｏ４）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ５（Ｏ５）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ７（Ｏ７）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ８（Ｏ８）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ９（Ｏ９）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ１（Ｏ１）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２（Ｏ２）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ２ａｃ（Ｏ２ａｃ）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ３（Ｏ３）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ４（Ｏ４）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ５（Ｏ５）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ７（Ｏ７）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ８（Ｏ８）である。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清群Ｏ９（Ｏ９）である。
任意の好適なコンジュゲーション反応を、必要に応じて任意の好適なリンカーと共に使用することができる。例えば、ＷＯ２００７１１６０２８、１７〜２２頁を参照されたい。
本明細書に記載の精製されたオリゴ糖または多糖を化学的に活性化して、担体タンパク質と反応することができる糖を作製する。
ある実施形態では、糖コンジュゲートを、還元的アミノ化を使用して調製する。
還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）精製された糖の酸化（活性化）、（２）糖コンジュゲートを形成させるための活性化された糖および担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７、ＤＴ、ＴＴまたはＰＤ）の還元（例えば、ＷＯ２０１５１１０９４１、ＷＯ２０１５１１０９４０を参照されたい）を含む。
上記のように、酸化の前に、標的分子量（ＭＷ）範囲への多糖のサイジングを実施することができる。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。ある実施形態では、精製された多糖のサイズを、機械的ホモジナイゼーションによって減少させる。
ある実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、
（ａ）前記精製された多糖またはオリゴ糖を、酸化剤と反応させるステップ；
（ｂ）場合により、クエンチング剤の添加によって酸化反応をクエンチするステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）または（ｂ）の活性化された多糖またはオリゴ糖を、担体タンパク質と混合するステップ；ならびに
（ｄ）混合された、活性化された多糖またはオリゴ糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、糖コンジュゲートを形成させるステップを含むプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートさせる。
酸化ステップ（ａ）の後、糖は、活性化されると言われ、「活性化された多糖またはオリゴ糖」と呼ばれる。
酸化ステップ（ａ）は、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸（ＩＯ４ −）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５−）の両方および過ヨウ素酸の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。
好ましい実施形態では、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。ある実施形態では、酸化のために使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。ある実施形態では、酸化のために使用される過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
酸化ステップ（ａ）は、アルデヒド基を含有する活性化された糖を産生するための、前記多糖またはオリゴ糖の一次ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化剤の存在下での、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物などの、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物との反応を含んでもよい（ＷＯ２０１４０９７０９９を参照されたい）。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＷＯ２０１４０９７０９９の３頁、１４行〜４頁、７行に開示された任意のものであり、酸化剤は、ＷＯ２０１４０９７０９９の４頁、８〜１５行に開示された任意のものである。ある態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）であり、酸化剤は、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。
一実施形態では、クエンチング剤は、ＷＯ２０１５１１０９４１（３０頁、３〜２６行を参照されたい）に開示されたものである。
ある実施形態では、還元反応（ｄ）は、水性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応（ｄ）は、非プロトン性溶媒中で実行される。ある実施形態では、還元反応（ｄ）は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。
ある実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ＢｒｏｎｓｔｅｄもしくはＬｅｗｉｓ酸の存在下での水素化ホウ素ナトリウムもしくは亜鉛、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅｉＰｒＮ−ＢＨ３、ベンジルアミン−ＢＨ３または５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボランである。好ましい実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基があってもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を使用してキャップすることができる。一実施形態では、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。
担体タンパク質へのコンジュゲーション後、糖コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術によって精製する（糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
ある実施形態では、糖コンジュゲートを、シアニル化化学を使用して調製する。
ある実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、臭化シアンを用いて活性化する。活性化は、多糖またはオリゴ糖のヒドロキシル基のシアニル化に対応する。かくして、活性化された多糖またはオリゴ糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングする。
ある実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、シアン酸エステルを形成するための１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化する。かくして、活性化された多糖またはオリゴ糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングする。
ある実施形態では、スペーサーは、マレイミド活性化された担体タンパク質（例えば、Ｎ−［γ−マレイミドブチリロキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を使用する）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ−スクシンイミジルブロモ酢酸（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ−ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸（ＳＩＡ）もしくはスクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオン酸（ＳＢＡＰ））との反応後に得られるチオエーテル結合によって担体にカップリングすることができるチオール化された多糖またはオリゴ糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンであってよい。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学によって作製してもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
ある実施形態では、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）などのビス求電子試薬を使用することにより、糖コンジュゲートを調製する。そのような実施形態では、コンジュゲーション反応は、好ましくは、直接的経路により、または二属リンカー（例えば、ＷＯ２０１１０４１００３を参照されたい）を使用して、ＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中で行われる。
ある実施形態では、ＷＯ２０１４０２７３０２に開示された糖コンジュゲートを作製する方法により、糖コンジュゲートを調製する。得られる糖コンジュゲートは、二価、ヘテロ二官能性スペーサー（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバメート（ｅＴＥＣ）を介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた糖を含む。あるいは、ＷＯ２０１５１２１７８３に開示された糖コンジュゲートを作製する方法により、糖コンジュゲートを調製する。
他の好適なコンジュゲーション技術は、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）、ＥＤＣ＋スルホＮＨＳ、ＣＭＣ（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、またはＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド））を使用する。
ある実施形態では、多糖またはオリゴ糖を、リンカー、例えば、二官能性リンカーを介して担体タンパク質にコンジュゲートする。リンカーは、例えば、反応性アミノ基と反応性カルボン酸基、２つの反応性アミノ基または２つの反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性であってもよい。リンカーは、例えば、４〜２０個、４〜１２個、５〜１０個の炭素原子を有する。あり得るリンカーは、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（ＷＯ００／１０５９９）、ニトロフェニル−エチルアミン、ハロゲン化ハロアルキル、グリコシド結合（米国特許第４，６７３，５７４号、米国特許第４，８０８，７００号）、ヘキサンジアミンおよび６−アミノカプロン酸（米国特許第４，４５９，２８６号）が挙げられる。
担体タンパク質
糖コンジュゲートの成分は、精製された多糖またはオリゴ糖がコンジュゲートされる担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に使用することができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性的であるが、抗原的に同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８〜３８４４）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３またはＣＲＭ１０７；ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．（１９９２）により記載された他の突然変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号および第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号および第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、一部の様式で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（ＷＯ２００４／０８１５１５、ＷＯ２００６／０３２４９９）またはｄＰＬＹ−ホルモル、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５およびＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、ＰｈｔＡ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／０５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）を含む、肺炎球菌ニューモリシン（ｐｌｙ）（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６〜２７１３）、通常、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出されるＯＭＰＣ（髄膜炎菌外膜タンパク質）（ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、またはその免疫学的機能等価物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６〜３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４〜４８８７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を担持する外毒素Ａなど（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９（１１）：４９６７〜４９７１））からなる群から選択される。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。他の好適な担体タンパク質としては、コレラトキソイド（例えば、ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されている）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が挙げられる。
好ましい実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／０５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡからなる群から独立に選択される。
ある実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。
別の実施形態では、糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。
好ましい実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートする。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に識別不可能である。ＣＲＭ１９７は、毒素原性コリネファージベータ（Ｕｃｈｉｄａら（１９７１）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８〜１１）のニトロソグアニジン突然変異誘発によって創出された非毒素原性ファージβ１９７ｔｏｘ−により感染したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一の塩基変化（グアニンからアデニンへの）によってそれと異なる。この単一の塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の有毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。ＣＲＭ１９７およびその産生に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号に見出すことができる。
ある実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、ＣＲＭ１９７タンパク質またはＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートする（ＣＮ１０３４９５１６１を参照されたい）。ある実施形態では、精製された多糖またはオリゴ糖を、遺伝子組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現を介して得られるＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートする（ＣＮ１０３４９５１６１を参照されたい）。
好ましくは、糖コンジュゲート中の、担体タンパク質の多糖またはオリゴ糖に対する比は、１：５〜５：１；例えば、１：０．５〜４：１、例えば、１：１〜３．５：１、１．２：１〜３：１、１．５：１〜２．５：１；例えば、１：２〜２．５：１または１：１〜２：１（ｗ／ｗ）である。ある実施形態では、糖コンジュゲート中の、担体タンパク質の多糖またはオリゴ糖に対する比は、約１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１または１．６：１である。
担体タンパク質へのコンジュゲーション後、糖コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術によって精製する（糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
組成物は、少量の遊離担体を含んでもよい。所与の担体タンパク質が本発明の組成物中で遊離形態とコンジュゲート化形態の両方で存在する場合、非コンジュゲート化形態は、好ましくは、全体として組成物中の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは、２重量％未満で存在する。
２．２ 免疫原性組成物
ある実施形態では、本発明は、本明細書に開示される精製された多糖および／または糖コンジュゲートのいずれかを含む免疫原性組成物に関する。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に開示される糖コンジュゲートのいずれかを含む免疫原性組成物に関する。
ある実施形態では、本発明は、セクション２．１に開示された１〜２５種の異なる糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。
ある実施形態では、本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の異なる血清型に由来する１〜２５種の糖コンジュゲート（１〜２５種の肺炎球菌コンジュゲート）を含む免疫原性組成物に関する。一実施形態では、本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５種の異なる血清型に由来する糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。一実施形態では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６または２０種の異なる血清型に由来する糖コンジュゲートを含む。ある実施形態では、免疫原性組成物は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は１４、１５、１６、１７、１８、または１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、１６価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
ある実施形態では、前記免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する糖コンジュゲートを含む。
ある実施形態では、前記免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆおよび３３Ｆに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆおよび１５Ｂに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する糖コンジュゲートを含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来する糖コンジュゲートをさらに含む。
しかし、好ましい実施形態では、糖は、タンパク質担体の異なる分子にそれぞれ個別にコンジュゲートされる（タンパク質担体の各分子は、それにコンジュゲートされた１つの型の糖だけを有する）。前記実施形態では、莢膜糖は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされると言われる。好ましくは、上記免疫原性組成物の全ての糖コンジュゲートを、担体タンパク質に個別にコンジュゲートする。
上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。上記免疫原性組成物のいずれかの実施形態では、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する糖コンジュゲートを、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの糖コンジュゲートを、全て個別にＣＲＭ１９７にコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＰＤに個別にコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来する糖コンジュゲートを、ＴＴにコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＤＴにコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物のいずれかの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＰＤに個別にコンジュゲートし、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来する糖コンジュゲートを、ＴＴにコンジュゲートし、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来する糖コンジュゲートを、ＤＴにコンジュゲートする。
ある実施形態では、上記免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の８〜２０種の異なる血清型を含む。
ある実施形態では、本発明は、異なる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群に由来する１〜５種の糖コンジュゲート（１〜５種の髄膜炎菌コンジュゲート）を含む免疫原性組成物に関する。一実施形態では、本発明は、１、２、３、４または５種の異なる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群に由来する糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。一実施形態では、免疫原性組成物は、４または５種の異なる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）を含む。ある実施形態では、免疫原性組成物は、１、２、３、４または５価の髄膜炎菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、２価の髄膜炎菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、４価の髄膜炎菌コンジュゲート組成物である。ある実施形態では、免疫原性組成物は、５価の髄膜炎菌コンジュゲート組成物である。
ある実施形態では、免疫原性組成物は、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖（ＭｅｎＣ）を含む。
ある実施形態では、免疫原性組成物は、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖（ＭｅｎＡ）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖（ＭｅｎＣ）を含む。
ある実施形態では、免疫原性組成物は、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖（ＭｅｎＣ）を含む。
ある実施形態では、免疫原性組成物は、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖（ＭｅｎＡ）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖（ＭｅｎＹ）、コンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖（ＭｅｎＣ）および／またはコンジュゲート化髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ莢膜糖（ＭｅｎＸ）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１、２または３つのアジュバントをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、１つのアジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。抗原は、主に送達系として、主に免疫モジュレーターとして作用するか、または両方の強力な特徴を有してもよい。好適なアジュバントとしては、ヒトを含む哺乳動物中での使用にとって好適なものが挙げられる。
ヒトにおいて使用することができる公知の好適な送達系型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））などの水中油エマルジョン、モンタニドなどの油中水エマルジョン、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子が挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）を含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。
本明細書に開示される免疫原性組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとしては、限定されるものではないが、（１）例えば、（ａ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック遮断ポリマーＬ１２１、およびマイクロメートル以下のエマルジョンにマイクロ流体化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスされたｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）などの、水中油エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤を含む、または含まない）；（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、または使用することができるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）もしくはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それから生成される粒子（ＩＳＣＯＭはさらなる洗剤を含まなくてもよい（例えば、ＷＯ００／０７６２１を参照されたい））などのサポニンアジュバント；（３）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６を参照されたい））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）場合により、肺炎球菌糖類（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）と共に使用した場合、ミョウバンの実質的な非存在下にある、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）；（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（９）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）；（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）；（１１）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１３）組成物の効能を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
本発明の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
免疫原性組成物を、液体形態（すなわち、溶液もしくは懸濁液）または凍結乾燥形態で製剤化することができる。有利には、液体製剤を、その包装形態から直接投与することができ、かくして、それらは、そうでなければ凍結乾燥された本発明の組成物にとって必要とされる水性媒体中での再構成を必要とすることがなく、注射にとって理想的である。
本開示の免疫原性組成物の製剤化を、当業界で認識された方法を使用して達成することができる。例えば、個々の多糖および／またはコンジュゲートを、生理的に許容できるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例としては、限定されるものではないが、水、緩衝塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる。
本開示は、本明細書に開示される多糖または糖コンジュゲートの組合せのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、液体形態、好ましくは、水性液体形態にある。
本開示の免疫原性組成物は、緩衝剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、糖などの凍結防止剤、およびフリーラジカルスカベンジャーもしくはキレート剤などの酸化防止剤のうちの１つもしくは複数、またはそれらの任意の複数の組合せを含んでもよい。
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、緩衝剤を含む。ある実施形態では、前記緩衝剤は、約３．５〜約７．５のｐＫａを有する。一部の実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤またはクエン酸緩衝剤である。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝剤である。１つの特定の実施形態では、コハク酸緩衝剤の最終濃度は、約５ｍＭである。
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、塩を含む。一部の実施形態では、塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、界面活性剤を含む。ある実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリソルベート６５（ＴＷＥＥＮ（商標）６５）、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリソルベート８５（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、オクトキシノール４０、ノノキシノール−９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン−６６０ヒドロキシステアレート（ＰＥＧ−１５、Ｓｏｌｕｔｏｌ Ｈ１５）、ポリオキシエチレン−３５−リシノレエート（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ）、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０である。
１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート２０の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート２０である。
１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート４０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート４０の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート４０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート４０の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート４０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート４０の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート４０である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート４０の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート４０である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート４０の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート４０である。
１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート６０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６０の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６０の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６０である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６０の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６０である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート６０の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６０である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート６０の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６０である。
１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート６５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６５の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６５の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート６５の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６５である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート６５の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６５である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート６５の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート６５である。
１つの特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８５の最終濃度は、少なくとも０．０００１重量％〜１０重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８５の最終濃度は、少なくとも０．００１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８５である。一部の前記実施形態では、製剤中のポリソルベート８５の最終濃度は、少なくとも０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８５である。他の実施形態では、製剤中のポリソルベート８５の最終濃度は、０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８５である。別の実施形態では、製剤中のポリソルベート８５の最終濃度は、１重量％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８５である。
ある特定の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、５．５〜７．５のｐＨ、より好ましくは、５．６〜７．０のｐＨ、さらにより好ましくは、５．８〜６．０のｐＨを有する。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填した容器を提供する。一実施形態では、容器は、バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵器、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、容器はシリコン処理される。
ある実施形態では、本開示の容器は、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）および／またはポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性物質−エラストマー）製である。ある実施形態では、本開示の容器は、ガラス製である。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填したシリンジを提供する。ある特定の実施形態では、シリンジは、シリコン処理される、および／またはガラス製である。
注射のための本発明の免疫原性組成物の典型的な用量は、０．１ｍＬ〜２ｍＬ、より好ましくは、０．２ｍＬ〜１ｍＬ、さらにより好ましくは、約０．５ｍＬの容量を有する。
２．３ 抗原としての使用
本発明の方法によって精製された多糖および本明細書に開示されるコンジュゲートを、抗原として使用することができる。例えば、それらはワクチンの一部であってもよい。
したがって、ある実施形態では、本発明の方法によって精製された多糖または前記多糖を使用して得られた糖コンジュゲートは、対象における免疫応答を生成するのに使用するためのものである。一態様では、対象は、ヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌなどの哺乳動物である。一態様では、対象は、ヒトである。
ある実施形態では、本発明の方法によって精製された多糖、前記多糖を使用して得られた糖コンジュゲートまたは本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンにおける使用のためのものである。
ある実施形態では、本発明の方法によって精製された多糖、前記多糖を使用して得られた糖コンジュゲートまたは本明細書に開示される免疫原性組成物は、薬剤としての使用のためのものである。
本明細書に記載の免疫原性組成物を、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための様々な治療または予防方法において使用することができる。特に、本明細書に記載の免疫原性組成物を使用して、対象における肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を防止、処置または改善することができる。
かくして、一態様では、本開示は、対象における肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的有効量の本開示の免疫原性組成物（特に、その対応する多糖または糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物）を投与することを含む、方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、対象における肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、免疫学的有効量の本開示の免疫原性組成物（特に、その対応する多糖または糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物）を投与することを含む、方法を提供する。
ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。そのような実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物を使用して、対象における肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）または溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）感染を防止することができる。かくして、一態様では、本発明は、対象における肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する方法であって、対象に、免疫学的有効量の本開示の免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
一態様では、対象は、ヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌなどの哺乳動物である。一態様では、対象は、ヒトである。
本開示の免疫原性組成物を使用して、全身または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することによって、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に感受性のヒトを保護または処置することができる。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路によって投与する。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下注射によって投与する。ある実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物を、筋肉内または皮下注射によって投与する。
一部の場合、本開示による免疫原性組成物のわずか１用量が必要とされるが、より高い免疫欠損の状態などの一部の環境下では、第２、第３または第４の用量を与えてもよい。初回ワクチン接種の後、対象は、十分に間隔を空けた１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
ある実施形態では、本開示による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、単回用量である。
ある実施形態では、本開示による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、複数回用量スケジュールである。
３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する糖
一実施形態では、糖は、組換えグラム陰性細菌中で産生される。一実施形態では、糖は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で産生される。一実施形態では、糖は、組換えサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞中で産生される。例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＤ５５９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２８３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８６９、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８７８、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ８９６、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ１９０２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５ａ ＥＴＣ ＮＲ−５、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７：Ｋ−、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＣＶＤ１９４３、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＣＶＤ１９２５、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型パラティフィ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）Ａ ＣＶＤ１９０２、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＣＶＤ１２０８Ｓが挙げられる。一実施形態では、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＡＲ２４０１ではない。糖産生に対するこの遺伝的手法は、ワクチン成分としてのＯ多糖およびＯ抗原分子の効率的な産生を可能にする。
本明細書で使用される用語「ｗｚｚタンパク質」とは、例えば、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２などの、鎖長決定因子ポリペプチドを指す。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｅ４９９１／７６についてはＡＦ０１１９１０、Ｆ１８６についてはＡＦ０１１９１１、Ｍ７０／１−１についてはＡＦ０１１９１２、７９／３１１についてはＡＦ０１１９１３、Ｂｉ７５０９−４１についてはＡＦ０１１９１４、Ｃ６６４−１９９２についてはＡＦ０１１９１５、Ｃ２５８−９４についてはＡＦ０１１９１６、Ｃ７２２−８９についてはＡＦ０１１９１７、およびＥＤＬ９３３についてはＡＦ０１１９１９である。Ｇ７およびＢｉ３１６−４１ ｗｚｚ遺伝子配列に関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれ、Ｕ３９３０５およびＵ３９３０６である。例示的なｗｚｚ遺伝子配列に関するさらなるＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４５９５８１；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ ＦｅｐＥについてはＡＩＧ６６８５９；サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４６１０２４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５ ＷｚｚＢについてはＮＰ＿４１６５３１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５ ＦｅｐＥについてはＮＰ＿４１５１１９である。好ましい実施形態では、ｗｚｚファミリータンパク質は、ｗｚｚＢ、ｗｚｚ、ｗｚｚＳＦ、ｗｚｚＳＴ、ｆｅｐＥ、ｗｚｚｆｅｐＥ、ｗｚｚ１およびｗｚｚ２のいずれか１つ、最も好ましくは、ｗｚｚＢ、より好ましくは、ｆｅｐＥである。
例示的なｗｚｚＢ配列としては、
＞Ｏ２５ｂ ２４０１ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＥＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＥＱＶＴＫＰＱＶＱＱＴＥＤＶＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＳＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２０）
＞Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＮＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＤＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２１）
＞Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＶＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＦＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＫＥＰＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＤＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＬＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＮＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＳＫ（配列番号２２）
＞Ｋ１２ Ｗ３１１０ ＷｚｚＢ
ＭＲＶＥＮＮＮＶＳＧＱＮＨＤＰＥＱＩＤＬＩＤＬＬＶＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＩＳＶＩＶＡＩＡＬＡＩＧＹＬＡＶＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＶＧＱＩＡＧＹＮＮＡＭＮＶＩＹＧＱＡＡＰＫＶＳＤＬＱＥＴＬＩＧＲＦＳＳＡＦＳＡＬＡＥＴＬＤＮＱＥＥＲＥＫＬＴＩＥＰＳＶＫＮＱＱＬＰＬＴＶＳＹＶＧＱＴＡＥＧＡＱＭＫＬＡＱＹＩＱＱＶＤＤＫＶＮＱＥＬＥＫＤＬＫＤＮＩＡＬＧＲＫＮＬＱＤＳＬＲＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＲＱＩＱＥＡＬＱＹＡＮＱＡＱＶＴＫＰＱＩＱＱＴＧＥＤＩＴＱＤＴＬＦＬＬＧＳＥＡＬＥＳＭＩＫＨＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＮＹＹＱＴＲＱＮＬＬＤＩＥＳＬＫＶＤＤＬＤＩＨＡＹＲＹＶＭＫＰＭＬＰＩＲＲＤＳＰＫＫＡＩＴＬＩＬＡＶＬＬＧＧＭＶＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＮＹＮＡＫ（配列番号２３）
＞サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＷｚｚＢ
ＭＴＶＤＳＮＴＳＳＧＲＧＮＤＰＥＱＩＤＬＩＥＬＬＬＱＬＷＲＧＫＭＴＩＩＶＡＶＩＩＡＩＬＬＡＶＧＹＬＭＩＡＫＥＫＷＴＳＴＡＩＩＴＱＰＤＡＡＱＶＡＴＹＴＮＡＬＮＶＬＹＧＧＮＡＰＫＩＳＥＶＱＡＮＦＩＳＲＦＳＳＡＦＳＡＬＳＥＶＬＤＮＱＫＥＲＥＫＬＴＩＥＱＳＶＫＧＱＡＬＰＬＳＶＳＹＶＳＴＴＡＥＧＡＱＲＲＬＡＥＹＩＱＱＶＤＥＥＶＡＫＥＬＥＶＤＬＫＤＮＩＴＬＱＴＫＴＬＱＥＳＬＥＴＱＥＶＶＡＱＥＱＫＤＬＲＩＫＱＩＥＥＡＬＲＹＡＤＥＡＫＩＴＱＰＱＩＱＱＴＱＤＶＴＱＤＴＭＦＬＬＧＳＤＡＬＫＳＭＩＱＮＥＡＴＲＰＬＶＦＳＰＡＹＹＱＴＫＱＴＬＬＤＩＫＮＬＫＶＴＡＤＴＶＨＶＹＲＹＶＭＫＰＴＬＰＶＲＲＤＳＰＫＴＡＩＴＬＶＬＡＶＬＬＧＧＭＩＧＡＧＩＶＬＧＲＮＡＬＲＳＹＫＰＫＡＬ（配列番号２４）
が挙げられる。
例示的なＦｅｐＥ配列としては、
＞Ｏ２５ｂ ＧＡＲ２４０１ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＳＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＴＬＶＶＫＥＳＬＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＨＶＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１５）
＞Ｏ２５ａ：Ｋ５：Ｈ１ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＥＡＨＦＰＥＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＥＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＴＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＰＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＳＡＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＫＶＬＡＧＹＩＤＹＩＳＡＬＶＶＫＥＳＩＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＴＮＩＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＲＰＳＬＰＶＫＫＤＧＱＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＶＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＨＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１６）
＞Ｏ２５ａ ＥＴＥＣ ＡＴＣＣ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＳＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＴＬＶＶＫＥＳＬＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＴＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＨＶＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＧＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１７）
＞Ｏ１５７ ＦｅｐＥ
ＭＳＳＬＮＩＫＱＧＳＤＡＨＦＰＤＹＰＬＡＳＰＳＮＮＥＩＤＬＬＮＬＩＳＶＬＷＲＡＫＫＴＶＭＡＶＶＦＡＦＡＣＡＧＬＬＩＳＦＩＬＰＱＫＷＴＳＡＡＶＶＴＰＰＥＰＶＱＷＱＥＬＥＫＴＦＴＫＬＲＶＬＤＬＤＩＫＩＤＲＴＥＡＦＮＬＦＩＫＫＦＱＳＶＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＥＡＫＩＤＥＬＤＬＨＲＡＩＶＡＬＳＥＫＭＫＡＶＤＤＮＡＳＫＫＫＤＥＰＳＬＹＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＳＥＥＡＱＴＶＬＳＧＹＩＤＹＩＳＡＬＶＶＫＥＳＩＥＮＶＲＮＫＬＥＩＫＴＱＦＥＫＥＫＬＡＱＤＲＩＫＭＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＮＹＳＬＤＩＡＮＡＡＧＩＫＫＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＥＲＫＬＥＩＥＫＡＶＴＤＶＡＥＬＮＧＥＬＲＮＲＱＹＬＶＥＱＬＴＫＡＮＩＮＤＶＮＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＶＩＬＳＡＬＩＧＧＭＶＡＣＧＳＶＬＬＲＹＡＭＡＳＲＫＱＤＡＭＭＡＤＨＬＶ（配列番号１８）
＞サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＬＴ２ ＦｅｐＥ
ＭＰＳＬＮＶＫＱＥＫＮＱＳＦＡＧＹＳＬＰＰＡＮＳＨＥＩＤＬＦＳＬＩＥＶＬＷＱＡＫＲＲＩＬＡＴＶＦＡＦＡＣＶＧＬＬＬＳＦＬＬＰＱＫＷＴＳＱＡＩＶＴＰＡＥＳＶＱＷＱＧＬＥＲＴＬＴＡＬＲＶＬＤＭＥＶＳＶＤＲＧＳＶＦＮＬＦＩＫＫＦＳＳＰＳＬＬＥＥＹＬＲＳＳＰＹＶＭＤＱＬＫＧＡＱＩＤＥＱＤＬＨＲＡＩＶＬＬＳＥＫＭＫＡＶＤＳＮＶＧＫＫＮＥＴＳＬＦＴＳＷＴＬＳＦＴＡＰＴＲＥＥＡＱＫＶＬＡＧＹＩＱＹＩＳＤＩＶＶＫＥＴＬＥＮＩＲＮＱＬＥＩＫＴＲＹＥＱＥＫＬＡＭＤＲＶＲＬＫＮＱＬＤＡＮＩＱＲＬＨＹＳＬＥＩＡＮＡＡＧＩＫＲＰＶＹＳＮＧＱＡＶＫＤＤＰＤＦＳＩＳＬＧＡＤＧＩＳＲＫＬＥＩＥＫＧＶＴＤＶＡＥＩＤＧＤＬＲＮＲＱＹＨＶＥＱＬＡＡＭＮＶＳＤＶＫＦＴＰＦＫＹＱＬＳＰＳＬＰＶＫＫＤＧＰＧＫＡＩＩＩＩＬＡＡＬＩＧＧＭＭＡＣＧＧＶＬＬＲＨＡＭＶＳＲＫＭＥＮＡＬＡＩＤＥＲＬＶ（配列番号１９）
が挙げられる。
一部の実施形態では、改変された糖（対応する野生型糖と比較して改変されている）を、グラム陰性細菌中でグラム陰性細菌からｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｆｅｐＥ）を発現させる（必ずしも過剰発現させない）ことによって、および／または第２のｗｚｚ遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）のスイッチを切って（すなわち、抑制して、欠失させて、除去して）、中間の、もしくは長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成することによって産生させることができる。例えば、改変された糖を、ｗｚｚ２を発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚ１のスイッチを切ることによって産生させることができる。または、別の方法では、改変された糖を、ｗｚｚｆｅｐＥを発現させ（必ずしも過剰発現させない）、ｗｚｚＢのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｗｚｚＢを発現させる（必ずしも過剰発現させない）が、ｗｚｚｆｅｐＥのスイッチを切ることによって産生させることができる。別の実施形態では、改変された糖を、ｆｅｐＥを発現させることによって産生させることができる。好ましくは、ｗｚｚファミリータンパク質は、宿主細胞にとって異種である株に由来する。
一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中で、ｗｚｚファミリータンパク質、好ましくは、ｆｅｐＥを発現させて、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。一態様では、本発明は、グラム陰性細菌中で、ｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現させて（必ずしも過剰発現させない）、対応する野生型Ｏ抗原と比較して、少なくとも１、２、３、４、または５個の反復単位の増加を有する、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する高分子量糖を生成させることによって産生される糖に関する。対応する野生型糖と比較して、反復単位の数が増加したさらなる例示的な糖については、以下のＯ多糖およびＯ抗原の記載を参照されたい。望ましい鎖長は、所与のワクチン構築物との関連で改善された、または最大の免疫原性をもたらすものである。
別の実施形態では、糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。糖の長さを決定する方法は、当業界で公知である。そのような方法としては、核磁気共鳴、質量分析、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明は、内因性ｗｚｚ Ｏ抗原長調節因子の遺伝子（例えば、ｗｚｚＢ）が欠失し、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にとって異種のグラム陰性細菌に由来する（第２の）ｗｚｚ遺伝子（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ）で置き換えられ、中間の、または長いＯ抗原鎖を含有する、リポ多糖などの高分子量糖を生成する、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で産生される糖に関する。 一部の実施形態では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、好ましくは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するｗｚｚ遺伝子を含む。
一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、ｗｚｚファミリータンパク質の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。一実施形態では、宿主細胞は、安定に維持されるプラスミドベクターとして、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中の組み込まれた遺伝子として、Ｏ抗原の異種遺伝子を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞中でプラスミドベクターを安定に発現させる方法は、当業界で公知である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）宿主細胞の染色体中に異種遺伝子を組み込む方法は、当業界で公知である。
一態様では、組換え宿主細胞は、炭素源を含む培地中で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための炭素源は、当業界で公知である。例示的な炭素源としては、限定されるものではないが、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネートおよびメチルアミンなどの、糖アルコール、ポリオール、アルドール糖またはケト糖が挙げられる。好ましい実施形態では、培地は、グルコースを含む。一部の実施形態では、培地は、炭素源として、ポリオールまたはアルドール糖、例えば、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースおよびアラビノースを含む。培養を開始する前に、全ての炭素源を培地に添加するか、または培養中に少しずつ、もしくは連続的に添加してもよい。
組換え宿主細胞のための例示的な培養培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏのいずれか１つから選択される要素を含む。好ましくは、培地は、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、Ｎａ２ＳＯ４、アスパラギン酸、グルコース、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２およびＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏを含む。
本明細書で使用される培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）または天然であってよく、組換え宿主細胞の培養のための十分な栄養素を含んでもよい。好ましくは、培地は、液体培地である。
一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、微量栄養素をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、増殖因子をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、さらなる炭素源をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および追加炭素源をさらに含んでもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するのに好適な無機塩、微量栄養素、増殖因子、および補助炭素源は、当業界で公知である。
一部の実施形態では、培地は、必要に応じて、ペプトン、Ｎ−Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、さらなる成分を含んでもよい。一部の実施形態では、培地は、ペプトン、Ｎ−Ｚアミン、大豆酵素加水分解物、さらなる酵母抽出物、モルト抽出物、補助炭素源および種々のビタミンなどの、そのようなさらなる成分を含まない。
好適な補助炭素源の実例としては、限定されるものではないが、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物および糖蜜などの他の炭水化物；酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸などの有機酸；ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトールなどのアルコールが挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、窒素源をさらに含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための好適な窒素源は、当業界で公知である。好適な窒素源の実例としては、限定されるものではないが、アンモニアガスおよび水性アンモニアを含むアンモニア；塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩；尿素；硝酸または亜硝酸塩、および純粋な、または未精製の調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解物、コーン浸出液、カゼイン加水分解物、大豆かす加水分解物、酵母抽出物、ドライイースト、エタノール−酵母蒸留物、大豆粉、綿実粉などを含む、他の窒素含有材料が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、無機塩を含む。好適な無機塩の実例としては、限定されるものではないが、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素、ならびにリン酸の塩が挙げられる。
一部の実施形態では、培地は、好適な増殖因子を含む。好適な微量栄養素、増殖因子などの実例としては、限定されるものではないが、純粋な、もしくは部分的に精製された化合物として、または天然材料中に存在するものとしての、コエンザイムＡ、パントテン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ−６，８−チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ１２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸、アデニン、ウラシル、グアニン、チミンおよびシトシンなどの塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−またはｒ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトリロアセテートなどが挙げられる。当業者であれば、当業界で公知の方法および技術に従って、経験的にその量を決定することができる。
別の実施形態では、本明細書に記載の改変された糖（対応する野生型糖と比較した場合）は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的に生産される。糖の合成的生産または合成は、費用および時間集約的な生産プロセスの回避を容易にし得る。一実施形態では、糖は、例えば、逐次的グリコシル化戦略または逐次的グリコシル化戦略と、好適に保護された単糖中間体からの［３＋２］ブロック合成戦略との組合せを使用するなどによって合成される。例えば、チオールグリコシドおよびグリコシルトリクロロアセトイミデート誘導体を、グリコシル化におけるグリコシルドナーとして使用することができる。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成される糖は、上記のｗｚｚファミリータンパク質の操作などの組換え手段によって産生される糖と同一の構造を有する。
産生される糖（組換えまたは合成手段による）は、例えば、以下の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型：Ｏ１（例えば、Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、およびＯ１Ｃ）、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４（例えば、Ｏ４：Ｋ５２およびＯ４：Ｋ６）、Ｏ５（例えば、Ｏ５ａｂおよびＯ５ａｃ（１８０／Ｃ３株））、Ｏ６（例えば、Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５およびＯ６：Ｋ５４）、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８（例えば、Ｏ１８Ａ、Ｏ１８ａｃ、Ｏ１８Ａ１、Ｏ１８Ｂ、およびＯ１８Ｂ１）、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３（例えば、Ｏ２３Ａ）、Ｏ２４、Ｏ２５（例えば、Ｏ２５ａおよびＯ２５ｂ）、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５（例えば、Ｏ４５およびＯ４５ｒｅｌ）、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、６２Ｄ１、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３（例えば、Ｏ７３（７３−１株））、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、Ｏ１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、およびＯ１８７のいずれか１つを含む、任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する構造を含む。
個々の多糖は、典型的には、例えば、透析、濃縮操作、透析濾過操作、接線流濾過、沈降、溶出、遠心分離、沈降、限外濾過、深層濾過、および／またはカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）などの当業界で公知の方法によって精製される（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。好ましくは、多糖は、接線流濾過を含む方法によって精製される。
精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応することができるようにし（例えば、担体タンパク質に直接的に、またはｅＴＥＣスペーサーなどのリンカーを介して）、次いで、本明細書にさらに記載されるように、本発明の糖コンジュゲートに組み入れることができる。
１つの好ましい実施形態では、本発明の糖は、血清型がＯ２５ａである、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に由来する。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２５ｂである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ２である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１８Ａである。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７５である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ４である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１６である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ１３である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ７である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ８である。別の好ましい実施形態では、血清型は、Ｏ９である。
本明細書で使用される場合、上記の血清型のいずれかに対する参照は、当業界で公知であり、対応する血清型にとって独特である、反復単位構造（以下に記載されるようなＯ単位）を包含する血清型を指す。例えば、用語「Ｏ２５ａ」血清型（当業界では血清型「Ｏ２５」としても公知である）は、表１に示される式Ｏ２５を包含する血清型を指す。別の例として、用語「Ｏ２５ｂ」血清型とは、表１に示される式Ｏ２５ｂを包含する血清型を指す。
本明細書で使用される場合、血清型は、別途特定されない限り、例えば、式「Ｏ１８」という用語が、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、および式Ｏ１８Ｂ１を包含すると一般的に指すように、本明細書で一般的に称される。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ１」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ１」を含む式の種を包含することを一般的に指す。したがって、「Ｏ１血清型」とは、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃのいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ６」とは、それぞれ、表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つなどの、表１に記載の式名に総称「Ｏ６」を含む式の種を一般的に指す。したがって、「Ｏ６血清型」とは、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５；およびＯ６：Ｋ５４のいずれか１つを包含する血清型を一般的に指す。
表１に記載の式名中に総称を含む式の種を一般的に指す用語の他の例は、「Ｏ４」、「Ｏ５」、「Ｏ１８」、および「Ｏ４５」を含む。
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ２」とは、表１に示される式Ｏ２を指す。用語「Ｏ２ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２を包含する糖を指す。
本明細書で使用される場合、上記の血清型に由来するＯ抗原に対する参照は、対応する血清型名と共に標識された式を包含する糖を指す。例えば、用語「Ｏ２５Ｂ Ｏ抗原」とは、表１に示される式Ｏ２５Ｂを包含する糖を指す。
別の例として、用語「Ｏ１ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ａ１、式Ｏ１Ｂ、および式Ｏ１Ｃなどの、用語「Ｏ１」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
別の例として、用語「Ｏ６ Ｏ抗原」は、それぞれ表１に示される式Ｏ６：Ｋ２；式Ｏ６：Ｋ１３；式Ｏ６：Ｋ１５および式Ｏ６：Ｋ５４などの、用語「Ｏ６」を含む式を包含する糖を一般的に指す。
Ｏ多糖
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ多糖」とは、その構造が全細胞またはリピドＡを含まないという条件で、Ｏ抗原を含む任意の構造を指す。例えば、一実施形態では、Ｏ多糖は、リピドＡが結合していないリポ多糖を含む。リピドＡを除去するステップは当業界で公知であり、例として、酸を添加する熱処理を含む。例示的なプロセスは、１００℃で９０分間の１％酢酸による処理を含む。このプロセスは、除去されるリピドＡを単離するプロセスと組み合わされる。リピドＡを単離するための例示的プロセスとしては、超遠心分離が挙げられる。
一実施形態では、Ｏ多糖とは、Ｏ抗原からなる構造を指し、その場合、Ｏ多糖は、Ｏ抗原という用語と同義である。１つの好ましい実施形態では、Ｏ多糖とは、コア糖を含まない、Ｏ抗原の反復単位を含む構造を指す。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。別の好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原と、コア糖とを含む構造を指す。別の実施形態では、Ｏ多糖は、Ｏ抗原、コア糖、およびＫＤＯ部分を含む構造を指す。
ＬＰＳから、コアオリゴ糖を含むＯ多糖を精製する方法は、当業界で公知である。例えば、ＬＰＳの精製後、精製されたＬＰＳを、１００℃で９０分間にわたって１％（ｖ／ｖ）酢酸中で加熱することによって加水分解した後、４℃で５時間にわたって１４２，０００ｘｇで超遠心分離することができる。Ｏ多糖を含有する上清を凍結乾燥し、４℃で保存する。ある特定の実施形態では、Ｏ多糖の単純な精製を可能にするための莢膜合成遺伝子の欠失が記載される。
Ｏ多糖を、限定されるものではないが、ＬＰＳからリピドＡを除去するための弱酸加水分解を含む方法によって単離することができる。他の実施形態は、Ｏ多糖調製のための薬剤としてヒドラジンの使用を含んでもよい。ＬＰＳの調製を、当業界で公知の方法によって達成することができる。
ある特定の実施形態では、Ｗｚｚタンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）を発現する（必ずしも過剰発現しない）野生型、改変された、または弱毒化されたグラム陰性細菌株から精製されたＯ多糖が、コンジュゲートワクチンにおける使用のために提供される。好ましい実施形態では、Ｏ多糖鎖は、コンジュゲートまたは複合体化ワクチンとしてのワクチン抗原としての使用のためにｗｚｚタンパク質を発現する（必ずしも過剰発現しない）グラム陰性細菌株から精製される。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５１倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、６０倍、６１倍、６２倍、６３倍、６４倍、６５倍、６６倍、６７倍、６８倍、６９倍、７０倍、７１倍、７２倍、７３倍、７４倍、７５倍、７６倍、７７倍、７８倍、７９倍、８０倍、８１倍、８２倍、８３倍、８４倍、８５倍、８６倍、８７倍、８８倍、８９倍、９０倍、９１倍、９２倍、９３倍、９４倍、９５倍、９６倍、９７倍、９８倍、９９倍、１００倍以上増加した分子量を有する。好ましい実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１倍かつ最大でも５倍増加した分子量を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２倍かつ最大でも４倍増加した分子量を有する。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量の増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｋＤａ以上増加した分子量を有する。一実施形態では、本発明のＯ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも1ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加した分子量を有する。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２１ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２２ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも２００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも１００ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１５ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１８ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも３０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも９０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１２ｋＤａかつ最大でも８５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも７０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも６０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも５０ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４９ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４８ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４７ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも１０ｋＤａかつ最大でも４６ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４５ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４４ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４３ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４２ｋＤａ増加している。一実施形態では、分子量は、少なくとも２０ｋＤａかつ最大でも４１ｋＤａ増加している。対応する野生型Ｏ多糖と比較した、Ｏ多糖の分子量のそのような増加は、好ましくは、Ｏ抗原反復単位数の増加と関連する。一実施形態では、Ｏ多糖の分子量の増加は、ｗｚｚファミリータンパク質に起因する。
別の実施形態では、Ｏ多糖は、表１から選択されるいずれか１つの式を含み、Ｏ多糖中の反復単位数ｎは、対応する野生型Ｏ多糖中の反復単位数よりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の反復単位で多い。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。
Ｏ抗原
Ｏ抗原は、グラム陰性細菌の外膜中のリポ多糖（ＬＰＳ）の一部である。Ｏ抗原は、細胞表面上にあり、可変性細胞構成要素である。Ｏ抗原の可変性は、グラム陰性細菌の血清型決定のための基礎を提供する。現在の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型決定スキームは、Ｏ多糖１〜１８１を含む。
Ｏ抗原は、オリゴ糖反復単位（Ｏ単位）を含み、その野生型構造は、通常、広範囲の糖に由来する２〜８個の残基を含有する。例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原のＯ単位を、表１に示す。例示的なクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ抗原のＯ単位を、表１ａに示す。
一実施形態では、本発明の糖は、１個のオリゴ糖単位であってもよい。一実施形態では、本発明の糖は、関連する血清型の１つの反復オリゴ糖単位である。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の糖は、オリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、少数の反復単位（典型的には、５〜１５の反復単位）を有し、典型的には、合成的に、または多糖の加水分解によって誘導される。そのような実施形態では、糖は、式Ｏ８、式Ｏ９ａ、式Ｏ９、式Ｏ２０ａｂ、式Ｏ２０ａｃ、式Ｏ５２、式Ｏ９７、および式Ｏ１０１のいずれか１つから選択される構造を含んでもよい。
好ましくは、本発明の、および本発明の免疫原性組成物中の全ての糖は、多糖である。高分子量の多糖は、抗原性表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量の多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図される。
一部の実施形態では、それぞれ個々のＯ抗原ポリマー中の反復Ｏ単位の数（したがって、ポリマー鎖の長さおよび分子量）は、ｗｚｚ鎖長調節因子、内膜タンパク質に依存する。異なるｗｚｚタンパク質は、異なる範囲のモード長（４〜１００を超える反復単位）を付与する。用語「モード長」とは、反復Ｏ単位の数を指す。グラム陰性細菌は、一方は長く、一方は短い、２つの異なるＯＡｇモード鎖長を付与する２つの異なるＷｚｚタンパク質を有することが多い。グラム陰性細菌中でのｗｚｚファミリータンパク質（例えば、ｗｚｚＢ）の発現（必ずしも過剰発現ではない）は、ある特定の長さ範囲のＯ抗原の細菌産生にシフトさせる、もしくは偏らせる、および高収率の高分子量リポ多糖の産生を増強させる、Ｏ抗原長の操作を可能にし得る。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「短い」モード長とは、少数、例えば、１〜２０の反復Ｏ単位を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「長い」モード長とは、２０より大きく、最大で４０までの反復Ｏ単位の数を指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合の「非常に長い」モード長とは、４０より大きい反復Ｏ単位を指す。
一実施形態では、産生される糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも１０反復単位、１５反復単位、２０反復単位、２５反復単位、３０反復単位、３５反復単位、４０反復単位、４５反復単位、５０反復単位、５５反復単位、６０反復単位、６５反復単位、７０反復単位、７５反復単位、８０反復単位、８５反復単位、９０反復単位、９５反復単位、または１００反復単位の増加を有する。
別の実施形態では、本発明の糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。好ましくは、糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０反復単位の増加を含む。
糖中の反復単位の数を決定する方法も、当業界で公知である。例えば、多糖の分子量（コア糖またはＫＤＯ残基の分子量を含まない）を、反復単位の分子量（すなわち、式内のそれぞれの単糖の分子量の和として理論的に算出することができる、例えば、表１に示される対応する式中の構造の分子量）で除算することによって、反復単位の数（または式中の「ｎ」）を算出することができる。式内のそれぞれの単糖の分子量は、当業界で公知である。例えば、式Ｏ２５ｂの反復単位の分子量は、約８６２Ｄａである。例えば、式Ｏ１ａの反復単位の分子量は、約８４５Ｄａである。例えば、式Ｏ２の反復単位の分子量は、約８２９Ｄａである。例えば、式Ｏ６の反復単位の分子量は、約８９３Ｄａである。コンジュゲート中の反復単位の数を決定する場合、担体タンパク質の分子量およびタンパク質：多糖比を考慮に入れる。本明細書で定義される場合、「ｎ」とは、多糖分子中の反復単位の数（表１中で括弧内に示される）を指す。当業界で公知のように、生体高分子中で、反復構造は、例えば、失われる分枝などの、不完全な反復の領域が組み入れられていてもよい。さらに、細菌などの天然供給源から単離および精製された多糖は、サイズおよび分枝において不均一であり得ることが当業界で公知である。そのような場合、ｎは、集団中の分子のｎに関する平均値または中央値を表してもよい。
一実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、Ｏ抗原の少なくとも１の反復単位の増加を有する。Ｏ抗原の反復単位は、表１および表１ａに示される。一実施形態では、Ｏ多糖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の合計反復単位を含む。好ましくは、糖は、合計で少なくとも３から最大でも８０の反復単位を有する。別の実施形態では、Ｏ多糖は、対応する野生型Ｏ多糖と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の反復単位の増加を有する。一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式（例えば、表１に示される式など）のいずれかにおけるｎが、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および最大でも２００、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、または５０の整数である、Ｏ抗原を含む。任意の最小値と任意の最大値とを組み合わせて、範囲を定義することができる。例示的な範囲としては、例えば、少なくとも１〜最大でも１０００；少なくとも１０〜最大でも５００；および少なくとも２０〜最大でも８０、好ましくは、最大でも９０が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも３１〜最大でも９０である。好ましい実施形態では、ｎは、４０〜９０、より好ましくは、６０〜８５である。
一実施形態では、糖は、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎが少なくとも１であり、最大でも２００である、Ｏ抗原を含む。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１００であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１２５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１５０であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１７５であり、最大でも２００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも７５であり、最大でも１００である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも１０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも２５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも４０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも５０であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３０であり、最大でも９０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも８５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも７０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも６０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも５０である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４９である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４８である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４７である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３５であり、最大でも４６である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３６であり、最大でも４５である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３７であり、最大でも４４である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３８であり、最大でも４３である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４２である。一実施形態では、Ｏ抗原式のいずれか１つにおけるｎは、少なくとも３９であり、最大でも４１である。
例えば、一実施形態では、糖におけるｎは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０、最も好ましくは４０である。別の実施形態では、ｎは、少なくとも３５〜最大でも６０である。例えば、一実施形態では、ｎは、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０のいずれか１つ、好ましくは５０である。別の好ましい実施形態では、ｎは、少なくとも５５〜最大でも７５である。例えば、一実施形態では、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９、最も好ましくは６０である。
糖構造を、例えば、１Ｄ、１Ｈ、および／もしくは１３Ｃを含むＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの、当業界で公知の方法および手段によって決定することができる。
一部の実施形態では、コンジュゲーション前の精製された多糖は、５ｋＤａ〜４００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；５ｋＤａ〜４００ｋＤａ；５ｋＤａ〜３００ｋＤａ；５ｋＤａ〜２００ｋＤａ；５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ；１０ｋＤａ〜７５ｋＤａ；１０ｋＤａ〜６０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ；１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ；１５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ；１２ｋＤａ〜１２０ｋＤａ；１２〜７５ｋＤａ；１２〜５０ｋＤａ；１２〜６０ｋＤａ；３５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；４０ｋＤａ〜６０ｋＤａ；３５ｋＤａ〜６０ｋＤａ；２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２０ｋＤａ；または２０ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。 さらなる実施形態では、多糖は、７ｋＤａ〜１５ｋＤａ；８ｋＤａ〜１６ｋＤａ；９ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ；１０ｋＤａ〜６０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜７０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜１６０ｋＤａ；１５ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；２０ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；３０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；３０ｋＤａ〜６０ｋＤａ；３０ｋＤａ〜５０ｋＤａまたは５ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量を有する。上記の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
本明細書で使用される場合、多糖または担体タンパク質−多糖コンジュゲートの用語「分子量」とは、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって算出される分子量を指す。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけることができる。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を使用して行うことができる。機械的サイジングを、高圧ホモジナイゼーション剪断を使用して行うことができる。上記の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖を指す。
Figure 2021132644
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コアオリゴ糖
コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ中のリピドＡとＯ抗原外側領域との間に位置する。より具体的には、コアオリゴ糖は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＯ抗原とリピドＡとの間に結合を含む多糖の部分である。この結合は、最深部の３−デオキシ−ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基のヘミケタール機能と、リピドＡのＧｌｃＮＡｃ残基のヒドロキシル基との間のケトシド結合を含む。コアオリゴ糖領域は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株間で高い類似度を示す。それは通常、限られた数の糖を含む。コアオリゴ糖は、内側コア領域と、外側コア領域とを含む。
より具体的には、内側コアは、主にＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（ヘプトース）およびＫＤＯ残基から構成される。内側コアは、高度に保存されている。ＫＤＯ残基は、以下の式ＫＤＯ：
Figure 2021132644
 を含む。
コアオリゴ糖の外側領域は、内側コア領域よりも大きな変化を示し、この領域の差異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における５つのケモタイプ：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＫ−１２を区別する。ＨｅｐＩＩは、内側コアオリゴ糖の最後の残基である。外側コアオリゴ糖は全て、（ヘキソース）３炭水化物骨格および２つの側鎖残基と共に、構造テーマを共有するが、骨格中のヘキソースの順序ならびに側鎖残基の性質、位置、および結合は全て変化し得る。Ｒ１およびＲ４外側コアオリゴ糖の構造は、非常に類似しており、単一のβ結合残基においてのみ異なっている。
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコアオリゴ糖は、遠位オリゴ糖の構造に基づいて、当業界では５つの異なるケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に分類される。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含む糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、組成物は、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも２つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも３つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４つのコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、組成物は、５つ全部のコア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプに対する免疫応答を誘導する。
別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ｏ多糖がＯ抗原に結合したコアオリゴ糖を含まない糖コンジュゲートを含む。一実施形態では、そのような組成物は、Ｏ多糖を有する糖コンジュゲートがコアオリゴ糖を含まないにも拘わらず、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型は、５つのケモタイプの１つに従って特徴付けることができる。表２は、ケモタイプに従って特徴付けられる例示的な血清型を列挙する。太字の血清型は、示されたコアケモタイプと最も一般的に関連する血清型を表す。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、それぞれの対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のいずれか１つに対する免疫応答を含む、コア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケモタイプ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の少なくともいずれか１つに対する免疫応答を誘導する。
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一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ８、式Ｏ１８、式Ｏ９、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１〜１００である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ａ、式Ｏ６、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ７５、式Ｏ４、式Ｏ１６、式Ｏ１８、式Ｏ１３、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ９１、および式Ｏ１６３（式中、ｎは１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖から選択される、Ｒ１ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、糖中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２１、式Ｏ４４、式Ｏ１１、式Ｏ８９、式Ｏ１６２、および式Ｏ９（式中、ｎは１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖から選択される、Ｒ２ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ１５、式Ｏ１５３、式Ｏ２１、式Ｏ１７、式Ｏ１１、式Ｏ１５９、式Ｏ２２、式Ｏ８６、および式Ｏ９３（式中、ｎは１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖から選択される、Ｒ３ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、式Ｏ２、式Ｏ１、式Ｏ８６、式Ｏ７、式Ｏ１０２、式Ｏ１６０、および式Ｏ１６６（式中、ｎは１〜１００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖から選択される、Ｒ４ケモタイプを有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物は、Ｋ−１２ケモタイプ（例えば、式Ｏ２５ｂを有する糖および式Ｏ１６（式中、ｎは１〜１０００、好ましくは３１〜１００、より好ましくは３５〜９０、最も好ましくは３５〜６５である）を有する糖から選択される）を有する血清型に由来する構造を含む糖を含む。一部の実施形態では、前記組成物中の糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含む。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分をさらに含む。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分をさらに含む。
一部の実施形態では、糖は、コア糖を含まない。したがって、一実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ１コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ２コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ３コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒ４コア部分を含まない。別の実施形態では、Ｏ多糖は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２コア部分を含まない。
クレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥＢＳＩＥＬＬＡ ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ）に由来する糖および／またはポリペプチドまたはその断片
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、尿路感染、菌血症、および敗血症を引き起こすことが知られるグラム陰性病原菌である。一態様では、本明細書に開示される組成物はいずれも、Ｏ１（およびｄ−Ｇａｌ−ＩＩＩバリアント）、Ｏ２（およびｄ−Ｇａｌ−ＩＩＩバリアント）、Ｏ２ａｃ、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ７、Ｏ８、およびＯ１２から選択される少なくとも１つのクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型である、またはそれに由来する少なくとも１つの糖をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、本明細書に開示される組成物はいずれも、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｉ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片；およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＩＩ型線毛タンパク質に由来するポリペプチドまたはその免疫原性断片から選択されるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するポリペプチドをさらに含んでもよい。
当業界で公知のように、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原は、ホモポリマーガラクトース単位（またはガラクタン）を含有する。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１およびＯ２抗原はそれぞれ、Ｄ−ガラクタンＩ単位（Ｏ２ａ反復単位と称されることもある）を含有するが、Ｏ１抗原は、Ｏ１抗原がＤ−ガラクタンＩＩキャップ構造を有する点で異なる。Ｄ−ガラクタンＩＩＩ（ｄ−Ｇａｌ−ＩＩＩ）は、Ｄ−ガラクタンＩのバリアントである。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、［→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］の反復単位、および［→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１に由来する糖は、→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→３）−［α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）］−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］の反復単位（Ｄ−Ｇａｌ−ＩＩＩ反復単位と称される）を含む。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→］の反復単位を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ａ抗原のエレメントであってもよい）。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、［→３）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→５）−β−Ｄ−Ｇａｌｆ−（１→］の反復単位を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ２ｃ抗原のエレメントであってもよい）。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→４）結合Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｆｇ抗原のエレメントであってもよい）。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２に由来する糖は、（１→2）結合Ｇａｌｐ残基の側鎖付加によるＯ２ａ反復単位の改変を含む（クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａｅｈ抗原のエレメントであってもよい）。
メカニズムまたは理論によって束縛されるものではないが、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型Ｏ３およびＯ５のＯ抗原多糖構造は、それぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ９ａ（式Ｏ９ａ）およびＯ８（式Ｏ８）のものと同一であることが当業界で開示されている。
一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ４に由来する糖は、［→４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→２）−β−Ｄ−Ｒｉｂｆ−（１→）］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ７に由来する糖は、［→２−ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→２）−β−Ｄ−Ｒｉｂｆ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→］の反復単位を含む。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ８血清型に由来する糖は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ２ａと同じ反復単位構造を含むが、非化学量論的にはＯアセチル化されている。一部の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｏ１２血清型に由来する糖は、［α−Ｒｈａｐ−（１→３）−β−ＧｌｃｐＮＡｃ］二糖反復単位の反復単位を含む。
Figure 2021132644
本明細書で使用される場合、用語「約」は、記述された濃度範囲、時間枠、分子量、温度またはｐＨなどの、統計的に意味のある値の範囲内にあることを意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の１桁分以内、典型的には、２０％以内、より典型的には、１０％以内、さらにより典型的には、５％以内または１％以内であってもよい。時には、そのような範囲は、所与の値または範囲の測定および／または決定のために使用される標準的な方法に典型的な実験誤差以内であってもよい。用語「約」によって包含される許容可能な変動は、試験下の特定の系に依存し、当業者であれば容易に理解できる。本出願内である範囲が記載される場合はいつでも、その範囲内の全ての数も、本開示の実施形態として企図される。
本明細書における用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、全ての例において、それぞれ、用語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」と置換可能であってもよいことが本発明者らによって意図される。
本明細書でそれぞれ互換的に使用される、「免疫原性量」、「免疫学的有効量」、「治療有効量」、「予防有効量」、または「用量」は、一般的には、当業者には公知の標準的なアッセイによって測定した場合、細胞性（Ｔ細胞）または体液性（Ｂ細胞もしくは抗体）応答のいずれか、または両方である免疫応答を惹起するのに十分な抗原または免疫原性組成物の量を指す。
本文献の範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
本特許明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、添付の実施例に例示される。以下の実施例は、そうでなければ詳細に説明される場合を除いて、当業者には周知であり、日常的である標準的な技術を使用して実行される。実施例は、例示的であるが、本発明を限定するものではない。
（実施例１）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ＥＮＴＥＲＩＣＡ）株
臨床株および誘導体を、表３に列挙する。さらなる参照株は、Ｏ２５Ｋ５Ｈ１、臨床Ｏ２５ａ血清型株；およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＬＴ２を含んでいた。
標的オープンリーディングフレームを除去するが、短いｓｃａｒ配列を残す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の遺伝子ノックアウトを構築した。
簡単にするために、加水分解されたＯ抗原鎖およびコア糖を、Ｏ多糖（ＯＰＳ）の次に示す。
Figure 2021132644
（実施例２）
ＷＺＺＢ、ＦＥＰＥおよびＯ抗原遺伝子クラスタークローニングのためのオリゴヌクレオチドプライマー
Figure 2021132644
（実施例３）
プラスミド
プラスミドベクターおよびサブクローンを、表５に列挙する。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｗｚｚＢおよびｆｅｐＥ遺伝子を担持するＰＣＲ断片を、精製ゲノムＤＮＡから増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔに提供される高コピー数プラスミド中にサブクローニングした。このプラスミドは、ｐＵＣレプリコンに基づく。プライマーＰ３およびＰ４を使用して、その天然プロモーターと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｗｚｚＢ遺伝子を増幅したが、それらは、それぞれ、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼおよびホスホリボシルアデニンヌクレオチドヒドロラーゼをコードする近位および遠位遺伝子中の領域に結合するように設計される（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＧ１６５５ ＮＣ＿０００９１３．３に注釈されている）。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｆｅｐＥ遺伝子およびプロモーターを含有するＰＣＲ断片を、以前に記載されたプライマーを使用して増幅した。同様の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆｅｐＥプライマーを、利用可能なＧｅｎｂａｎｋゲノム配列または内部で生成された全ゲノムデータ（ＧＡＲ２４０１およびＯ２５Ｋ５Ｈ１の場合）に基づいて設計した。低コピー数プラスミドｐＢＡＤ３３を使用して、アラビノースプロモーターの制御下でＯ抗原生合成遺伝子を発現させた。プラスミドを最初に改変して、５’プロモーターおよび３’６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子と相同なユニバーサルプライマーを使用して増幅された長いＰＣＲ断片のクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ法による）を容易にした（表５）。
Figure 2021132644
 （実施例４）
Ｏ抗原精製
発酵ブロスを、酢酸で処理して、１〜２％の最終濃度（４．１の最終ｐＨ）にした。ＯＡｇの抽出および脱脂を、酸処理したブロスを１００℃に２時間加熱することによって達成した。酸加水分解の終わりに、バッチを周囲温度に冷却し、１４％ＮＨ４ＯＨを添加して、６．１の最終ｐＨにした。中和されたブロスを遠心分離し、遠心分離液を収集した。遠心分離液に、リン酸ナトリウム中のＣａＣｌ２を添加し、得られたスラリーを室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
遠心分離によって固体を除去し、１０ｋＤａ膜を使用して遠心分離液を１２倍に濃縮した後、水に対して２回透析濾過した。次いで、ＯＡｇを保持する保持液を、炭素フィルターを使用して精製した。炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウムを用いて１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。最終硫酸アンモニウム濃度は２Ｍであった。硫酸アンモニウム処理した炭素濾液を、泳動緩衝剤として２Ｍ硫酸アンモニウムを含む膜を使用してさらに精製した。ＯＡｇは流出液中に収集された。長いＯＡｇについては、ＨＩＣ濾液を濃縮した後、５ｋＤａ膜を使用して水（２０倍透析容量）に対して緩衝剤交換した。短い（天然）ＯＡｇ多糖については、ＭＷＣＯをさらに低減させて、収率を増強した。
別の実施形態では、遠心分離によって固体を除去し、１０ｋＤａ膜を使用して遠心分離液を１２倍に濃縮した後、水または２０〜２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜７．を含有する２０〜２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝剤に対して２回透析濾過した。次いで、ＯＡｇを保持する保持液を、炭素フィルターを使用して精製した。炭素濾液を、イオン交換（ＩＥＸ）膜クロマトグラフィーによってさらに精製した。次いで、ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウムを用いて１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。最終硫酸アンモニウム濃度は２Ｍであった。硫酸アンモニウム処理したＩＥＸ濾液を、泳動緩衝剤として２Ｍ硫酸アンモニウムを含むＨＩＣ膜を使用してさらに精製した。ＯＡｇは流出液中に収集された。ＨＩＣ濾液を濃縮した後、５ｋＤａ膜を使用して水（２０倍透析容量）に対して緩衝剤交換した。
実施例５〜１７の背景：ここで例示される実施例は、内側／外側オリゴ糖を含有してもよい、全ての血清型のＯ抗原多糖（Ｏ抗原またはＯ−Ａｇとも称される）の精製のためのプラットフォームに基づくプロセスを示す。
本明細書に記載の精製プロセスは、短鎖と長鎖との両方のＯ−Ａｇ多糖に適用可能である。ここで与えられる多くの実施例は、それぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ８およびＯ９に関する短鎖Ｏ−Ａｇである実施例１０および１１を除いて、長鎖Ｏ−Ａｇに関するものである。
（実施例５）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原多糖を精製するための方法
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵の完了後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂの細胞培養物の粗懸濁液を、ｐＨ約４．０にした最終濃度１．０％（ｖ／ｖ）の酢酸で処理することによって、これを達成した。次いで、酸性ブロスを１００℃の温度に加熱し、２．０時間インキュベートした。生成物を放出させた後、バッチを２０〜３０℃の周囲温度に冷却した。
Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇの放出条件をさらに改良するために、％ＫＤＯ、濃度、分子量（ＭＷ）、およびＯ−アセテートに対するｐＨ、温度、および保持時間の効果を検査するように実験設計（ＤＯＥ）を設定した。ＤＯＥ試験において検査される因子を、表１−１に示す。初期濃度、ＫＤＯの上限およびＯ−アセテートの上限は、この試験については、それぞれ、３．５ｍｇ／ｍＬ、２％および１．０ｍＭに設定されたことに留意されたい。
Figure 2021132644
それぞれ、１．０、２．０、２．５および４．０時間の時点での濃度、％ＫＤＯおよびＯ−アセテートの予測応答を評価した。ＭＷが大きい８０℃の温度に関する条件を除いて、全ての条件での分子量は一律で約５０〜５４ｋＤａであった。これはおそらく、生成物の不完全な放出に起因するものであったが、その場合、Ｏ−Ａｇは細胞成分または他の非特異的な表面多糖と結合しているかもしれない。したがって、ＤＯＥモデルは、これらの条件でＭＷに関する予測応答を提供することができなかった。４．０時間の時点で、範囲内に％ＫＤＯがなかった。
このＤＯＥの結果に基づいて、酸加水分解に関する条件を、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間の保持時間に再設定する。これらの放出条件を、その後の実験においてＯ−Ａｇ多糖の他の全ての血清型のために使用した。
２．凝集
このステップの主な目的は、放出された生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化ユニット操作の効率を増強する。ステップ１に由来する生成物の放出後の酸性化されたブロスを、１０％ミョウバン溶液で処理して２％（ｗ／ｖ）の最終濃度にし、さらに、硫酸を使用してｐＨを３．２に調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の初期精製に進めた。
あるいは、酸性化されたブロスを、６．０〜７．０のｐＨに中和した。中和された濾液を、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。中和された上清を、０．２μｍフィルターによって濾過した。中和された濾液を、生成物の品質に対していかなる有害な影響も与えることもなく、少なくとも１週間、４℃で保存することができる。バッチが精製の準備が整っている場合、中和された濾液は、上記段落に記載された凝集プロセスを経由するであろう。本実施例に例示されるその後の精製ステップは、別途指摘しない限り、この凝集法を使用する。
凝集後に生成物および深層濾液を含有する中和された濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルの比較を行った。屈折率（ＲＩ）とＵＶ２８０検出との両方の結果から、凝集ステップは、発酵培地から受け継がれた実質的な量の不純物を除去した。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ２に由来する深層濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる深層濾液の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤であった。透析容量の数は、両方の透析濾過ステップについて１０であった。ＵＦＤＦに由来する保持液を収集し、分析した。ＵＦＤＦ実行中の伝導度およびＵＶプロファイルは、浸透液に関するＵＶシグナルの有意な低下によって証明されるように、１回目の透析濾過の間に大部分の低分子量ならびにＵＶ関連不純物が除去されたことを示す。ＲＩとＵＶ検出との両方に関する、深層濾液およびＵＦＤＦ−１の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１５０ｇの、ＵＦＤＦ−１の保持液に由来するＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素フィルターを最初に水でリンスした後、フィルター面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、フィルターを緩衝剤でリンスし、生成物を含有するリンスを含む濾液を、炭素濾液として収集した。
ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩおよびＵＶ２８０関連不純物が除去され、炭素濾液が視覚的に無色になったことを示す。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために、血清型Ｏ２およびＯ６のＯ抗原のために元々開発された（実施例６および１５を参照されたい）。したがって、イオン交換（ＩＥＸ）膜クロマトグラフィーを使用してこれらの分子の静電相互作用特性を探索することによって、非血清型特異的細胞外または細胞内多糖に由来する不純物を除去することができる。
ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ膜カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。ここで例示される全ての実施例は、別途指摘しない限り、ＩＥＸ膜クロマトグラフィーのためにＮａｔｒｉＦｌｏ膜（または以後、ＨＤ−Ｑと称する）を使用した。
膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。以前のステップに由来する炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり、約２００〜２５０ｍｇの、炭素濾液中のＯ−Ａｇと共に、３０〜４０ｍＬ／ｍｉｎの流量で膜を通してポンプで送出した。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。このプロファイルでのＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶ２８０プロファイル、ＵＶシグナルは、高塩洗浄中に溶出したピークを示したが、これは、炭素濾液中に未知の負に荷電した不純物が存在していたことを示している。
炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩洗浄クロマトグラムが生成物ピークと同じ保持時間に小さいピークを示したことを示している。これは、この未知の物質がＯ２５ｂ Ｏ−Ａｇよりも強いイオン強度を有することを示唆している。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ステップ４に由来する炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）の泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理された炭素濾液を、４０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。あるいは、このＨＩＣ濾過ステップを、ステップ４からのＩＥＸ濾液について実施することもできる。
ＨＩＣ精製のためのＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー泳動を分析した。生成物はフロースルー流出液中にあり、水洗浄液中で示されたピークは、ＨＩＣ膜上に結合した非特定の疎水性関連不純物であった。炭素濾液およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、炭素濾液中に存在する小さい前肩部の不純物ピークがＨＩＣ濾過ステップによって除去されたことを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルを分析した。１０ＤＶ後、伝導度は安定状態に達したが、これは緩衝剤交換の完了を示している。
ＵＦＤＦ−２後のＨＩＣ濾液および最終精製されたＯ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。以下の表１−２は、最終精製されたＯ２５ｂ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例６）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ６の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの完了後、酸加水分解から始まる。Ｏ２５ｂについて行われるＤＯＥ試験に基づくと（実施例５を参照されたい）、酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間の保持時間である。酢酸を使用し、このステップを発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液について実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
凝集後に生成物および深層濾液を含有する酸性化されたブロスに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルの比較を分析した。屈折率（ＲＩ）とＵＶ２８０検出との両方は、凝集ステップが、発酵培地から受け継がれた実質的な量の不純物を除去したことを示す。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ２に由来する深層濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ２０および１０である。ＵＦＤＦ−１の深層濾液および保持液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較は、大部分の低分子量ならびにＵＶ関連不純物が透析濾過の間に除去されたことを示す。しかしながら、ＲＩクロマトグラムにおける生成物ピークと関連する大きい前肩部の不純物ピークが存在していた。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素フィルターを最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、フィルターを緩衝剤でリンスし、生成物を含有する濾液／リンスを収集した。ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩおよびＵＶ２８０関連不純物が除去され、炭素濾液が文学的に無色になったことを示す。しかしながら、前肩部の不純物ピークは、炭素濾液中に依然として存在する。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ＨＤ−Ｑ膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約１００〜２５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。
炭素濾液、およびＩＥＸ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、生成物ピークと関連する大きい前肩部のピークが炭素濾液から除去されたことを示す。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。以前のステップに由来するＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して濾過した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ濾液およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、炭素濾液中に存在する小さい前肩部の不純物ピークがＨＩＣ濾過ステップによって除去されたことを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために、以前のＨＩＣ精製ステップに由来する硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水と置き換える。このステップを、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔの５ｋＤａ分子量カットオフ膜を使用して実施する。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。
ＵＦＤＦ−２後のＨＩＣ濾液および最終精製されたＯ６ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。以下の表２−１は、最終精製されたＯ６ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例７）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ７５の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液についてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０および１５である。中和された濾液、凝集後の深層濾液およびＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。宿主細胞タンパク質および低分子量不純物を除去するための凝集およびＵＦＤＦ−１の有効性が、ＲＩとＵＶ２８０との両方のクロマトグラムによって証明された。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、実質的な量のＵＶ関連低分子量不純物が除去されたことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ＩＥＸ膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約２００〜２５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルを分析した。このプロファイルでは、ＵＶシグナルは、高塩洗浄液中にピークを示したが、これは、炭素濾液中に存在する未知の負に荷電した不純物が存在したことを示している。
炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩溶出試料が生成物ピークの下に二重のピークを示したことを示している。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＩＥＸ濾液、ＨＩＣ濾液、ＨＩＣ水洗浄液および精製されたＯ７５ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣは、水洗浄液試料も、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて生成物と同じ保持時間で溶出するピークを示したが、これは、より高い疎水性を有する少量の未知の物質が、ＩＥＸ濾液中におそらく存在することを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ７５ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表３−１は、最終精製されたＯ７５ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例８）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ１の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液についてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
凝集後の中和された濾液および深層濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。このデータは、実質的な量の不純物が凝集ステップによって除去されたことを示している。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０および１５である。ＵＦＤＦ−１後の深層濾液および保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。宿主細胞タンパク質および低分子量不純物を除去するための凝集およびＵＦＤＦ−１の有効性が、ＲＩとＵＶ２８０との両方のクロマトグラムによって証明された。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。濾過後、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液およびリンスを、炭素濾液として混合した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩクロマトグラフィープロファイルはあまり変化しなかったが、実質的な量のＵＶおよび着色関連不純物が除去されたことを示している。
５．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去し、内毒素レベルが最小レベルに保持されることを確保する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理された炭素濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して濾過した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。炭素濾液、およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルに基づく検出可能な改善はなかったが、内毒素レベルは有意に低下したことを示す（以下の表４−１を参照されたい）。
６．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ ５ｋＤａ膜を使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ１ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表４−１は、最終精製されたＯ１ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例９）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型１５の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液を用いてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。凝集後の中和された濾液および深層濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０である。実際の実験のＵＦＤＦ泳動は、低分子量ならびにＵＶ関連不純物の大部分が透析濾過の間に除去され、これがＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおいても証明されたことを示している。宿主細胞タンパク質および低分子量不純物を除去するための凝集およびＵＦＤＦ−１の有効性が、ＲＩとＵＶ２８０との両方のクロマトグラムによって証明された。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、実質的な量の低分子量不純物が除去されたことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏカセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約２００〜２５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の高塩緩衝剤で洗浄した。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルを分析した。このプロファイルでは、ＵＶシグナルは、高塩洗浄の間にピークを示したが、これは、炭素濾液中に存在する未知の負に荷電した不純物が存在したことを示している。炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩溶出試料が生成物と同様の保持時間で小さい二重のピークを示したことを示している。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ膜濾過に関するＵＶおよび伝導度のクロマトグラフィープロファイルを分析した。水洗浄ステップにおいて、小さい目に見えるピークが示されたが、これは、微量の特定されていない物質がＨＩＣ膜上に結合したことを示している。
ＩＥＸ濾液、ＨＩＣ濾液、ＨＩＣ水洗浄液および精製されたＯ１５ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、水洗浄液試料が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて生成物のわずかに前に溶出する二重のピークを示したが、これは、ＨＤ−Ｑの流れの中にいくらかの未知の物質が存在することを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルは、１０ＤＶ後、伝導度が安定状態に達し、緩衝剤交換の完了を示していることを示す。最終精製されたＯ１５ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表５−１は、最終精製されたＯ１５ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１０）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ８の精製
１．Ｏ抗原の放出
血清型Ｏ８は短鎖Ｏ抗原であり、分子量は１０〜１５ｋＤａの範囲にあると予想される。しかしながら、概略された精製プロセスは、全ての短鎖大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ−Ａｇにも適用される。このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液を用いてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０である。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。生成物ピークが炭素濾過後に減少したという事実は、炭素フィルターが設計された非特異的吸着モードを示している。それにも拘わらず、着色関連不純物の多くが除去された。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ（ＨＤ−Ｑ）カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約２００〜２５０ｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルを分析した。このプロファイルでは、ＵＶシグナルは、高塩洗浄の間にピークを示したが、これは、炭素濾液中に存在する未知の負に荷電した不純物が存在したことを示している。
炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩溶出試料が生成物と同様の保持時間で小さい二重のピークを示したことを示している。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ膜濾過に関するＵＶおよび伝導度のクロマトグラフィープロファイルを分析した。水洗浄ステップにおいて、目に見えるピークが示されたが、これは、微量の特定されていない疎水性物質がＨＩＣ膜上に結合したことを示している。
ＩＥＸ濾液、ＨＩＣ濾液、ＨＩＣ水洗浄液および精製されたＯ８ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、水洗浄液試料が、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいて生成物のわずかに前に溶出する二重のピークを示したが、これは、ＨＤ−Ｑの流れの中にごく少量の未知の物質のみが存在することを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、２００ＬＭＨおよび０．５バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ８ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表６−１は、最終精製されたＯ８ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１１）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ９の精製
１．Ｏ抗原の放出
血清型Ｏ９は短鎖Ｏ抗原であり、分子量は１０〜１５ｋＤａの範囲にあると予想される。概略された精製プロセスを使用した。このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液について実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。中和された濾液および深層濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムプロファイルの比較を分析した。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０である。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。生成物ピークが炭素濾過後に減少したという事実は、炭素フィルターが設計された非特異的吸着モードを示している。それにも拘わらず、着色関連不純物の多くが除去された。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ（ＨＤ−Ｑ）カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約２００〜２５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルを分析した。このプロファイルでは、ＵＶシグナルは、高塩洗浄の間にピークを示したが、これは、炭素濾液中に存在する未知の負に荷電した不純物が存在したことを示している。炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩溶出試料が生成物と同様の保持時間で小さいピークを示したことを示している。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ膜濾過に関するＵＶおよび伝導度のクロマトグラフィープロファイル。
ＩＥＸ濾液、ＨＩＣ濾液、ＨＩＣ水洗浄液および精製されたＯ８ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、水洗浄液試料がＲＩ検出において眼に見えるピークを示さなかったが、これは、ＩＥＸの流れの中に疎水性関連物質が存在しなかったことを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、２００ＬＭＨおよび０．５バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ９ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表７−１は、最終精製されたＯ９ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１２）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ２１の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液についてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１８である。実際の実験のＵＦＤＦ泳動は、低分子量ならびにＵＶ関連不純物の大部分が透析濾過の間に除去されたことを示している。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。宿主細胞タンパク質および低分子量不純物を除去するための凝集およびＵＦＤＦ−１の有効性が、ＲＩとＵＶ２８０との両方のクロマトグラムによって証明された。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ５５ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、実質的な量のＵＶ関連低分子量不純物が除去されたことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏカセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約１５０〜２００ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を、平衡化緩衝剤と、第１のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の緩衝剤であり、第２のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の高塩緩衝剤である２段階の洗浄液とでリンスした。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルは、膜上に結合したいくらかの未知の負に荷電した不純物が存在していたこと、および続いて、それらがステップの溶出の間に除去されたことを示す。
炭素濾液、ＩＥＸ濾液、１回目および２回目の段階の洗浄溶出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムはそれぞれ、段階洗浄試料からの２つの溶出液が生成物のものとは異なるプロファイル（ＲＩとＵＶとの両方のクロマトグラムにおける）を示したことを示す。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルは、１０ＤＶ後、伝導度が安定状態に達し、緩衝剤交換の完了を示していることを示す。最終精製されたＯ２１ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表８−１は、最終精製されたＯ２１ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１３）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ４の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
このステップの主な目的は、生成物を含有するブロスから、細胞破片、宿主細胞タンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化プロセスの効率を増強する。凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液についてここで実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。中和された濾液および深層濾液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１８である。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ５５ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、実質的な量のＵＶ関連低分子量不純物が除去されたことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ（ＨＤ−Ｑ）カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約１５０〜２００ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を、平衡化緩衝剤と、第１のものは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の緩衝剤であり、第２のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の高塩緩衝剤である２段階の洗浄液とでリンスした。炭素濾液およびＩＥＸ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。フロースルー流出液を、ＨＩＣ濾液としてリンスと共に収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ膜クロマトグラフィー泳動に関する伝導度およびＵＶプロファイルは、疎水性関連不純物がＨＩＣ膜上に結合した後、水によって洗浄除去されたことを示している。ＨＩＣ濾液およびＨＩＣ洗浄液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ４ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表９−１は、最終精製されたＯ４ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１４）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ２の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液から実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１８である。１０−１はＵＦＤＦ−１に関するＵＶおよび伝導度のプロファイルを示し、当業者であれば、多くのＵＶ関連低分子量不純物が１回目の透析濾過の間に除去されたことを見ることができる。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約７５〜１２５ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、炭素濾過が残留する着色および低分子量不純物の除去において非常に有効であったことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏカセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約５０〜１００ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を、平衡化緩衝剤と、第１のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の緩衝剤であり、第２のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の高塩緩衝剤である２段階の洗浄液とでリンスした。ＩＥＸ膜クロマトグラフィーに関するＵＶおよび伝導度プロファイルを分析した。高塩洗浄サイクル中に溶出したピークがあったことが描写されたが、これは、膜上に結合した少量の不純物があったことを示している。炭素濾液およびＩＥＸ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、１．２Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。フロースルー流出液を、ＨＩＣ濾液としてリンスと共に収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ２ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表１０−１は、最終精製されたＯ２ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１５）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ１１の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液から実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１８である。ＵＦＤＦ−１に関するＵＶおよび伝導度プロファイルは、多くのＵＶ関連低分子量不純物が１回目の透析濾過の間に除去されたことを示している。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ５５ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、炭素濾過が残留する着色および低分子量不純物の除去において非常に有効であったことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏカセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約１００〜１２５ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を、平衡化緩衝剤と、第１のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の緩衝剤であり、第２のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の高塩緩衝剤である２段階の洗浄液とでリンスした。ＩＥＸ膜クロマトグラフィーに関するＵＶおよび伝導度プロファイルを分析した。高塩洗浄ステップ中に溶出したピークがあったことが描写されたが、これは、膜上に結合した未知の不純物があったことを示している。炭素濾液、ＩＥＸ濾液および２つの高塩洗浄液試料に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。フロースルー流出液を、ＨＩＣ濾液としてリンスと共に収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水の中に透析濾過した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ１１ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表１１−１は、最終精製されたＯ１１ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１６）
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原血清型Ｏ１８の精製
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．凝集
凝集を、「凝集」のセクションの下で実施例５に記載された酸加水分解後に中和された濾液から実施した。１０％ミョウバン溶液を、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように中和された濾液に添加し、硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整した。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去する。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。１２−１は、凝集後の中和された濾液および深層濾液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり２０〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１８である。ＵＦＤＦ−１後の深層濾液および保持液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ５５ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約２００〜２５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
リンスを含む、ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液および炭素バルクに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、炭素濾過が残留する着色および低分子量不純物の除去において非常に有効であったことを示している。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏカセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約１００〜１５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を、平衡化緩衝剤と、第１のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４の緩衝剤であり、第２のものは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４の高塩緩衝剤である２段階の洗浄液とでリンスした。ＩＥＸ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム（上のクロマトグラム）を分析した。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。フロースルー流出液を、ＨＩＣ濾液としてリンスと共に収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶ２８０のプロファイルを分析した。少量の疎水性物質がＨＩＣ膜上に結合し、続いて、それを水によって洗浄除去した。ＨＩＣ濾液およびＨＩＣ洗浄液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００ＬＭＨおよび０．５〜１．０バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。最終精製されたＯ１８ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルを分析した。以下の表１２−１は、最終精製されたＯ１８ Ｏ−Ａｇの品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１７）
凝集を用いない大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）Ｏ抗原の精製
以前の１２の実施例に記載された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の精製プロセスのロバスト性をさらに証明するために、ここで本発明者らは、同じ精製プロセスが凝集剤としてミョウバン溶液を使用しなくても供給流にとって同等に有効であることを示した。Ｏ２およびＯ６およびＯ２５ｂの血清型のＯ−Ａｇを、この明澄化プロセスの証明のために使用した。
１．Ｏ抗原の放出
このプロセスは、リポ多糖（ＬＰＳ）からＯ−Ａｇを放出させるための発酵プロセスの後、酸加水分解から始まる。血清型Ｏ２５ｂ Ｏ−Ａｇに関して行われたこのＤＯＥの結果（実施例５を参照されたい）に基づくと、Ｏ抗原の全ての血清型に関する酸加水分解のために使用される条件は、ｐＨ３．８±０．１、温度９５±５℃および２．０時間のインキュベーション時間である。このステップを、発酵タンク中で実施した。
２．血清型Ｏ２５ｂに関する酸処理
酸加水分解の後、バッチを周囲温度に冷却した。硫酸を使用してｐＨを３．２にさらに調整し、バッチを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清は、凝集したバッチのものとは反対に、わずかな霞みを示し、次いで、霞んだ上清を０．２μｍフィルターによって濾過した。得られる深層濾液は視覚的に透明であり、これを、実施例５〜１６に記載されたＵＦＤＦ−１、炭素濾過、ＩＥＸ膜クロマトグラフィー、ＨＩＣ濾過およびＵＦＤＦ−２を含むその後の精製プロセシングステップに進めた。
表１３−１は、ミョウバン凝集ステップを用いて、および用いずに精製されたＯ２５ｂ Ｏ−Ａｇの品質特性の比較を示す。
Figure 2021132644
３．血清型Ｏ２およびＯ６に関する酸処理
血清型Ｏ２およびＯ６のＯ−Ａｇの酸処理を、実施例５のセクション１に記載されたプロセスによって得られた、中和された濾液について実施した。中和された濾液のｐＨを３．２に調整した後、バッチを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。両血清型における上清は再度、その対応する凝集した溶液と比較してわずかな霞みを示した。しかしながら、上清を０．２μｍフィルターによって濾過した後、得られた濾液は視覚的に透明になった。次いで、深層濾液を、実施例５〜１６に記載されたＵＦＤＦ−１、炭素濾過、ＩＥＸ膜クロマトグラフィー、ＨＩＣ濾過およびＵＦＤＦ−２を含むその後の精製プロセシングステップに進めた。
表１３−２および１３−３は、それぞれ、ミョウバン凝集ステップを用いて、および用いずに精製された、Ｏ２およびＯ６ Ｏ−Ａｇの品質特性の比較を示す。
Figure 2021132644
Figure 2021132644
（実施例１８）
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ多糖（Ｎｍ−Ａ ｐｏｌｙ）を精製するための方法
１．凝集および明澄化
このプロセスは、細胞表面から多糖を放出させるために５５℃に１時間熱処理した髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞培養物から始まる。次いで、放出された生成物を含有する細胞ブロスを、凝集にかける。このステップの主な目的は、ブロスから細胞破片、宿主細胞のタンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化ユニット操作の効率を増強する。
凝集は、５Ｍ ＣａＣｌ２溶液を発酵ブロスに添加して、０．２Ｍの最終ＣａＣｌ２濃度にすることによって達成される。ＣａＣｌ２処理された溶液を、穏やかに混合しながら、５０〜７０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、バッチを周囲温度に冷却した後、２０℃にて１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。明澄化された濾液を、ＵＦＤＦ−１の初期精製に進めた。
２．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ１に由来する明澄化された濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる明澄化された濾液の量は、典型的には、膜の面積１ｍ２あたり約５５ｇの多糖である。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜１５倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用された緩衝剤は、第１の透析濾過については２５ｍＭクエン酸塩／５０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０であり、この後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を使用する第２の透析濾過を行った。２つの透析濾過ステップに関する透析容量（ＤＶ）の数は、それぞれ、１０および２０であった。ＵＦＤＦに由来する保持液を収集し、分析した。ＵＦＤＦ泳動中の伝導度およびＵＶプロファイルは、浸透液のＵＶシグナルの有意な低下ならびに明澄化された濾液およびＵＦＤＦ−１の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムによって証明されたように、大部分の低分子量ならびにＵＶ関連低分子量不純物が透析濾過の間に除去されたことを示す。
３．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約３００〜６００ｇの、ＵＦＤＦ−１の保持液に由来するＮｍ−Ａ ｐｏｌｙの負荷で使用した。炭素フィルターを、フィルター面積１ｍ２あたり約２０リットルの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０の透析緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０〜７５ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で炭素フィルターによって濾過した。次いで、フィルターを緩衝剤でリンスし、生成物を含有するリンスを含む濾液を、炭素濾液として収集した。
ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩおよびＵＶ２８０関連不純物が除去され、炭素濾液が視覚的に無色になったことを示した。
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、残留脂質多糖（内毒素）などの、疎水特性を有する不純物を除去するものであった。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ステップ３に由来する炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、１．５Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）の泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理された炭素濾液を、０．２〜１．０膜容量（ＭＶ）／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜を通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ精製のためのＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー泳動を分析した。生成物はフロースルー流出液中にあり、水洗浄液中で示されたピークは、ＨＩＣ膜上に結合した非特定の疎水性関連不純物であった。炭素濾液およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、疎水性不純物がＨＩＣ濾過ステップによって除去されたことを示す。
５．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０〜１５倍に濃縮した後、約１０〜２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、１００〜５００ＬＭＨおよび０．５〜１．５バールに設定した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルを分析した。１０ＤＶ後、伝導度は安定状態に達したが、これは緩衝剤交換の完了を示している。
ＵＦＤＦ−２後のＨＩＣ濾液および最終精製されたＮｍ＿Ａ多糖に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を、０．２μｍ濾過にかけた。表１４は、最終精製されたＮｍ＿Ａ多糖の品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例１９）
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ多糖（Ｎｍ−Ｃ ｐｏｌｙ）を精製するための方法
１．凝集および明澄化
このプロセスは、細胞表面から多糖を放出させるために５５℃に１時間熱処理した髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞培養物から始まる。次いで、放出された生成物を含有する細胞ブロスを、凝集にかける。このステップの主な目的は、ブロスから細胞破片、宿主細胞のタンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化ユニット操作の効率を増強する。
これは、濃ＣａＣａｌ２溶液を発酵ブロスに添加し、最終ＣａＣｌ２濃度を０．３Ｍに調整することによって達成される。ＣａＣｌ２処理された溶液を、穏やかに混合しながら、５０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、バッチを周囲温度に冷却した後、２０℃にて１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。明澄化された濾液を、ＵＦＤＦ−１の初期精製に進めた。
２．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ１に由来する明澄化された濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる明澄化された濾液の量は、典型的には、膜の面積１ｍ２あたり約４０ｇの多糖である。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜１５倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２５ｍＭクエン酸塩／５０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０であり、次いで、水または他の望ましい緩衝剤の第２の透析濾過を行う。透析容量の数は、両方の透析濾過ステップについて１０〜２０であった。ＵＦＤＦに由来する保持液を収集し、分析する。ＵＦＤＦ泳動中の伝導度およびＵＶプロファイルは、浸透液のＵＶシグナルの有意な低下によって証明されるように、１回目の透析濾過の間に大部分の低分子量ならびにＵＶ関連不純物が除去されることを検証するために審査される。ＲＩとＵＶ検出との両方に関する、明澄化された濾液およびＵＦＤＦ−１の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を分析する。
３．イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）
ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ膜カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜を使用することもできる。
膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させる。以前のステップに由来する炭素濾液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ濃度に調整し、ＭＶ １ｍＬあたり約７０ｍｇの多糖を用いて０．２〜１．０ＭＶ／ｍｉｎの流量で膜を通してポンプ送出する。次いで、膜を、１０〜３０ＭＶの平衡化緩衝剤でリンスする。１００％の高塩緩衝剤に対して約１３ＭＶ、次いで、１５ＭＶ中、５０％の高塩緩衝剤２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０の直線勾配で溶出を実行する。２つの溶出ピークに対応する溶出画分を別々にプールし、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。ＵＦＤＦ−１において示した高分子量不純物は、ＩＥＸ膜によって捕捉され、１回目の溶出の間に除去される。２回目の溶出部分は、大部分は生成物を含有する。
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、残留脂質多糖（内毒素）などの、疎水特性を有する不純物を除去するものである。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸクロマトグラフィーに由来する溶出液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、１．５Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）の泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ溶出液を、０．２〜１．０膜容量（ＭＶ）／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜を通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ精製のためのＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー泳動を分析した。生成物はフロースルー流出液中にあり、水洗浄液中で示されたピークは、ＨＩＣ膜上に結合した非特定の疎水性関連不純物であった。
５．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０〜１５倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、１００〜５００ＬＭＨおよび０．５〜１．５バールに設定した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルを分析した。１０ＤＶ後、伝導度は安定状態に達したが、これは緩衝剤交換の完了を示している。ＵＦＤＦ−２後の最終精製されたＮｍ＿Ｃ多糖を、０．２μｍ濾過にかけた。表１５は、最終精製されたＮｍ＿Ｃ多糖の品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例２０）
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ多糖（Ｎｍ−Ｗ ｐｏｌｙ）を精製するための方法
１．凝集および明澄化
このプロセスは、細胞表面から多糖を放出させるために５５℃に１時間熱処理した髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞培養物から始まる。次いで、放出された生成物を含有する細胞ブロスを、凝集にかける。このステップの主な目的は、ブロスから細胞破片、宿主細胞のタンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化ユニット操作の効率を増強する。
これは、５Ｍ ＣａＣａｌ２溶液を発酵ブロスに添加し、最終ＣａＣｌ２濃度を０．２Ｍに調整することによって達成される。ＣａＣｌ２処理された溶液を、穏やかに混合しながら、５０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、バッチを周囲温度に冷却した後、２０℃にて１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。明澄化された濾液を、ＵＦＤＦ−１の初期精製に進めた。
２．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ１に由来する明澄化された濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる明澄化された濾液の量は、典型的には、膜の面積１ｍ２あたり約８４ｇの多糖である。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜１５倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２５ｍＭクエン酸塩／５０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０であり、次いで、水または他の望ましい緩衝剤の第２の透析濾過を行った。透析容量数は、それぞれ、第１の透析濾過については１０および第２の透析濾過については２０であった。ＵＦＤＦに由来する保持液を収集し、分析した。ＵＦＤＦ泳動中の伝導度およびＵＶプロファイルは、浸透液のＵＶシグナルの有意な低下によって証明されるように、１回目の透析濾過の間に大部分の低分子量ならびにＵＶ関連不純物が除去されたことを示す。
３．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１，０００ｇの、ＵＦＤＦ−１の保持液に由来するＮｍ−Ｗ ｐｏｌｙの負荷で使用した。炭素フィルターを最初に水でリンスした後、フィルター面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで６０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、フィルターを緩衝剤でリンスし、生成物を含有するリンスを含む濾液を、炭素濾液として収集した。
ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩ、ＵＶ２８０関連および低分子量不純物が炭素フィルターによって除去されることを示していた。炭素濾液は、視覚的に無色になった。
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、残留脂質多糖（内毒素）などの、疎水特性を有する不純物を除去するものである。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ステップ３に由来する炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、１．５〜２．０Ｍの最終濃度にした。ＨＩＣ膜上にロードされたＮｍ＿Ｗ多糖の量は、膜容量（ＭＶ）１ｍＬあたり約３０〜１１６ｍｇであった。フェニル膜を、最初に硫酸アンモニウム（ＡＳ）の泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理された炭素濾液を、０．２〜１．０膜容量（ＭＶ）／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜を通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ精製のためのＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー泳動を分析した。生成物はフロースルー流出液中にあり、水洗浄液中で示されたピークは、ＨＩＣ膜上に結合した非特定の疎水性関連不純物であった。炭素濾液およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、疎水性不純物がＨＩＣ濾過ステップによって除去されたことを示す。
５．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０〜１５倍に濃縮した後、約１０〜２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、１００〜５００ＬＭＨおよび０．５〜１．５バールに設定した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルを分析した。１０ＤＶ後、伝導度は安定状態に達したが、これは緩衝剤交換の完了を示している。
ＵＦＤＦ−２後のＨＩＣ濾液および最終精製されたＮｍ＿Ｗ多糖に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を、０．２μｍ濾過にかけた。表１６は、最終精製されたＮｍ＿Ｗ多糖の品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例２１）
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ多糖（Ｎｍ−Ｙ ｐｏｌｙ）を精製するための方法
１．凝集および明澄化
このプロセスは、細胞表面から多糖を放出させるために５５℃に１時間熱処理した髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞培養物から始まる。次いで、放出された生成物を含有する細胞ブロスを、凝集にかける。このステップの主な目的は、ブロスから細胞破片、宿主細胞のタンパク質および核酸を沈降させることである。また、それは下流の明澄化ユニット操作の効率を増強する。
これは、５Ｍ ＣａＣａｌ２溶液を発酵ブロスに添加し、最終ＣａＣｌ２濃度を０．２Ｍに調整することによって達成される。ＣａＣｌ２処理された溶液を、穏やかに混合しながら、５０〜７０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、バッチを周囲温度に冷却した後、２０℃にて１５，０００ｇで４０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。明澄化された濾液を、ＵＦＤＦ−１の初期精製に進めた。
２．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
上記のステップ１に由来する明澄化された濾液を、１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）によってさらに精製する。プロセシングされる明澄化された濾液の量は、典型的には、膜の面積１ｍ２あたり約２０ｇの多糖である。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜１５倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２５ｍＭクエン酸塩／５０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０であり、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０の第２の透析濾過であった。透析容量数は、それぞれ、第１の透析濾過については１２および第２の透析濾過については２５であった。ＵＦＤＦに由来する保持液を収集し、分析した。ＵＦＤＦ泳動中の伝導度およびＵＶプロファイルは、浸透液のＵＶシグナルの有意な低下によって証明されるように、１回目の透析濾過の間に大部分の低分子量ならびにＵＶ関連不純物が除去されたことを示す。
３．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ Ｒ３２ＳＰ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約８８５ｇの、ＵＦＤＦ−１の保持液に由来するＮｍ−Ｙ ｐｏｌｙの負荷で使用した。炭素フィルターを最初に水でリンスした後、フィルター面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで７２ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、フィルターを緩衝剤でリンスし、生成物を含有するリンスを含む濾液を、炭素濾液として収集した。
ＵＦＤＦ保持液および炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＲＩ、ＵＶ２８０関連および低分子量不純物が炭素フィルターによって除去されることを示していた。炭素濾液は、視覚的に無色になった。
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、残留脂質多糖（内毒素）などの、疎水特性を有する不純物を除去するものである。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ステップ３に由来する炭素濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、１．７５Ｍの最終濃度にした。ＨＩＣ膜上にロードされたＮｍ＿Ｙ多糖の量は、膜容量（ＭＶ）１ｍＬあたり約４０ｍｇであった。フェニル膜を、最初に硫酸アンモニウム（ＡＳ）の泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理された炭素濾液を、０．２〜１．０膜容量（ＭＶ）／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜を通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。
ＨＩＣ精製のためのＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー泳動を分析した。生成物はフロースルー流出液中にあり、水洗浄液中で示されたピークは、ＨＩＣ膜上に結合した非特定の疎水性関連不純物であった。炭素濾液およびＨＩＣ濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、疎水性関連不純物がＨＩＣ濾過ステップによって除去されたことを示す。
５．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０〜１５倍に濃縮した後、約２５の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、３００〜４００ＬＭＨおよび０．５〜１．５バールに設定した。透析濾過中のＤＶの関数としての浸透液の伝導度およびＵＶ２８０シグナルを分析した。１０ＤＶ後、伝導度は安定状態に達したが、これは緩衝剤交換の完了を示している。
ＵＦＤＦ−２後のＨＩＣ濾液および最終精製されたＮｍ＿Ｙ多糖に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を、０．２μｍ濾過にかけた。表１７は、最終精製されたＮｍ＿Ｙ多糖の品質特性をまとめたものである。
Figure 2021132644
（実施例２２）
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）Ｏ抗原多糖の精製に関する説明
１．Ｏ抗原の放出
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｉａ）Ｏ１およびＯ２ Ｏ抗原（Ｋｌｅｂ Ｏ−Ａｇ）は短鎖Ｏ抗原であり、その分子量は８．０〜１６．０ｋＤａの範囲にあると予想される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ−Ａｇに関して実施例５〜１７に記載された精製プロセスは、Ｋｌｅｂ Ｏ−Ａｇにも適用される。発酵後、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｉａ）Ｏ１およびＯ２ Ｏ抗原を、ｐＨ３．８±０．１、温度９５℃±５℃および２．０時間のインキュベーション時間での酸加水分解によってリポ多糖（ＬＰＳ）から放出させる。このステップを、発酵タンク中で実施した。この条件は、リピドＡと、ＬＰＳのコアオリゴ糖との間の酸不安定結合を切断するであろう（実施例５を参照されたい）。
２．凝集
上記のステップ１に記載されたＫｌｅｂ Ｏ−Ａｇの放出後、ブロスを周囲温度に冷却し、１０％ミョウバン溶液で処理して２．０％（ｗ／ｖ）の最終濃度にし、さらにｐＨを３．２に調整した。この凝集ステップは、細胞破片、宿主細胞のタンパク質および核酸を沈降させるであろう。凝集したスラリーを周囲温度で１．０時間インキュベートした後、１２，０００〜１４，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を０．２μｍフィルターまたは別の好適な深層フィルターによって濾過して、溶液中に飛ばすことができる小さい粒子を除去した。深層濾液を、ＵＦＤＦ−１の次のステップに進めた。
３．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）
精製は、５ｋＤａまたは１０ｋＤａのＳａｒｔｏｃｏｎ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを使用する限外濾過および透析濾過（ＵＦＤＦ）による深層濾液（上記のステップ２に由来する）から始まる。プロセシングされる材料の量は、典型的には膜の面積１ｍ２あたり１５〜３０リットルである。この操作の目的は、（ｉ）溶液を１０〜２０倍濃縮することによる体積低減および（ｉｉ）透析濾過によって発酵培地を所望の緩衝剤と置き換えることによる緩衝剤交換である。このステップで使用される緩衝剤は、２０ｍＭクエン酸塩／０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０、次いで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の第２の緩衝剤である。透析容量の数は、それぞれの透析濾過ステップについて、それぞれ１０〜１８である。ＵＦＤＦ−１後の保持液のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。
４．炭素濾過
このユニット操作は、タンパク質および核酸などの宿主細胞不純物ならびに着色不純物のレベルを低下させるものである（ＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。３Ｍ炭素フィルターを、炭素フィルター面積１ｍ２あたり約１００〜１５０ｇのＯ−Ａｇの負荷で使用する。炭素を最初に水でリンスした後、膜面積１ｍ２あたり約２０リットルの緩衝剤の透析濾過緩衝剤でリンスした。次いで、ＵＦＤＦ−１に由来する保持液を、１回通過モードで５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）の流量で濾過した。次いで、炭素フィルターを緩衝剤でリンスした。生成物を含有する濾液および緩衝剤リンスを収集した。
炭素濾液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを分析した。生成物ピークが炭素濾過後に減少したという事実は、炭素フィルターが設計された非特異的吸着モードを示している。それにも拘わらず、着色関連不純物の多くが除去された。
５．ＩＥＸ膜クロマトグラフィー
このステップは、非特異的な負に荷電した不純物を除去するために開発された（実施例５のＩＥＸ膜クロマトグラフィーのセクションを参照されたい）。ここで使用されるＩＥＸ膜は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＮａｔｒｉＦｌｏ（ＨＤ−Ｑ）カセットである。あるいは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＳｔｅｄｉｍからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ膜または３ＭからのＥｍｐｈａｚｅ ＡＥＸ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用することもできる。膜を、最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２、典型的には、２０〜３０膜容量（ＭＶ）で平衡化させた。次いで、炭素濾液を、ＭＶ １ｍＬあたり約７５〜２５０ｍｇのＯ−Ａｇで膜上にロードした。生成物を含有するフロースルー流出液または濾液を収集した。膜を平衡化緩衝剤でリンスした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１．０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の高塩緩衝剤で洗浄した。
ＩＥＸ膜クロマトグラフィー泳動の伝導度およびＵＶプロファイルを分析した。このプロファイルでは、ＵＶシグナルは、高塩洗浄の間にピークを示したが、これは、炭素濾液中に存在する未知の負に荷電した不純物が存在したことを示している。炭素濾液、ＩＥＸ濾液および高塩洗浄流出液に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、高塩溶出液試料、高塩洗浄液試料が高分子量不純物を含有していたことを示す。
６．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
このユニット操作は、酸加水分解ステップから残った、残留リピドＡなどの、疎水特性を有していた不純物を除去する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ １５０ｍＬ膜を、ＨＩＣステップのために使用した。ＩＥＸ濾液を、４．０Ｍ硫酸アンモニウム（ＡＳ）溶液で処理して、２．０Ｍの最終濃度にした。フェニル膜を、最初に２．０Ｍ硫酸アンモニウムの泳動緩衝剤で平衡化させた。ＡＳ処理されたＩＥＸ濾液を、４０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨＩＣ膜に通して送出した。次いで、ＨＩＣ膜を泳動緩衝剤でリンスした後、水で洗浄した。緩衝剤リンスと共にフロースルー流出液をＨＩＣ濾液として収集し、水洗浄液も分析のために収集した。ＨＩＣ膜濾過に関するＵＶおよび伝導度のクロマトグラフィープロファイル。
ＩＥＸ濾液、ＨＩＣ濾液、ＨＩＣ水洗浄液および精製されたＯ８ Ｏ−Ａｇに関するＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、水洗浄液試料がＲＩ検出において眼に見えるピークを示さなかったが、これは、ＩＥＸの流れの中に疎水性関連物質が存在しなかったことを示している。
７．限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
このユニット操作は、生成物を所望の濃度に濃縮し、コンジュゲーションのために硫酸アンモニウムを、望ましい緩衝剤または水に置き換える。このステップは、５ｋＤａの分子量カットオフのフィルターを使用して実施される。
ＨＩＣ濾液を約１０倍に濃縮した後、約２０の透析容量（ＤＶ）数の水を使用して透析濾過を行った。ＵＦＤＦ−２泳動に関する交差流量およびＴＭＰを、典型的には、それぞれ、２００ＬＭＨおよび０．５バールに設定した。ＵＦＤＦ−２に由来する保持液を、リンスと共に収集した。最終プールを、０．２μｍフィルターを通して濾過した。
精製後のブロス中の放出後のＯ−Ａｇおよび４つのバリアントの最終精製されたＫｐ Ｏ−ＡｇのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ−Ａｇのために開発されたプラットフォームに基づく精製プロセスが高品質の生成物を生産するのに有効であることを示している（図１〜４）。
表１８は、天然のＫｐ株によって産生された精製されたＫｐ Ｏ−Ａｇの品質特性の概要を提供する。
Figure 2021132644
本発明のさらなる実施形態を、以下の番号付きの条項に記載する。
条項１．細菌多糖を、夾雑物と一緒に前記多糖を含む溶液から精製するための方法であって、凝集ステップを含む、方法。
条項２．凝集剤が多価陽イオンを含む、条項１に記載の方法。
条項３．前記多価陽イオンが、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される、条項２に記載の方法。
条項４．前記凝集剤が、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される少なくとも２つの多価陽イオンの混合物である、条項２に記載の方法。
条項５．前記凝集剤が、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される少なくとも３つの多価陽イオンの混合物である、条項２に記載の方法。
条項６．前記凝集剤が、アルミニウム、鉄、カルシウムおよびマグネシウムからなる４つの多価陽イオンの混合物である、条項２に記載の方法。
条項７．凝集剤が、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルミン酸ナトリウム、塩化カルシウム、およびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される薬剤を含む、条項１に記載の方法。
条項８．凝集剤が、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される、条項１に記載の方法。
条項９．凝集剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、条項１に記載の方法。
条項１０．凝集剤がミョウバンを含む、条項１に記載の方法。
条項１１．凝集剤がミョウバンである、条項１に記載の方法。
条項１２．凝集剤がカリウムミョウバンを含む、条項１に記載の方法。
条項１３．凝集剤がカリウムミョウバンである、条項１に記載の方法。
条項１４．凝集剤がナトリウムミョウバンを含む、条項１に記載の方法。
条項１５．凝集剤がナトリウムミョウバンである、条項１に記載の方法。
条項１６．凝集剤がアンモニウムミョウバンを含む、条項１に記載の方法。
条項１７．凝集剤がアンモニウムミョウバンである、条項１に記載の方法。
条項１８．凝集剤が、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される２つの薬剤の混合物である、条項１に記載の方法。ある実施形態では、凝集剤は、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される。
条項１９．凝集剤が、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される３つの薬剤の混合物である、条項１に記載の方法。
条項２０．凝集剤が、ミョウバン（例えば、カリウムミョウバン、ナトリウムミョウバンまたはアンモニウムミョウバン）、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、硫酸鉄（ＩＩ）（硫酸鉄）、塩化鉄（ＩＩＩ）（塩化鉄）、ポリアクリルアミド、改変ポリアクリルアミド、ポリＤＡＤＭＡＣ、アルミン酸ナトリウムおよびケイ酸ナトリウムからなる群から選択される４つの薬剤の混合物である、条項１に記載の方法。
条項２１．凝集剤が、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される薬剤を含む、条項１に記載の方法。ある実施形態では、凝集剤は、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される。
条項２２．凝集剤が、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される薬剤である、条項１に記載の方法。ある実施形態では、凝集剤は、キトサン、アイシングラス、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）種子（ワサビノキ）、ゼラチン、ストリクノス・ポタトルム（Ｓｔｒｙｃｈｎｏｓ ｐｏｔａｔｏｒｕｍ）種子（ニルマリナッツの木）、グアーガムおよびアルギネート（例えば、ワカメ抽出物）からなる群から選択される。
条項２３．凝集剤の濃度が、約０．１〜約２０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２４．凝集剤の濃度が、約０．５〜約１０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２５．凝集剤の濃度が、約１〜約５％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２６．凝集剤の濃度が、約０．１、約０．２５、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２７．凝集剤の濃度が、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、約１４．０、約１４．５、約１５．０、約１５．５、約１６．０、約１６．５、約１７．０、約１７．５、約１８．０、約１８．５、約１９．０、約１９．５または約２０．０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２８．凝集剤の濃度が、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５または約５．０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２９．凝集剤の濃度が、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５または約４．０％（ｗ／ｖ）である、条項１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
条項３０．凝集剤が、数秒（例えば、１〜１０秒）〜約１カ月の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３１．凝集剤が、約２秒〜約２週間の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３２．凝集剤が、約１分〜約１週間の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３３．凝集剤が、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間〜約２日の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３４．凝集剤が、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３５．凝集剤が、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３６．凝集剤が、約１５分〜約３時間の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３７．凝集剤が、約３０分〜約１２０分の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３８．凝集剤が、約２秒、約１０秒、約３０秒、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日または約１５日の期間にわたって添加される、条項１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３９．凝集剤が、撹拌せずに添加される、条項１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
条項４０．凝集剤が、撹拌下で添加される、条項１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
条項４１．凝集剤が、穏やかな撹拌下で添加される、条項１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
条項４２．凝集剤が、激しい撹拌下で添加される、条項１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
条項４３．溶液が、下流のプロセシングの前にフロックの沈降を可能にするためにいくらかの時間にわたって保持される、条項１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
条項４４．凝集ステップが、数秒（例えば、２〜１０秒）〜約１分の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項４５．凝集ステップが、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約３５分、少なくとも約４０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約５５分、少なくとも約６０分、少なくとも約６５分、少なくとも約７０分、少なくとも約７５分、少なくとも約８０分、少なくとも約８５分、少なくとも約９０分、少なくとも約９５分、少なくとも約１００分、少なくとも約１０５分、少なくとも約１１０分、少なくとも約１１５分、少なくとも約１２０分、少なくとも約１２５分、少なくとも約１３０分、少なくとも約１３５分、少なくとも約１４０分、少なくとも約１４５分、少なくとも約１５０分、少なくとも約１５５分または少なくとも約１６０分の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項４６．沈降時間が１週間未満である、条項１〜４３に記載の方法。
条項４７．凝集ステップが、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１２０分、約１４０分、約１６０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分、約１３８０分、約１４４０分、約２日、約３日、約４日、約５日または約６日〜１週間の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項４８．凝集ステップが、数秒（例えば、1〜１０秒）〜約１カ月の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９．凝集ステップが、約２秒〜約２週間の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０．凝集ステップが、約１分〜約１週間の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１．凝集ステップが、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間〜約２日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２．凝集ステップが、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３．凝集ステップが、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１１０分、約１２０分、約１３０分、約１４０分、約１５０分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間または約１２時間〜約１日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４．凝集ステップが、約１５分〜約３時間の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５．凝集ステップが、約３０分〜約１２０分の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６．凝集ステップが、約１０秒、約３０秒、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分、約１６０分、約１７０分、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日または約１５日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５７．凝集ステップが、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約６０分、約９０分、約１２０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分、約１３８０分または約１４４０分〜２日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５８．凝集ステップが、約５分〜約１日の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項５９．凝集ステップが、約５分〜約１２０分の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項６０．凝集ステップが、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分、約１５５分または約１６０分の沈降時間を用いて実施される、条項１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
条項６１．沈降ステップが、撹拌せずに行われる、条項４３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
条項６２．沈降ステップが、撹拌下で行われる、条項４３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
条項６３．沈降ステップが、穏やかな撹拌下で行われる、条項４３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
条項６４．沈降ステップが、激しい撹拌下で行われる、条項４３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
条項６５．前記凝集ステップが、酸性ｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項６６．前記凝集ステップが、７．０、６．０、５．０または４．０より下のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項６７．前記凝集ステップが、７．０〜１．０のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項６８．前記凝集ステップが、５．５〜２．５、５．０〜２．５、４．５〜２．５、４．０〜２．５、５．５〜３．０、５．０〜３．０、４．５〜３．０、４．０〜３．０、５．５〜３．５、５．０〜３．５、４．５〜３．５または４．０〜３．５のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項６９．前記凝集ステップが、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、約３．０、約２．５、約２．０、約１．５または約１．０のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項７０．前記凝集ステップが、約４．０、約３．５、約３．０または約２．５のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項７１．前記凝集ステップが、約３．５のｐＨで実施される、条項１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
条項７２．前記酸性ｐＨが、酸を用いて溶液を酸性化することによって得られる、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７３．前記酸性ｐＨが、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、クエン酸、酢酸、亜硝酸、および硫酸からなる群から選択される酸を用いて溶液を酸性化することによって得られる、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７４．前記酸性ｐＨが、アミノ酸を用いて溶液を酸性化することによって得られる、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７５．前記酸性ｐＨが、グリシン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸を用いて溶液を酸性化することによって得られる、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７６．前記酸性ｐＨが、硫酸を用いて溶液を酸性化することによって得られる、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７７．酸が、撹拌下で添加される、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７８．酸が、穏やかな撹拌下で添加される、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項７９．酸が、激しい撹拌下で添加される、条項６５〜７１のいずれか１つに記載の方法。
条項８０．凝集剤の添加が、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８１．凝集剤の添加が、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８２．凝集剤の添加が、約２０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８３．凝集剤の添加が、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８４．凝集剤の添加が、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８５．凝集剤の添加が、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８６．凝集剤の添加が、約５０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項８７．存在する場合、沈降ステップが、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項８８．存在する場合、沈降ステップが、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項８９．存在する場合、沈降ステップが、約２０℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項９０．存在する場合、沈降ステップが、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項９１．存在する場合、沈降ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項９２．存在する場合、沈降ステップが、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項９３．存在する場合、沈降ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
条項９４．存在する場合、酸性化ステップが、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項９５．存在する場合、酸性化ステップが、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項９６．存在する場合、酸性化ステップが、約２０℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項９７．存在する場合、酸性化ステップが、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項９８．存在する場合、酸性化ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項９９．存在する場合、酸性化ステップが、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項１００．存在する場合、酸性化ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項７２〜９３のいずれか１つに記載の方法。
条項１０１．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０２．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０３．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約２０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０４．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０５．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０６．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０７．存在する場合、凝集剤の添加および沈降ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０８．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１０９．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１０．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約２０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１１．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１２．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１３．存在する場合、凝集剤の添加および酸性化ステップが、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１４．凝集剤の添加および酸性化ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１５．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約４℃〜約３０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１６．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃または約３０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１７．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約２０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１８．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約３０℃〜約９５℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１１９．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１２０．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１２１．凝集剤の添加、沈降および酸性化ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項７２〜７９のいずれか１つに記載の方法。
条項１２２．凝集ステップが、ｐＨ調整なしに凝集剤を添加することを含む、条項１〜７１、８０〜９３または１０１〜１０７のいずれか１つに記載の方法。
条項１２３．凝集ステップが、凝集剤を添加すること、ｐＨを調整すること、および溶液を沈降させることを含む、条項１〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
条項１２４．凝集剤が、ｐＨを調整する前に添加される、条項１２３に記載の方法。
条項１２５．ｐＨが、凝集剤を添加する前に調整される、条項１２３に記載の方法。
条項１２６．ｐＨが、凝集剤を添加し、溶液を沈降させる前に調整される、条項１２３に記載の方法。
条項１２７．ｐＨを調整する前に、凝集剤が添加され、溶液が沈降される、条項１２３に記載の方法。
条項１２８．凝集の後に、懸濁液がデカンテーション、沈降化、濾過または遠心分離によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１２９．凝集の後に、懸濁液がデカンテーションによって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３０．凝集の後に、懸濁液が液体遠心分離によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３１．凝集の後に、懸濁液が沈降化によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３２．凝集の後に、懸濁液が浮遊選別によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３３．凝集の後に、懸濁液が濾過によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３４．凝集の後に、懸濁液が遠心分離によって明澄化される、条項１〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３５．多糖含有溶液が、保存のために収集される、条項１２７〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
条項１３６．多糖含有溶液が、さらなるプロセシングのために収集される、条項１２７〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
条項１３７．多糖含有溶液が、保存された後、さらにプロセシングされる、条項１２７〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
条項１３８．前記遠心分離が、連続遠心分離である、条項１３４〜１３７のいずれか１つに記載の方法。
条項１３９．前記遠心分離が、バケット遠心分離である、条項１３４〜１３７のいずれか１つに記載の方法。
条項１４０．懸濁液が、約１，０００ｇ、約２，０００ｇ、約３，０００ｇ、約４，０００ｇ、約５，０００ｇ、約６，０００ｇ、約８，０００ｇ、約９，０００ｇ、約１０，０００ｇ、約１１，０００ｇ、約１２，０００ｇ、約１３，０００ｇ、約１４，０００ｇ、約１５，０００ｇ、約１６，０００ｇ、約１７，０００ｇ、約１８，０００ｇ、約１９，０００ｇ、約２０，０００ｇ、約２５，０００ｇ、約３０，０００ｇ、約３５，０００ｇ、約４０，０００ｇ、約５０，０００ｇ、約６０，０００ｇ、約７０，０００ｇ、約８０，０００ｇ、約９０，０００ｇ、約１００，０００ｇ、約１２０，０００ｇ、約１４０，０００ｇ、約１６０，０００ｇまたは約１８０，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４１．懸濁液が、約８，０００ｇ、約９，０００ｇ、約１０，０００ｇ、約１１，０００ｇ、約１２，０００ｇ、約１３，０００ｇ、約１４，０００ｇ、約１５，０００ｇ、約１６，０００ｇ、約１７，０００ｇ、約１８，０００ｇ、約１９，０００ｇ、約２０，０００ｇまたは約２５，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４２．懸濁液が、約５，０００ｇ〜約２５，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４３．懸濁液が、約８，０００ｇ〜約２０，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４４．懸濁液が、約１０，０００ｇ〜約１５，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４５．懸濁液が、約１０，０００ｇ〜約１２，０００ｇで遠心分離される、条項１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
条項１４６．懸濁液が、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも６５分間、少なくとも７０分間、少なくとも７５分間、少なくとも８０分間、少なくとも８５分間、少なくとも９０分間、少なくとも９５分間、少なくとも１００分間、少なくとも１０５分間、少なくとも１１０分間、少なくとも１１５分間、少なくとも１２０分間、少なくとも１２５分間、少なくとも１３０分間、少なくとも１３５分間、少なくとも１４０分間、少なくとも１４５分間、少なくとも１５０分間、少なくとも１５５分間または少なくとも１６０分間遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１４７．懸濁液が、２４時間未満、遠心分離される、条項１４６に記載の方法。
条項１４８．懸濁液が、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１２０分、約１４０分、約１６０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分または約１３８０分〜１４４０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１４９．好ましくは、懸濁液は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約６０、約９０、約１２０、約１８０、約２４０、約３００、約３６０、約４２０、約４８０または約５４０分〜約６００分間、遠心分離される。
条項１５０．懸濁液が、約５分〜約３時間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５１．懸濁液が、約５分〜約１２０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５２．懸濁液が、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分または約１５５分〜約１６０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５３．懸濁液が、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分または約５５分〜約６０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５４．懸濁液が、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約７０分、約８０分、約９０分、約１００分、約１２０分、約１４０分、約１６０分、約１８０分、約２２０分、約２４０分、約３００分、約３６０分、約４２０分、約４８０分、約５４０分、約６００分、約６６０分、約７２０分、約７８０分、約８４０分、約９００分、約９６０分、約１０２０分、約１０８０分、約１１４０分、約１２００分、約１２６０分、約１３２０分または約１３８０分または１４４０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５５．懸濁液が、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、約１２０分、約１２５分、約１３０分、約１３５分、約１４０分、約１４５分、約１５０分または約１５５分または約１６０分間、遠心分離される、条項１３４〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５６．前記遠心分離が連続遠心分離であり、供給速度が５０〜５０００ｍｌ／ｍｉｎ、１００〜４０００ｍｌ／ｍｉｎ、１５０〜３０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎ、２５０〜２０００ｍｌ／ｍｉｎ、３００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、３００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、２００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、４００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜１５００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜１０００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜２０００ｍｌ／ｍｉｎ、５００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎまたは１０００〜２５００ｍｌ／ｍｉｎである、条項１３４〜１３８または１４０〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５７．前記遠心分離が連続遠心分離であり、供給速度が約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１６５０、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３２５０、約３５００、約３７５０、約４０００、約４２５０、約４５００または約５０００ｍｌ／ｍｉｎである、条項１３４〜１３８または１４０〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
条項１５８．多糖含有溶液が、濾過される、条項1〜１５７のいずれか１つに記載の方法。
条項１５９．前記濾過が、深層濾過、活性炭を通す濾過、サイズ濾過、透析濾過および限外濾過からなる群から選択される、条項１５８に記載の方法。
条項１６０．前記濾過ステップが透析濾過である、条項１５８に記載の方法。
条項１６１．前記濾過が接線流濾過である、条項１６０に記載の方法。
条項１６２．前記濾過が深層濾過である、条項１５８に記載の方法。
条項１６３．深層フィルター設計が、カセット、カートリッジ、ディープベッド（例えば、サンドフィルター）およびレンズ状フィルターからなる群から選択される、条項１６２に記載の方法。
条項１６４．深層フィルターが、約０．０１〜１００μｍ、約０．０５〜１００μｍ、約０．１〜１００μｍ、約０．２〜１００μｍ、約０．３〜１００μｍ、約０．４〜１００μｍ、約０．５〜１００μｍ、約０．６〜１００μｍ、約０．７〜１００μｍ、約０．８〜１００μｍ、約０．９〜１００μｍ、約１〜１００μｍ、約１．２５〜１００μｍ、約１．５〜１００μｍ、約１．７５〜１００μｍ、約２〜１００μｍ、約３〜１００μｍ、約４〜１００μｍ、約５〜１００μｍ、約６〜１００μｍ、約７〜１００μｍ、約８〜１００μｍ、約９〜１００μｍ、約１０〜１００μｍ、約１５〜１００μｍ、約２０〜１００μｍ、約２５〜１００μｍ、約３０〜１００μｍ、約４０〜１００μｍ、約５０〜１００μｍまたは約７５〜１００μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１６５．深層フィルターが、約０．０１〜７５μｍ、約０．０５〜７５μｍ、約０．１〜７５μｍ、約０．２〜７５μｍ、約０．３〜７５μｍ、約０．４〜７５μｍ、約０．５〜７５μｍ、約０．６〜７５μｍ、約０．７〜７５μｍ、約０．８〜７５μｍ、約０．９〜７５μｍ、約１〜７５μｍ、約１．２５〜７５μｍ、約１．５〜７５μｍ、約１．７５〜７５μｍ、約２〜７５μｍ、約３〜７５μｍ、約４〜７５μｍ、約５〜７５μｍ、約６〜７５μｍ、約７〜７５μｍ、約８〜７５μｍ、約９〜７５μｍ、約１０〜７５μｍ、約１５〜７５μｍ、約２０〜７５μｍ、約２５〜７５μｍ、約３０〜７５μｍ、約４０〜７５μｍまたは約５０〜７５μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１６６．深層フィルターが、約０．０１〜５０μｍ、約０．０５〜５０μｍ、約０．１〜５０μｍ、約０．２〜５０μｍ、約０．３〜５０μｍ、約０．４〜５０μｍ、約０．５〜５０μｍ、約０．６〜５０μｍ、約０．７〜５０μｍ、約０．８〜５０μｍ、約０．９〜５０μｍ、約１〜５０μｍ、約１．２５〜５０μｍ、約１．５〜５０μｍ、約１．７５〜５０μｍ、約２〜５０μｍ、約３〜５０μｍ、約４〜５０μｍ、約５〜５０μｍ、約６〜５０μｍ、約７〜５０μｍ、約８〜５０μｍ、約９〜５０μｍ、約１０〜５０μｍ、約１５〜５０μｍ、約２０〜５０μｍ、約２５〜５０μｍ、約３０〜５０μｍ、約４０〜５０μｍまたは約５０〜５０μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１６７．深層フィルターが、約０．０１〜２５μｍ、約０．０５〜２５μｍ、約０．１〜２５μｍ、約０．２〜２５μｍ、約０．３〜２５μｍ、約０．４〜２５μｍ、約０．５〜２５μｍ、約０．６〜２５μｍ、約０．７〜２５μｍ、約０．８〜２５μｍ、約０．９〜２５μｍ、約１〜２５μｍ、約１．２５〜２５μｍ、約１．５〜２５μｍ、約１．７５〜２５μｍ、約２〜２５μｍ、約３〜２５μｍ、約４〜２５μｍ、約５〜２５μｍ、約６〜２５μｍ、約７〜２５μｍ、約８〜２５μｍ、約９〜２５μｍ、約１０〜２５μｍ、約１５〜２５μｍまたは約２０〜２５μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１６８．深層フィルターが、約０．０１〜１０μｍ、約０．０５〜１０μｍ、約０．１〜１０μｍ、約０．２〜１０μｍ、約０．３〜１０μｍ、約０．４〜１０μｍ、約０．５〜１０μｍ、約０．６〜１０μｍ、約０．７〜１０μｍ、約０．８〜１０μｍ、約０．９〜１０μｍ、約１〜１０μｍ、約１．２５〜１０μｍ、約１．５〜１０μｍ、約１．７５〜１０μｍ、約２〜１０μｍ、約３〜１０μｍ、約４〜１０μｍ、約５〜１０μｍ、約６〜１０μｍ、約７〜１０μｍ、約８〜１０μｍまたは約９〜１０μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１６９．深層フィルターが、約０．０１〜８μｍ、約０．０５〜８μｍ、約０．１〜８μｍ、約０．２〜８μｍ、約０．３〜８μｍ、約０．４〜８μｍ、約０．５〜８μｍ、約０．６〜８μｍ、約０．７〜８μｍ、約０．８〜８μｍ、約０．９〜８μｍ、約１〜８μｍ、約１．２５〜８μｍ、約１．５〜８μｍ、約１．７５〜８μｍ、約２〜８μｍ、約３〜８μｍ、約４〜８μｍ、約５〜８μｍ、約６〜８μｍまたは約７〜８μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７０．深層フィルターが、約０．０１〜５μｍ、約０．０５〜５μｍ、約０．１〜５μｍ、約０．２〜５μｍ、約０．３〜５μｍ、約０．４〜５μｍ、約０．５〜５μｍ、約０．６〜５μｍ、約０．７〜５μｍ、約０．８〜５μｍ、約０．９〜５μｍ、約１〜５μｍ、約１．２５〜５μｍ、約１．５〜５μｍ、約１．７５〜５μｍ、約２〜５μｍ、約３〜５μｍまたは約４〜５μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７１．深層フィルターが、約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、約１．７５〜２μｍ、約２〜２μｍ、約３〜２μｍまたは約４〜２μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７２．深層フィルターが約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７３．深層フィルターが、約０．０５〜５０μｍ、０．１〜２５μｍ、０．２〜１０μｍ、０．１〜１０μｍ、０．２〜５μｍまたは０．２５〜１μｍの名目保持範囲を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１６３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７４．深層フィルターが、1〜２５００Ｌ／ｍ２、５〜２５００Ｌ／ｍ２、１０〜２５００Ｌ／ｍ２、２５〜２５００Ｌ／ｍ２、５０〜２５００Ｌ／ｍ２、７５〜２５００Ｌ／ｍ２、１００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５０〜２５００Ｌ／ｍ２、２００〜２５００Ｌ／ｍ２、３００〜２５００Ｌ／ｍ２、４００〜２５００Ｌ／ｍ２、５００〜２５００Ｌ／ｍ２、７５０〜２５００Ｌ／ｍ２、１０００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５００〜２５００Ｌ／ｍ２または２０００〜２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７５．深層フィルターが、１〜１０００Ｌ／ｍ２、５〜１０００Ｌ／ｍ２、１０〜１０００Ｌ／ｍ２、２５〜１０００Ｌ／ｍ２、５０〜１０００Ｌ／ｍ２、７５〜１０００Ｌ／ｍ２、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、１５０〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７６．深層フィルターが、1〜７５０Ｌ／ｍ２、５〜７５０Ｌ／ｍ２、１０〜７５０Ｌ／ｍ２、２５〜７５０Ｌ／ｍ２、５０〜７５０Ｌ／ｍ２、７５〜７５０Ｌ／ｍ２、１００〜７５０Ｌ／ｍ２、１５０〜７５０Ｌ／ｍ２、２００〜７５０Ｌ／ｍ２、３００〜７５０Ｌ／ｍ２、４００〜７５０Ｌ／ｍ２または５００〜７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５５〜１５６または１５９〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
条項１７７．深層フィルターが、１〜５００Ｌ／ｍ２、５〜５００Ｌ／ｍ２、１０〜５００Ｌ／ｍ２、２５〜５００Ｌ／ｍ２、５０〜５００Ｌ／ｍ２、７５〜５００Ｌ／ｍ２、１００〜５００Ｌ／ｍ２、１５０〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７８．深層フィルターが、１〜４００Ｌ／ｍ２、５〜４００Ｌ／ｍ２、１０〜４００Ｌ／ｍ２、２５〜４００Ｌ／ｍ２、５０〜４００Ｌ／ｍ２、７５〜４００Ｌ／ｍ２、１００〜４００Ｌ／ｍ２、１５０〜４００Ｌ／ｍ２、２００〜４００Ｌ／ｍ２または３００〜４００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１７９．深層フィルターが、１〜３００Ｌ／ｍ２、５〜３００Ｌ／ｍ２、１０〜３００Ｌ／ｍ２、２５〜３００Ｌ／ｍ２、５０〜３００Ｌ／ｍ２、７５〜３００Ｌ／ｍ２、１００〜３００Ｌ／ｍ２、１５０〜３００Ｌ／ｍ２または２００〜３００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１８０．深層フィルターが、１〜２００Ｌ／ｍ２、５〜２００Ｌ／ｍ２、１０〜２００Ｌ／ｍ２、２５〜２００Ｌ／ｍ２、５０〜２００Ｌ／ｍ２、７５〜２００Ｌ／ｍ２、１００〜２００Ｌ／ｍ２または１５０〜２００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１８１．深層フィルターが、１〜１００Ｌ／ｍ２、５〜１００Ｌ／ｍ２、１０〜１００Ｌ／ｍ２、２５〜１００Ｌ／ｍ２、５０〜１００Ｌ／ｍ２または７５〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１８２．深層フィルターが、１〜５０Ｌ／ｍ２、５〜５０Ｌ／ｍ２、１０〜５０Ｌ／ｍ２または２５〜５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１５８〜１５９または１６２〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
条項１８３．供給速度が１〜１０００ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）、１０〜１０００ＬＭＨ、２５〜１０００ＬＭＨ、５０〜１０００ＬＭＨ、１００〜１０００ＬＭＨ、１２５〜１０００ＬＭＨ、１５０〜１０００ＬＭＨ、２００〜１０００ＬＭＨ、２５０〜１０００ＬＭＨ、３００〜１０００ＬＭＨ、４００〜１０００ＬＭＨ、５００〜１０００ＬＭＨ、６００〜１０００ＬＭＨ、７００〜１０００ＬＭＨ、８００〜１０００ＬＭＨまたは９００〜１０００ＬＭＨである、条項１５８〜１５９または１６２〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
条項１８４．供給速度が１〜５００ＬＭＨ、１０〜５００ＬＭＨ、２５〜５００ＬＭＨ、５０〜５００ＬＭＨ、１００〜５００ＬＭＨ、１２５〜５００ＬＭＨ、１５０〜５００ＬＭＨ、２００〜５００ＬＭＨ、２５０〜５００ＬＭＨ、３００〜５００ＬＭＨまたは４００〜５００ＬＭＨである、条項１５８〜１５９または１６２〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
条項１８５．供給速度が１〜４００ＬＭＨ、１０〜４００ＬＭＨ、２５〜４００ＬＭＨ、５０〜４００ＬＭＨ、１００〜４００ＬＭＨ、１２５〜４００ＬＭＨ、１５０〜４００ＬＭＨ、２００〜４００ＬＭＨ、２５０〜４００ＬＭＨまたは３００〜４００ＬＭＨである、条項１５８〜１５９または１６２〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
条項１８６．供給速度が１〜２５０ＬＭＨ、１０〜２５０ＬＭＨ、２５〜２５０ＬＭＨ、５０〜２５０ＬＭＨ、１００〜２５０ＬＭＨ、１２５〜２５０ＬＭＨ、１５０〜２５０ＬＭＨまたは２００〜２５０ＬＭＨである、条項１５８〜１５９または１６２〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
条項１８７．供給速度が約１、約２、約５、約１０、約２５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２６０、約２７０、約２８０、約２９０、約３００、約３１０、約３２０、約３３０、約３４０、約３５０、約３６０、約３７０、約３８０、約３９０、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０または約１０００ＬＭＨである、条項１５８〜１５９または１６２〜１８２のいずれか１つに記載の方法。
条項１８８．濾液が、精密濾過にかけられる、条項１５８〜１８７のいずれか１つに記載の方法。
条項１８９．前記精密濾過が、デッドエンド濾過である、条項１８８に記載の方法。
条項１９０．前記精密濾過が、接線流精密濾過である、条項１８８に記載の方法。
条項１９１．精密濾過フィルターが、約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．４５〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、または約１．７５〜２μｍの名目保持範囲を有する、条項１８８〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
条項１９２．精密濾過フィルターが、約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．４５〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する、条項１８８〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
条項１９３．精密濾過フィルターが、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２μｍの名目保持範囲を有する、条項１８８〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
条項１９４．精密濾過フィルターが、約０．４５μｍの名目保持を有する、条項１８８〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
条項１９５．精密濾過フィルターが、１００〜５０００Ｌ／ｍ２、２００〜５０００Ｌ／ｍ２、３００〜５０００Ｌ／ｍ２、４００〜５０００Ｌ／ｍ２、５００〜５０００Ｌ／ｍ２、７５０〜５０００Ｌ／ｍ２、１０００〜５０００Ｌ／ｍ２、１５００〜５０００Ｌ／ｍ２、２０００〜５０００Ｌ／ｍ２、３０００〜５０００Ｌ／ｍ２または４０００〜５０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項１９６．精密濾過フィルターが、１００〜２５００Ｌ／ｍ２、２００〜２５００Ｌ／ｍ２、３００〜２５００Ｌ／ｍ２、４００〜２５００Ｌ／ｍ２、５００〜２５００Ｌ／ｍ２、７５０〜２５００Ｌ／ｍ２、１０００〜２５００Ｌ／ｍ２、１５００〜２５００Ｌ／ｍ２または２０００〜２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項１９７．精密濾過フィルターが、１００〜１５００Ｌ／ｍ２、２００〜１５００Ｌ／ｍ２、３００〜１５００Ｌ／ｍ２、４００〜１５００Ｌ／ｍ２、５００〜１５００Ｌ／ｍ２、７５０〜１５００Ｌ／ｍ２または１０００〜１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項１９８．精密濾過フィルターが、１００〜１２５０Ｌ／ｍ２、２００〜１２５０Ｌ／ｍ２、３００〜１２５０Ｌ／ｍ２、４００〜１２５０Ｌ／ｍ２、５００〜１２５０Ｌ／ｍ２、７５０〜１２５０Ｌ／ｍ２または１０００〜１２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項１９９．精密濾過フィルターが、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項２００．精密濾過フィルターが、１００〜７５０Ｌ／ｍ２、２００〜７５０Ｌ／ｍ２、３００〜７５０Ｌ／ｍ２、４００〜７５０Ｌ／ｍ２または５００〜７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項２０１．精密濾過フィルターが、１００〜６００Ｌ／ｍ２、２００〜６００Ｌ／ｍ２、３００〜６００Ｌ／ｍ２、４００〜６００Ｌ／ｍ２または４００〜６００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項２０２．精密濾過フィルターが、１００〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項２０３．精密濾過フィルターが、１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０、約１５００、約１５５０、約１６００、約１６５０、約１７００、約１７５０、約１８００、約１８５０、約１９００、約１９５０、約２０００、約２０５０、約２１００、約２１５０、約２２００、約２２５０、約２３００、約２３５０、約２４００、約２４５０または約２５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項１８８〜１９４のいずれか１つに記載の方法。
条項２０４．濾液が、限外濾過および／または透析濾過によってさらに処理される、条項１５８〜２０３のいずれか１つに記載の方法。
条項２０５．濾液が、限外濾過によってさらに処理される、条項１５８〜２０３のいずれか１つに記載の方法。
条項２０６．限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２０７．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２０８．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２０９．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１０．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１１．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１２．限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１３．限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａまたは約７５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１４．限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜５００ｋＤａまたは約４００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１５．分子が５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａまたは約２００ｋＤａ〜３００ｋＤａである、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１６．限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１００ｋＤａまたは約７５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１７．限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約７５０ｋＤａまたは約１０００ｋＤａである、条項２０４〜２０５のいずれか１つに記載の方法。
条項２１８．限外濾過ステップの濃縮係数が、約１．５〜約１０である、条項２０４〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
条項２１９．濃縮係数が、約２〜約８である、条項２０４〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
条項２２０．濃縮係数が、約２〜約５である、条項２０４〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
条項２２１．濃縮係数が、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０．０である、条項２０４〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
条項２２２．濃縮係数が、約２、約３、約４、約５、または約６である、条項２０４〜２１７のいずれか１つに記載の方法。
条項２２３．前記限外濾過ステップが、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項２０４〜２２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２２４．前記限外濾過ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項２０４〜２２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２２５．前記限外濾過ステップが、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項２０４〜２２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２２６．前記限外濾過ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項２０４〜２２２のいずれか１つに記載の方法。
条項２２７．限外濾過の濾液が、透析濾過によって処理される、条項１５８〜２２６のいずれか１つに記載の方法。
条項２２８．置換液が水である、条項２２７に記載の方法。
条項２２９．置換液が塩水である、条項２２７に記載の方法。
条項２３０．塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される、条項２２９に記載の方法。
条項２３１．塩が、塩化ナトリウムである、条項２２９に記載の方法。
条項２３２．置換液が、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭまたは約５００ｍＭの塩化ナトリウムである、条項２２９に記載の方法。
条項２３３．置換液が、緩衝溶液である、条項２２７に記載の方法。
条項２３４．置換液が、緩衝剤がＮ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、酢酸の塩（酢酸塩）、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、タウリン）、アンモニア、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ、アメジオール）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、炭酸水素ナトリウム（重炭酸塩）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（ビシン）、［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）（ビス−トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス−プロパン）、ホウ酸、ジメチルアルシン酸（カコジル酸塩）、３−（シクロヘキシルアミノ）−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、炭酸ナトリウム（炭酸塩）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、イミダゾール、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、リン酸の塩（リン酸塩）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、ピリジン、コハク酸の塩（コハク酸塩）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（トリシン）およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）からなる群から選択される、緩衝溶液である、条項２２７に記載の方法。
条項２３５．置換液が、緩衝剤が酢酸の塩（酢酸塩）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、リン酸の塩（リン酸塩）およびコハク酸の塩（コハク酸塩）からなる群から選択される緩衝溶液である、条項２２７に記載の方法。
条項２３６．置換液が、緩衝剤がクエン酸の塩（クエン酸塩）である緩衝溶液である、条項２２７に記載の方法。
条項２３７．置換液が、緩衝剤がコハク酸の塩（コハク酸塩）である緩衝溶液である、条項２２７に記載の方法。
条項２３８．前記塩が、ナトリウム塩である、条項２３４〜２３７のいずれか１つに記載の方法。
条項２３９．前記塩が、カリウム塩である、条項２３４〜２３７のいずれか１つに記載の方法。
条項２４０．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約４．０〜１１．０、約５．０〜１０．０、約５．５〜９．０、約６．０〜８．０、約６．０〜７．０、約６．５〜７．５、約６．５〜７．０または約６．０〜７．５である、条項２３３〜２３９のいずれか１つに記載の方法。
条項２４１．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５または約１１．０である、条項２３３〜２３９のいずれか１つに記載の方法。
条項２４２．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５または約９．０である、条項２３３〜２３９のいずれか１つに記載の方法。
条項２４３．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．５、約７．０または約７．５である、条項２２６〜２３１のいずれか１つに記載の方法。
条項２４４．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約７．０である、条項２３３〜２３９のいずれか１つに記載の方法。
条項２４５．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約３ｍＭ〜１００ｍＭ、約４ｍＭ〜１００ｍＭ、約５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６ｍＭ〜１００ｍＭ、約７ｍＭ〜１００ｍＭ、約８ｍＭ〜１００ｍＭ、約９ｍＭ〜１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、約１１ｍＭ〜１００ｍＭ、約１２ｍＭ〜１００ｍＭ、約１３ｍＭ〜１００ｍＭ、約１４ｍＭ〜１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１６ｍＭ〜１００ｍＭ、約１７ｍＭ〜１００ｍＭ、約１８ｍＭ〜１００ｍＭ、約１９ｍＭ〜１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜１００ｍＭ、約５５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜１００ｍＭ、約６５ｍＭ〜１００ｍＭ、約７０ｍＭ〜１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜１００ｍＭ、約８０ｍＭ〜１００ｍＭ、約８５ｍＭ〜１００ｍＭ、約９０ｍＭ〜１００ｍＭまたは約９５ｍＭ〜１００ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２４６．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、約２ｍＭ〜５０ｍＭ、約３ｍＭ〜５０ｍＭ、約４ｍＭ〜５０ｍＭ、約５ｍＭ〜５０ｍＭ、約６ｍＭ〜５０ｍＭ、約７ｍＭ〜５０ｍＭ、約８ｍＭ〜５０ｍＭ、約９ｍＭ〜５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、約１１ｍＭ〜５０ｍＭ、約１２ｍＭ〜５０ｍＭ、約１３ｍＭ〜５０ｍＭ、約１４ｍＭ〜５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１６ｍＭ〜５０ｍＭ、約１７ｍＭ〜５０ｍＭ、約１８ｍＭ〜５０ｍＭ、約１９ｍＭ〜５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜５０ｍＭ、約３５ｍＭ〜５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜５０ｍＭまたは約４５ｍＭ〜５０ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２４７．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１ｍＭ〜２５ｍＭ、約２ｍＭ〜２５ｍＭ、約３ｍＭ〜２５ｍＭ、約４ｍＭ〜２５ｍＭ、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、約６ｍＭ〜２５ｍＭ、約７ｍＭ〜２５ｍＭ、約８ｍＭ〜２５ｍＭ、約９ｍＭ〜２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜２５ｍＭ、約１１ｍＭ〜２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜２５ｍＭ、約１３ｍＭ〜２５ｍＭ、約１４ｍＭ〜２５ｍＭ、約１５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１６ｍＭ〜２５ｍＭ、約１７ｍＭ〜２５ｍＭ、約１８ｍＭ〜２５ｍＭ、約１９ｍＭ〜２５ｍＭまたは約２０ｍＭ〜２５ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２４８．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１５ｍＭ、約１ｍＭ〜１５ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１５ｍＭ、約４ｍＭ〜１５ｍＭ、約５ｍＭ〜１５ｍＭ、約６ｍＭ〜１５ｍＭ、約７ｍＭ〜１５ｍＭ、約８ｍＭ〜１５ｍＭ、約９ｍＭ〜１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜１５ｍＭ、約１１ｍＭ〜１５ｍＭ、約１２ｍＭ〜１５ｍＭ、約１３ｍＭ〜１５ｍＭまたは約１４ｍＭ〜1５ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２４９．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１０ｍＭ、約２ｍＭ〜１０ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜１０ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約６ｍＭ〜１０ｍＭ、約７ｍＭ〜１０ｍＭ、約８ｍＭ〜１０ｍＭまたは約９ｍＭ〜１０ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５０．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５１．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５２．透析濾過緩衝剤の濃度が、約１０ｍＭである、条項２３３〜２４４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５３．置換液が、キレート剤を含む、条項２３３〜２５２のいずれか１つに記載の方法。
条項２５４．置換液が、ミョウバンキレート剤を含む、条項２３３〜２５２のいずれか１つに記載の方法。
条項２５５．置換液が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸ジヒドロクロリド（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン−テトラキス（メチレンスルホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、イミノ−二酢酸（ＩＤＡ）、ヒドロキシアミノ−二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ−三酢酸（ＮＴＰ）、トリエチレンテトラミン−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、アルファリポ酸（ＡＬＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、チアミンテトラヒドロフルフリルジスルフィド（ＴＴＦＤ）、ジメルカプロール、ペニシラミン、デフェロキサミン（ＤＦＯＡ）、デフェラシロクス、ホスホネート、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択されるキレート剤を含む、条項２３３〜２５２のいずれか１つに記載の方法。
条項２５６．置換液が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択されるキレート剤を含む、条項２３３〜２５５のいずれか１つに記載の方法。
条項２５７．置換液が、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、条項２３３〜２５４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５８．置換液が、キレート剤としてクエン酸の塩（クエン酸塩）を含む、条項２３３〜２５４のいずれか１つに記載の方法。
条項２５９．置換液が、キレート剤としてクエン酸ナトリウムを含む、条項２３３〜２５４のいずれか１つに記載の方法。
条項２６０．置換液中のキレート剤の濃度が、１〜５００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６１．置換液中のキレート剤の濃度が、２〜４００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６２．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜４００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６３．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜２００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６４．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜１００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６５．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜５０ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６６．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜３０ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６７．置換液中のキレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６８．置換液中のキレート剤の濃度が、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２６９．置換液中のキレート剤の濃度が、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである、条項２５３〜２５８のいずれか１つに記載の方法。
条項２７０．置換液が、塩を含む、条項２３３〜２６９のいずれか１つに記載の方法。
条項２７１．塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される、条項２７０に記載の方法。
条項２７２．塩が、塩化ナトリウムである、条項２７０に記載の方法。
条項２７３．置換液が、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０または約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、条項２７０〜２７２のいずれか１つに記載の方法。
条項２７４．透析容量の数が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０である、条項２２７〜２７３のいずれか１つに記載の方法。
条項２７５．透析容量の数が、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００である、条項２２７〜２７３のいずれか１つに記載の方法。
条項２７６．透析容量の数が、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である、条項２２７〜２７３のいずれか１つに記載の方法。
条項２７７．前記限外濾過ステップが、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項２２７〜２７６のいずれか１つに記載の方法。
条項２７８．前記透析濾過ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項２２７〜２７６のいずれか１つに記載の方法。
条項２７９．前記透析濾過ステップが、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項２２７〜２７６のいずれか１つに記載の方法。
条項２８０．前記透析濾過ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項２２７〜２７６のいずれか１つに記載の方法。
条項２８１．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項２０４〜２７７のいずれか１つに記載の方法。
条項２８２．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項２０４〜２７７のいずれか１つに記載の方法。
条項２８３．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項２０４〜２７７のいずれか１つに記載の方法。
条項２８４．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約５０℃の温度で実施される、条項２０４〜２７７のいずれか１つに記載の方法。
条項２８５．多糖を含有する溶液（例えば、上清、濾液または保持液）が、活性炭濾過ステップによって処理される、条項１〜２８４のいずれか１つに記載の方法。
条項２８６．活性炭が、粉末の形態で、顆粒活性炭層として、圧縮炭素ブロックまたは押出し炭素ブロックとして添加される（例えば、Ｎｏｒｉｔのアクティブチャコールを参照されたい）、条項２８５のいずれか１つに記載の方法。
条項２８７．活性炭が、約０．１〜２０％（重量）、１〜１５％（重量）、１〜１０％（重量）、２〜１０％（重量）、３〜１０％（重量）、４〜１０％（重量）、５〜１０％（重量）、１〜５％（重量）または２〜５％（重量）の量で添加される、条項２８６に記載の方法。
条項２８８． 混合物が撹拌され、静置される、条項２８６〜２８７のいずれか１つに記載の方法。
条項２８９．混合物が撹拌され、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約４５、約６０、約９０、約１２０、約１８０、約２４０分またはそれより長く静置される、条項２８６〜２８７のいずれか１つに記載の方法。
条項２９０．活性炭がその後除去される、条項２８６〜２８９のいずれか１つに記載の方法。
条項２９１．活性炭が、遠心分離または濾過によって除去される、条項２８６〜２９０のいずれか１つに記載の方法。
条項２９２．溶液が、マトリックス中に固定された活性炭を介して濾過される、条項２８５に記載の方法。
条項２９３．前記マトリックスが、溶液にとって透過性の多孔性フィルター媒体である、条項２８５に記載の方法。
条項２９４．前記マトリックスが、支持材料を含む、条項２９２〜２９３のいずれか１つに記載の方法。
条項２９５．前記マトリックスが、結合剤材料を含む、条項２９２〜２９３のいずれか１つに記載の方法。
条項２９６．前記支持材料が、合成ポリマーである、条項２９４〜２９５のいずれか１つに記載の方法。
条項２９７．前記支持材料が、天然起源のポリマーである、条項２９４〜２９５のいずれか１つに記載の方法。
条項２９８．前記合成ポリマーが、ポリスチレン、ポリアクリルアミドまたはポリメチルメタクリレートのいずれか１つを含む、条項２９６に記載の方法。
条項２９９．前記合成ポリマーが、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびポリメチルメタクリレートからなる群から選択される、条項２９６に記載の方法。
条項３００．天然起源の前記ポリマーが、セルロース、多糖、デキストランまたはアガロースのいずれか１つを含む、条項２９７に記載の方法。
条項３０１．前記天然のポリマーが、セルロース、多糖、デキストランおよびアガロースからなる群から選択される、条項２９７に記載の方法。
条項３０２．前記ポリマー支持材料が、存在する場合、機械的剛性を提供するための繊維ネットワークの形態にある、条項２９４〜３０１のいずれか１つに記載の方法。
条項３０３．前記結合材材料が、存在する場合、樹脂である、条項２９４〜３０２のいずれか１つに記載の方法。
条項３０４．前記マトリックスが、膜シートの形態を有する、条項２９２〜３０３のいずれか１つに記載の方法。
条項３０５．マトリックス中に固定された活性炭が、フロースルー炭素カートリッジの形態にある、条項２９２〜３０４のいずれか１つに記載の方法。
条項３０６．膜シートがらせん状に巻かれる、条項３０４のいずれか１つに記載の方法。
条項３０７．いくつかのディスクが互いに積み重ねられる、条項２９２〜３０６のいずれか１つに記載の方法。
条項３０８．積み重ねられたディスクの構成がレンズ状である、条項３０７に記載の方法。
条項３０９．炭素フィルター中の活性炭が、泥炭、褐炭、木材またはヤシ殻に由来する、条項２９２〜３０８のいずれか１つに記載の方法。
条項３１０．マトリックス中に固定された活性炭が、筺体中に入れられて、独立フィルターユニットを形成する、条項２９２〜３０９のいずれか１つに記載の方法。
条項３１１．活性炭フィルターが、活性炭粉末が所定の位置に捕捉され、樹脂に結合したセルロースマトリックスを含む、条項２９２〜３１０のいずれか１つに記載の方法。
条項３１２．活性炭フィルターが、約０．０１〜１００μｍ、約０．０５〜１００μｍ、約０．１〜１００μｍ、約０．２〜１００μｍ、約０．３〜１００μｍ、約０．４〜１００μｍ、約０．５〜１００μｍ、約０．６〜１００μｍ、約０．７〜１００μｍ、約０．８〜１００μｍ、約０．９〜１００μｍ、約１〜１００μｍ、約１．２５〜１００μｍ、約１．５〜１００μｍ、約１．７５〜１００μｍ、約２〜１００μｍ、約３〜１００μｍ、約４〜１００μｍ、約５〜１００μｍ、約６〜１００μｍ、約７〜１００μｍ、約８〜１００μｍ、約９〜１００μｍ、約１０〜１００μｍ、約１５〜１００μｍ、約２０〜１００μｍ、約２５〜１００μｍ、約３０〜１００μｍ、約４０〜１００μｍ、約５０〜１００μｍまたは約７５〜１００μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１３．活性炭フィルターが、約０．０１〜５０μｍ、約０．０５〜５０μｍ、約０．１〜５０μｍ、約０．２〜５０μｍ、約０．３〜５０μｍ、約０．４〜５０μｍ、約０．５〜５０μｍ、約０．６〜５０μｍ、約０．７〜５０μｍ、約０．８〜５０μｍ、約０．９〜５０μｍ、約１〜５０μｍ、約１．２５〜５０μｍ、約１．５〜５０μｍ、約１．７５〜５０μｍ、約２〜５０μｍ、約３〜５０μｍ、約４〜５０μｍ、約５〜５０μｍ、約６〜５０μｍ、約７〜５０μｍ、約８〜５０μｍ、約９〜５０μｍ、約１０〜５０μｍ、約１５〜５０μｍ、約２０〜５０μｍ、約２５〜５０μｍ、約３０〜５０μｍ、約４０〜５０μｍまたは約５０〜５０μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１４．活性炭フィルターが、約０．０１〜２５μｍ、約０．０５〜２５μｍ、約０．１〜２５μｍ、約０．２〜２５μｍ、約０．３〜２５μｍ、約０．４〜２５μｍ、約０．５〜２５μｍ、約０．６〜２５μｍ、約０．７〜２５μｍ、約０．８〜２５μｍ、約０．９〜２５μｍ、約１〜２５μｍ、約１．２５〜２５μｍ、約１．５〜２５μｍ、約１．７５〜２５μｍ、約２〜２５μｍ、約３〜２５μｍ、約４〜２５μｍ、約５〜２５μｍ、約６〜２５μｍ、約７〜２５μｍ、約８〜２５μｍ、約９〜２５μｍ、約１０〜２５μｍ、約１５〜２５μｍまたは約２０〜２５μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１５．活性炭フィルターが、約０．０１〜１０μｍ、約０．０５〜１０μｍ、約０．１〜１０μｍ、約０．２〜１０μｍ、約０．３〜１０μｍ、約０．４〜１０μｍ、約０．５〜１０μｍ、約０．６〜１０μｍ、約０．７〜１０μｍ、約０．８〜１０μｍ、約０．９〜１０μｍ、約１〜１０μｍ、約１．２５〜１０μｍ、約１．５〜１０μｍ、約１．７５〜１０μｍ、約２〜１０μｍ、約３〜１０μｍ、約４〜１０μｍ、約５〜１０μｍ、約６〜１０μｍ、約７〜１０μｍ、約８〜１０μｍまたは約９〜１０μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１６．活性炭フィルターが、約０．０１〜８μｍ、約０．０５〜８μｍ、約０．１〜８μｍ、約０．２〜８μｍ、約０．３〜８μｍ、約０．４〜８μｍ、約０．５〜８μｍ、約０．６〜８μｍ、約０．７〜８μｍ、約０．８〜８μｍ、約０．９〜８μｍ、約１〜８μｍ、約１．２５〜８μｍ、約１．５〜８μｍ、約１．７５〜８μｍ、約２〜８μｍ、約３〜８μｍ、約４〜８μｍ、約５〜８μｍ、約６〜８μｍまたは約７〜８μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１７．活性炭フィルターが、約０．０１〜５μｍ、約０．０５〜５μｍ、約０．１〜５μｍ、約０．２〜５μｍ、約０．３〜５μｍ、約０．４〜５μｍ、約０．５〜５μｍ、約０．６〜５μｍ、約０．７〜５μｍ、約０．８〜５μｍ、約０．９〜５μｍ、約１〜５μｍ、約１．２５〜５μｍ、約１．５〜５μｍ、約１．７５〜５μｍ、約２〜５μｍ、約３〜５μｍまたは約４〜５μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１８．活性炭フィルターが、約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、約１．７５〜２μｍ、約２〜２μｍ、約３〜２μｍまたは約４〜２μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３１９．活性炭フィルターが、約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３２０． 活性炭フィルターが、約０．０５〜５０μｍ、０．１〜２５μｍ、０．２〜１０μｍ、０．１〜１０μｍ、０．２〜５μｍまたは０．２５〜１μｍの名目ミクロンレーティングを有する、条項２８５〜３１１のいずれか１つに記載の方法。
条項３２１．活性炭フィルターが、１〜５００ＬＭＨ、１０〜５００ＬＭＨ、１５〜５００ＬＭＨ、２０〜５００ＬＭＨ、２５〜５００ＬＭＨ、３０〜５００ＬＭＨ、４０〜５００ＬＭＨ、５０〜５００ＬＭＨ、１００〜５００ＬＭＨ、１２５〜５００ＬＭＨ、１５０〜５００ＬＭＨ、２００〜５００ＬＭＨ、２５０〜５００ＬＭＨ、３００〜５００ＬＭＨまたは４００〜５００ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２２．活性炭フィルターが、１〜２００ＬＭＨ、１０〜２００ＬＭＨ、１５〜２００ＬＭＨ、２０〜２００ＬＭＨ、２５〜２００ＬＭＨ、３０〜２００ＬＭＨ、４０〜２００ＬＭＨ、５０〜２００ＬＭＨ、１００〜２００ＬＭＨ、１２５〜２００ＬＭＨまたは１５０〜２００ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２３．活性炭フィルターが、１〜１５０ＬＭＨ、１０〜１５０ＬＭＨ、１５〜１５０ＬＭＨ、２０〜１５０ＬＭＨ、２５〜１５０ＬＭＨ、３０〜１５０ＬＭＨ、４０〜１５０ＬＭＨ、５０〜１５０ＬＭＨ、１００〜１５０ＬＭＨまたは１２５〜１５０ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２４．活性炭フィルターが、１〜１００ＬＭＨ、１０〜１００ＬＭＨ、１５〜１００ＬＭＨ、２０〜１００ＬＭＨ、２５〜１００ＬＭＨ、３０〜１００ＬＭＨ、４０〜１００ＬＭＨ、または５０〜１００ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２５．活性炭フィルターが、１〜７５ＬＭＨ、５〜７５ＬＭＨ、１０〜７５ＬＭＨ、１５〜７５ＬＭＨ、２０〜７５ＬＭＨ、２５〜７５ＬＭＨ、３０〜７５ＬＭＨ、３５〜７５ＬＭＨ、４０〜７５ＬＭＨ、４５〜７５ＬＭＨ、５０〜７５ＬＭＨ、５５〜７５ＬＭＨ、６０〜７５ＬＭＨ、６５〜７５ＬＭＨ、または７０〜７５ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２６．活性炭フィルターが、１〜５０ＬＭＨ、５〜５０ＬＭＨ、７〜５０ＬＭＨ、１０〜５０ＬＭＨ、１５〜５０ＬＭＨ、２０〜５０ＬＭＨ、２５〜５０ＬＭＨ、３０〜５０ＬＭＨ、３５〜５０ＬＭＨ、４０〜５０ＬＭＨまたは４５〜５０ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２７．活性炭フィルターが、約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２２５、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約９５０または約１０００ＬＭＨの供給速度で行われる、条項２８５〜３２０のいずれか１つに記載の方法。
条項３２８．フィルターが５〜１０００Ｌ／ｍ２、１０〜７５０Ｌ／ｍ２、１５〜５００Ｌ／ｍ２、２０〜４００Ｌ／ｍ２、２５〜３００Ｌ／ｍ２、３０〜２５０Ｌ／ｍ２、４０〜２００Ｌ／ｍ２または３０〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する活性炭フィルターによって、溶液が処理される、条項２８５〜３２７のいずれか１つに記載の方法。
条項３２９．フィルターが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する活性炭フィルターによって、溶液が処理される、条項２８５〜３２７のいずれか１つに記載の方法。
条項３３０．１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回の活性炭濾過ステップが実施される、条項２８５〜３２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３３１．１、２または３回の活性炭濾過ステップが実施される、条項２８５〜３２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３３２．１または２回の活性炭濾過ステップが実施される、条項２８５〜３２９のいずれか１つに記載の方法。
条項３３３．溶液が、活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３４．溶液が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３５．溶液が、２、３、４または５個の活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３６．溶液が、２つの活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３７．溶液が、３つの活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３８．溶液が、４つの活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３３９．溶液が、５つの活性炭フィルターによって連続的に処理される、条項２８５〜３３２のいずれか１つに記載の方法。
条項３４０．活性炭濾過ステップが、１回通過モードで実施される、条項２８５〜３３９のいずれか１つに記載の方法。
条項３４１．活性炭濾過ステップが、再循環モードで実施される、条項２８５〜３３９のいずれか１つに記載の方法。
条項３４２．２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０サイクルの活性炭濾過が実施される、条項３４１に記載の方法。
条項３４３．２、３、４、５、６、７、８、９または１０サイクルの活性炭濾過が実施される、条項３４１に記載の方法。
条項３４４．２または３サイクルの活性炭濾過が実施される、条項３４１に記載の方法。
条項３４５．２サイクルの活性炭濾過が実施される、条項３４１に記載の方法。
条項３４６．濾液が、さらに濾過される、条項２８５〜３４５のいずれか１つに記載の方法。
条項３４７．濾液が、精密濾過にかけられる、条項２８５〜３４５のいずれか１つに記載の方法。
条項３４８．前記精密濾過が、デッドエンド濾過（垂直濾過）である、条項３４７に記載の方法。
条項３４９．前記精密濾過が、接線流精密濾過である、条項３４７に記載の方法。
条項３５０．前記精密濾過フィルターが、約０．０１〜２μｍ、約０．０５〜２μｍ、約０．１〜２μｍ、約０．２〜２μｍ、約０．３〜２μｍ、約０．４〜２μｍ、約０．４５〜２μｍ、約０．５〜２μｍ、約０．６〜２μｍ、約０．７〜２μｍ、約０．８〜２μｍ、約０．９〜２μｍ、約１〜２μｍ、約１．２５〜２μｍ、約１．５〜２μｍ、または約１．７５〜２μｍの名目保持範囲を有する、条項３４７〜３４９のいずれか１つに記載の方法。
条項３５１．前記精密濾過フィルターが、約０．０１〜１μｍ、約０．０５〜１μｍ、約０．１〜１μｍ、約０．２〜１μｍ、約０．３〜１μｍ、約０．４〜１μｍ、約０．４５〜１μｍ、約０．５〜１μｍ、約０．６〜１μｍ、約０．７〜１μｍ、約０．８〜１μｍまたは約０．９〜１μｍの名目保持範囲を有する、条項３４７〜３４９のいずれか１つに記載の方法。
条項３５２．前記精密濾過フィルターが、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９または約２．０μｍの名目保持範囲を有する、条項３４７〜３４９のいずれか１つに記載の方法。
条項３５３．前記精密濾過フィルターが、約０．２μｍの名目保持範囲を有する、条項３４３〜３４５のいずれか１つに記載の方法。
条項３５４．前記精密濾過フィルターが、１００〜６０００Ｌ／ｍ２、２００〜６０００Ｌ／ｍ２、３００〜６０００Ｌ／ｍ２、４００〜６０００Ｌ／ｍ２、５００〜６０００Ｌ／ｍ２、７５０〜６０００Ｌ／ｍ２、１０００〜６０００Ｌ／ｍ２、１５００〜６０００Ｌ／ｍ２、２０００〜６０００Ｌ／ｍ２、３０００〜６０００Ｌ／ｍ２または４０００〜６０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項３４７〜３５３のいずれか１つに記載の方法。
条項３５５．前記精密濾過フィルターが、１００〜４０００Ｌ／ｍ２、２００〜４０００Ｌ／ｍ２、３００〜４０００Ｌ／ｍ２、４００〜４０００Ｌ／ｍ２、５００〜４０００Ｌ／ｍ２、７５０〜４０００Ｌ／ｍ２、１０００〜４０００Ｌ／ｍ２、１５００〜４０００Ｌ／ｍ２、２０００〜４０００Ｌ／ｍ２、２５００〜４０００Ｌ／ｍ２、３０００〜４０００Ｌ／ｍ２、３０００〜４０００Ｌ／ｍ２または３５００〜４０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項３４７〜３５３のいずれか１つに記載の方法。
条項３５６．前記精密濾過フィルターが、１００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３００〜３７５０Ｌ／ｍ２、４００〜３７５０Ｌ／ｍ２、５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、７５０〜３７５０Ｌ／ｍ２、１０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、１５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、２５００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３０００〜３７５０Ｌ／ｍ２、３０００〜３７５０Ｌ／ｍ２または３５００〜３７５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項３４７〜３５３のいずれか１つに記載の方法。
条項３５７．前記精密濾過フィルターが、１００〜１２５０Ｌ／ｍ２、２００〜１２５０Ｌ／ｍ２、３００〜１２５０Ｌ／ｍ２、４００〜１２５０Ｌ／ｍ２、５００〜１２５０Ｌ／ｍ２、７５０〜１２５０Ｌ／ｍ２または１０００〜１２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項３４７〜３５３のいずれか１つに記載の方法。
条項３５８．前記精密濾過フィルターが、約１００、約２００、約３００、約４００、約５５０、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、約５０００、約５２５０、約５５００、約５７５０または約６０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項３４７〜３５３のいずれか１つに記載の方法。
条項３５９．多糖含有溶液または濾液が、疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらに精製される、条項１〜３５８のいずれか１つに記載の方法。
条項３６０．疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フェニル膜、ブチル−アガロース、フェニル−アガロース、オクチル−アガロース、ブチル有機ポリマー樹脂、フェニル有機ポリマー樹脂、エーテル有機ポリマー樹脂、ポリプロピレングリコール有機ポリマー樹脂およびヘキシル有機ポリマー樹脂からなる群から選択される疎水性吸着剤を使用して行われる、条項３５９に記載の方法。
条項３６１．疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フェニル膜を使用して行われる、条項３６０に記載の方法。
条項３６２．疎水性相互作用クロマトグラフィーが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ膜またはＣｙｔｉｖａ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ Ａｄｓｏｒｂｅｒ膜を使用して行われる、条項３６１に記載の方法。
条項３６３．多糖含有溶液または濾液が、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９または約７．０Ｍから選択される塩濃度を有する泳動緩衝剤を得るために塩を含む平衡化緩衝剤で処理される、条項３５９〜３６２のいずれか１つに記載の方法。
条項３６４．泳動緩衝剤のｐＨが約４．０〜約８．０である、条項３６３に記載の方法。
条項３６５．泳動緩衝剤のｐＨが、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９または約８．０である、条項３６４に記載の方法。
条項３６６．塩が、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムから選択される、条項３６３〜３６５に記載の方法。
条項３６７．泳動緩衝剤が、ｐＨ６．０±２．０で約０．５Ｍ〜約３．０Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３６８．泳動緩衝剤が、約６．０のｐＨで約１．０Ｍ〜約２．０Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む、条項３６７に記載の方法。
条項３６９．泳動緩衝剤が、ｐＨ７．０±１．５で約０．５Ｍ〜約３．０Ｍの濃度のリン酸ナトリウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３７０．泳動緩衝剤が、ｐＨ７．０±１．５で約０．５Ｍ〜約３．０Ｍの濃度のリン酸カリウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３７１．泳動緩衝剤が、ｐＨ６．０±２．０で約０．１Ｍ〜約０．７５Ｍの濃度の硫酸ナトリウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３７２．泳動緩衝剤が、ｐＨ６．０±２．０で約０．１Ｍ〜約１．５Ｍの濃度のクエン酸ナトリウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３７３．泳動緩衝剤が、ｐＨ７．０±１．５で約０．５Ｍ〜約５．０Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む、条項３６３に記載の方法。
条項３７４．疎水性吸着剤が泳動緩衝剤で平衡化される、条項３６３〜３７３のいずれかに記載の方法。
条項３７５．疎水性吸着剤が、フェニル膜であり、流量が、約０．１〜約２０膜容量／ｍｉｎ、約０．１〜約１０膜容量／ｍｉｎ、約０．２〜約１０膜容量／ｍｉｎ、約０．２〜約５膜容量／ｍｉｎまたは約０．１〜約１膜容量／ｍｉｎで含まれる、条項３６０〜３７４のいずれか１つに記載の方法。
条項３７６．流量が、約０．１〜約１．０膜容量／ｍｉｎで含まれる、条項３７５に記載の方法。
条項３７７．流量が、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９または約１．０膜容量／ｍｉｎである、条項３７６に記載の方法。
条項３７８．疎水性吸着剤が泳動緩衝剤で洗浄される、条項３６３〜３７５のいずれか１つに記載の方法。
条項３７９．濾液が、限外濾過および／または透析濾過によってさらに明澄化される、条項２８５〜３７８のいずれか１つに記載の方法。
条項３８０．濾液が、限外濾過によってさらに明澄化される、条項２８５〜３７８のいずれか１つに記載の方法。
条項３８１．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８２．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８３．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８４．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８５．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８６．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８７．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８８．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約４００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａまたは約７５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３８９．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、約３００ｋＤａ〜５００ｋＤａまたは約４００ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３９０．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約７５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａまたは約２００ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３９１．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜１００ｋＤａまたは約７５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲にある、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３９２．前記限外濾過膜の分子量カットオフが、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約７５０ｋＤａまたは約１０００ｋＤａである、条項３７９または３８０に記載の方法。
条項３９３．前記限外濾過ステップの濃縮係数が、約１．５〜約１０．０である、条項３７９〜３８１のいずれか１つに記載の方法。
条項３９４．前記限外濾過ステップの濃縮係数が、約２．０〜約８．０である、条項３７９〜３８１のいずれか１つに記載の方法。
条項３９５．前記限外濾過ステップの濃縮係数が、約２．０〜約５．０である、条項３７９〜３８１のいずれか１つに記載の方法。
条項３９６．前記限外濾過ステップの濃縮係数が、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５または約１０．０である、条項３７９〜３８１のいずれか１つに記載の方法。ある実施形態では、濃縮係数は、約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、または約６．０である。
条項３９７．前記限外濾過ステップが、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項３７９〜３９６のいずれか１つに記載の方法。
条項３９８．前記限外濾過ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項３７９〜３９６のいずれか１つに記載の方法。
条項３９９．前記限外濾過ステップが、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項３７９〜３９６のいずれか１つに記載の方法。
条項４００．前記限外濾過ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項３７９〜３９６のいずれか１つに記載の方法。
条項４０１．限外濾過の濾液が、透析濾過によって処理される、条項３７９〜３９６のいずれか１つに記載の方法。
条項４０２．置換液が水である、条項４０１に記載の方法。
条項４０３．置換液が塩水である、条項４０１に記載の方法。
条項４０４．塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される、条項４０３に記載の方法。
条項４０５．塩が、塩化ナトリウムである、条項４０３に記載の方法。
条項４０６．置換液が、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭまたは約５００ｍＭの塩化ナトリウムである、条項４０３に記載の方法。
条項４０７．置換液が、緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４０８．置換液が、緩衝剤がＮ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、酢酸の塩（酢酸塩）、Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２−アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、タウリン）、アンモニア、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ、アメジオール）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、炭酸水素ナトリウム（重炭酸塩）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（ビシン）、［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）（ビス−トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス−プロパン）、ホウ酸、ジメチルアルシン酸（カコジル酸塩）、３−（シクロヘキシルアミノ）−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、炭酸ナトリウム（炭酸塩）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、イミダゾール、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、リン酸の塩（リン酸塩）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、ピリジン、コハク酸の塩（コハク酸塩）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（トリシン）およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）からなる群から選択される、緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４０９．置換液が、緩衝剤が酢酸の塩（酢酸塩）、クエン酸の塩（クエン酸塩）、ギ酸の塩（ギ酸塩）、リンゴ酸の塩（リンゴ酸塩）、マレイン酸の塩（マレイン酸塩）、リン酸の塩（リン酸塩）およびコハク酸の塩（コハク酸塩）からなる群から選択される緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４１０．置換液が、緩衝剤がクエン酸の塩（クエン酸塩）である緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４１１．置換液が、緩衝剤がコハク酸の塩（コハク酸塩）である緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４１２．置換液が、緩衝剤がリン酸の塩（リン酸塩）である緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４１３．前記塩が、ナトリウム塩である、条項４０８〜４１２のいずれか１つに記載の方法。
条項４１４．前記塩が、カリウム塩である、条項４０８〜４１２のいずれか１つに記載の方法。
条項４１５．置換液が、緩衝剤がリン酸カリウムである緩衝溶液である、条項４０１に記載の方法。
条項４１６．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約４．０〜１１．０、約５．０〜１０．０、約５．５〜９．０、約６．０〜８．０、約６．０〜７．０、約６．５〜７．５、約６．５〜７．０または約６．０〜７．５である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４１７．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５または約１１．０である、条項４０１〜４１５に記載の方法。
条項４１８．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５または約９．０である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４１９．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．５、約７．０または約７．５である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４２０．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．０である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４２１．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約６．５である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４２２．透析濾過緩衝剤のｐＨが、約７．０である、条項４０１〜４１５のいずれか１つに記載の方法。
条項４２３．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約３ｍＭ〜１００ｍＭ、約４ｍＭ〜１００ｍＭ、約５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６ｍＭ〜１００ｍＭ、約７ｍＭ〜１００ｍＭ、約８ｍＭ〜１００ｍＭ、約９ｍＭ〜１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、約１１ｍＭ〜１００ｍＭ、約１２ｍＭ〜１００ｍＭ、約１３ｍＭ〜１００ｍＭ、約１４ｍＭ〜１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜１００ｍＭ、約１６ｍＭ〜１００ｍＭ、約１７ｍＭ〜１００ｍＭ、約１８ｍＭ〜１００ｍＭ、約１９ｍＭ〜１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜１００ｍＭ、約５５ｍＭ〜１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜１００ｍＭ、約６５ｍＭ〜１００ｍＭ、約７０ｍＭ〜１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜１００ｍＭ、約８０ｍＭ〜１００ｍＭ、約８５ｍＭ〜１００ｍＭ、約９０ｍＭ〜１００ｍＭまたは約９５ｍＭ〜１００ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２４．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１ｍＭ〜５０ｍＭ、約２ｍＭ〜５０ｍＭ、約３ｍＭ〜５０ｍＭ、約４ｍＭ〜５０ｍＭ、約５ｍＭ〜５０ｍＭ、約６ｍＭ〜５０ｍＭ、約７ｍＭ〜５０ｍＭ、約８ｍＭ〜５０ｍＭ、約９ｍＭ〜５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、約１１ｍＭ〜５０ｍＭ、約１２ｍＭ〜５０ｍＭ、約１３ｍＭ〜５０ｍＭ、約１４ｍＭ〜５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜５０ｍＭ、約１６ｍＭ〜５０ｍＭ、約１７ｍＭ〜５０ｍＭ、約１８ｍＭ〜５０ｍＭ、約１９ｍＭ〜５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜５０ｍＭ、約３５ｍＭ〜５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜５０ｍＭまたは約４５ｍＭ〜５０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２５．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１ｍＭ〜２５ｍＭ、約２ｍＭ〜２５ｍＭ、約３ｍＭ〜２５ｍＭ、約４ｍＭ〜２５ｍＭ、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、約６ｍＭ〜２５ｍＭ、約７ｍＭ〜２５ｍＭ、約８ｍＭ〜２５ｍＭ、約９ｍＭ〜２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜２５ｍＭ、約１１ｍＭ〜２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜２５ｍＭ、約１３ｍＭ〜２５ｍＭ、約１４ｍＭ〜２５ｍＭ、約１５ｍＭ〜２５ｍＭ、約１６ｍＭ〜２５ｍＭ、約１７ｍＭ〜２５ｍＭ、約１８ｍＭ〜２５ｍＭ、約１９ｍＭ〜２５ｍＭまたは約２０ｍＭ〜２５ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２６．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１５ｍＭ、約１ｍＭ〜１５ｍＭ、約２ｍＭ〜１５ｍＭ、約３ｍＭ〜１５ｍＭ、約４ｍＭ〜１５ｍＭ、約５ｍＭ〜１５ｍＭ、約６ｍＭ〜１５ｍＭ、約７ｍＭ〜１５ｍＭ、約８ｍＭ〜１５ｍＭ、約９ｍＭ〜１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜１５ｍＭ、約１１ｍＭ〜１５ｍＭ、約１２ｍＭ〜１５ｍＭ、約１３ｍＭ〜１５ｍＭまたは約１４ｍＭ〜１５ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２７．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１０ｍＭ、約２ｍＭ〜１０ｍＭ、約３ｍＭ〜１０ｍＭ、約４ｍＭ〜１０ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約６ｍＭ〜１０ｍＭ、約７ｍＭ〜１０ｍＭ、約８ｍＭ〜１０ｍＭまたは約９ｍＭ〜１０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２８．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４２９．透析濾過緩衝剤の濃度が、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３０．透析濾過緩衝剤の濃度が、約３０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３１．透析濾過緩衝剤の濃度が、約２５ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３２．透析濾過緩衝剤の濃度が、約２０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３３．透析濾過緩衝剤の濃度が、約１５ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３４．透析濾過緩衝剤の濃度が、約１０ｍＭである、条項４０７〜４２２のいずれか１つに記載の方法。
条項４３５．置換液が、キレート剤を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４３６．置換液が、ミョウバンキレート剤を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４３７．置換液が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸ジヒドロクロリド（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン−テトラキス（メチレンスルホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、イミノ−二酢酸（ＩＤＡ）、ヒドロキシアミノ−二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ−三酢酸（ＮＴＰ）、トリエチレンテトラミン−六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）、アルファリポ酸（ＡＬＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、チアミンテトラヒドロフルフリルジスルフィド（ＴＴＦＤ）、ジメルカプロール、ペニシラミン、デフェロキサミン（ＤＦＯＡ）、デフェラシロクス、ホスホネート、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択されるキレート剤を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４３８．置換液が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、クエン酸の塩（クエン酸塩）およびこれらの組合せからなる群から選択されるキレート剤を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４３９．置換液が、キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４４０．置換液が、キレート剤としてクエン酸の塩（クエン酸塩）を含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４４１．置換液が、キレート剤としてクエン酸ナトリウムを含む、条項４０１〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４４２．置換液中のキレート剤の濃度が、１〜５００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４３．置換液中のキレート剤の濃度が、２〜４００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４４．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜４００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４５．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜２００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４６．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜１００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４７．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜５０ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４８．置換液中のキレート剤の濃度が、１０〜３０ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４４９．置換液中のキレート剤の濃度が、約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４５０．置換液中のキレート剤の濃度が、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭまたは約１００ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４５１．置換液中のキレート剤の濃度が、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである、条項４３５〜４４１のいずれか１つに記載の方法。
条項４５２．置換液が、塩を含む、条項４０７〜４５１のいずれか１つに記載の方法。
条項４５３．塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される、条項４５２に記載の方法。
条項４５４．塩が、塩化ナトリウムである、条項４５２に記載の方法。
条項４５５．置換液が、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０または約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、条項４３２〜４３４のいずれか１つに記載の方法。
条項４５６．透析容量の数が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０である、条項４０１〜４５５のいずれか１つに記載の方法。
条項４５７．透析容量の数が、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００である、条項４０１〜４５５のいずれか１つに記載の方法。
条項４５８．透析容量の数が、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である、条項４０１〜４５５のいずれか１つに記載の方法。
条項４５９．前記限外濾過ステップが、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項４０１〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６０．前記透析濾過ステップが、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項４０１〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６１．前記透析濾過ステップが、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項４０１〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６２．前記透析濾過ステップが、約５０℃の温度で実施される、条項４０１〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６３．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約２０℃〜約９０℃の温度で実施される、条項３７９〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６４．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約３５℃〜約８０℃の温度、約４０℃〜約７０℃の温度、約４５℃〜約６５℃の温度、約５０℃〜約６０℃の温度、約５０℃〜約５５℃の温度、約４５℃〜約５５℃の温度または約４５℃〜約５５℃の温度で実施される、条項３７９〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６５．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃または約８０℃の温度で実施される、条項３７９〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６６．前記限外濾過および透析濾過ステップが、両方とも行われる場合、約５０℃の温度で実施される、条項３７９〜４５８のいずれか１つに記載の方法。
条項４６７．前記精製された多糖の溶液が、サイジングによってホモジナイズされる、条項３７９〜４６６のいずれか１つに記載の方法。
条項４６８．前記精製された多糖の溶液が、機械的サイジングにかけられる、条項３７９〜４６６のいずれか１つに記載の方法。
条項４６９．前記精製された多糖の溶液が、高圧ホモジナイゼーション剪断にかけられる、条項３７９〜４６６のいずれか１つに記載の方法。
条項４７０．前記精製された多糖の溶液が、化学的加水分解にかけられる、条項３７９〜４６６のいずれか１つに記載の方法。
条項４７１．前記精製された多糖の溶液が、標的分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７０のいずれか１つに記載の方法。
条項４７２．前記精製された多糖の溶液が、約５ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７１のいずれか１つに記載の方法。
条項４７３．前記精製された多糖の溶液が、約１０ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７１のいずれか１つに記載の方法。
条項４７４．前記精製された多糖の溶液が、約５０ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７１のいずれか１つに記載の方法。
条項４７５．前記精製された多糖の溶液が、約５０ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約２００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；または約２００ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７１のいずれか１つに記載の方法。さらなるそのような実施形態では、精製された多糖は、約２５０ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約２５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；約３００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約４，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約３，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，２５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，７５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，５００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，２５０ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ；約５００ｋＤａ〜約７５０ｋＤａ；または約５００ｋＤａ〜約６００ｋＤａの分子量にサイジングされる。
条項４７６．前記精製された多糖の溶液が、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約７５０ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約８５０ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約９５０ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、約１２５０ｋＤａ、約１５００ｋＤａ、約１７５０ｋＤａ、約２０００ｋＤａ、約２２５０ｋＤａ、約２５００ｋＤａ、約２７５０ｋＤａ、約３０００ｋＤａ、約３２５０ｋＤａ、約３５００ｋＤａ、約３７５０ｋＤａまたは約４，０００ｋＤａの分子量にサイジングされる、条項３７９〜４７１のいずれか１つに記載の方法。
条項４７７．前記精製された多糖の溶液が、滅菌濾過される、条項１〜４７６のいずれか１つに記載の方法。
条項４７８．前記滅菌濾過が、デッドエンド濾過である、条項４７７に記載の方法。
条項４７９．前記滅菌濾過が、接線流濾過である、条項４７７に記載の方法。
条項４８０．フィルターが、約０．０１〜０．２μｍ、約０．０５〜０．２μｍ、約０．１〜０．２μｍまたは０．１５〜０．２μｍの名目保持範囲を有する、条項４７７〜４７９のいずれか１つに記載の方法。
条項４８１．フィルターが、約０．０５、約０．１、約０．１５または約０．２μｍの名目保持範囲を有する、条項４７７〜４７９のいずれか１つに記載の方法。
条項４８２．フィルターが、約０．２μｍの名目保持範囲を有する、条項４７７〜４７９のいずれか１つに記載の方法。
条項４８３．フィルターが、約２５〜１５００Ｌ／ｍ２、５０〜１５００Ｌ／ｍ２、７５〜１５００Ｌ／ｍ２、１００〜１５００Ｌ／ｍ２、１５０〜１５００Ｌ／ｍ２、２００〜１５００Ｌ／ｍ２、２５０〜１５００Ｌ／ｍ２、３００〜１５００Ｌ／ｍ２、３５０〜１５００Ｌ／ｍ２、４００〜１５００Ｌ／ｍ２、５００〜１５００Ｌ／ｍ２、７５０〜１５００Ｌ／ｍ２、１０００〜１５００Ｌ／ｍ２または１２５０〜１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８４．フィルターが、約２５〜１０００Ｌ／ｍ２、５０〜１０００Ｌ／ｍ２、７５〜１０００Ｌ／ｍ２、１００〜１０００Ｌ／ｍ２、１５０〜１０００Ｌ／ｍ２、２００〜１０００Ｌ／ｍ２、２５０〜１０００Ｌ／ｍ２、３００〜１０００Ｌ／ｍ２、３５０〜１０００Ｌ／ｍ２、４００〜１０００Ｌ／ｍ２、５００〜１０００Ｌ／ｍ２または７５０〜１０００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８５．フィルターが、２５〜５００Ｌ／ｍ２、５０〜５００Ｌ／ｍ２、７５〜５００Ｌ／ｍ２、１００〜５００Ｌ／ｍ２、１５０〜５００Ｌ／ｍ２、２００〜５００Ｌ／ｍ２、２５０〜５００Ｌ／ｍ２、３００〜５００Ｌ／ｍ２、３５０〜５００Ｌ／ｍ２または４００〜５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８６．フィルターが、２５〜３００Ｌ／ｍ２、５０〜３００Ｌ／ｍ２、７５〜３００Ｌ／ｍ２、１００〜３００Ｌ／ｍ２、１５０〜３００Ｌ／ｍ２、２００〜３００Ｌ／ｍ２または２５０〜３００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８７．フィルターが、２５〜２５０Ｌ／ｍ２、５０〜２５０Ｌ／ｍ２、７５〜２５０Ｌ／ｍ２、１００〜２５０Ｌ／ｍ２または１５０〜２５０Ｌ／ｍ２、２００〜２５０Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８８．フィルターが、２５〜１００Ｌ／ｍ２、５０〜１００Ｌ／ｍ２または７５〜１００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４８９．フィルターが、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００または約１５００Ｌ／ｍ２のフィルター能力を有する、条項４７７〜４８２のいずれか１つに記載の方法。
条項４９０．得られた精製された多糖が、液体溶液中にある、条項１〜４８９のいずれか１つに記載の方法。
条項４９１．得られた精製された多糖が、乾燥粉末である、条項１〜４８９のいずれか１つに記載の方法。
条項４９２．得られた精製された多糖溶液が、凍結乾燥される、条項１〜４８９のいずれか１つに記載の方法。
条項４９３．得られた精製された多糖溶液が、凍結乾燥ケーキである、条項１〜４８９または４９２のいずれか１つに記載の方法。
条項４９４．前記細菌多糖が、莢膜多糖、莢膜下多糖、またはリポ多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９５．前記細菌多糖が、莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９６．前記細菌多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９７．前記細菌多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）５型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９８．前記細菌多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）８型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項４９９．前記細菌多糖が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５００． 前記細菌多糖が、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０１．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０２．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０３．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０４． 前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０５．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０６．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０７．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０８．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５０９．前記細菌多糖が、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ））に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１０．前記細菌多糖が、ＧＢＳ Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩ型に由来する莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１１．前記細菌多糖が、腸毒性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）群（ＥＥＣ群）の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株部分に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１２．前記細菌多糖が、腸管毒素産生性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）−Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、または腸管細胞侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ）などの腸毒性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）群（ＥＥＣ群）の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株部分に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。ある実施形態では、細菌莢膜多糖の供給源は、尿路病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）である。
条項５１３．前記細菌多糖が、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ１１１：Ｈ−およびＯ１０３：Ｈ２からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１４．前記細菌多糖が、血清型Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１およびＯ１８：Ｋ１：Ｈ７からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１５．前記細菌多糖が、血清型Ｏ４５：Ｋ１、Ｏ１７：Ｋ５２：Ｈ１８、Ｏ１９：Ｈ３４およびＯ７：Ｋ１からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１６．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１０４：Ｈ４に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１７．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１：Ｋ１２：Ｈ７に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１８．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２７：Ｈ６に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５１９．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１３９：Ｈ２８に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２０．前記細菌多糖が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１２８：Ｈ２に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２１．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２２．前記細菌多糖が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２４Ｆ、２９、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３８、７２および７３からなる群から選択される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２３．前記細菌多糖が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２９、３１、３３Ｆ、３５Ｂ、３５Ｆ、３８、７２および７３からなる群から選択される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２４．前記細菌多糖が、血清型８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆおよび３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２５．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２６．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２７．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２８．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５２９．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型５に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３０．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３１．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３２．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｃに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３３．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型７Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３４．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３５．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３６．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３７．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３８．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５３９．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４０．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４１．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４２．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４３．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４４．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１６Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４５．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４６．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４７．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４８．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５４９．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５０．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５１．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５２．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５３．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２３Ａに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５４．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２３Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５５．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２３Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５６．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２４Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５７．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２４Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５８．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２９に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５５９．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３１に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６０．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６１．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３４に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６２．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３５Ｂに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６３．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３５Ｆに由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６４．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３８に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６５．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型７２に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６６．前記細菌多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型７３に由来する莢膜多糖である、条項１〜４９３のいずれか１つに記載の方法。
条項５６７．条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られた精製された細菌多糖。
条項５６８．条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られる精製された細菌多糖。
条項５６９．抗原としての使用のための条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られた精製された細菌多糖。
条項５７０．担体タンパク質にコンジュゲートされた、条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られた精製された細菌多糖。
条項５７１．担体タンパク質にさらにコンジュゲートされた、条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られた精製された細菌多糖。
条項５７２．条項１〜５６６のいずれか１つに記載の方法によって得られた精製された細菌多糖の糖コンジュゲート。
条項５７３．条項５６７〜５６８のいずれか１つに記載の精製された多糖のいずれかを含む免疫原性組成物。
条項５７４．条項５７１〜５７２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物。
条項５７５．本明細書に開示される糖コンジュゲートのいずれかを含む免疫原性組成物。
条項５７６．本明細書に開示される糖コンジュゲートの組合せのいずれかを含む免疫原性組成物。
条項５７７．髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５（ＭｅｎＷ１３５）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｘ（ＭｅｎＸ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）に由来する莢膜多糖を、夾雑物と共に前記多糖を含む溶液から精製するための方法であって、凝集ステップとクロマトグラフィーステップとを含む、前記方法。
条項５７８．クロマトグラフィーステップが、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップである、条項５７７に記載の方法。
条項５７９．前記ＨＩＣステップが条項３５９〜３７８に定義された通りである、条項５７８に記載の方法。
条項５８０．条項５７８および条項２〜４９３のいずれかに記載の方法。
条項５８１．前記細菌多糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）に由来する莢膜多糖である、条項５７８〜５８０のいずれかに記載の方法。
条項５８２．ＨＩＣステップの前にイオン交換クロマトグラフィーステップをさらに含む、条項５８１に記載の方法。
条項５８３．活性炭濾過ステップを含まない、条項５８２に記載の方法。

Claims (11)

  1. 細菌由来の糖を、発酵後の前記糖および夾雑物を含む溶液から精製するための方法であって、以下のステップ：
    ａ）酸加水分解；
    ｂ）第１の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−１）；
    ｂ）炭素濾過；
    ｃ）クロマトグラフィー；および
    ｄ）第２の限外濾過／透析濾過−（ＵＦＤＦ−２）
    を含む、前記方法。
  2. ステップ（ａ）の酸加水分解の後に凝集ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｃ）のクロマトグラフィーが、ＩＥＸ膜クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）またはその両方を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 細菌がグラム陽性細菌である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 細菌が、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のうちのいずれか１つである、請求項４に記載の方法。
  6. 細菌が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはＣおよびＧ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のうちのいずれか１つである、請求項５に記載の方法。
  7. 細菌がグラム陰性細菌である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 細菌が、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のうちのいずれか１つである、請求項７に記載の方法。
  9. 細菌が、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項８に記載の方法。
  10. 細菌が、式Ｏ１、式Ｏ１Ａ、式Ｏ１Ｂ、式Ｏ１Ｃ、式Ｏ２、式Ｏ３、式Ｏ４、式Ｏ４：Ｋ５２、式Ｏ４：Ｋ６、式Ｏ５、式Ｏ５ａｂ、式Ｏ５ａｃ、式Ｏ６、式Ｏ６：Ｋ２；Ｋ１３；Ｋ１５、式Ｏ６：Ｋ５４、式Ｏ７、式Ｏ８、式Ｏ９、式Ｏ１０、式Ｏ１１、式Ｏ１２、式Ｏ１３、式Ｏ１４、式Ｏ１５、式Ｏ１６、式Ｏ１７、式Ｏ１８、式Ｏ１８Ａ、式Ｏ１８ａｃ、式Ｏ１８Ａ１、式Ｏ１８Ｂ、式Ｏ１８Ｂ１、式Ｏ１９、式Ｏ２０、式Ｏ２１、式Ｏ２２、式Ｏ２３、式Ｏ２３Ａ、式Ｏ２４、式Ｏ２５、式Ｏ２５ａ、式Ｏ２５ｂ、式Ｏ２６、式Ｏ２７、式Ｏ２８、式Ｏ２９、式Ｏ３０、式Ｏ３２、式Ｏ３３、式Ｏ３４、式Ｏ３５、式Ｏ３６、式Ｏ３７、式Ｏ３８、式Ｏ３９、式Ｏ４０、式Ｏ４１、式Ｏ４２、式Ｏ４３、式Ｏ４４、式Ｏ４５、式Ｏ４５、式Ｏ４５ｒｅｌ、式Ｏ４６、式Ｏ４８、式Ｏ４９、式Ｏ５０、式Ｏ５１、式Ｏ５２、式Ｏ５３、式Ｏ５４、式Ｏ５５、式Ｏ５６、式Ｏ５７、式Ｏ５８、式Ｏ５９、式Ｏ６０、式Ｏ６１、式Ｏ６２、式６２Ｄ１、式Ｏ６３、式Ｏ６４、式Ｏ６５、式Ｏ６６、式Ｏ６８、式Ｏ６９、式Ｏ７０、式Ｏ７１、式Ｏ７３、式Ｏ７３、式Ｏ７４、式Ｏ７５、式Ｏ７６、式Ｏ７７、式Ｏ７８、式Ｏ７９、式Ｏ８０、式Ｏ８１、式Ｏ８２、式Ｏ８３、式Ｏ８４、式Ｏ８５、式Ｏ８６、式Ｏ８７、式Ｏ８８、式Ｏ８９、式Ｏ９０、式Ｏ９１、式Ｏ９２、式Ｏ９３、式Ｏ９５、式Ｏ９６、式Ｏ９７、式Ｏ９８、式Ｏ９９、式Ｏ１００、式Ｏ１０１、式Ｏ１０２、式Ｏ１０３、式Ｏ１０４、式Ｏ１０５、式Ｏ１０６、式Ｏ１０７、式Ｏ１０８、式Ｏ１０９、式Ｏ１１０、式０１１１、式Ｏ１１２、式Ｏ１１３、式Ｏ１１４、式Ｏ１１５、式Ｏ１１６、式Ｏ１１７、式Ｏ１１８、式Ｏ１１９、式Ｏ１２０、式Ｏ１２１、式Ｏ１２３、式Ｏ１２４、式Ｏ１２５、式Ｏ１２６、式Ｏ１２７、式Ｏ１２８、式Ｏ１２９、式Ｏ１３０、式Ｏ１３１、式Ｏ１３２、式Ｏ１３３、式Ｏ１３４、式Ｏ１３５、式Ｏ１３６、式Ｏ１３７、式Ｏ１３８、式Ｏ１３９、式Ｏ１４０、式Ｏ１４１、式Ｏ１４２、式Ｏ１４３、式Ｏ１４４、式Ｏ１４５、式Ｏ１４６、式Ｏ１４７、式Ｏ１４８、式Ｏ１４９、式Ｏ１５０、式Ｏ１５１、式Ｏ１５２、式Ｏ１５３、式Ｏ１５４、式Ｏ１５５、式Ｏ１５６、式Ｏ１５７、式Ｏ１５８、式Ｏ１５９、式Ｏ１６０、式Ｏ１６１、式Ｏ１６２、式Ｏ１６３、式Ｏ１６４、式Ｏ１６５、式Ｏ１６６、式Ｏ１６７、式Ｏ１６８、式Ｏ１６９、式Ｏ１７０、式Ｏ１７１、式Ｏ１７２、式Ｏ１７３、式Ｏ１７４、式Ｏ１７５、式Ｏ１７６、式Ｏ１７７、式Ｏ１７８、式Ｏ１７９、式Ｏ１８０、式Ｏ１８１、式Ｏ１８２、式Ｏ１８３、式Ｏ１８４、式Ｏ１８５、式Ｏ１８６または式Ｏ１８７のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の方法。
  11. 細菌が、式Ｋ．Ｏ１．１、式Ｋ．Ｏ１．２、式Ｋ．Ｏ１．３、式Ｋ．Ｏ１．４、式Ｋ．Ｏ２．１、式Ｋ．Ｏ２．２、式Ｋ．Ｏ２．３、式Ｋ．Ｏ２．４、式Ｋ．Ｏ３、式Ｋ．Ｏ４、式Ｋ．Ｏ５、式Ｋ．Ｏ７、式Ｋ．Ｏ１２または式Ｋ．Ｏ８のいずれか１つから選択される構造を有する糖を含むクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項９に記載の方法。
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