KR20220144393A - 당류의 정제 - Google Patents

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KR20220144393A KR1020227032647A KR20227032647A KR20220144393A KR 20220144393 A KR20220144393 A KR 20220144393A KR 1020227032647 A KR1020227032647 A KR 1020227032647A KR 20227032647 A KR20227032647 A KR 20227032647A KR 20220144393 A KR20220144393 A KR 20220144393A
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링 추
니시스 머천트
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 박테리아 다당류를 정제하는 방법, 특히 다당류를 생성하는 박테리아의 세포 용해물로부터 불순물을 제거하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 산　가수분해;
(b) 제1　한외여과/정용여과-(UFDF-1);
(b) 탄소　여과;
(c)　크로마토그래피; 및
(d) 제2　한외여과/정용여과-(UFDF-2).

Description

당류의 정제
본 발명은 박테리아 다당류를 정제하는 방법, 특히 다당류를 생성하는 박테리아의 세포 용해물로부터 불순물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되며, .txt 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일에는 2021년 1월 29일에 생성되고 크기가 34KB인 "PC72592_ST25.txt"로 표제된 서열 목록이 포함되어 있다.　상기 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본원의 일부이며, 전체가 본원에 참고로 인용된다.
박테리아 다당류, 특히 캡슐 다당류는 다양한 박테리아 질환에 연루되는 박테리아의 표면에서 발견되는 중요한 면역원이다. 이는 박테리아 다당류가 백신의 설계에 중요한 요소가 되게 한다. 박테리아 다당류는 특히 담체 단백질과 결합될 때 면역 반응을 발휘하는데 유용한 것으로 증명된 바 있다.
박테리아 다당류는 전형적으로 박테리아(예컨대 스트렙토코커스(Streptococcus)(예컨대 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 피오젠스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티에(S. agalactiae) 또는 그룹 C & G 스트렙토코커스(Group C & G Streptococcus)), 스타필로코커스(Staphylococcus)(예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 헤모필러스(Haemophilus)(예컨대 헤모필러스 인플루엔제(Haemophilus influenzae), 네이쎄리아(Neisseria)(예컨대 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)) 및 에셔리키아(Escherichia)(예컨대 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli)) 및 클레브시엘라(Klebsiella)(예컨대 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae))의 발효의 의해 생성된다.
전형적으로, 박테리아 다당류는 복합 배지에서의 배치식 배양(batch culture), 유가식 배양 또는 연속식 배양에서 배치를 사용하여 제조된다.
박테리아 다당류 후-발효(post-fermentation)의 대량 생산에 사용될 수 있는 강력하고 효율적인 정제 공정이 필요하다.
또한, 박테리아 용해물 중 가용성 단백질 수준을 감소시키고 현행 정제 공정의 비효율성을 없앰으로써, 백신에 혼입되기에 적합한 상당히 정제된 박테리아 다당류를 제조하는 단순화된 정제 공정이 필요하다.
본 발명은 발효 후 상기 당류 및 오염물을 포함하는 용액으로부터　박테리아　유래 당류를 정제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 산 가수분해; (b) 제1　한외여과/정용여과-(UFDF-1); (b) 탄소 여과; (c) 크로마토그래피; 및 (d) 제2　한외여과/정용여과-(UFDF-2).　한 양태에서,　상기 방법은 단계 (a)의 산 가수분해 후에 응집(flocculation) 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 또 다른 양태에서, 박테리아는 그람 양성 박테리아이다.　한 양상에서, 박테리아는　스트렙토코커스, 스타필로코커스, 엔테로코커스, 바실러스, 코리네박테리움(Corynebacterium), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)　또는　클로스트리디움(Clostridium)　중 어느 하나이다.　추가 양상에서, 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토코커스 피오젠스, 스트렙토코커스 아갈락티에, 그룹 C & G 스트렙토코커스　또는　스타필로코커스 아우레우스　중 어느 하나이다.
상기 방법의 다른 양태에서, 박테리아는 그람 음성 박테리아이다.　한 양상에서, 박테리아는　헤모필러스,　네이쎄리아,　에셔리키아　또는　클레브시엘라 중 어느 하나이다.　또 다른 양상에서, 박테리아는　헤모필러스 인플루엔제,　네이쎄리아 메닌지티디스,　에셔리키아 콜라이 또는　클레브시엘라 뉴모니에이다.
도 1　은　브로스(broth)(상단) 및　O1V1　변이체에 대한 정제된　Kp O-Ag(하단)에서 방출 후 Kp O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 브로스(상단) 및 O1V2 변이체에 대한 정제된　Kp O-Ag(하단)에서 방출 후 Kp O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 브로스(상단) 및 O2V1 변이체에 대한 정제된　Kp O-Ag(하단)에서 방출 후 Kp O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 4는 브로스(상단) 및　O2V2 변이체에 대한 정제된　Kp O-Ag(하단)에서 방출 후 Kp O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 도시한다.
본 발명은 발효 후, 박테리아　유래 당류 및 오염물을 포함하는 용액으로부터 상기　박테리아　유래 당류를 정제하는 방법으로서,
(a) 산　가수분해;
(b) 제1　한외여과/정용여과-(UFDF-1);
(b) 탄소　여과;
(c)　크로마토그래피; 및
(d) 제2　한외여과/정용여과-(UFDF-2)
를 포함하는 방법을 제시한다.
한 실시양태에서,　상기 방법은 단계 (a)의 산 가수분해 후, 응집 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 단계 (c)의 크로마토그래피는 이온교환(IEX) 막 크로마토그래피,　소수성　상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 둘 다를 포함한다.
상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 박테리아는 그람 양성 박테리아이다.　한 양상에서, 박테리아는　스트렙토코커스, 스타필로코커스, 엔테로코커스, 바실러스, 코리네박테리움, 리스테리아, 에리시펠로트릭스　또는　클로스트리디움　중 어느 하나이다.　추가 양상에서, 박테리아는 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토코커스 피오젠스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 그룹 C & G 스트렙토코커스　또는　스타필로코커스 아우레우스　중 어느 하나이다.
상기 방법의 다른 양태에서, 박테리아는 그람 음성 박테리아이다.　한 양상에서, 박테리아는　헤모필러스,　네이쎄리아,　에셔리키아　또는　클레브시엘라 중 어느 하나이다.　또 다른 양상에서, 박테리아는　헤모필러스 인플루엔제,　네이쎄리아 메닌지티디스,　에셔리키아 콜라이 또는　뉴모니에 클레브시엘라이다.
추가 양상에서, 박테리아는 식 O1, 식 O1A, 식 O1B, 식 O1C, 식 O2, 식 O3, 식 O4, 식 O4:K52, 식 O4:K6, 식 O5, 식 O5ab, 식 O5ac, 식 O6, 식 O6:K2; K13; K15, 식 O6:K54, 식 O7, 식 O8, 식 O9, 식 O10, 식 O11, 식 O12, 식 O13, 식 O14, 식 O15, 식 O16, 식 O17, 식 O18, 식 O18A, 식 O18ac, 식 O18A1, 식 O18B, 식 O18B1, 식 O19, 식 O20, 식 O21, 식 O22, 식 O23, 식 O23A, 식 O24, 식 O25, 식 O25a, 식 O25b, 식 O26, 식 O27, 식 O28, 식 O29, 식 O30, 식 O32, 식 O33, 식 O34, 식 O35, 식 O36, 식 O37, 식 O38, 식 O39, 식 O40, 식 O41, 식 O42, 식 O43, 식 O44, 식 O45, 식 O45, 식 O45rel, 식 O46, 식 O48, 식 O49, 식 O50, 식 O51, 식 O52, 식 O53, 식 O54, 식 O55, 식 O56, 식 O57, 식 O58, 식 O59, 식 O60, 식 O61, 식 O62, 식 62D1, 식 O63, 식 O64, 식 O65, 식 O66, 식 O68, 식 O69, 식 O70, 식 O71, 식 O73, 식 O73, 식 O74, 식 O75, 식 O76, 식 O77, 식 O78, 식 O79, 식 O80, 식 O81, 식 O82, 식 O83, 식 O84, 식 O85, 식 O86, 식 O87, 식 O88, 식 O89, 식 O90, 식 O91, 식 O92, 식 O93, 식 O95, 식 O96, 식 O97, 식 O98, 식 O99, 식 O100, 식 O101, 식 O102, 식 O103, 식 O104, 식 O105, 식 O106, 식 O107, 식 O108, 식 O109, 식 O110, 식 O111, 식 O112, 식 O113, 식 O114, 식 O115, 식 O116, 식 O117, 식 O118, 식 O119, 식 O120, 식 O121, 식 O123, 식 O124, 식 O125, 식 O126, 식 O127, 식 O128, 식 O129, 식 O130, 식 O131, 식 O132, 식 O133, 식 O134, 식 O135, 식 O136, 식 O137, 식 O138, 식 O139, 식 O140, 식 O141, 식 O142, 식 O143, 식 O144, 식 O145, 식 O146, 식 O147, 식 O148, 식 O149, 식 O150, 식 O151, 식 O152, 식 O153, 식 O154, 식 O155, 식 O156, 식 O157, 식 O158, 식 O159, 식 O160, 식 O161, 식 O162, 식 O163, 식 O164, 식 O165, 식 O166, 식 O167, 식 O168, 식 O169, 식 O170, 식 O171, 식 O172, 식 O173, 식 O174, 식 O175, 식 O176, 식 O177, 식 O178, 식 O179, 식 O180, 식 O181, 식 O182, 식 O183, 식 O184, 식 O185, 식 O186 및 식 O187 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 갖는 당류를 포함하는 에셔리키아 콜라이이다.
또 다른 양상에서, 박테리아는　식 K.O1.1, 식 K.O1.2, 식 K.O1.3, 식 K.O1.4, 식 K.O2.1, 식 K.O2.2, 식 K.O2.3, 식 K.O2.4, 식 K.O3, 식 K.O4, 식 K.O5, 식 K.O7, 식 K.O12 및 식 K.O8 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 갖는 당류를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니에이다.
1. 박테리아 다당류의 정제 방법
1.1. 출발 물질
본 발명의 방법은 박테리아 다당류와 함께 오염물을 포함하는 용액으로부터 상기 박테리아 다당류를 정제하는데 사용될 수 있다.
1.1.1 박테리아 세포
본 발명에 따라 정제되는 박테리아 다당류의 공급원은 박테리아 세포, 특히 병원성 박테리아이다. 본 발명에 따라 사용되는 그람양성 박테리아의 비제한적인 예는 스트렙토코커스(Streptococcus)(예컨대 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 피오젠스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티에(S. agalactiae) 또는 그룹 C & G 스트렙토 코커스(Group C & G Streptococcus)), 스타필로코커스(Staphylococcus)(예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 엔테로코커스(Enterococcus), 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix) 및 클로스트리디움(Clostridium)이다. 본 발명에 따라 사용되는 그람음성 박테리아의 비제한적인 예는 헤모필러스(Haemophilus)(예컨대 헤모필러스 인플루엔제(Haemophilus influenzae), 네이쎄리아(Neisseria)(예컨대 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)), 에셔리키아(Escherichia)(예컨대 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli)) 및 클레브시엘라(예컨대 클레브시엘라 뉴모니에)이다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 박테리아 다당류의 공급원은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 및 기타 종(spp.); 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis); 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 클로스트리디움의 보툴리눔(Botulinum) 신경독소 생성 종; 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis); 브루셀라 슈이스(Brucella suis); 버콜데리아 말레이(Burkholderia mallei)(원명 슈도모나스 말레이(Pseudomonas mallei)); 버콜데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)(원명 슈도모나스 슈도말레이(Pseudomonas pseudomallei)); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci); 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum); 클로스트리디움 디피실레(Clostridium dificile); 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens); 코시디오드스 이미티스(Coccidioides immitis); 코시디오드스 포사다시이(Coccidioides posadasii); 카우드리아 루미난티움(Cowdria ruminantium)(하트워터(Heartwater)); 콕시엘라 버네티이(Coxiella burnetii); 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis); 장병독성 에셔리키아 콜라이 그룹(Enterovirulent Escherichia coli group)(EEC Group), 예컨대 에셔리키아 콜라이 - 장독소원성(enterotoxigenic)(ETEC), 에셔리키아 콜라이 - 장병원성(EPEC), 에셔리키아 콜라이 - O157:H7 장출혈성(EHEC), 및 에셔리키아 콜라이 - 장침습성(EIEC); 에를리키아(Ehrlichia) spp., 예컨대 에를리키아 차츠피엔시스(Ehrlichia chajfeensis); 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis); 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia); 리베로박터 아프리카누스(Liberobacter africanus); 리베로박터 아시아티쿠스(Liberobacter asiaticus); 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes); 기타 장균(miscellaneous enterics), 예컨대 클레브시엘라(Klebsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 프로테우스(Proteus), 시트로박터(Citrobacter), 에어로박터(Aerobacter), 프로비덴시아(Providencia), 및 세라티아(Serratia); 바이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis); 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis); 마이코플라즈마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum); 마이코플라즈마 마이코이드스 subsp. 마이코이드스(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides); 페로노스클레로스포라필리피네시스(Peronosclerosporaphilippinensis); 파코스포라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi); 플레시오모나스 시겔로이드스(Plesiomonas shigelloides); 라스토니아 솔라네이세룸 레이스 3, 바이오바 2(Ralstonia solanacearum race 3, biovar 2); 리케차 프로와제키이(Rickettsia prowazekii); 리케차 리케치이(Rickettsia rickettsii); 살모넬라(살모넬라) spp.; 슐레로프토라 레이시에 var. 지에(Schlerophthora rayssiae var. zeae); 시켈라(시겔라) spp.; 스타필로코커스 아우레우스; 스트렙토코커스; 신키트리움 엔도바이오티쿰(Synchytrium endobioticum); 비브리오 콜레레 논-01(Vibrio cholerae non-01); 비브리오 콜레레 01; 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 기타 비브리오; 비브리오 벌니피쿠스(Vibrio vulnificus); 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae); 자일렐라 패스티디오사(Xylella fastidiosa)(감귤류 얼룩 황백화 균주(citrus variegated chlorosis 균주)); 이르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 이르시니아 슈도튜버큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis); 및 이르시니아 페스티스(Yersinia pestis)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 정제 목적인 다당류는 세포 요소, 예컨대 세포벽과 회합될 수 있다. 세포벽과의 회합은 다당류가 세포벽 자체의 요소이고/거나 세포벽에 중간 분자를 통해 직접적 또는 간접적으로 부착되거나, 세포벽의 일시적 코팅임(예컨대 특정 박테리아 균주는 당업계에 '외다당류(exopolysaccharide)'로도 공지된 캡슐 다당류를 분비함)을 의미한다.
일부 양태에서, 박테리아로부터 추출된 다당류는 캡슐 다당류, 서브-캡슐 다당류, 또는 지다당류(lipopolysaccharide)이다. 바람직한 양태에서, 다당류는 캡슐 다당류이다.
한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이이다.
추가 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 장병독성 에셔리키아 콜라이 그룹(EEC 그룹)의 에셔리키아 콜라이 부분, 예컨대 에셔리키아 콜라이 - 장독소원성(ETEC), 에셔리키아 콜라이 - 장병원성(EPEC), 에셔리키아 콜라이 - O157:H7 장출혈성(EHEC) 또는 에셔리키아 콜라이 - 장침습성(EIEC)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 요로병원성 에셔리키아 콜라이(UPEC)이다.
또 다른 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 혈청형 O157:H7, O26:H11, O111:H- 및 O103:H2로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 혈청형 O6:K2:H1 및 O18:K1:H7로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 혈청형 O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 및 O7:K1로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형 이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이 혈청형 O104:H4이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이 혈청형 O1:K12:H7이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이 혈청형 O127:H6이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이 혈청형 O139:H28이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 에셔리키아 콜라이 혈청형 O128:H2이다.
또 다른 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX) 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX)이다.
추가 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O1(O1), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2(O2), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2ac(O2ac), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O3(O3), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O4(O4), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O5(O5), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O7(O7), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O8(O8) 또는 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O9(O9)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O1(O1)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2(O2)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2ac(O2ac)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O3(O3)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O4(O4)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O5(O5)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O7(O7)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O8(O8)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O9(O9)이다.
1.1.2. 박테리아 세포 성장
전형적으로, 다당류는 배지(예컨대 고형, 또는 바람직하게 액체 배지)에서 박테리아를 성장시킴으로써 생성된다. 이어서, 다당류는 박테리아 세포를 처리함으로써 제조된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 방법을 위한 출발 물질은 박테리아 배양 및 바람직하게는 액체 박테리아 배양(예컨대 발효 브로스(broth))이다. 박테리아 배양은 전형적으로 배치식 배양, 유가식 배양 또는 연속식 배양에 의해 수득된다(예컨대 WO 2007/052168 또는 WO 2009/081276 참고). 연속식 배양 동안, 신선한 배지가 고정 속도로 배양에 첨가되고, 세포 및 배지는 일정한 배양 부피를 유지하는 속도로 제거된다.
통상적으로, 개체수는 시드 바이알(seed vial)로부터 시드 보틀(seed bottle)로 규모 증대되고, 생산 규모 발효 부피에 도달할 때까지 증가하는 부피의 하나 이상의 시드 발효기를 통과한다.
1.1.3. 출발 물질을 수득하기 위한 박테리아 세포의 전처리
일반적으로, 소량의 다당류는 박테리아 성장 동안 배양 배지로 방출되고, 이에 따라, 출발 물질은 원심분리된 박테리아 배양으로부터의 상청액일 수 있다. 그러나, 전형적으로는, 출발 물질은 다당류가 방출되도록 박테리아 자체를 처리함으로써 제조될 것이다.
임의적으로, 세포 성장 후, 박테리아 세포는 불활성화된다. 이는 특히 병원성 박테리아가 사용될 때의 경우이다. 불활성화에 적합한 방법은 페놀:에탄올에 의한 처리이고, 이는 예컨대 문헌[Fattom et al. (1990) Infect lmmun. 58(7):2367-74]에 기재되어 있다. 하기 양태에서, 박테리아 세포는 선행적으로 불활성화되거나 불활성화되지 않을 수 있다.
다당류는 다양한 방법, 예컨대 화학적, 물리적 또는 효소적 처리에 의해 박테리아로부터 방출될 수 있다(예컨대 WO 2010/151544, WO 2011/051917 또는 WO 2007/084856 참고).
한 양태에서, 박테리아 세포(불활성화 또는 불활성화되지 않음)는 원래 배양 배지에서 현탁액 중 처리된다. 따라서, 공정은 원래 배양 배지에서의 현탁액 중 세포에 의해 시작될 수 있다.
또 다른 양태에서, 박테리아 세포는 캡슐 다당류의 방출 전에 원심분리된다. 따라서, 공정은 습윤한 세포 페이스트 형태의 세포에 의해 시작될 수 있다. 다르게는, 세포는 건조된 형태로 처리될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 원심분리 후, 박테리아 세포는 공정에서 후속 단계에 적합한 수성 배지, 예컨대 완충액 또는 증류수 중 재현탁된다. 세포는 재현탁 전에 상기 배지에 의해 세척될 수 있다.
한 양태에서, 박테리아 세포(예컨대 이의 원래 배양 배지에서의 현탁액 중, 습윤한 세포 페이스트 형태, 건조된 형태, 또는 원심분리 후 수성 배지 중 재현탁된 것)는 용해제로 처리된다. "용해제"는 세포벽 파괴를 보조하는 임의의 제제이다.
한 양태에서, 용해제는 계면활성제이다. 본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 박테리아 세포의 용해를 유도할 수 있는 임의의 음이온성 또는 양이온성 계면활성제를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용되는 이러한 계면활성제의 대표적인 예는 데옥시콜레이트 나트륨(DOC), N-라우릴 사르코신(NLS), 케노데옥시콜산 나트륨 및 사포닌을 포함한다(WO 2008/118752의 13쪽 14번째 줄에서 14쪽 10번째 줄). 본 발명의 한 양태에서, 박테리아 세포를 용해시키는데 사용되는 용해제는 DOC이다.
한 양태에서, 용해제는 비동물성 유래 용해제이다. 한 양태에서, 비동물성 유래 용해제는 데칸설폰산, tert-옥틱페녹시 5 폴리(옥시에틸렌)에탄올(예컨대 아이제팔(IGEPAL: 등록상표), CA-630, CAS #: 9002-93-1, 미국 미주리주 세인트루이스의 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 입수가능), 옥틸페놀 에틸렌 옥사이드 축합물(예컨대 트라이톤(TRITON: 등록상표) X-100, 미국 미주리주 세인트루이스의 시그마 알드리치로부터 입수가능), N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS), 라우릴 아미노다이프로피오네이트, 나트륨 도데실 설페이트, 케노데옥시콜레이트, 하이오데옥시콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 타우로케노데옥시콜레이트 및 콜레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 비동물성 유래 용해제는 NLS이다.
한 양태에서, 박테리아 세포(예컨대 이의 원래 배양 배지에서의 현탁액 중, 습윤한 세포 페이스트 형태, 건조된 형태, 또는 원심분리 후 수성 배지 중 재현탁된 것)는 다당류가 방출되도록 효소 처리된다. 한 양태에서, 박테리아 세포는 리소스타핀, 뮤타놀리신 β-N-아세틸글루코스아미니다제, 및 뮤타놀리신과 β-N-아세틸글루코스아미니다제의 조합으로 처리된다. 이는 박테리아 펩티도글리칸에 작용하여 본 발명에 사용되는 캡슐 당류를 방출시키지만, 군-특이성 탄수화물 항원의 방출도 야기한다. 한 양태에서, 박테리아 세포는 타입 II 포스포다이에스터라제(PDE2)로 처리된다.
임의적으로, 다당류 방출 후, 효소는 불활성화된다. 불활성화에 적합한 방법은 열 처리 또는 산성 처리이다.
한 양태에서, 한 양태에서, 박테리아 세포(예컨대 이의 원래 배양 배지에서의 현탁액 중, 습윤한 세포 페이스트 형태, 건조된 형태, 또는 원심분리 후 수성 배지 중 재현탁된 것)는 다당류가 방출되도록 고압멸균(autoclaving)된다.
추가 양태에서, 박테리아 세포(예컨대 이의 원래 배양 배지에서의 현탁액 중, 습윤한 세포 페이스트 형태, 건조된 형태, 또는 원심분리 후 수성 배지 중 재현탁된 것)는 다당류가 방출되도록 화학 처리된다. 이러한 양태에서, 상기 화학 처리는 염기 또는 산을 사용한 가수분해일 수 있다(예컨대 WO 2007/084856 참고). 한 양태에서, 박테리아 세포는 (예컨대 수산화나트륨을 사용하여) 염기 추출된다. 염기 추출은 캡슐 당류와 펩티도글리칸 골격간의 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 있다. 한 양태에서, 염기는 NaOH, KOH, LiOH, NaHC03, Na2C03, KzC03, KCN, Et3N, NH3, HzN2H2, NaH, NaOMe, NaOEt 및 KOtBu로 이루어진 군으로부터 선택된다. 염기 처리 후, 반응 혼합물은 중화될 수 있다. 이는 산의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 한 양태에서, 염기 처리 후, 반응 혼합물은 HCl, H3PO4, 시트르산, 아세트산, 아질산 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산에 의해 중화될 수 있다.
한 양태에서, 박테리아 세포의 화학 처리는 산(예컨대 황산) 처리이다. 한 양태에서, 산은 HCl, H3PO4, 시트르산, 아세트산, 아질산 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 처리 후, 반응 혼합물은 중화될 수 있다. 이는 염기의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 한 양태에서, 산 처리 후, 반응 혼합물은 NaOH, KOH, LiOH, NaHC03, Na2C03, KzC03, KCN, Et3N, NH3, HzN2H2, NaH, NaOMe, NaOEt 및 KOtBu로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기에 의해 중화될 수 있다.
1.2. 응집
본 발명의 방법은 응집 단계를 포함한다. 본 발명자들은 상기 공정이 신속 및 간단하고, 적은 오염으로, 정제된 다당류를 야기함을 발견하였다. 본 발명자들의 공정은 신속하고 간편하다.
따라서, 본 발명의 방법에서, 1.1 부분의 임의의 방법에 의해 수득되는 용액은 응집에 의해 처리된다.
본 발명에서, 용어 "응집"은 응집제의 첨가에 기인하여 콜로이드가 현탁액으로부터 응집체 또는 박편(flake) 형태로 방출되는 공정을 지칭한다.
응집 단계는 박테리아 다당류와 오염물을 포함하는 용액에 응집제를 첨가하는 단계를 포함한다. 한 양태에서, 오염물은 박테리아 세포 파편, 박테리아 세포 단백질 및 핵산을 포함한다. 한 양태에서, 오염물은 박테리아 세포 단백질 및 핵산을 포함한다. 본원에서 더 후술되는 바와 같이, 응집 단계는 응집제의 첨가 전 또는 후, pH의 조정을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 용액은 산성화될 수 있다.
또한, 응집제의 첨가 및/또는 pH의 조정은 바람직한 수준으로 조정된 온도에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 하기 중 임의의 순서로 수행될 수 있다:
- 응집제의 첨가 후, pH의 조정 후, 온도의 조정;
- 응집제의 첨가 후, 온도의 조정 후, pH의 조정;
- pH의 조정 후, 응집제의 첨가 후, 온도의 조정;
- pH의 조정 후, 온도의 조정 후, 응집제의 첨가;
- 온도의 조정 후, 응집제의 첨가 후, pH의 조정; 또는
- 온도의 조정 후, pH의 조정 후, 응집제의 첨가.
또한, 응집제의 첨가 및/또는 pH의 조정 후, 용액은 다운스트림 가공 전 응집체가 침강(settling)하도록 일정 시간 동안 유지될 수 있다.
본 발명에서, "응집제"는 대상 다당류와 오염물을 포함하는 용액에서 콜로이드 및 기타 현탁된 입자가 응집체 또는 박편의 형태로 집합되고 대상 다당류는 용액에 머물도록 함을 야기하여 응집을 허용 또는 촉진할 수 있는 제제를 지칭한다.
본 발명의 한 양태에서, 응집제는 다가 양이온을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 다가 양이온이다. 바람직한 양태에서, 상기 다가 양이온은 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 응집제는 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다가 양이온의 혼합물이다. 한 양태에서, 응집제는 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 다가 양이온의 혼합물이다. 한 양태에서, 응집제는 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 4개의 다가 양이온의 혼합물이다.
한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 폴리에틸렌이민(PEI), 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 응집제는 폴리에틸렌이민(PEI)이다. 한 양태에서, 응집제는 명반을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 명반이다. 한 양태에서, 응집제는 칼륨 명반을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 칼륨 명반이다. 한 양태에서, 응집제는 나트륨 명반을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 나트륨 명반이다. 한 양태에서, 응집제는 암모늄 명반을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 암모늄 명반이다.
한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 폴리에틸렌이민(PEI), 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제(예컨대 2개, 3개 또는 4개의 제제)의 혼합물이다. 한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 제제의 혼합물이다. 한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 제제의 혼합물이다.
한 양태에서, 응집제는 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라(Moringa oleifera) 씨(서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸(Strychnos potatorum) 씨(니르말리 너트(Nirmali nut) 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라 씨 (서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸 씨(니르말리 너트 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
응집제의 농도는 사용되는 제제, 대상 다당류 및 응집 단계의 매개변수(예컨대 농도 등)에 종속될 수 있다.
응집제가 명반을 포함하거나 명반인 양태에서, 약 0.1 내지 20%(w/v)의 농도의 응집제가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 전체적으로, 0.5 내지 10%(w/v)의 농도의 응집제가 사용될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 1 내지 5%(w/v)의 농도의 응집제가 사용될 수 있다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10%(w/v)의 농도의 응집제가 사용된다. 한 양태에서, 약 10.5, 약 11.0, 약 11.5, 약 12.0, 약 12.5, 약 13.0, 약 13.5, 약 14.0, 약 14.5, 약 15.0, 약 15.5, 약 16.0, 약 16.5, 약 17.0, 약 17.5, 약 18.0, 약 18.5, 약 19.0, 약 19.5 또는 약 20.0%(w/v)의 농도의 응집제가 사용된다. 한 양태에서, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5 또는 약 5.0%(w/v)의 농도의 응집제가 사용된다. 한 양태에서, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0%(w/v)의 농도의 응집제가 사용된다.
본 발명의 일부 양태에서, 응집제는 특정 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 응집제는 수초(예컨대 1 내지 10초) 내지 약 1개월의 시간에 걸쳐 첨가된다. 일부 양태에서, 응집제는 약 2초 내지 약 2주의 시간에 걸쳐 첨가된다. 본 발명의 일부 양태에서, 응집제는 약 1분 내지 약 1주의 시간에 걸쳐 첨가된다. 일부 양태에서, 응집제는 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간 또는 약 24시간 내지 약 2일의 시간에 걸쳐 첨가된다.
따라서, 특정 양태에서, 응집제는 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 시간에 걸쳐 첨가된다.
바람직하게는 응집제는 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 시간에 걸쳐 첨가된다.
특정 양태에서, 응집제는 약 15분 내지 약 3시간의 시간에 걸쳐 첨가된다. 특정 양태에서, 응집제는 약 30분 내지 약 120분의 시간에 걸쳐 첨가된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 응집제는 약 2초, 약 10초, 약 30초, 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일 또는 약 15일의 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다.
한 양태에서, 응집제는 교반없이 첨가된다. 또 다른 양태에서, 응집제는 교반하에 첨가된다. 또 다른 양태에서, 응집제는 온화한 교반에 의해 첨가된다. 또 다른 양태에서, 응집제는 격렬한 교반하에 첨가된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 응집이 산성 pH에서 수행될 때 향상됨을 추가적으로 주목하였다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 응집 단계는 7.0, 6.0, 5.0 또는 4.0보다 낮은 pH에서 수행된다. 본 발명의 특정 양태에서, 응집 단계는 7.0 내지 1.0의 pH에서 수행된다. 한 양태에서, 응집 단계는 5.5 내지 2.5, 5.0 내지 2.5, 4.5 내지 2.5, 4.0 내지 2.5, 5.5 내지 3.0, 5.0 내지 3.0, 4.5 내지 3.0, 4.0 내지 3.0, 5.5 내지 3.5, 5.0 내지 3.5, 4.5 내지 3.5, 또는 4.0 내지 3.5의 pH에서 수행된다. 한 양태에서, 응집 단계는 약 5.5, 약 5.0, 약 4.5, 약 4.0, 약 3.5, 약 3.0, 약 2.5, 약 2.0, 약 1.5 또는 약 1.0의 pH에서 수행된다. 한 양태에서, 응집 단계는 약 4.0, 약 3.5, 약 3.0 또는 약 2.5의 pH에서 수행된다. 한 양태에서, 응집 단계는 약 3.5의 pH에서 수행된다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 상기 산성 pH는 상기 1.1 부분의 임의의 방법에 의해 수득되거나 1.2 부분에 개시된 바와 같이 추가 청징(clarifying)된 용액을 산에 의해 산성화시킴으로써 수득된다. 한 양태에서, 상기 산은 HCl, H3PO4, 시트르산, 아세트산, 아질산 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 상기 산은 아미노산이다. 한 양태에서, 상기 산은 아미노산 글리신, 알라닌 및 글루타메이트으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 한 양태에서, 상기 산은 HCl(염산)이다. 한 양태에서, 상기 산은 황산이다.
한 양태에서, 산은 교반없이 첨가된다. 또 다른 양태에서, 산은 교반하에 첨가된다. 또 다른 양태에서, 산은 온화한 교반에 의해 첨가된다. 또 다른 양태에서, 산은 격렬한 교반하에 첨가된다.
본 발명의 일부 양태에서, 응집제의 첨가(및 임의적인 산성화) 후, 용액은 일정 시간 동안 유지되어 다운스트림 가공 전 응집체가 침강된다.
본 발명의 일부 양태에서, 응집 단계는 수초(예컨대 2 내지 10초) 내지 약 1분의 침강 시간에 의해 수행된다. 바람직하게는 침강 시간은 약 2분 이상, 약 3분 이상, 약 4분 이상, 약 5분 이상, 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 약 25분 이상, 약 30분 이상, 약 35분 이상, 약 40분 이상, 약 45분 이상, 약 50분 이상, 약 55분 이상, 약 60분 이상, 약 65분 이상, 약 70분 이상, 약 75분 이상, 약 80분 이상, 약 85분 이상, 약 90분 이상, 약 95분 이상, 약 100분 이상, 약 105분 이상, 약 110분 이상, 약 115분 이상, 약 120분 이상, 약 125분 이상, 약 130분 이상, 약 135분 이상, 약 140분 이상, 약 145분 이상, 약 150분 이상, 약 155분 이상 또는 약 160분 이상이다. 바람직하게는 침강 시간은 1주 미만이지만, 침강 시간이 더 길 수 있다.
따라서, 특정 양태에서, 침강 시간은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380, 약 1440분, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일 또는 약 6일 내지 1주이다.
본 발명의 일부 양태에서, 침강 시간은 수초 (예컨대 1 내지 10초) 내지 약 1개월이다. 일부 양태에서, 침강 시간은 약 2초 내지 약 2주이다. 본 발명의 일부 양태에서, 침강 시간은 약 1분 내지 약 1주이다. 일부 양태에서, 침강 시간은 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간 또는 약 24시간 내지 약 2일이다.
따라서, 특정 양태에서, 침강 시간은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일이다.
바람직하게는 침강 시간은 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일이다.
특정 양태에서, 침강 시간은 약 15분 내지 약 3시간이다. 특정 양태에서, 침강 시간은 약 30분 내지 약 120분이다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
특정 양태에서, 침강 시간은 약 2초, 약 10초, 약 30초, 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일 또는 약 15일이다.
바람직하게는 침강 시간은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380 또는 약 1440분 내지 2일이다. 특정 양태에서, 침강 시간은 약 5분 내지 약 1일이다. 특정 양태에서, 침강 시간은 약 5분 내지 약 120분이다.
침강 시간은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분 또는 약 160분일 수 있다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 임의적인 침강 단계는 교반없이 수행된다. 또 다른 양태에서, 임의적인 침강 단계는 교반하에 수행된다. 또 다른 양태에서, 임의적인 침강 단계는 온화한 교반에 의해 수행된다. 또 다른 양태에서, 임의적인 침강 단계는 격렬한 교반하에 수행된다.
본 발명의 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 20℃의 온도에서 수행된다. 놀랍게도, 본 발명자들은 응집이 고온에서 수행될 때 더 향상됨에 주목하였다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가, 용액의 침강 및/또는 pH의 조정은 약 50℃의 온도에서 수행된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 응집제의 첨가는 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, 응집제의 첨가 후 용액의 침강 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, pH의 조정은 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, 응집제의 첨가 및 응집제의 첨가 후 용액의 침강은 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, 응집제의 첨가 및 pH의 조정은 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, 응집제의 첨가, 응집제의 첨가 후 용액의 침강 및 pH의 조정은 전술된 임의의 온도에서 수행된다.
한 양태에서, 응집 단계는 pH의 조정없이 (전술된 바와 같이) 응집제를 첨가함을 포함한다.
한 양태에서, 응집 단계는 pH의 조정없이 (전술된 바와 같이) 응집제를 첨가함 및 용액을 침강시킴을 포함한다.
한 양태에서, 응집 단계는 (전술된 바와 같이) 응집제를 첨가함, pH를 조정함 및 용액을 침강시킴을 포함한다. 한 양태에서, 응집제는 pH의 조정 전 첨가된다. 또 다른 양태에서, pH는 응집제 첨가 전 조정된다.
한 양태에서, 응집 단계는 (전술된 바와 같이) 응집제를 첨가함, 용액을 침강시킴 및 pH를 조정함을 포함한다. 한 양태에서, 응집제의 첨가 및 용액의 침강은 pH의 조정 전 수행된다. 또 다른 양태에서, pH는 응집제의 첨가 및 용액의 침강 전 조정된다. 한 양태에서, 응집제의 첨가 및 pH의 조정은 용액의 침강 전 수행된다. 또 다른 양태에서, pH는 응집제의 첨가 및 용액의 침강 전 조정된다.
한 양태에서, 응집 단계는 (전술된 바와 같이) 응집제를 첨가함, pH를 조정함 및 온도를 조정함을 포함한다.
하기 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있다:
- 응집제의 첨가 후, pH의 조정 후, 온도의 조정;
- 응집제의 첨가 후, 온도의 조정 후, pH의 조정;
- pH의 조정 후, 응집제의 첨가 후, 온도의 조정;
- pH의 조정 후, 온도의 조정 후, 응집제의 첨가;
- 온도의 조정 후, 응집제의 첨가 후, pH의 조정; 또는
- 온도의 조정 후, pH의 조정 후, 응집제의 첨가.
또한, 응집제의 첨가 및/또는 pH의 조정 후, 용액이 일정 시간 동안 유지되어 다운스트림 가공 전 응집체가 침강된다.
1.3. 고체/액체 분리
응집된 물질은 임의의 적합한 고체/액체 분리 방법에 의해 대상 다당류로부터 분리될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 디캔테이션(decantation), 침전, 여과 또는 원심분리에 의해 청징된다. 이어서, 한 양태에서, 다당류-함유 용액은 보관 및/또는 추가 가공을 위해 수집된다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 디캔테이션에 의해 청징된다. 디캔터는 액체간의 밀도에 충분한 차이가 있는 경우, 응집체를 침강시켜 상기 액체을 분리하는데 사용된다. 디캔터 작동에 있어서, 3개의 구분된 영역, 즉 투명하고 무거운 액체, 분리되는 분산된 액체(분산액 영역), 및 투명하고 가벼운 액체가 있을 것이다. 투명한 용액을 생성하기 위해, 일반적으로, 소량의 용액이 용기에 남아 있어야 한다. 디캔터는 연속식 작동을 위해 설계된다.
본 발명의 한 양태에서, 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 침전(침강)에 의해 청징된다. 침전은 중력 침강에 의해 액체 혼합물로부터 현탁된 고체 입자를 투명한 유체 및 더 높은 고체 함량의 슬러리로 분리하는 것이다. 침전은 증점제, 농축조(thickener), 청징조(clarifier) 또는 분급기(classifier)에서 수행될 수 있다. 농축 및 청징은 큰 부피의 액체의 처리에 사용될 때 비교적 저렴한 공정이고, 이는 여과를 위한 공급물의 사전농축에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 원심분리에 의해 청징된다. 한 양태에서, 상기 원심분리는 연속식 원심분리이다. 한 양태에서, 상기 원심분리는 버킷 원심분리(bucket centrifugation)이다. 이어서, 한 양태에서, 다당류-함유 상청액은 보관 및/또는 추가 가공을 위해 수집된다.
일부 양태에서, 현탁액은 약 1,000 g 약 2,000 g, 약 3,000 g, 약 4,000 g, 약 5,000 g, 약 6,000 g, 약 8,000 g, 약 9,000 g, 약 10,000 g, 약 11,000 g, 약 12,000 g, 약 13,000 g, 약 14,000 g, 약 15,000 g, 약 16,000 g, 약 17,000 g, 약 18,000 g, 약 19,000 g, 약 20,000 g, 약 25,000 g, 약 30,000 g, 약 35,000 g, 약 40,000 g, 약 50,000 g, 약 60,000 g, 약 70,000 g, 약 80,000 g, 약 90,000 g, 약 100,000 g, 약 120,000 g, 약 140,000 g, 약 160,000 g 또는 약 180,000 g로 원심분리된다. 일부 양태에서, 현탁액은 약 8,000 g, 약 9,000 g, 약 10,000 g, 약 11,000 g, 약 12,000 g, 약 13,000 g, 약 14,000 g, 약 15,000 g, 약 16,000 g, 약 17,000 g, 약 18,000 g, 약 19,000 g, 약 20,000 g 또는 약 25,000 g로 원심분리된다.
일부 양태에서, 현탁액은 약 5,000 g 내지 약 25,000 g로 원심분리된다. 일부 양태에서, 현탁액은 약 8,000 g 내지 약 20,000 g로 원심분리된다. 일부 양태에서, 현탁액은 약 10,000 g 내지 약 15,000 g로 원심분리된다. 일부 양태에서, 현탁액은 약 10,000 g 내지 약 12,000 g로 원심분리된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
일부 양태에서, 현탁액은 2분 이상, 3분 이상, 4분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 25분 이상, 30분 이상, 35분 이상, 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상, 55분 이상, 60분 이상, 65분 이상, 70분 이상, 75분 이상, 80분 이상, 85분 이상, 90분 이상, 95분 이상, 100분 이상, 105분 이상, 110분 이상, 115분 이상, 120분 이상, 125분 이상, 130분 이상, 135분 이상, 140분 이상, 145분 이상, 150분 이상, 155분 이상 또는 160분 이상 동안 원심분리된다. 바람직하게는, 원심분리 시간은 24시간 미만이다.
따라서, 특정 양태에서, 현탁액은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320 또는 약 1380분 내지 1440분 동안 원심분리된다.
바람직하게는 현탁액은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 180, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480 또는 약 540분 내지 약 600분 동안 원심분리된다. 특정 양태에서, 현탁액은 약 5분 내지 약 3시간 동안 원심분리된다. 특정 양태에서, 현탁액은 약 5분 내지 약 120분 동안 원심분리된다.
현탁액은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분 또는 약 155분 내지 약 160분 동안 원심분리될 수 있다.
현탁액은 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분 또는 약 55분 내지 약 60분 동안 원심분리될 수 있다.
현탁액은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380분 또는 약 1440분 동안 원심분리될 수 있다.
현탁액은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분 또는 약 160분 동안 원심분리될 수 있다.
현탁액은 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분 또는 약 60분 동안 원심분리될 수 있다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
본 발명의 한 양태에서, 원심분리는 연속식 원심분리이다. 상기 양태에서, 공급 속도는 50 내지 5000 mL/분, 100 내지 4000 mL/분, 150 내지 3000 mL/분, 200 내지 2500 mL/분, 250 내지 2000 mL/분, 300 내지 1500 mL/분, 300 내지 1000 mL/분, 200 내지 1000 mL/분, 200 내지 1500 mL/분, 400 내지 1500 mL/분, 500 내지 1500 mL/분, 500 내지 1000 mL/분, 500 내지 2000 mL/분, 500 내지 2500 mL/분 또는 1000 내지 2500 mL/분일 수 있다.
한 양태에서, 공급 속도는 약 10, 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 약 1500, 약 1650, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3250, 약 3500, 약 3750, 약 4000, 약 4250, 약 4500 또는 약 5000 mL/분일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 여과에 의해 청징된다. 여과에서, 액체 중 현탁된 고체 입자는 입자를 보유하고 투명한 여과물은 통과시키는 다공성 매질을 통해 혼합물을 통과시킴으로써 제거된다. 여과는 중력에 의한 스크린(screen), 또는 진공, 압력 또는 원심분리에 의한 필터에서 수행된다. 고체는 필터 매질의 표면에 보유될 수 있거나(케이크(cake) 여과), 필터 매질 내에 포획될 수 있다(심층여과). 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 마이크로여과에 의해 청징된다. 한 양태에서, 마이크로여과는 접선(tangential) 마이크로여과이다. 또 다른 양태에서, 마이크로여과는 데드-엔드(dead-end) 여과(수직 여과)이다. 한 양태에서, 마이크로여과는 규조토(DE)(DE 다이아토마이트로도 공지되어 있음)가 고체/액체 분리의 효율을 용이하게 하고 증대시킴을 보조하는 필터로서 사용되는 데드-엔드 여과이다. 따라서, 한 양태에서, 응집 후, 현탁액(상기 1.2 부분에서 수득됨)은 규조토(DE)를 포함하는 데드-엔드 마이크로여과에 의해 청징된다. DE는 심층 필터의 구성요소로서 데드-엔드 필터에 포함(또는 혼입)될 수 있다.
또 다른 형식에서, DE는 응집된 용액(1.2 부분 후 수득됨)에 분말 형태로 첨가될 수 있다. 이러한 경우, 응집된 용액으로 처리된 DE는 심층여과에 의해 추가로 청징될 수 있다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.45 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 또는 약 1.75 내지 2 μm의 공칭 보유 범위(nominal retention range)를 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.45 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2 μm의 공칭 보유 등급(rating)을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.45 μm의 공칭 보유 등급을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 5000 L/m2, 200 내지 5000 L/m2, 300 내지 5000 L/m2, 400 내지 5000 L/m2, 500 내지 5000 L/m2, 750 내지 5000 L/m2, 1000 내지 5000 L/m2, 1500 내지 5000 L/m2, 2000 내지 5000 L/m2, 3000 내지 5000 L/m2 또는 4000 내지 5000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 2500 L/m2, 200 내지 2500 L/m2, 300 내지 2500 L/m2, 400 내지 2500 L/m2, 500 내지 2500 L/m2, 750 내지 2500 L/m2, 1000 내지 2500 L/m2, 1500 내지 2500 L/m2 또는 2000 내지 2500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1500 L/m2, 200 내지 1500 L/m2, 300 내지 1500 L/m2, 400 내지 1500 L/m2, 500 내지 1500 L/m2, 750 내지 1500 L/m2 또는 1000 내지 1500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1250 L/m2, 200 내지 1250 L/m2, 300 내지 1250 L/m2, 400 내지 1250 L/m2, 500 내지 1250 L/m2, 750 내지 1250 L/m2 또는 1000 내지 1250 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 750 L/m2, 200 내지 750 L/m2, 300 내지 750 L/m2, 400 내지 750 L/m2 또는 500 내지 750 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 600 L/m2, 200 내지 600 L/m2, 300 내지 600 L/m2, 400 내지 600 L/m2 또는 400 내지 600 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 약 1500, 약 1550, 약 1600, 약 1650, 약 1700, 약 1750, 약 1800, 약 1850, 약 1900, 약 1950, 약 2000, 약 2050, 약 2100, 약 2150, 약 2200, 약 2250, 약 2300, 약 2350, 약 2400, 약 2450 또는 약 2500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
전술된 고체/액체 분리 방법은 단일 형식, 임의의 순서로 2개의 조합, 또는 임의의 순서로 3개의 조합으로 사용될 수 있다.
1.4. 여과(예컨대 심층여과)
용액이 상기 1.2 부분의 응집 단계에 의하고/거나 상기 1.3 부분의 고체/액체 분리 단계에 의해 처리된 후, 다당류-함유 용액(예컨대 상청액)은 임의적으로 추가 청징될 수 있다.
한 양태에서, 용액은 여과되어 추가 청징된 용액이 생성된다. 한 양태에서, 여과는 상기 1.2 부분의 임의의 방법에 의해 수득된 용액에 바로 적용된다. 한 양태에서, 여과는 상기 1.3 부분에 기재된 고체/액체 분리 단계에 의해 추가 청징된 용액에 적용된다. 한 양태에서, 용액은 심층여과, 활성탄을 통한 여과, 크기 여과, 정용여과 및 한외여과로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 용액은 정용여과 단계, 특히 접선 유동 여과에 의해 처리된다. 한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리된다.
심층여과는 매질의 표면에 바로 위가 아닌, 매질 전체에 걸쳐 입자를 보유한다. 여과 매질의 굴곡적 및 통로적 성질에 기인하여, 입자는 표면이 아니라 매질의 구조 내의 매질 전체에 걸쳐 보유된다. 한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 카세트, 카트리지, 심층(예컨대 모래 필터) 및 렌즈형 필터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 100 μm, 약 0.05 내지 100 μm, 약 0.1 내지 100 μm, 약 0.2 내지 100 μm, 약 0.3 내지 100 μm, 약 0.4 내지 100 μm, 약 0.5 내지 100 μm, 약 0.6 내지 100 μm, 약 0.7 내지 100 μm, 약 0.8 내지 100 μm, 약 0.9 내지 100 μm, 약 1 내지 100 μm, 약 1.25 내지 100 μm, 약 1.5 내지 100 μm, 약 1.75 내지 100 μm, 약 2 내지 100 μm, 약 3 내지 100 μm, 약 4 내지 100 μm, 약 5 내지 100 μm, 약 6 내지 100 μm, 약 7 내지 100 μm, 약 8 내지 100 μm, 약 9 내지 100 μm, 약 10 내지 100 μm, 약 15 내지 100 μm, 약 20 내지 100 μm, 약 25 내지 100 μm, 약 30 내지 100 μm, 약 40 내지 100 μm, 약 50 내지 100 μm 또는 약 75 내지 100 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 75 μm, 약 0.05 내지 75 μm, 약 0.1 내지 75 μm, 약 0.2 내지 75 μm, 약 0.3 내지 75 μm, 약 0.4 내지 75 μm, 약 0.5 내지 75 μm, 약 0.6 내지 75 μm, 약 0.7 내지 75 μm, 약 0.8 내지 75 μm, 약 0.9 내지 75 μm, 약 1 내지 75 μm, 약 1.25 내지 75 μm, 약 1.5 내지 75 μm, 약 1.75 내지 75 μm, 약 2 내지 75 μm, 약 3 내지 75 μm, 약 4 내지 75 μm, 약 5 내지 75 μm, 약 6 내지 75 μm, 약 7 내지 75 μm, 약 8 내지 75 μm, 약 9 내지 75 μm, 약 10 내지 75 μm, 약 15 내지 75 μm, 약 20 내지 75 μm, 약 25 내지 75 μm, 약 30 내지 75 μm, 약 40 내지 75 μm 또는 약 50 내지 75 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 50 μm, 약 0.05 내지 50 μm, 약 0.1 내지 50 μm, 약 0.2 내지 50 μm, 약 0.3 내지 50 μm, 약 0.4 내지 50 μm, 약 0.5 내지 50 μm, 약 0.6 내지 50 μm, 약 0.7 내지 50 μm, 약 0.8 내지 50 μm, 약 0.9 내지 50 μm, 약 1 내지 50 μm, 약 1.25 내지 50 μm, 약 1.5 내지 50 μm, 약 1.75 내지 50 μm, 약 2 내지 50 μm, 약 3 내지 50 μm, 약 4 내지 50 μm, 약 5 내지 50 μm, 약 6 내지 50 μm, 약 7 내지 50 μm, 약 8 내지 50 μm, 약 9 내지 50 μm, 약 10 내지 50 μm, 약 15 내지 50 μm, 약 20 내지 50 μm, 약 25 내지 50 μm, 약 30 내지 50 μm, 약 40 내지 50 μm 또는 약 50 내지 50 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 25 μm, 약 0.05 내지 25 μm, 약 0.1 내지 25 μm, 약 0.2 내지 25 μm, 약 0.3 내지 25 μm, 약 0.4 내지 25 μm, 약 0.5 내지 25 μm, 약 0.6 내지 25 μm, 약 0.7 내지 25 μm, 약 0.8 내지 25 μm, 약 0.9 내지 25 μm, 약 1 내지 25 μm, 약 1.25 내지 25 μm, 약 1.5 내지 25 μm, 약 1.75 내지 25 μm, 약 2 내지 25 μm, 약 3 내지 25 μm, 약 4 내지 25 μm, 약 5 내지 25 μm, 약 6 내지 25 μm, 약 7 내지 25 μm, 약 8 내지 25 μm, 약 9 내지 25 μm, 약 10 내지 25 μm, 약 15 내지 25 μm 또는 약 20 내지 25 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 10 μm, 약 0.05 내지 10 μm, 약 0.1 내지 10 μm, 약 0.2 내지 10 μm, 약 0.3 내지 10 μm, 약 0.4 내지 10 μm, 약 0.5 내지 10 μm, 약 0.6 내지 10 μm, 약 0.7 내지 10 μm, 약 0.8 내지 10 μm, 약 0.9 내지 10 μm, 약 1 내지 10 μm, 약 1.25 내지 10 μm, 약 1.5 내지 10 μm, 약 1.75 내지 10 μm, 약 2 내지 10 μm, 약 3 내지 10 μm, 약 4 내지 10 μm, 약 5 내지 10 μm, 약 6 내지 10 μm, 약 7 내지 10 μm, 약 8 내지 10 μm 또는 약 9 내지 10 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 8 μm, 약 0.05 내지 8 μm, 약 0.1 내지 8 μm, 약 0.2 내지 8 μm, 약 0.3 내지 8 μm, 약 0.4 내지 8 μm, 약 0.5 내지 8 μm, 약 0.6 내지 8 μm, 약 0.7 내지 8 μm, 약 0.8 내지 8 μm, 약 0.9 내지 8 μm, 약 1 내지 8 μm, 약 1.25 내지 8 μm, 약 1.5 내지 8 μm, 약 1.75 내지 8 μm, 약 2 내지 8 μm, 약 3 내지 8 μm, 약 4 내지 8 μm, 약 5 내지 8 μm, 약 6 내지 8 μm 또는 약 7 내지 8 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 5 μm, 약 0.05 내지 5 μm, 약 0.1 내지 5 μm, 약 0.2 내지 5 μm, 약 0.3 내지 5 μm, 약 0.4 내지 5 μm, 약 0.5 내지 5 μm, 약 0.6 내지 5 μm, 약 0.7 내지 5 μm, 약 0.8 내지 5 μm, 약 0.9 내지 5 μm, 약 1 내지 5 μm, 약 1.25 내지 5 μm, 약 1.5 내지 5 μm, 약 1.75 내지 5 μm, 약 2 내지 5 μm, 약 3 내지 5 μm 또는 약 4 내지 5 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 약 1.75 내지 2 μm, 약 2 내지 2 μm, 약 3 내지 2 μm 또는 약 4 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 약 0.05 내지 50 μm, 0.1 내지 25 μm 0.2 내지 10, μm 0.1 내지 10 μm, 0.2 내지 5 μm 또는 0.25 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 2500 L/m2, 5 내지 2500 L/m2, 10 내지 2500 L/m2, 25 내지 2500 L/m2, 50 내지 2500 L/m2, 75 내지 2500 L/m2, 100 내지 2500 L/m2, 150 내지 2500 L/m2, 200 내지 2500 L/m2, 300 내지 2500 L/m2, 400 내지 2500 L/m2, 500 내지 2500 L/m2, 750 내지 2500 L/m2, 1000 내지 2500 L/m2, 1500 내지 2500 L/m2 또는 2000 내지 2500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 1000 L/m2, 5 내지 1000 L/m2, 10 내지 1000 L/m2, 25 내지 1000 L/m2, 50 내지 1000 L/m2, 75 내지 1000 L/m2, 100 내지 1000 L/m2, 150 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 750 L/m2, 5 내지 750 L/m2, 10 내지 750 L/m2, 25 내지 750 L/m2, 50 내지 750 L/m2, 75 내지 750 L/m2, 100 내지 750 L/m2, 150 내지 750 L/m2, 200 내지 750 L/m2, 300 내지 750 L/m2, 400 내지 750 L/m2 또는 500 내지 750 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 500 L/m2, 5 내지 500 L/m2, 10 내지 500 L/m2, 25 내지 500 L/m2, 50 내지 500 L/m2, 75 내지 500 L/m2, 100 내지 500 L/m2, 150 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 400 L/m2, 5 내지 400 L/m2, 10 내지 400 L/m2, 25 내지 400 L/m2, 50 내지 400 L/m2, 75 내지 400 L/m2, 100 내지 400 L/m2, 150 내지 400 L/m2, 200 내지 400 L/m2 또는 300 내지 400 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 300 L/m2, 5 내지 300 L/m2, 10 내지 300 L/m2, 25 내지 300 L/m2, 50 내지 300 L/m2, 75 내지 300 L/m2, 100 내지 300 L/m2, 150 내지 300 L/m2 또는 200 내지 300 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 200 L/m2, 5-200 L/m2, 10 내지 200 L/m2, 25 내지 200 L/m2, 50 내지 200 L/m2, 75 내지 200 L/m2, 100 내지 200 L/m2 또는 150 내지 200 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 100 L/m2, 5 내지 100 L/m2, 10 내지 100 L/m2, 25 내지 100 L/m2, 50 내지 100 L/m2 또는 75 내지 100 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 심층 필터는 1 내지 50 L/m2, 5 내지 50 L/m2, 10 내지 50 L/m2 또는 25 내지 50 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 전체 정수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 공급 속도는 1 내지 1000 LMH(L/m2/h), 10 내지 1000 LMH, 25 내지 1000 LMH, 50 내지 1000 LMH, 100 내지 1000 LMH, 125 내지 1000 LMH, 150 내지 1000 LMH, 200 내지 1000 LMH, 250 내지 1000 LMH, 300 내지 1000 LMH, 400 내지 1000 LMH, 500 내지 1000 LMH, 600 내지 1000 LMH, 700 내지 1000 LMH, 800 내지 1000 LMH 또는 900 내지 1000 LMH이다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 공급 속도는 1 내지 500 LMH, 10 내지 500 LMH, 25 내지 500 LMH, 50 내지 500 LMH, 100 내지 500 LMH, 125 내지 500 LMH, 150 내지 500 LMH, 200 내지 500 LMH, 250 내지 500 LMH, 300 내지 500 LMH 또는 400 내지 500 LMH이다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 공급 속도는 1 내지 400 LMH, 10 내지 400 LMH, 25 내지 400 LMH, 50 내지 400 LMH, 100 내지 400 LMH, 125 내지 400 LMH, 150 내지 400 LMH, 200 내지 400 LMH, 250 내지 400 LMH 또는 300 내지 400 LMH이다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 공급 속도는 1 내지 250 LMH, 10 내지 250 LMH, 25 내지 250 LMH, 50 내지 250 LMH, 100 내지 250 LMH, 125 내지 250 LMH, 150 내지 250 LMH 또는 200 내지 250 LMH이다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 공급 속도는 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 25, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 310, 약 320, 약 330, 약 340, 약 350, 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950 또는 약 1000 LMH이다.
1.5. 임의적인 추가 정제
용액이 상기 1.4 부분의 여과 단계에 의해 처리된 후, 수득된 용액(즉 여과물)은 임의적으로 추가 청징될 수 있다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과된다. 한 양태에서, 마이크로여과는 데드-엔드 여과(수직 여과)이다. 한 양태에서, 마이크로여과는 접선 마이크로여과이다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.45 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 또는 약 1.75 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 심층여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.45 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2 μm의 공칭 보유 등급을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.45 μm의 공칭 보유 등급을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 5000 L/m2, 200 내지 5000 L/m2, 300 내지 5000 L/m2, 400 내지 5000 L/m2, 500 내지 5000 L/m2, 750 내지 5000 L/m2, 1000 내지 5000 L/m2, 1500 내지 5000 L/m2, 2000 내지 5000 L/m2, 3000 내지 5000 L/m2 또는 4000 내지 5000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 2500 L/m2, 200 내지 2500 L/m2, 300 내지 2500 L/m2, 400 내지 2500 L/m2, 500 내지 2500 L/m2, 750 내지 2500 L/m2, 1000 내지 2500 L/m2, 1500 내지 2500 L/m2 또는 2000 내지 2500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1500 L/m2, 200 내지 1500 L/m2, 300 내지 1500 L/m2, 400 내지 1500 L/m2, 500 내지 1500 L/m2, 750 내지 1500 L/m2 또는 1000 내지 1500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1250 L/m2, 200 내지 1250 L/m2, 300 내지 1250 L/m2, 400 내지 1250 L/m2, 500 내지 1250 L/m2, 750 내지 1250 L/m2 또는 1000 내지 1250 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 750 L/m2, 200 내지 750 L/m2, 300 내지 750 L/m2, 400 내지 750 L/m2 또는 500 내지 750 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 600 L/m2, 200 내지 600 L/m2, 300 내지 600 L/m2, 400 내지 600 L/m2 또는 400 내지 600 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 약 1500, 약 1550, 약 1600, 약 1650, 약 1700, 약 1750, 약 1800, 약 1850, 약 1900, 약 1950, 약 2000, 약 2050, 약 2100, 약 2150, 약 2200, 약 2250, 약 2300, 약 2350, 약 2400, 약 2450 또는 약 2500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
1.6. 한외여과 및/또는 정용여과
용액이 상기 1.4 부분의 임의의 방법에 의하고/거나 상기 1.5 부분의 여과 단계에 의해 여과된 후, 수득된 용액(즉 여과물)은 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 임의적으로 추가 청징될 수 있다.
한외여과(UF)는 희석 생성물 스트림을 농축시키기 위한 공정이다. UF는 용액 중 분자를 막 세공 크기 또는 컷 오프 분자량(분자량 cutoff, MWCO)을 기준으로 분리한다. 본 발명의 한 양태에서, 용액(예컨대 상기 1.5 또는 1.6 부분에서 수득된 여과물)은 한외여과에 의해 처리된다.
한 양태에서, 용액은 한외여과에 의해 처리되고, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 1000 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 750 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 500 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 300 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 100 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 50 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 30 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 1000 kDa, 약 10 kDa 내지 1000 kDa 약 20 kDa 내지 1000 kDa, 약 30 kDa 내지 1000 kDa, 약 40 kDa 내지 1000 kDa, 약 50 kDa 내지 1000 kDa, 약 75 kDa 내지 1000 kDa, 약 100 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 200 kDa 내지 1000 kDa, 약 300 kDa 내지 1000 kDa, 약 400 kDa 내지 1000 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa 또는 약 750 kDa 내지 1000 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 500 kDa, 약 10 kDa 내지 500 kDa, 약 20 kDa 내지 500 kDa, 약 30 kDa 내지 500 kDa, 약 40 kDa 내지 500 kDa, 약 50 kDa 내지 500 kDa, 약 75 kDa 내지 500 kDa, 약 100 kDa 내지 500 kDa, 약 150 kDa 내지 500 kDa, 약 200 kDa 내지 500 kDa, 약 300 kDa 내지 500 kDa 또는 약 400 kDa 내지 500 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 300 kDa, 약 10 kDa 내지 300 kDa, 약 20 kDa 내지 300 kDa, 약 30 kDa 내지 300 kDa, 약 40 kDa 내지 300 kDa, 약 50 kDa 내지 300 kDa, 약 75 kDa 내지 300 kDa, 약 100 kDa 내지 300 kDa, 약 150 kDa 내지 300 kDa 또는 약 200 kDa 내지 300 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 100 kDa, 약 10 kDa 내지 100 kDa, 약 20 kDa 내지 100 kDa, 약 30 kDa 내지 100 kDa, 약 40 kDa 내지 100 kDa, 약 50 kDa 내지 100 kDa 또는 약 75 kDa 내지 100 kDa이다.
한 양태에서, 막의 컷 오프 분자량은 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 750 kDa 또는 약 1000 kDa이다.
한 양태에서, 한외여과의 농축 계수는 약 1.5 내지 10이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2 내지 8이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2 내지 5이다.
한 양태에서, 농축 계수는 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6이다.
본 발명의 한 양태에서, 용액(예컨대 상기 1.5 또는 1.6 부분에서 수득된 여과물)은 정용여과에 의해 처리된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 본 부분에 개시된 한외여과(UF)에 의해 수득되는 용액은 정용여과에 의해 추가 처리된다(UF/DF 처리).
정용여과(DF)는 목적하는 완충 용액(또는 단지 물) 내로 생성물을 교환하는데 사용된다. 한 양태에서, 정용여과는 일정 부피하에 보유된 용액의 화학적 특성을 변화시키는데 사용된다. 원치않는 입자는 막을 통과하는 한편, 공급 스트림을 이루는 나머지는 대체 용액(완충 용액, 염수 용액, 완충 염수 용액 또는 물)의 첨가를 통해 보다 더 바람직한 상태로 변화된다.
한 양태에서, 대체 용액은 물이다.
한 양태에서, 대체 용액은 물 중 염수이다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 한 양태에서, 대체 용액은 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM 또는 약 500 mM의 나트륨 클로라이드이다. 하나의 특정 양태에서, 대체 용액은 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 250 mM 또는 약 300 mM의 나트륨 클로라이드이다.
한 양태에서, 대체 용액은 완충 용액이다. 한 양태에서, 대체 용액은 완충제가 N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산(ACES), 아세트산의 염(아세테이트), N-(2-아세트아미도)-이미노다이아세트산(ADA), 2-아미노에탄설폰산(AES, 타우린), 암모니아, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올(AMPD), 암메다이올, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(AMPSO), N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 나트륨 수소 카보네이트(바이카보네이트), N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-글리신(바이신(bicine)), [비스-(2-하이드록시에틸)-이미노]-트리스-(하이드록시메틸메탄)(비스-트리스), 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판(비스-트리스-프로판), 붕산, 다이메틸아르신산(카코딜레이트), 3-(사이클로헥실아미노)-프로판설폰산(CAPS), 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO), 나트륨 카보네이트(카보네이트), 사이클로헥실아미노에탄설폰산(CHES), 시트르산의 염(시트레이트), 3-[N-비스(하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(DIPSO), 포름산의 염(포르메이트), 글리신, 글리실글리신, N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-에탄설폰산(HEPES), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산(HEPPS, EPPS), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 이미다졸, 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(MOPS), 3-(N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 인산의 염(포스페이트), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), 피리딘, 숙신산의 염(숙시네이트), 3-{[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판설폰산(TAPS), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트라이에탄올아민(TEA), 2-[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-에탄설폰산(TES), N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신(트라이신(tricine)) 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충 용액이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제는 아세트산의 염(아세테이트), 시트르산의 염(시트레이트), 포름산의 염(포르메이트), 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 인산의 염(포스페이트) 및 숙신산의 염(숙시네이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 정용여과 완충제는 시트르산의 염(시트레이트)이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제는 숙신산의 염(숙시네이트)이다. 한 양태에서, 상기 염 나트륨 염이다. 한 양태에서, 상기 염은 칼륨 염이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 4.0 내지 11.0, 약 5.0 내지 10.0, 약 5.5 내지 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 약 6.0 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0 또는 약 6.0 내지 7.5이다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.5, 약 7.0 또는 약 7.5이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 7.0이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 100 mM, 약 0.1 mM 내지 100 mM, 약 0.5 mM 내지 100 mM, 약 1 mM 내지 100 mM, 약 2 mM 내지 100 mM, 약 3 mM 내지 100 mM, 약 4 mM 내지 100 mM, 약 5 mM 내지 100 mM, 약 6 mM 내지 100 mM, 약 7 mM 내지 100 mM, 약 8 mM 내지 100 mM, 약 9 mM 내지 100 mM, 약 10 mM 내지 100 mM, 약 11 mM 내지 100 mM, 약 12 mM 내지 100 mM, 약 13 mM 내지 100 mM, 약 14 mM 내지 100 mM, 약 15 mM 내지 100 mM, 약 16 mM 내지 100 mM, 약 17 mM 내지 100 mM, 약 18 mM 내지 100 mM, 약 19 mM 내지 100 mM, 약 20 mM 내지 100 mM, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 30 mM 내지 100 mM, 약 35 mM 내지 100 mM, 약 40 mM 내지 100 mM, 약 45 mM 내지 100 mM, 약 50 mM 내지 100 mM, 약 55 mM 내지 100 mM, 약 60 mM 내지 100 mM, 약 65 mM 내지 100 mM, 약 70 mM 내지 100 mM, 약 75 mM 내지 100 mM, 약 80 mM 내지 100 mM, 약 85 mM 내지 100 mM, 약 90 mM 내지 100 mM 또는 약 95 mM 내지 100 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 50 mM, 약 0.1 mM 내지 50 mM, 약 0.5 mM 내지 50 mM, 약 1 mM 내지 50 mM, 약 2 mM 내지 50 mM, 약 3 mM 내지 50 mM, 약 4 mM 내지 50 mM, 약 5 mM 내지 50 mM, 약 6 mM 내지 50 mM, 약 7 mM 내지 50 mM, 약 8 mM 내지 50 mM, 약 9 mM 내지 50 mM, 약 10 mM 내지 50 mM, 약 11 mM 내지 50 mM, 약 12 mM 내지 50 mM, 약 13 mM 내지 50 mM, 약 14 mM 내지 50 mM, 약 15 mM 내지 50 mM, 약 16 mM 내지 50 mM, 약 17 mM 내지 50 mM, 약 18 mM 내지 50 mM, 약 19 mM 내지 50 mM, 약 20 mM 내지 50 mM, 약 25 mM 내지 50 mM, 약 30 mM 내지 50 mM, 약 35 mM 내지 50 mM, 약 40 mM 내지 50 mM 또는 약 45 mM 내지 50 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 25 mM, 약 0.1 mM 내지 25 mM, 약 0.5 mM 내지 25 mM, 약 1 mM 내지 25 mM, 약 2 mM 내지 25 mM, 약 3 mM 내지 25 mM, 약 4 mM 내지 25 mM, 약 5 mM 내지 25 mM, 약 6 mM 내지 25 mM, 약 7 mM 내지 25 mM, 약 8 mM 내지 25 mM, 약 9 mM 내지 25 mM, 약 10 mM 내지 25 mM, 약 11 mM 내지 25 mM, 약 12 mM 내지 25 mM, 약 13 mM 내지 25 mM, 약 14 mM 내지 25 mM, 약 15 mM 내지 25 mM, 약 16 mM 내지 25 mM, 약 17 mM 내지 25 mM, 약 18 mM 내지 25 mM, 약 19 mM 내지 25 mM 또는 약 20 mM 내지 25 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 15 mM, 약 0.1 mM 내지 15 mM, 약 0.5 mM 내지 15 mM, 약 1 mM 내지 15 mM, 약 2 mM 내지 15 mM, 약 3 mM 내지 15 mM, 약 4 mM 내지 15 mM, 약 5 mM 내지 15 mM, 약 6 mM 내지 15 mM, 약 7 mM 내지 15 mM, 약 8 mM 내지 15 mM, 약 9 mM 내지 15 mM, 약 10 mM 내지 15 mM, 약 11 mM 내지 15 mM, 약 12 mM 내지 15 mM, 약 13 mM 내지 15 mM 또는 약 14 mM 내지 15 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 10 mM, 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 2 mM 내지 10 mM, 약 3 mM 내지 10 mM, 약 4 mM 내지 10 mM, 약 5 mM 내지 10 mM, 약 6 mM 내지 10 mM, 약 7 mM 내지 10 mM, 약 8 mM 내지 10 mM 또는 약 9 mM 내지 10 mM이다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 10 mM이다.
한 양태에서, 대체 용액은 킬레이트제를 포함한다. 한 양태에서, 대체 용액은 명반 킬레이트제를 포함한다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 에틸렌다이아민-N,N'-다이프로피온산 다이하이드로클로라이드(EDDP), 에틸렌다이아민테트라키스(메틸렌설폰산)(EDTPO), 니트릴로트리스(메틸렌포스폰산)(NTPO), 이미노다이아세트산(IDA), 하이드록시이미노다이아세트산(HIDA), 니트릴로트라이아세트산(NTP), 트라이에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 다이머캅토숙신산(DMSA), 2,3-다이머캅토-1-프로판설폰산(DMPS), α리포산(ALA), 니트릴로트라이아세트산(NTA), 티아민테트라하이드로퓨르퓨르일다이설파이드(TTFD), 다이머캅롤, 페니실아민, 데페록사민(DFOA), 데페라시록스, 포스포네이트, 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA)이다.
일부 양태에서, 킬레이트제는 시트르산의 염(시트레이트)이다. 일부 양태에서, 킬레이트제는 나트륨 시트레이트이다.
일반적으로, 킬레이트제는 1 내지 500 mM의 농도로 사용된다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 2 내지 400 mM이다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 10 내지 400 mM이다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 10 내지 200 mM이다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 10 내지 100 mM이다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 10 내지 50 mM이다. 한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 10 내지 30 mM이다.
한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM이다.
한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM이다.
한 양태에서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충 용액은 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 한 양태에서, 정용여과 완충 용액은 나트륨 클로라이드를 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450 또는 약 500 mM로 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 정용여과 완충 용액은 나트륨 클로라이드를 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250 또는 약 300 mM로 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피(diavolum)는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50이다. 본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100이다. 본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15이다.
본 발명의 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도의 온도에서 수행된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도의 온도에서 수행된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도의 온도에서 수행된다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 한외여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
1.7. 활성탄 여과
용액이 상기 1.2 부분의 응집 단계에 의해 처리된 후, 다당류-함유 용액은 활성탄 여과 단계에 의해 임의적으로 추가 청징될 수 있다.
한 양태에서, 1.3 부분의 고체/액체 분리 단계에 의해 추가 처리된 1.2 부분의 용액(예컨대 상청액)은 활성탄 여과 단계에 의해 추가 청징된다. 한 양태에서, 상기 1.4 부분의 임의의 방법에 의하고/거나 상기 1.5 부분의 여과 단계에 의해 추가 여과된 용액은 활성탄 여과 단계에 의해 추가 청징된다. 한 양태에서, 상기 1.6 부분의 한외여과 및/또는 정용여과 단계에 의해 추가 청징된 용액은 활성탄 여과 단계에 의해 추가 청징된다.
활성탄 여과는 숙주 세포 불순물, 예컨대 단백질 및 핵산, 및 착색된 불순물이 추가로 제거되게 한다(WO 2008/118752).
한 양태에서, 활성탄(활성 차콜(charcoal)로도 지칭됨)은 대부분의 단백질 및 핵산 오염물을 흡착하기에 충분한 양으로 용액에 첨가된 후, 상기 오염물이 활성탄에 흡착된 후 제거된다. 한 양태에서, 활성탄은 약 0.1 내지 20%(중량 부피), 1 내지 15%(중량 부피), 1 내지 10%(중량 부피), 2 내지 10%(중량 부피), 3 내지 10%(중량 부피), 4 내지 10%(중량 부피), 5 내지 10%(중량 부피), 1 내지 5%(중량 부피) 또는 2 내지 5%(중량 부피)의 양으로 첨가된다. 이어서, 혼합물은 교반되어 방치된다. 한 양태에서, 혼합물은 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240분 또는 그 이상 동안 방치된다. 이어서, 활성탄은 제거된다. 활성탄은 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다.
바람직한 양태에서, 용액은 매트릭스 중 부동화된 활성탄을 통해 여과된다. 매트릭스는 용액에 대해 투과성인 임의의 다공성 필터 매질일 수 있다. 매트릭스는 지지 물질 및/또는 결합제 물질을 포함할 수 있다. 지지 물질은 합성 중합체 또는 천연 유래 중합체일 수 있다. 적합한 합성 중합체는 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 및 폴리메틸메트아크릴레이트를 포함할 수 있고, 천연 유래 중합체는 셀룰로스, 다당류, 덱스트란 및 아가로스를 포함할 수 있다. 전형적으로, 중합체 지지 물질은 역학적 강성을 제공하는 섬유 네트워크 형태이다. 매트릭스는 막 시트 형태일 수 있다. 한 양태에서, 매트릭스 중 부동화된 활성탄은 유동-통과 탄소 카트리지 형태이다. 카트리지는 매트릭스 중 부동화된 분말 활성탄을 함유하는 자체-함유 일체이고 막 시트의 형태로 제조된다. 막 시트는 플라스틱 투과성 지지체에 포획되어 디스크를 형성할 수 있다.
다르게는, 막 시트는 나선형으로 꼬일 수 있다. 필터 표면적을 증가시키기 위해, 몇몇 디스크는 서로 적층될 수 있다. 특히, 서로 적층된 디스크는 필터로부터 탄소-처리된 샘플을 수집 및 제거하기 위한 중심 코어 파이프를 가진다. 적층된 디스크의 형태는 렌즈형일 수 있다.
탄소 필터에서, 활성탄은 상이한 원료, 예컨대 이탄, 갈탄, 목재 또는 코코넛 껍질로부터 유래할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 방법, 예컨대 증기 또는 화학 처리가 탄소를 활성화시키는데 사용될 수 있다(예컨대 목재-기반 인산-활성탄).
본 발명에서, 매트릭스에 부동화된 활성탄은 하우징(housing) 내에 위치되어 독립적인 필터 단위를 형성할 수 있다. 각각의 필터 단위는 정제되는 용액을 위한 이 자체의 입구부 및 출구부를 가진다. 본 발명에 사용가능한 필터 단위의 예는 쿠노 인코포레이티드(Cuno Inc.)(미국 코네티컷주 메리덴) 또는 팔 코포레이션(Pall Corporation)(미국 오레건주 이스트 힐)로부터의 탄소 카트리지이다. 특히, 쿠노(CUNO) 제타탄소 필터가 본 발명에 적합하다. 이러한 탄소 필터는 활성탄 분말이 포획되고 그 자리에서 수지-결합되는 셀룰로스 매트릭스를 포함한다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 100 μm, 약 0.05 내지 100 μm, 약 0.1 내지 100 μm, 약 0.2 내지 100 μm, 약 0.3 내지 100 μm, 약 0.4 내지 100 μm, 약 0.5 내지 100 μm, 약 0.6 내지 100 μm, 약 0.7 내지 100 μm, 약 0.8 내지 100 μm, 약 0.9 내지 100 μm, 약 1 내지 100 μm, 약 1.25 내지 100 μm, 약 1.5 내지 100 μm, 약 1.75 내지 100 μm, 약 2 내지 100 μm, 약 3 내지 100 μm, 약 4 내지 100 μm, 약 5 내지 100 μm, 약 6 내지 100 μm, 약 7 내지 100 μm, 약 8 내지 100 μm, 약 9 내지 100 μm, 약 10 내지 100 μm, 약 15 내지 100 μm, 약 20 내지 100 μm, 약 25 내지 100 μm, 약 30 내지 100 μm, 약 40 내지 100 μm, 약 50 내지 100 μm 또는 약 75 내지 100 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 50 μm, 약 0.05 내지 50 μm, 약 0.1 내지 50 μm, 약 0.2 내지 50 μm, 약 0.3 내지 50 μm, 약 0.4 내지 50 μm, 약 0.5 내지 50 μm, 약 0.6 내지 50 μm, 약 0.7 내지 50 μm, 약 0.8 내지 50 μm, 약 0.9 내지 50 μm, 약 1 내지 50 μm, 약 1.25 내지 50 μm, 약 1.5 내지 50 μm, 약 1.75 내지 50 μm, 약 2 내지 50 μm, 약 3 내지 50 μm, 약 4 내지 50 μm, 약 5 내지 50 μm, 약 6 내지 50 μm, 약 7 내지 50 μm, 약 8 내지 50 μm, 약 9 내지 50 μm, 약 10 내지 50 μm, 약 15 내지 50 μm, 약 20 내지 50 μm, 약 25 내지 50 μm, 약 30 내지 50 μm, 약 40 내지 50 μm 또는 약 50 내지 50 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 25 μm, 약 0.05 내지 25 μm, 약 0.1 내지 25 μm, 약 0.2 내지 25 μm, 약 0.3 내지 25 μm, 약 0.4 내지 25 μm, 약 0.5 내지 25 μm, 약 0.6 내지 25 μm, 약 0.7 내지 25 μm, 약 0.8 내지 25 μm, 약 0.9 내지 25 μm, 약 1 내지 25 μm, 약 1.25 내지 25 μm, 약 1.5 내지 25 μm, 약 1.75 내지 25 μm, 약 2 내지 25 μm, 약 3 내지 25 μm, 약 4 내지 25 μm, 약 5 내지 25 μm, 약 6 내지 25 μm, 약 7 내지 25 μm, 약 8 내지 25 μm, 약 9 내지 25 μm, 약 10 내지 25 μm, 약 15 내지 25 μm 또는 약 20 내지 25 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 10 μm, 약 0.05 내지 10 μm, 약 0.1 내지 10 μm, 약 0.2 내지 10 μm, 약 0.3 내지 10 μm, 약 0.4 내지 10 μm, 약 0.5 내지 10 μm, 약 0.6 내지 10 μm, 약 0.7 내지 10 μm, 약 0.8 내지 10 μm, 약 0.9 내지 10 μm, 약 1 내지 10 μm, 약 1.25 내지 10 μm, 약 1.5 내지 10 μm, 약 1.75 내지 10 μm, 약 2 내지 10 μm, 약 3 내지 10 μm, 약 4 내지 10 μm, 약 5 내지 10 μm, 약 6 내지 10 μm, 약 7 내지 10 μm, 약 8 내지 10 μm 또는 약 9 내지 10 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 8 μm, 약 0.05 내지 8 μm, 약 0.1 내지 8 μm, 약 0.2 내지 8 μm, 약 0.3 내지 8 μm, 약 0.4 내지 8 μm, 약 0.5 내지 8 μm, 약 0.6 내지 8 μm, 약 0.7 내지 8 μm, 약 0.8 내지 8 μm, 약 0.9 내지 8 μm, 약 1 내지 8 μm, 약 1.25 내지 8 μm, 약 1.5 내지 8 μm, 약 1.75 내지 8 μm, 약 2 내지 8 μm, 약 3 내지 8 μm, 약 4 내지 8 μm, 약 5 내지 8 μm, 약 6 내지 8 μm 또는 약 7 내지 8 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 5 μm, 약 0.05 내지 5 μm, 약 0.1 내지 5 μm, 약 0.2 내지 5 μm, 약 0.3 내지 5 μm, 약 0.4 내지 5 μm, 약 0.5 내지 5 μm, 약 0.6 내지 5 μm, 약 0.7 내지 5 μm, 약 0.8 내지 5 μm, 약 0.9 내지 5 μm, 약 1 내지 5 μm, 약 1.25 내지 5 μm, 약 1.5 내지 5 μm, 약 1.75 내지 5 μm, 약 2 내지 5 μm, 약 3 내지 5 μm 또는 약 4 내지 5 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 약 1.75 내지 2 μm, 약 2 내지 2 μm, 약 3 내지 2 μm 또는 약 4 내지 2 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
한 양태에서, 상기 개시된 활성화 탄소 필터는 약 0.05 내지 50 μm, 0.1 내지 25 μm 0.2 내지 10, μm 0.1 내지 10 μm, 0.2 내지 5 μm 또는 0.25 내지 1 μm의 공칭 μm 등급을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 500 LMH, 10 내지 500 LMH, 15 내지 500 LMH, 20 내지 500 LMH, 25 내지 500 LMH, 30 내지 500 LMH, 40 내지 500 LMH, 50 내지 500 LMH, 100 내지 500 LMH, 125 내지 500 LMH, 150 내지 500 LMH, 200 내지 500 LMH, 250 내지 500 LMH, 300 내지 500 LMH 또는 400 내지 500 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 200 LMH, 10 내지 200 LMH, 15 내지 200 LMH, 20 내지 200 LMH, 25 내지 200 LMH, 30 내지 200 LMH, 40 내지 200 LMH, 50 내지 200 LMH, 100 내지 200 LMH, 125 내지 200 LMH 또는 150 내지 200 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 150 LMH, 10 내지 150 LMH, 15 내지 150 LMH, 20 내지 150 LMH, 25 내지 150 LMH, 30 내지 150 LMH, 40 내지 150 LMH, 50 내지 150 LMH, 100 내지 150 LMH 또는 125 내지 150 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 100 LMH, 10 내지 100 LMH, 15 내지 100 LMH, 20 내지 100 LMH, 25 내지 100 LMH, 30 내지 100 LMH, 40 내지 100 LMH 또는 50 내지 100 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 75 LMH, 5 내지 75 LMH, 10 내지 75 LMH, 15 내지 75 LMH, 20 내지 75 LMH, 25 내지 75 LMH, 30 내지 75 LMH, 35 내지 75 LMH, 40 내지 75 LMH, 45 내지 75 LMH, 50 내지 75 LMH, 55 내지 75 LMH, 60 내지 75 LMH, 65 내지 75 LMH 또는 70 내지 75 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 1 내지 50 LMH, 5 내지 50 LMH, 7 내지 50 LMH, 10 내지 50 LMH, 15 내지 50 LMH, 20 내지 50 LMH, 25 내지 50 LMH, 30 내지 50 LMH, 35 내지 50 LMH, 40 내지 50 LMH 또는 45 내지 50 LMH의 공급 속도로 수행된다,
상기 임의의 범위 내의 전체 정수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 225, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 950 또는 약 1000 LMH의 공급 속도로 수행된다.
한 양태에서, 용액은 활성탄 필터에 의해 처리되되, 상기 필터는 5 내지 1000 L/m2, 10 내지 750 L/m2, 15 내지 500 L/m2, 20 내지 400 L/m2, 25 내지 300 L/m2, 30 내지 250 L/m2, 40 내지 200 L/m2 또는 30 내지 100 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 활성탄 필터에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
최초 활성탄 여과 단계 후, 오염물 함량이 고정 한계값을 초과하는 경우, 상기 단계는 반복될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 활성탄 여과 단계가 수행된다. 본 발명의 한 양태에서, 1, 2 또는 3회의 활성탄 여과 단계가 수행된다. 본 발명의 한 양태에서, 1 또는 2회의 활성탄 여과 단계가 수행된다.
한 양태에서, 용액은 일련의 활성탄 필터에 의해 처리된다. 한 양태에서, 용액은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다. 한 양태에서, 용액은 2, 3, 4 또는 5개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다. 한 양태에서, 용액은 2개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다. 한 양태에서, 용액은 3개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다. 한 양태에서, 용액은 4개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다. 한 양태에서, 용액은 5개의 일련의 활성탄 필터로 처리된다.
한 양태에서, 활성탄 여과 단계는 단일 경로 모드로 수행된다.
또 다른 양태에서 활성탄 여과 단계는 재순환 모드로 수행된다. 상기 양태(재순환 모드)에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 사이클의 활성탄 여과가 수행된다. 또 다른 양태에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 사이클의 활성탄 여과가 수행된다. 한 양태에서, 2 또는 3 사이클의 활성탄 여과가 수행된다. 한 양태에서, 2 사이클의 활성탄 여과가 수행된다.
1.8. 임의적인 추가 여과
용액이 상기 1.7 부분의 활성탄 단계에 의해 처리된 후, 수득된 용액(즉 여과물)은 임의적으로 추가 여과될 수 있다. 한 양태에서, 용액은 마이크로여과된다. 한 양태에서, 마이크로여과는 데드-엔드여과(수직 여과)이다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.45 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 또는 약 1.75 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.45 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2.0 μm의 공칭 보유 등급을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 0.2 μm의 공칭 보유 등급을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 6000 L/m2, 200 내지 6000 L/m2, 300 내지 6000 L/m2, 400 내지 6000 L/m2, 500 내지 6000 L/m2, 750 내지 6000 L/m2, 1000 내지 6000 L/m2, 1500 내지 6000 L/m2, 2000 내지 6000 L/m2, 3000 내지 6000 L/m2 또는 4000 내지 6000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 4000 L/m2, 200 내지 4000 L/m2, 300 내지 4000 L/m2, 400 내지 4000 L/m2, 500 내지 4000 L/m2, 750 내지 4000 L/m2, 1000 내지 4000 L/m2, 1500 내지 4000 L/m2, 2000 내지 4000 L/m2, 2500 내지 4000 L/m2, 3000 내지 4000 L/m2, 3000 내지 4000 L/m2 또는 3500 내지 4000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 3750 L/m2, 200 내지 3750 L/m2, 300 내지 3750 L/m2, 400 내지 3750 L/m2, 500 내지 3750 L/m2, 750 내지 3750 L/m2, 1000 내지 3750 L/m2, 1500 내지 3750 L/m2, 2000 내지 3750 L/m2, 2500 내지 3750 L/m2, 3000 내지 3750 L/m2, 3000 내지 3750 L/m2 또는 3500 내지 3750 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 100 내지 1250 L/m2, 200 내지 1250 L/m2, 300 내지 1250 L/m2, 400 내지 1250 L/m2, 500 내지 1250 L/m2, 750 내지 1250 L/m2 또는 1000 내지 1250 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3100, 약 3200, 약 3300, 약 3400, 약 3500, 약 3600, 약 3700, 약 3800, 약 3900, 약 4000, 약 4100, 약 4200, 약 4300, 약 4400, 약 4500, 약 4600, 약 4700, 약 4800, 약 4900, 약 5000, 약 5250, 약 5500, 약 5750 또는 약 6000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
1.9. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 단위 조작은 선행 정제 단계로부터 남겨진 소수성 특징을 갖는 임의의 불순물, 예컨대 잔류성 지질 다당류(내독소)를 제거한다.
용액이 상기 1.2 부분의 응집 단계에 의해 처리된 후, 다당류를 함유하는 용액은 임의적으로 HIC 단계에 의해 추가 정제될 수 있다.
한 양태에서, 1.3 부분의 고체/액체 분리 단계에 의해 추가 처리된 1.2 부분의 용액(예컨대 상청액)은 HIC 단계에 의해 추가 정제된다. 한 양태에서, 상기 1.5 부분의 임의의 방법에 의해 및/또는 상기 1.4 부분의 여과 단계에 의해 추가 여과된 용액은 HIC 단계에 의해 추가 정제된다. 한 양태에서, 상기 1.6 부분의 한외여과 및/또는 정용여과 단계에 의해 추가 정제화(clarifying)된 용액은 HIC 단계에 의해 추가 정제된다. 한 양태에서, 1.7 부분의 활성탄 여과 단계에 의해 추가 정제화된 용액은 HIC 단계에 의해 추가 정제된다.
한 양태에서, 상기 1.6 부분의 한외여과 및/또는 정용여과 단계에 의해 추가 정제화된 용액은 이온교환(IEX) 막 여과 단계에 의해 추가 정제된 후, HIC 단계에 의해 추가 정제될 수 있다.
한 양태에서, HIC 단계는 비제한적으로 페닐 막, 부틸-, 페닐-, 및 옥틸-아가로스, 부틸-, 페닐-, 에터-, 폴리프로필렌글리콜- 및 헥실- 유기 중합체 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 수소성 흡착제를 사용하여 수행된다.
한 양태에서, HIC 단계에서 사용되는 소수성 흡착제는 페닐 막, 예컨대 사르토바인드(SARTOBIND) 페닐 막 또는 시티바(CYTIVA) 페닐 흡착제 막이다.
한 양태에서, HIC 단계에서 사용되는 소수성 흡착제는 사르토바인드 페닐 막이다.
한 양태에서, 선행 단계로부터의 물질(예컨대 탄소 여과물)은 평형 완충액에 의해 처리되어 정제된 물질 및 목적하는 염 농도를 포함하는 전개(running) 완충액이 수득된다. 한 양태에서, 평형 완충액은 염, 및 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9 및 약 7.0 M으로부터 선택되는 (즉 전개 완충액 중) 최종 염 농도를 포함한다. 한 양태에서, 전개 완충액의 pH는 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0이다. 한 양태에서, 평형 완충액은 암모늄 설페이트(바람직하게는 0.5 M 내지 3.0 M 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 6.0±2.0), 나트륨 포스페이트(바람직하게는 0.5 M 내지 3.0 M의 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 7.0±1.5), 칼륨 포스페이트(바람직하게는 0.5 M 내지 3.0 M의 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 7.0±1.5), 나트륨 설페이트(바람직하게는 0.1 M 내지 0.75 M의 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 6.0±2.0), 나트륨 시트레이트(바람직하게는 0.1 M 내지 1.5 M의 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 6.0±2.0) 또는 나트륨 클로라이드(바람직하게는 0.5 M 내지 5.0 M의 전개 완충액 중 최종 농도 및 pH 7.0±1.5)로부터 선택되는 염을 포함한다.
한 양태에서, 평형 완충액은 암모늄 설페이트를 포함하고, 전개 완충액 중 최종 염 농도는 약 1.0 M 내지 약 2.0 M(바람직하게는 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0 M)로 구성된다.
한 양태에서, 소수성 흡착제는 전개 완충액, 및 상기 전개 완충액 중 정제될 물질을 사용하여 평형화된 후, 컬럼 또는 막을 통해 전개된다.
한 양태에서, 소수성 흡착제는 페닐 막이고, 유속은 약 0.1 내지 약 20 막 부피/분, 약 0.1 내지 약 10 막 부피/분, 약 0.2 내지 약 10 막 부피/분, 약 0.2 내지 약 5 막 부피/분, 약 0.1 내지 약 1 막 부피/분으로 구성된다. 한 양태에서, 소수성 흡착제는 페닐 막이고, 유속은 약 0.1 내지 약 1.0 막 부피/분, 바람직하게는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9 또는 약 1.0 막 부피/분으로 구성된다.
한 양태에서, 이어서, HIC 막은 전개 완충액에 의해 헹구어지고, 또한, 물에 의해 추가 세척될 수 있다. 완충액 헹굼에 따른 배수액 전반의 유동물(flow)은 HIC 여과물로서 수집되고, 물 세척액도 분석을 위해 수집된다.
1.10. 한외여과 / 정용여과
용액이 상기 1.9 부분의 HIC 단계에 의해 및/또는 상기 1.8 부분의 추가 여과 단계로 처리되면, 수득된 용액(즉 여과물)은 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 임의적으로 추가 청징될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 용액(예컨대 상기 1.9 또는 1.8 부분에서 수득됨)은 한외여과에 의해 처리된다.
한 양태에서, 용액은 한외여과에 의해 처리되고 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 1000 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 750 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 500 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 300 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 100 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 50 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 10 kDa 내지 30 kDa이다. 한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 1000 kDa, 약 10 kDa 내지 1000 kDa 약 20 kDa 내지 1000 kDa, 약 30 kDa 내지 1000 kDa, 약 40 kDa 내지 1000 kDa, 약 50 kDa 내지 1000 kDa, 약 75 kDa 내지 1000 kDa, 약 100 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 200 kDa 내지 1000 kDa, 약 300 kDa 내지 1000 kDa, 약 400 kDa 내지 1000 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa 또는 약 750 kDa 내지 1000 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 500 kDa, 약 10 kDa 내지 500 kDa, 약 20 kDa 내지 500 kDa, 약 30 kDa 내지 500 kDa, 약 40 kDa 내지 500 kDa, 약 50 kDa 내지 500 kDa, 약 75 kDa 내지 500 kDa, 약 100 kDa 내지 500 kDa, 약 150 kDa 내지 500 kDa, 약 200 kDa 내지 500 kDa, 약 300 kDa 내지 500 kDa 또는 약 400 kDa 내지 500 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 300 kDa, 약 10 kDa 내지 300 kDa, 약 20 kDa 내지 300 kDa, 약 30 kDa 내지 300 kDa, 약 40 kDa 내지 300 kDa, 약 50 kDa 내지 300 kDa, 약 75 kDa 내지 300 kDa, 약 100 kDa 내지 300 kDa, 약 150 kDa 내지 300 kDa 또는 약 200 kDa 내지 300 kDa이다.
한 양태에서, 막의 MWCO는 약 5 kDa 내지 100 kDa, 약 10 kDa 내지 100 kDa, 약 20 kDa 내지 100 kDa, 약 30 kDa 내지 100 kDa, 약 40 kDa 내지 100 kDa, 약 50 kDa 내지 100 kDa 또는 약 75 kDa 내지 100 kDa이다.
한 양태에서, 막의 컷 오프 분자량은 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 750 kDa 또는 약 1000 kDa이다.
한 양태에서, 한여여과 단계의 농축 계수는 약 1.5 내지 약 10.0이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2.0 내지 약 8.0이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2.0 내지 약 5.0이다.
한 양태에서, 농축 계수는 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0이다. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 5.0, 또는 약 6.0이다.
본 발명의 한 양태에서, 용액(예컨대 상기 1.9 또는 1.8 부분에서 수득된 여과물)은 정용여과에 의해 처리된다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 개시된 한외여과(UF) 후 수득된 용액은 정용여과에 의해 추가 처리된다(UF/DF 처리).
정용여과(DF)는 목적하는 완충 용액(또는 단지 물) 내로 생성물을 교환하는데 사용된다. 한 양태에서, 정용여과는 일정 부피하에 보유된 용액의 화학적 특성을 변화시키는데 사용된다. 원치않는 입자는 막을 통과하는 한편, 공급 스트림을 이루는 나머지는 대체 용액(완충 용액, 염수 용액, 완충 염수 용액 또는 물)의 첨가를 통해 보다 더 바람직한 상태로 변화된다.
한 양태에서, 대체 용액은 물이다. 한 양태에서, 대체 용액은 물 중 염수이다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 한 양태에서, 대체 용액은 한 양태에서, 대체 용액은 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450 또는 약 500 mM의 나트륨 클로라이드이다. 하나의 특정 양태에서, 대체 용액은 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250 또는 약 300 mM의 나트륨 클로라이드이다. 하나의 특정 양태에서, 대체 용액은 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90 또는 약 100 mM의 나트륨 클로라이드이다.
한 양태에서, 대체 용액은 완충 용액이다. 한 양태에서, 대체 용액은 완충 용액이되, 완충제는 N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산(ACES), 아세트산의 염(아세테이트), N-(2-아세트아미도)-이미노다이아세트산(ADA), 2-아미노에탄설폰산(AES, 타우린), 암모니아, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP), 2-아미노-2-메틸 내지 1,3-프로판다이올(AMPD), 암메다이올, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(AMPSO), N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 나트륨 수소 카보네이트(바이카보네이트), N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-글리신(바이신), [비스-(2-하이드록시에틸)-이미노]-트리스-(하이드록시메틸메탄)(비스-트리스), 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판(비스-트리스-프로판), 붕산, 다이메틸아르신산(카코딜레이트), 3-(사이클로헥실아미노)-프로판설폰산(CAPS), 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO), 나트륨 카보네이트(카보네이트), 사이클로헥실아미노에탄설폰산(CHES), 시트르산의 염(시트레이트), 3-[N-비스(하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(DIPSO), 포름산의 염(포르메이트), 글리신, 글리실글리신, N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-에탄설폰산(HEPES), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산(HEPPS, EPPS), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 이미다졸, 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(MOPS), 3-(N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 인산의 염(포스페이트), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), 피리딘, 숙신산의 염(숙시네이트), 3-{[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판설폰산(TAPS), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트라이에탄올아민(TEA), 2-[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-에탄설폰산(TES), N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신(트라이신) 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 정용여과 완충제는 아세트산의 염(아세테이트), 시트르산의 염(시트레이트), 포름산의 염(포르메이트), 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 인산의 염(포스페이트) 및 숙신산의 염(숙시네이트)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 정용여과 완충제는 시트르산의 염(시트레이트)이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제는 숙신산의 염(숙시네이트)이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제는 인산의 염(포스페이트)이다. 한 양태에서, 상기 염은 나트륨 염이다. 한 양태에서, 상기 염은 칼륨 염이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 4.0 내지 11.0, 약 5.0 내지 10.0, 약 5.5 내지 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 약 6.0 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0 또는 약 6.0 내지 7.5이다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.5, 약 7.0 또는 약 7.5이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.0. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.5이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 pH는 약 7.0이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 100 mM, 약 0.1 mM 내지 100 mM, 약 0.5 mM 내지 100 mM, 약 1 mM 내지 100 mM, 약 2 mM 내지 100 mM, 약 3 mM 내지 100 mM, 약 4 mM 내지 100 mM, 약 5 mM 내지 100 mM, 약 6 mM 내지 100 mM, 약 7 mM 내지 100 mM, 약 8 mM 내지 100 mM, 약 9 mM 내지 100 mM, 약 10 mM 내지 100 mM, 약 11 mM 내지 100 mM, 약 12 mM 내지 100 mM, 약 13 mM 내지 100 mM, 약 14 mM 내지 100 mM, 약 15 mM 내지 100 mM, 약 16 mM 내지 100 mM, 약 17 mM 내지 100 mM, 약 18 mM 내지 100 mM, 약 19 mM 내지 100 mM, 약 20 mM 내지 100 mM, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 30 mM 내지 100 mM, 약 35 mM 내지 100 mM, 약 40 mM 내지 100 mM, 약 45 mM 내지 100 mM, 약 50 mM 내지 100 mM, 약 55 mM 내지 100 mM, 약 60 mM 내지 100 mM, 약 65 mM 내지 100 mM, 약 70 mM 내지 100 mM, 약 75 mM 내지 100 mM, 약 80 mM 내지 100 mM, 약 85 mM 내지 100 mM, 약 90 mM 내지 100 mM 또는 약 95 mM 내지 100 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 50 mM, 약 0.1 mM 내지 50 mM, 약 0.5 mM 내지 50 mM, 약 1 mM 내지 50 mM, 약 2 mM 내지 50 mM, 약 3 mM 내지 50 mM, 약 4 mM 내지 50 mM, 약 5 mM 내지 50 mM, 약 6 mM 내지 50 mM, 약 7 mM 내지 50 mM, 약 8 mM 내지 50 mM, 약 9 mM 내지 50 mM, 약 10 mM 내지 50 mM, 약 11 mM 내지 50 mM, 약 12 mM 내지 50 mM, 약 13 mM 내지 50 mM, 약 14 mM 내지 50 mM, 약 15 mM 내지 50 mM, 약 16 mM 내지 50 mM, 약 17 mM 내지 50 mM, 약 18 mM 내지 50 mM, 약 19 mM 내지 50 mM, 약 20 mM 내지 50 mM, 약 25 mM 내지 50 mM, 약 30 mM 내지 50 mM, 약 35 mM 내지 50 mM, 약 40 mM 내지 50 mM 또는 약 45 mM 내지 50 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 25 mM, 약 0.1 mM 내지 25 mM, 약 0.5 mM 내지 25 mM, 약 1 mM 내지 25 mM, 약 2 mM 내지 25 mM, 약 3 mM 내지 25 mM, 약 4 mM 내지 25 mM, 약 5 mM 내지 25 mM, 약 6 mM 내지 25 mM, 약 7 mM 내지 25 mM, 약 8 mM 내지 25 mM, 약 9 mM 내지 25 mM, 약 10 mM 내지 25 mM, 약 11 mM 내지 25 mM, 약 12 mM 내지 25 mM, 약 13 mM 내지 25 mM, 약 14 mM 내지 25 mM, 약 15 mM 내지 25 mM, 약 16 mM 내지 25 mM, 약 17 mM 내지 25 mM, 약 18 mM 내지 25 mM, 약 19 mM 내지 25 mM 또는 약 20 mM 내지 25 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 15 mM, 약 0.1 mM 내지 15 mM, 약 0.5 mM 내지 15 mM, 약 1 mM 내지 15 mM, 약 2 mM 내지 15 mM, 약 3 mM 내지 15 mM, 약 4 mM 내지 15 mM, 약 5 mM 내지 15 mM, 약 6 mM 내지 15 mM, 약 7 mM 내지 15 mM, 약 8 mM 내지 15 mM, 약 9 mM 내지 15 mM, 약 10 mM 내지 15 mM, 약 11 mM 내지 15 mM, 약 12 mM 내지 15 mM, 약 13 mM 내지 15 mM 또는 약 14 mM 내지 15 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM 내지 10 mM, 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 2 mM 내지 10 mM, 약 3 mM 내지 10 mM, 약 4 mM 내지 10 mM, 약 5 mM 내지 10 mM, 약 6 mM 내지 10 mM, 약 7 mM 내지 10 mM, 약 8 mM 내지 10 mM 또는 약 9 mM 내지 10 mM이다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 30 mM이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 25 mM이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 20 mM이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 15 mM이다. 한 양태에서, 정용여과 완충제의 농도는 약 10 mM이다.
한 양태에서, 정용여과 완충 용액은 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 하나의 특정 양태에서, 정용여과 완충 용액은 나트륨 클로라이드를 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250 또는 약 300 mM로 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50이다. 본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100이다. 본 발명의 한 양태에서, 정용여과 부피는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15이다.
본 발명의 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 및 정용여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 정용여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 정용여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다. 상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 한외여과 단계는 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행된다. 한 양태에서, 한외여과 단계는 약 50℃의 온도에서 수행된다.
1.11. 균질화 / 사이징 (sizing)
다당류는 정제 절차 동안 크기가 약간 감소될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 다당류의 정제된 용액(예컨대 1.10 부분의 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 수득됨)은 사이징되지 않는다.
한 양태에서, 다당류는 사이징 기법에 의해 균질화될 수 있다. 기계적 또는 화학적 사이징이 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 예컨대 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 사이징은 고압 균질화 전단을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 1.10 부분의 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 수득된 다당류의 정제된 용액은 표적 분자량으로 사이징된다.
본원에 사용된 용어 다당류의 "분자량"은 예컨대 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 다각도 레이저 광 산란 검출(MALLS)의 조합에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.
일부 양태에서, 정제된 다당류는 약 5 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징된다. 다른 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 약 10 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징된다. 다른 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 약 50 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징된다. 추가의 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 약 50 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 750 kDa; 약 50 kDa 내지 약 500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 750 kDa; 약 100 kDa 내지 약 500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 750 kDa; 또는 약 200 kDa 내지 약 500 kDa의 분자량으로 사이징된다. 추가의 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 약 250 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 750 kDa; 약 250 kDa 내지 약 500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 750 kDa; 약 300 kDa 내지 약 500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 750 kDa; 또는 약 500 kDa 내지 약 600 kDa의 분자량으로 사이징된다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
일부 양태에서, 정제된 다당류는 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 약 35 kDa, 약 40 kDa, 약 45 kDa, 약 50 kDa, 약 75 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 350 kDa, 약 400 kDa, 약 450 kDa, 약 500 kDa, 약 550 kDa, 약 600 kDa, 약 650 kDa, 약 700 kDa, 약 750 kDa, 약 800 kDa, 약 850 kDa, 약 900 kDa, 약 950 kDa, 약 1000 kDa, 약 1250 kDa, 약 1500 kDa, 약 1750 kDa, 약 2000 kDa, 약 2250 kDa, 약 2500 kDa, 약 2750 kDa, 약 3000 kDa, 약 3250 kDa, 약 3500 kDa, 약 3750 kDa 또는 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징된다.
바람직한 양태에서, 정제된 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니에의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F로부터의 캡슐 다당류이되, 상기 캡슐 다당류는 본원에 전술된 범위 중 하나에 속하거나 이의 대략적인 크기의 분자량을 가진다.
1.12. 멸균여과
한 양태에서, 본 발명의 다당류의 정제된 용액은 멸균여과된다.
따라서, 한 양태에서, 임의적으로, 1.10 부분의 한외여과 및/또는 정용여과 단계에 멸균여과 단계가 이어질 수 있다.
한 양태에서, 수행되는 경우, 1.11 부분의 균질화/사이징 단계에 멸균여과 단계가 이어질 수 있다.
한 양태에서, 임의적으로, 1.2 내지 1.9 부분의 임의의 단계에 멸균여과 단계가 이어질 수 있다.
한 양태에서, 멸균여과는 데드-엔드 여과(수직 여과)이다. 한 양태에서, 멸균여과는 접선 여과이다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 0.01 내지 0.2 μm, 약 0.05 내지 0.2 μm, 약 0.1 내지 0.2 μm 또는 약 0.15 내지 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
임의의 상기 범위 내의 임의의 전체 정수는 본 발명의 양태로서 고려된다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 0.05, 약 0.1, 약 0.15 또는 약 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 25 내지 1500 L/m2, 50 내지 1500 L/m2, 75 내지 1500 L/m2, 100 내지 1500 L/m2, 150 내지 1500 L/m2, 200 내지 1500 L/m2, 250 내지 1500 L/m2, 300 내지 1500 L/m2, 350 내지 1500 L/m2, 400 내지 1500 L/m2, 500 내지 1500 L/m2, 750 내지 1500 L/m2, 1000 내지 1500 L/m2 또는 1250 내지 1500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 25 내지 1000 L/m2, 50 내지 1000 L/m2, 75 내지 1000 L/m2, 100 내지 1000 L/m2, 150 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 250 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 350 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 25 내지 500 L/m2, 50 내지 500 L/m2, 75 내지 500 L/m2, 100 내지 500 L/m2, 150 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 250 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2, 350 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 25 내지 300 L/m2, 50 내지 300 L/m2, 75 내지 300 L/m2, 100 내지 300 L/m2, 150 내지 300 L/m2, 200 내지 300 L/m2 또는 250 내지 300 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 25 내지 250 L/m2, 50 내지 250 L/m2, 75 내지 250 L/m2, 100 내지 250 L/m2 또는 150 내지 250 L/m2, 200 내지 250 L/m2의 필터 용량을 가진다.
한 양태에서, 용액은 멸균여과 단계에 의해 처리되되, 상기 필터는 25 내지 100 L/m2, 50 내지 100 L/m2 또는 75 내지 100 L/m2의 필터 용량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
한 양태에서, 용액은 마이크로여과 단계에 의해 처리되되, 필터는 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400 또는 약 1500 L/m2의 필터 용량을 가진다.
1.13. 최종 물질
다당류는 최종적으로 액상 용액으로서 제조될 수 있다. 다당류는 추가 가공(예컨대 건조 분말로서 동결건조, WO 2006/110381 참고)될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 다당류는 건조 분말이다. 한 양태에서, 다당류는 동결건조 케이크이다.
2. 정제된 다당류의 용도
본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류는 항원으로서 사용될 수 있다. 그대로의 다당류는 백신에서 항원으로서 사용된다(23가 미접합 폐렴구균 다당류 백신 뉴모백스(Pneumovax) 참고).
본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류는 또한 당접합체를 수득하기 위해 담체 단백질에 접합될 수 있다.
2.1. 당접합체
본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류는 당접합체를 수득하기 위해 담체 단백질에 접합될 수 있다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "당접합체"는 담체 단백질에 공유결합된 당류를 지칭한다. 한 양태에서, 당류는 담체 단백질에 직접 결합된다. 제2의 양태에서, 당류는 스페이서(spacer)/링커(linker)를 통해 담체 단백질에 결합된다.
일반적으로, 담체에 대한 당류의 공유 접합은 당류의 면역원성을 증대시키는데, 이는 당류를 T-독립성 항원에서 T-의존성 항원으로 전환시켜, 면역적 기억을 위한 밑바탕이 되게 한다. 접합은 소아용 백신에 특히 유용하다.
본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류는 (예컨대 링커에 의하거나 직접적으로 담체 단백질에 의해) 반응한 후, 본원에 추가로 기재된 당접합체에 혼입되도록 활성화(예컨대 화학적으로 활성화)될 수 있다.
정제된 다당류는 예컨대 상기 1.11 부분에 개시된 방법에 의한 접합 전 표적 분자량으로 사이징될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 정제된 다당류는 접합 전 사이징된다. 한 양태에서, 본원에 개시된 정제된 다당류는 접합 전 사이징되어 올리고당이 수득될 수 있다. 올리고당은 적은 수의 반복 단위(전형적으로 5 내지 15개의 반복 단위)를 갖고, 전형적으로, 다당류의 사이징(예컨대 가수분해)에 의해 유도된다.
그러나, 바람직하게는, 접합에 사용되는 당류는 다당류이다. 고분자량 다당류는 항원 표면에 존재하는 에피토프에 기인하는 특정한 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 고분자량 다당류의 단리 및 정제가 본 발명의 접합체에 사용됨이 의도된다.
따라서, 한 양태에서, 다당류는 사이징되어 다당류로 유지된다. 한 양태에서, 다당류는 사이징되지 않는다.
일부 양태에서, 접합 전(사이징되거나 사이징되지 않은 후)의 정제된 다당류는 5 내지 4,000 kDa의 분자량을 가진다. 다른 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 10 내지 4,000 kDa의 분자량을 가진다. 다른 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 50 내지 4,000 kDa의 분자량을 가진다. 추가의 이러한 양태에서, 다당류는 50 내지 3,500 kDa; 50 내지 3,000 kDa; 50 내지 2,500 kDa; 50 내지 2,000 kDa; 50 내지 1,750 kDa; 50 내지 1,500 kDa; 50 내지 1,250 kDa; 50 내지 1,000 kDa; 50 내지 750 kDa; 50 내지 500 kDa; 100 내지 4,000 kDa; 100 내지 3,500 kDa; 100 내지 3,000 kDa; 100 내지 2,500 kDa; 100 내지 2,250 kDa; 100 내지 2,000 kDa; 100 내지 1,750 kDa; 100 내지 1,500 kDa; 100 내지 1,250 kDa; 100 내지 1,000 kDa; 100 내지 750 kDa; 100 내지 500 kDa; 200 내지 4,000 kDa; 200 내지 3,500 kDa; 200 내지 3,000 kDa; 200 내지 2,500 kDa; 200 내지 2,250 kDa; 200 내지 2,000 kDa; 200 내지 1,750 kDa; 200 내지 1,500 kDa; 200 내지 1,250 kDa; 200 내지 1,000 kDa; 200 내지 750 kDa; 또는 200 내지 500 kDa의 분자량을 가진다. 추가의 이러한 양태에서, 다당류는 250 내지 3,500 kDa; 250 내지 3,000 kDa; 250 내지 2,500 kDa; 250 내지 2,000 kDa; 250 내지 1,750 kDa; 250 내지 1,500 kDa; 250 내지 1,250 kDa; 250 내지 1,000 kDa; 250 내지 750 kDa; 250 내지 500 kDa; 300 내지 4,000 kDa; 300 내지 3,500 kDa; 300 내지 3,000 kDa; 300 내지 2,500 kDa; 300 내지 2,250 kDa; 300 내지 2,000 kDa; 300 내지 1,750 kDa; 300 내지 1,500 kDa; 300 내지 1,250 kDa; 300 내지 1,000 kDa; 300 내지 750 kDa; 300 내지 500 kDa; 500 내지 4,000 kDa; 500 내지 3,500 kDa; 500 내지 3,000 kDa; 500 내지 2,500 kDa; 500 내지 2,250 kDa; 500 내지 2,000 kDa; 500 내지 1,750 kDa; 500 내지 1,500 kDa; 500 내지 1,250 kDa; 500 내지 1,000 kDa; 500 내지 750 kDa; 또는 500 내지 600 kDa의 분자량을 가진다.
상기 임의의 범위 내의 임의의 수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
일부 양태에서, 정제된 다당류는 약 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 35 kDa, 40 kDa, 45 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 500 kDa, 550 kDa, 600 kDa, 650 kDa, 700 kDa, 750 kDa, 800 kDa, 850 kDa, 900 kDa, 950 kDa, 1000 kDa, 1250 kDa, 1500 kDa, 1750 kDa, 2000 kDa, 2250 kDa, 2500 kDa, 2750 kDa, 3000 kDa, 3250 kDa, 3500 kDa, 3750 kDa 또는 4,000 kDa의 분자량을 가진다.
한 양태에서, 정제된 다당류는 캡슐 당류(다당류 또는 올리고당)이다.
한 양태에서, 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 장병독성 에셔리키아 콜라이 그룹(EEC 그룹)의 에셔리키아 콜라이 부분, 예컨대 에셔리키아 콜라이 - 장독소원성(ETEC), 에셔리키아 콜라이 - 장병원성(EPEC), 에셔리키아 콜라이 - O157:H7 장출혈성(EHEC) 또는 에셔리키아 콜라이 - 장침습성(EIEC)으로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 요로병원성 에셔리키아 콜라이(UPEC)로부터의 캡슐 다당류이다.
한 양태에서, 정제된 다당류는 혈청형 O157:H7, O26:H11, O111:H- 및 O103:H2로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류이다. 정제된 다당류는 혈청형 O6:K2:H1 및 O18:K1:H7로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 혈청형 O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 및 O7:K1로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형 O104:H4로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형 O1:K12:H7로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형 O127:H6으로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형 O139:H28로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 정제된 다당류는 정제된 다당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형 O128:H2로부터의 캡슐 다당류이다.
추가 양태에서, 정제된 다당류는 네이쎄리아 메닌지티디스로부터의 캡슐 다당류이다. 하나의 양태에서, 정제된 다당류는 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX) 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)으로부터의 캡슐 다당류이다.
또 다른 양태에서, 정제된 다당류는 클레브시엘라 뉴모니에로부터의 캡슐 다당류이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O1(O1), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2(O2), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2ac(O2ac), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O3(O3), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O4(O4), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O5(O5), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O7(O7), 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O8(O8) 또는 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O9(O9)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O1(O1)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2(O2)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O2ac(O2ac)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O3(O3)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O4(O4)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O5(O5)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O7(O7)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O8(O8)이다. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 클레브시엘라 뉴모니에 혈청군 O9(O9)이다.
임의의 적합한 접합 반응이 필요에 따라 임의의 적합한 링커에 의해 사용될 수 있다. 예컨대 WO 2007/116028의 페이지 17 내지 22를 참고한다.
본원에 기재된 정제된 올리고당 또는 다당류는 당류가 담체 단백질과의 반응할 수 있도록 화학적으로 활성화된다.
한 양태에서, 당접합체는 환원성 아민화를 사용하여 제조된다. 환원성 아민화는 2개의 단계 (1) 정제된 당류의 산화(활성화) 단계, 및 (2) 활성화된 당류 및 담체 단백질의 환원으로 당접합체가 생성되는 단계를 수반한다(예컨대 WO 2015/110941 및 WO 2015/110940 참고). 전술된 바와 같이, 산화 전, 다당류를 표적 분자량(MW) 범위로 사이징함이 수행될 수 있다. 기계적 또는 화학적 가수분해가 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 한 양태에서, 정제된 다당류의 크기는 기계적 균질화에 의해 감소된다.
한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 담체 단백질에 접합된다:
(a) 상기 정제된 다당류 또는 올리고당을 산화제와 반응시키는 단계;
(b) 임의적으로, 산화 반응을 ??칭제(quenching agent)의 첨가에 의해 ??칭하는 단계;
(c) 상기 단계 (a) 또는 (b)의 활성화된 다당류 또는 올리고당을 담체 단백질과 컴파운딩(compounding)하는 단계; 및
(d) 상기 컴파운딩된 활성화된 다당류 또는 올리고당 및 담체 단백질을 환원제와 반응시켜 당접합체를 생성하는 단계.
산화 단계 a 후, 당류는 활성화된 것으로 설명되고 "활성화된 다당류 또는 올리고당"으로서 지칭된다.
산화 단계 a는 퍼요오데이트와의 반응을 수반할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 용어 "퍼요오데이트"는 퍼요오데이트 및 퍼요오드산 둘다를 포함하고, 상기 용어는 메타퍼요오데이트(IO4 -) 및 오르쏘퍼요오데이트(IO6 5-) 둘다, 및 퍼요오데이트의 다양한 염(예컨대 나트륨 퍼요오데이트 및 칼륨 퍼요오데이트)도 포함한다.
바람직하게는, 산화제는 나트륨 퍼요오데이트이다. 한 양태에서, 산화에 사용되는 퍼요오데이트는 메타퍼요오데이트이다. 한 양태에서, 산화에 사용되는 퍼요오데이트는 나트륨 메타퍼요오데이트이다.
산화 단계 a는 알데히드 기를 함유하는 활성화된 당류를 제조하기 위해, 상기 다당류 또는 올리고당의 1차 하이드록시 기를 선택적으로 산화시키는 산화제의 존재하에 안정한 니트록실 또는 니트로옥사이드 라디칼 화합물, 예컨대 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물과의 반응을 수반할 수 있다(WO 2014/097099 참고). 한 양상에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트로옥사이드 라디칼 화합물은 WO 2014/097099의 페이지 3의 14번째 줄 내지 페이지 4의 7번째 줄에 개시된 임의의 것이고, 산화제는 WO 2014/097099의 페이지 4의 8 내지 15번째 줄에 개시된 임의의 것이다. 한 양태에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트로옥사이드 라디칼 화합물은 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리딘일옥시(TEMPO)이고, 산화제는 N-클로로숙신이미드(NCS)이다.
한 양태에서, ??칭제는 WO 2015/110941(페이지 30의 3 내지 26번째 줄 참고)에 개시된 것이다.
한 양태에서, 환원 반응 d는 수용성 용매 중 수행된다. 한 양태에서, 환원 반응 d는 비양성자성 용매 중 수행된다. 한 양태에서, 환원 반응 d는 DMSO(다이메틸설폭사이드) 또는 DMF(다이메틸포름아미드) 용매 중 수행된다.
한 양태에서, 환원제는 나트륨 시아노보로하이드라이드, 나트륨 트라이아세토보로하이드라이드, 브뢴스테드 또는 루이스 산의 존재하의 나트륨 또는 아연 보로하이드라이드, 아민 보란, 예컨대 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-다이보란-메탄올, 다이메틸아민-보란, t-BuMeiPrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란(PEMB)이다. 바람직한 양태에서, 환원제는 나트륨 시아노보로하이드라이드이다.
환원 반응 종료시, 접합체에 남아있는 미반응한 알데히드 기가 있을 수 있을 수 있고, 이는 적합한 캐핑제(capping agent)를 사용하여 캐핑될 수 있다. 한 양태에서, 상기 캐핑제는 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)이다.
담체 단백질에 접한 후, 당접합체는 당업자에 공지되어 있는 다양한 기법에 의해 정제(당류-단백질 접합체의 양이 풍부화됨)될 수 있다. 이러한 기법은 투석, 농축/정용여과 조작, 접선 유동 여과 침전/용리, 컬럼 크로마토그래피(DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피), 및 심층여과를 포함한다.
한 양태에서, 당접합체는 시아닐화(cyanylation) 화학을 사용하여 제조된다. 한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 시아노젠(cyanogen) 브로마이드에 의해 활성화된다. 활성화는 다당류 또는 올리고당의 하이드록시 기의 시아닐화에 상응한다. 이어서, 활성화된 다당류 또는 올리고당은 직접 또는 스페이서(링커) 기를 통해 담체 단백질의 아미노 기에 결합된다.
한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 1-시아노-4-다이메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화되어 시아네이트 에스터가 생성된다. 이어서, 성화된 다당류 또는 올리고당은 직접 또는 스페이서(링커) 기를 통해 담체 단백질의 아미노 기에 결합된다.
한 양태에서, 스페이서는 티올화된 다당류 또는 올리고당을 생성하는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있고, 말레이미드-활성화된 담체 단백질(예컨대 N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스터(GMBS)를 사용함) 또는 할로겐화된 담체 단백질(예컨대 요오도아세트이미드, N-숙신이미딜 브로모아세테이트(SBA; SIB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SlAB), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAB), N-숙신이미딜 요오도아세테이트(SIA) 또는 숙신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트(SBAP)를 사용함)과의 반응 후 생성되는 티오에터 결합을 통해 담체에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스터(임의적으로, CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 다이아민 또는 아디프산 다이하이드라지드(ADH)와 결합되고, 아미노-유도화된 당류는 단백질 담체의 카복시 기를 통해 카보다이이미드(예컨대 EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질(예컨대 CRM197)에 접합된다. 이러한 접합체는 예컨대 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/129094에 기재되어 있다.
한 양태에서, 당접합체는 2친전자성(biselectrophilic) 시약, 예컨대 카보닐다이이미다졸(CDI) 또는 카보닐다이트라이아졸(CDT)을 사용하여 제조된다. 이러한 양태에서, 접합 반응은 직접적 경로를 통해 또는 2속(bigeneric) 링커를 사용하여 바람직하게는 비양성자성 용매, 예컨대 DMF 또는 DMSO 중 수행된다(예컨대 WO 2011/041003).
한 양태에서, 당접합체는 WO 2014/027302에 개시되어 있는 당접합체의 제조 방법에 의해 제조된다. 결과적인 당접합체는 2가의 이종2작용성 스페이서(2-((2-옥소에틸)티오)에틸)카바메이트(eTEC)를 통해 담체 단백질에 접합된다. 다르게는, 당접합체는 WO 2015/121783에 개시되어 있는 당접합체의 제조 방법에 의해 제조된다.
기타 적합한 접합 기법은 카보다이이미드(예컨대 EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드, EDC와 설포 NHS, CMC(1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카보다이이미드, DCC(N,N'-다이사이클로헥실 카보다이이미드) 또는 DIC(다이이소프로필 카보다이이미드)를 사용한다.
한 양태에서, 다당류 또는 올리고당는 링커, 예컨대 2작용성 링커를 통해 담체 단백질에 접합된다. 임의적으로, 링커는 예컨대 반응성 아미노 기 및 반응성 카복시산 기, 2반응성 아미노 기 또는 2반응성 카복시산 기를 갖는 이종2작용성 또는 동종2작용성이다. 링커는 예컨대 4 내지 20개, 4 내지 12개, 또는 5 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 가능한 링커는 아디프산 다이하이드라지드(ADH)이다. 기타 링커는 B-프로피오아미노(WO 00/10599) 니트로페닐-에틸아민, 할로알킬 할라이드, 글리코시드 결합(US 4,673,574, US 4,808,700), 헥산 다이아민 및 6-아미노 카프로산(US 4,459,286)을 포함한다.
담체 단백질
당접합체의 담체 단백질 성분은 정제된 다당류 또는 올리고당이 접합되는 담체 단백질이다. 용어 "단백질 담체", "담체 단백질" 또는 "담체"는 본원에서 서로 대체가능하게 사용될 수 있다. 담체 단백질은 표준적인 접합 절차에 적합해야 한다.
바람직한 양태에서, 당접합체의 담체 단백질은 DT(디프테리아 독소), TT(테타누스 독소) 또는 TT의 단편 C, CRM197(비독성이지만 디프테리아 독소와 항원적으로 일치하는 변이), 기타 DT 돌연변이(예컨대 CRM176, CRM228, CRM45(문헌[Uchida et al.(1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844]), CRM9, CRM102, CRM103 또는 CRM107; 및 문헌[Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc.(1992)]에 기재되어 있는 기타 돌연변이; Glu 148에서 Asp, Gln 또는 Ser로 및/또는 Ala 158 에서 GIy로의 결실 또는 돌연변이 및 US 4,709,017 및 4,950,740에 기재되어 있는 기타 돌연변이; Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534 중 하나 이상의 모이어티(moiety)의 돌연변이 및 US 5,917,017 및 6,455,673에 개시되어 있는 기타 돌연변이; 또는 US 5,843,711에 개시되어 있는 단편, 폐렴구균의 폐렴구균용혈소(ply)(문헌[Kuo et al.(1995) Infect lmmun 63:2706-2713]), 예컨대 일부 방식으로 해독된 ply, 예컨대 dPLY-GMBS(WO 2004/081515, WO 2006/032499) 또는 dPLY-포몰(formol), PhtX, 예컨대 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE(PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE의 서열은 WO 00/37105 및 WO 00/39299에 개시되어 있음) 및 Pht 단백질의 융합, 예컨대 PhtDE 융합, PhtBE 융합, Pht A-E(WO 01/98334, WO 03/054007, WO 2009/000826), OMPC(수막구균 외막 단백질)(이는 통상적으로 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청형 B(EP0372501), PorB(네이쎄리아 메닌지티디스), PD(헤모필러스 인플루엔제 단백질 D로부터 추출됨)(예컨대, EP0594610 B 참고), 또는 이의 면역 작용상 등가물, 합성 펩티드(EP 0378881, EP 0427347), 열충격 단백질(WO 93/17712, WO 94/03208), 페르투시스 단백질(WO 98/58668, EP0471177), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬(WO 91/01146), 인공 단백질(다양한 병원체에서 유래하는 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함함)(문헌[Falugi et al.(2001) Eur J Immunol 31:3816-3824]), 예컨대 N19 단백질(문헌[Baraldoi et al.(2004) Infect lmmun 72:4884-4887]), 폐렴구균 표면 단백질 PspA(WO 02/091998), 철 흡수(uptake) 단백질(WO 01/72337), 클로스트리디움 디피실레의 독소 또는 B(WO 00/61761), 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 부착 단백질(PsaA) 및 재조합 슈도모나스 에루지노사 외독소(특히 이의 비독성 돌연변이(예컨대 글루탐산 553에서의 치환을 보유하는 외독소(문헌[Douglas et al.(1987) J. Bacteriol. 169(11):4967-4971])로부 이루어진 군으로부터 선택된다. 기타 단백질, 에컨대 오브알부민, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 또는 튜베르큘린의 정제된 유도체(PPD)도 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 기타 적합한 담체 단백질은 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 콜레라 독소(예컨대 WO 2004/083251에 기재되어 있음), 에셔리키아 콜라이 LT, 에셔리키아 콜라이 ST, 및 슈도모나스 에루지노사로부터의 외독소를 포함한다.
바람직한 양태에서, 당단백질의 담체 단백질은 서로 독립적으로 TT, DT, DT 돌연변이(예컨대 CRM197), 헤모필러스 인플루엔제 단백질 D, PhtX, PhtD, PhtDE 융합(특히 WO 01/98334 및 WO 03/054007에 개시된 것), 해독된 폐렴구균용혈소, PorB, N19 단백질, PspA, OMPC, 클로스트리디움 디피실레의 독소 및 PsaA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, 당단백질의 담체 단백질은 DT(디프테리아 독소)이다. 또 다른 양태에서, 당단백질의 담체 단백질은 TT(tetanus 독소)이다.
또 다른 양태에서, 당단백질의 담체 단백질은 PD(헤모필러스 인플루엔제 단백질 D, 예컨대 EP 0594610 B 참고)이다.
바람직한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 CRM197 단백질에 접합된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 형태이지만 디프테리아 독소와는 면역적으로 구별불가능하다. CRM197은 독소원성 코리네파지 β의 니트로소구아니딘 돌연변이생성에 의해 생성된 비독소원성 파지 β197tox-로 감염된 코리네박테리움 디프테리에에 의해 제조된다(문헌[Uchida et al.(1971) Nature New Biology 233:8-11]). CRM197 단백질은 디프테리아와 동일한 분자량을 갖지만, 유전자 구조에서 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌으로)로 이와는 상이하다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙 단백질에서 아미노산 치환(글루탐산에서 글리신으로)을 야기하고 디프테리아 독소의 독성적 특성을 제거한다. CRM197 단백질은 안전하고, 당류를 위한 효과적인 T 세포 의존성 담체이다. CRM197에 대한 추가 세부사항 및 이의 제조는 예컨대 US 5,614,382에서 찾을 수 있다.
한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 CRM197 단백질 또는 CRM197의 쇄에 접합된다(CN 103495161 참고). 한 양태에서, 정제된 다당류 또는 올리고당은 유전자 재조합 에셔리키아 콜라이의 발현을 통해 수득된 CRM197의 쇄에 접합된다.
바람직하게는, 접합체에서 담체 단백질 대 다당류 또는 올리고당의 비는 1:5(w/w) 내지 5:1, 예컨대 1:0.5 내지 4:1, 1:1 내지 3.5:1, 1.2:1 내지 3:1, 1.5:1 내지 2.5:1; 예컨대 1:2 내지 2.5:1 또는 1:1 내지 2:1이다. 접합체에서 담체 단백질 대 다당류 또는 올리고당의 비는 약 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1 또는 1.6:1이다.
담체 단백질에 접합 후, 당접합체는 당업자에 공지되어 있는 다양한 기법에 의해 정제(당류-단백질 접합체의 양이 풍부화됨)될 수 있다. 이러한 기법은 투석, 농축/정용여과 조작, 접선 유동 여과 침전/용리, 컬럼 크로마토그래피(DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피), 및 심층여과를 포함한다.
조성물은 소량의 자유 담체를 포함할 수 있다. 담체 단백질이 본 발명의 조성물 중 자유 형태 또는 접합된 형태 둘다로 존재할 때, 미접합된 형태는 전체 조성물 중 담체 단백질의 총량의 5% 이하이고, 보다 바람직하게는 2 중량% 미만으로 존재한다.
2.2. 면역원성 조성물
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 정제된 다당류 및/또는 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 2.1 부분에 개시된 1 내지 25개의 상이한 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 1 내지 25개의 상이한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형(1 내지 25 폐렴구균 접합체)을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 당접합체 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 상이한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형으로부터의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물 16 또는 20 개의 상이한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형으로부터의 당접합체를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20가 폐렴구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 14, 15, 16, 17, 18 또는 19가 폐렴구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 16가 폐렴구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 19가 폐렴구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 20가 폐렴구균 접합체 조성물이다.
한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터의 당접합체를 포함한다.
한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 1, 5 및 7F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 6A 및 19A로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 3으로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 22F 및 33F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 8, 10A, 11A, 12F 및 15B로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 2로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 9N으로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 17F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 20으로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 2로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 9N로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 17F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 20로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
그러나, 바람직한 양태에서, 당류는 각각 개별적으로 단백질 담체의 상이한 분자에 접합된다(단백질 담체의 각각의 분자가 이에 접합되는 하나의 유형의 당류만을 가짐). 상기 양태에서, 캡슐 당류는 개별적으로 담체 단백질에 접합되는 것으로 설명된다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물의 모든 당접합체는 개별적으로 담체 단백질에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 22F로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 33F로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 15B로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 12F로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 10A로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 11A로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 8로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 1, 5 및 7F로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 6A 및 19A로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다. 한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 3으로부터의 당접합체는 CRM197에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 당접합체는 모두 개별적으로 CRM197에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물 중 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및/또는 23F의 당접합체는 개별적으로 PD에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 18C로부터의 당접합체는 TT에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19F로부터의 당접합체는 DT에 접합된다.
한 양태에서, 임의의 상기 면역원성 조성물의 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및/또는 23F로부터의 당접합체는 개별적으로 PD에 접합되고, 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 18C로부터의 당접합체는 TT에 접합되고, 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19F로부터의 당접합체는 DT에 접합된다.
한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 8 내지 20개의 상이한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 상이한 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군으로부터의 1 내지 5개의 당접합체(1 내지 5개의 수막구균 접합체)를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군으로부터의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 4 또는 5개의 상이한 네이쎄리아 메닌지티디스를 포함한다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 1, 2, 3, 4 또는 5가 수막구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 2가 수막구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 4가 수막구균 접합체 조성물이다. 한 양태에서, 면역원성 조성물은 5가 수막구균 접합체 조성물이다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y 캡슐 당류(MenY) 및/또는 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C 캡슐 당류(MenC)를 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 캡슐 당류(MenA), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135 캡슐 당류(MenW135), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y 캡슐 당류(MenY) 및/또는 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C 캡슐 당류(MenC)를 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135 캡슐 당류(MenW135), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y 캡슐 당류(MenY) 및/또는 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C 캡슐 당류(MenC)를 포함한다.
한 양태에서, 면역원성 조성물은 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 캡슐 당류(MenA), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135 캡슐 당류(MenW135), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y 캡슐 당류(MenY), 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C 캡슐 당류(MenC) 및/또는 접합된 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 당류(MenX)를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 적어도 1, 2 또는 3개의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 1개의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "보조제"는 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 항원은 주로 전달 시스템으로서 또는 주로 면역 조절인자로서 작용하거나, 상기 둘다의 강한 특징을 가진다. 적합한 보조제는 포유류, 예컨대 인간에게 적합한 것을 포함한다.
인간에게 사용될 수 있는 적합한 전달 시스템 유형 보조제의 예는 비제한적으로 명반(예컨대, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드), 칼슘 포스페이트, 리포솜, 수 중 유(oil in water) 유화액, 예컨대 MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리솔베이트 80(트윈(Tween) 80), 0.5% w/v 솔비탄 트라이올리에이트(스팬(Span) 85)), 유 중 수 유화액, 예컨대 몬타니드(Montanide), 및 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드)(PLG) 마이크로입자 또는 나노입자를 포함한다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 알루미늄 염(명반)(예컨대, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드)을 보조제로서 포함한다. 바람직한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드를 보조제로서 포함한다.
본원에 개시된 면역원성 조성물의 효과를 강화시키기 위한 추가의 예시적인 보조제는 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 수 중 유 유화액 제형(기타 특정 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드(하기 참고) 또는 박테리아 세포벽 성분을 함유하거나 함유하지 않음), (a) 예컨대 SAF(10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉(pluronic)-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP(μm 하위 크기로 마이크로유동화(microfluidizing)되거나, 와류되어 더 큰 입도의 유화액으로 제조됨)를 함유함), 및 (b) 리비(RIBI: 상표명) 보조제 시스템(RAS)(미국 몬타나주 해밀턴의 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem))(2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분, 예컨대 모노인지질(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM), 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS(디톡스(DETOX: 상표명))를 함유함; (2) 사포닌 보조제, 예컨대 QS21, 스티뮬론(STIMULON: 상표명)(미국 메사추세츠주 워체스터의 캠프리지 바이오사이언스(Cambridge Bioscience)), 아비스코(ABISCO: 등록상표)(스웨덴의 이스코노바(Isconova)), 또는 이스코매트릭스(ISCOMATRIX: 등록상표)(호주의 커먼웰스 세럼 레버러토리스(Commonwealth Serum Laboratories))(전술한 것이 사용되거나 이로부터 생성된 입자 예컨대 ISCOM(면역자극 복합체)가 사용될 수 있는데, ISCOM은 추가적인 계면활성제를 함유하지 않음(예컨대 WO 00/07621)); (3) 완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant, CFA) 및 불완전 프로인트 보조제(IFA); (4) 시토카인, 예컨대 인터루킨(예컨대 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12(예컨대, WO 99/44636)), 인터페론(예컨대 감마 인터페론), 대식세포 군체 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 등; (5) 모노인지질(MPL) 또는 3-O-탈아시화된 MPL(3dMPL)(예컨대 GB 2220221 및 EP 0689454 참고)(폐럼구균 당류와 사용될 때, 임의적으로, 명반이 실질적으로 부재함)(예컨대 WO 00/56358 참고); (6) 3dMPL과 예컨대 QS21 및/또는 수 중 유 유화액의 조합(예컨대 EP 0835318, EP 0735898 또는 EP 0761231 참고); (7) 폴리옥시에틸렌 에터 또는 폴리옥시에틸렌 에스터(예컨대 WO 99/52549 참고); (8) 폴리옥시에틸렌 솔비탄 계면활성제와 옥토신올의 조합(예컨대 WO 01/21207), 또는 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 또는 에스터 계면활성제와 하나 이상의 추가적인 비이온성 계면활성제, 예컨대 옥토신올의 조합(예컨대 WO 01/21152); (9) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예컨대 CpG 올리고뉴클레오티드)(예컨대 WO 00/62800); (10) 면역자극제 및 금속 염의 입자(WO 00/23105 참고); (11) 사포닌 및 수 중 유 유화액(예컨대 WO 99/11241); (12) 사포닌(예컨대 QS21) + 3dMPL + IM2(임의적으로 스테롤 포함)(예컨대 WO 98/57659); (13) 조성물의 효능을 강화하는 면역자극제로서 작용하는 기타 물질. 무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타르닌일-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 CpG 올리고뉴클레오티드를 보조제로서 포함한다.
면역원성 조성물은 액체 형태(용액 또는 현탁액) 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다. 액체 형태는 이의 패키징된 형태로부터 바로 유리하게 투여될 수 있고, 이에 따라, 본 발명의 동결건조된 조성물에 요하는 바와 달리, 수성 매질 중 재구성이 필요 없는 주사에 이상적이다.
본 발명의 면역원성 조성물의 제형화는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 성취될 수 있다. 예컨대, 조성물 제조를 위해 개별 다당류 및/또는 접합체가 생리적으로 허용되는 비히클(vehicle)에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 비제한적으로 물, 완충된 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 다당류 또는 당접합체와 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제의 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 액체 형태, 바람직하게는 수용성 액체 형태이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 완충제, 염, 2가 양이온, 비이온성 계면활성제, 동결보호제(cryoprotectant), 예컨대 당, 및 항산화제, 예컨대 자유 라디칼 소거제 또는 킬레이트제, 또는 이의 임의의 다중 조합을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 완충제를 포함한다. 한 양태에서, 상기 완충제는 약 3.5 내지 약 7.5의 pKa를 가진다. 일부 양태에서, 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘 또는 시트레이트이다. 특정 양태에서, 완충제는 1 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트이다. 하나의 특정 양태에서, 숙시네이트 완충제의 최종 농도는 약 5 mM이다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 염을 포함한다. 일부 양태에서, 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 염은 나트륨 클로라이드이다. 하나의 특정 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 나트륨 클로라이드를 150 mM로 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 계면활성제를 포함한다. 한 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 20(트윈(상표명) 20), 폴리솔베이트 40(트윈(상표명) 40), 폴리솔베이트 60(트윈(상표명) 60), 폴리솔베이트 65(트윈(상표명) 65), 폴리솔베이트 80(트윈(상표명) 80), 폴리솔베이트 85(트윈(상표명) 85), 트라이톤(TRITON: 상표명) N-101, 트라이톤(상표명) X-100, 옥스톡신올 40, 노녹신올-9, 트라이에탄올아민, 트라이에탄올아민 폴리펩티드 올리에이트, 폴리옥시에틸렌 내지 660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, 솔루톨(Solutol) H 15), 폴리옥시에틸렌 내지 35-리시놀리에이트(크레모포르(CREMOPHOR: 등록상표) EL), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 80. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 80의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 80이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 80의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 80이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 80의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 80이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 80의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 80이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 80의 최종 농도(w/w)는 1% 폴리솔베이트 80이다.
하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 20이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 20의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 20이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 20의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 20이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 20의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 20이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 20의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 20이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트의 최종 농도는 1% 폴리솔베이트 20이다.
하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 40이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 40의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 40이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 40의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 40이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 40의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 40이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 40의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 40이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 40의 최종 농도(w/w)는 1% 폴리솔베이트 40이다.
하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 60이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 60의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 60이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 60의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 60이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 60의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 60이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 60의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 60이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 60의 최종 농도(w/w)는 1% 폴리솔베이트 60이다.
하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 65이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 65의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 65이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 65의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 65이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 65의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 65이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 65의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 65이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 65의 최종 농도(w/w)는 1% 폴리솔베이트 65이다.
하나의 특정 양태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 85이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 85의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.0001% 내지 10% 폴리솔베이트 85이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 85의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.001 내지 1% 폴리솔베이트 85이다. 일부 상기 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 85의 최종 농도는 적어도 중량:중량(w/w)으로 0.01 내지 1% 폴리솔베이트 85이다. 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 85의 최종 농도(w/w)는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1% 폴리솔베이트 85이다. 또 다른 양태에서, 제형 중 폴리솔베이트 85의 최종 농도(w/w)는 1% 폴리솔베이트 85이다.
특정 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 5.5 내지 7.5의 pH, 보다 바람직하게는 5.6 내지 7.0의 pH, 보다 더 바람직하게는 5.8 내지 6.0의 pH를 가진다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 면역원성 조성물이 충전된 용기를 제공한다. 한 양태에서, 용기는 바이알, 주사기, 플라스크, 발효기, 생물반응기(bioreactor), 낭(bag), 병(jar), 앰플, 카트리지 및 일회용 펜(pen)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 용기는 실리콘화된다.
한 양태에서, 본 발명의 용기는 유리, 금속(예컨대 강, 스테인리스 강, 알루미늄 등) 및/또는 중합체(예컨대 열가소성, 엘라스토머(elastomer), 열가소성-엘라스토머)로 제조된다. 한 양태에서, 본 발명의 용기는 유리로 제조된다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 면역원성 조성물이 충전된 주사기를 제공한다. 특정 양태에서, 주사기는 실리콘화되고/거나 유리로 제조된다.
주사를 위한 본 발명의 면역원성 조성물의 전형적인 용량은 0.1 내지 2 mL, 보다 바람직하게는 0.2 내지 1 mL의 부피, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 mL의 부피이다.
2.3. 항원으로서의 용도
본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류 및 본원에 개시된 접합체는 항원으로서 사용될 수 있다. 예컨대, 이는 백신의 부분일 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류 또는 상기 다당류를 사용하여 수득되는 당접합체는 대상에서 면역 반응을 생성하는데 사용된다. 한 양상에서, 대상은 포유류, 예컨대 인간, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 개이다. 한 양상에서, 대상은 인간이다.
한 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류, 상기 다당류를 사용하여 수득되는 당접합체, 또는 본원에 개시된 면역원성 조성물은 백신에 사용하기 위한 것이다.
한 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류, 상기 다당류를 사용하여 수득되는 당접합체, 또는 본원에 개시된 면역원성 조성물은 약제로서 사용하기 위한 것이다.
본원에 기재된 면역원성 조성물은 대상의 박테리아 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 완화하는 다양한 치료적 또는 예방적 방법에 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 대상의 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 아갈락티에 또는 클레브시엘라 뉴모니에 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 완화하는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 면역적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물(특히 상응하는 다당류 또는 이의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상의 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 아갈락티에 또는 클레브시엘라 뉴모니에와 관련된 감염, 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 완화시키는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 면역적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물(특히 상응하는 다당류 또는 이의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물)을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상의 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 아갈락티에 또는 클레브시엘라 뉴모니에에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로서 사용하기 위한 것이다. 이러한 양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 대상의 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스 또는 스트렙토코커스 아갈락티에 감염을 예방하는데 사용될 수 있다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 면역적 효과량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는 상기 대상의 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 아갈락티에 또는 클레브시엘라 뉴모니에에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
한 양상에서, 대상은 포유류, 예컨대 인간, 고양이, 양, 돼지, 소 또는 개이다. 한 양상에서, 대상은 인간이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 면역원성 조성물을 투여함으로써 스트렙토코커스 뉴모니에, 스타필로코커스 아우레우스, 엔테로코커스 페칼리스, 헤모필러스 인플루엔제 타입 b, 에셔리키아 콜라이, 네이쎄리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 아갈락티에 또는 클레브시엘라 뉴모니에 감염에 취약한 인간을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로로 투여된다. 한 양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
일부 경우, 단 1개 용량의 본 발명에 따른 면역원성 조성물이 필요하지만, 일부 경우, 예컨대 더 큰 면역 결함하에, 제2, 제3 또는 제4 투여가 제공될 수 있다. 초기 백신 접종 후, 환자는 적절한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터(booster) 예방 접종을 받을 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신 접종 스케쥴은 1회 용량이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신 접종 스케쥴은 다회 용량 스케쥴이다.
3. 에셔리키아 콜라이로부터 유래하는 당류
한 양태에서, 당류는 재조합 그람 음성 박테리아에서 생산된다. 한 양태에서, 당류는 재조합 에셔리키아 콜라이 세포에서 생산된다. 한 양태에서, 당류는 재조합 살모넬라 세포에서 생산된다. 예시적인 박테리아는 에셔리키아 콜라이 O25K5H1, 에셔리키아 콜라이 BD559, 에셔리키아 콜라이 GAR2831, 에셔리키아 콜라이 GAR865, 에셔리키아 콜라이 GAR868, 에셔리키아 콜라이 GAR869, 에셔리키아 콜라이 GAR872, 에셔리키아 콜라이 GAR878, 에셔리키아 콜라이 GAR896, 에셔리키아 콜라이 GAR1902, 에셔리키아 콜라이 O25a ETC NR-5, 에셔리키아 콜라이 O157:H7:K-, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 균주 LT2, 에셔리키아 콜라이 GAR2401, 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 CVD 1943, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 CVD 1925, 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라티피 A CVD 1902, 및 시겔라 플렉스네리 CVD 1208S를 포함한다. 한 양태에서, 박테리아는 에셔리키아 콜라이 GAR2401이 아니다. 당류 생산에 대한 이러한 유전적 접근법은 백신 구성요소로서 O-다당류 및 O-항원이 효율적으로 생성될 수 있게 한다.
본원에 사용된 용어 "wzz 단백질"은 쇄 길이 결정 폴리펩티드, 예컨대 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzzl 및 wzz2를 지칭한다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 진 뱅크(Gen Bank) 접근 번호는 AF011910(E4991/76의 경우), AF011911(F186의 경우), AF011912(M70/1-1의 경우), AF011913(79/311의 경우), AF011914(Bi7509- 41의 경우), AF011915(C664-1992의 경우), AF011916(C258-94의 경우), AF011917(C722-89의 경우), 및 AF011919(EDL933의 경우)이다. G7 및 Bi316-41 wzz 유전자 서열에 대한 진 뱅크 접근 번호는 각각 U39305 및 U39306이다. 예시적인 wzz 유전자 서열에 대한 추가 진 뱅크 접근 번호는 NP_459581(살모넬라 엔테리카 subsp. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 str. LT2 FepE의 경우); AIG66859(에셔리키아 콜라이 O157:H7 균주 EDL933 FepE의 경우); NP_461024(살모넬라 엔테리카 subsp. 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 str. LT2 WzzB의 경우); NP_416531(에셔리키아 콜라이 K-12 substr. MG1655 WzzB의 경우)NP_415119(에셔리키아 콜라이 K-12 substr. MG1655 FepE의 경우)이다. 바람직한 양태에서, wzz 과 단백질은 wzzB, wzz, wzzSF, wzzST, fepE, wzzfepE, wzz1 및 wzz2 중 어느 하나, 가장 바람직하게는 wzzB, 보다 바람직하게는 fepE이다.
예시적인 wzzB 서열은 하기를 포함한다:
> O25b 2401 WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQEQVTKPQVQQTEDVTQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSSNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK(서열번호 20)
> O25a:K5:H1 WzzB
MRVENNNVSGQNNDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQDEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK(서열번호 21)
> O25a ETEC ATCC WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVVVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSFAFSALAETLDNQKEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEDAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNLALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIENLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNSK(서열번호 22)
> K12 W3110 WzzB
MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEREKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPMLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK(서열번호 23)
> 살모넬라 LT2 WzzB
MTVDSNTSSGRGNDPEQIDLIELLLQLWRGKMTIIVAVIIAILLAVGYLMIAKEKWTSTAIITQPDAAQVATYTNALNVLYGGNAPKISEVQANFISRFSSAFSALSEVLDNQKEREKLTIEQSVKGQALPLSVSYVSTTAEGAQRRLAEYIQQVDEEVAKELEVDLKDNITLQTKTLQESLETQEVVAQEQKDLRIKQIEEALRYADEAKITQPQIQQTQDVTQDTMFLLGSDALKSMIQNEATRPLVFSPAYYQTKQTLLDIKNLKVTADTVHVYRYVMKPTLPVRRDSPKTAITLVLAVLLGGMIGAGIVLGRNALRSYKPKAL(서열번호 24)
예시적인 FepE 서열은 하기를 포함한다:
> O25b GAR2401 FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV(서열번호 15)
> O25a:K5:H1 FepE
MSSLNIKQGSEAHFPEYPLASPSNNEIDLLNLIEVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDPLDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDESALYTSWTLSFTAPTSEEAQKVLAGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKTNINDVNFTPFKYQLRPSLPVKKDGQGKAIIVILSALVGGMVACGGVLLRHAMASRKQDAMMADHLV(서열번호 16)
> O25a ETEC ATCC FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV(서열번호 17)
> O157 FepE
MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKMKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKANINDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGSVLLRYAMASRKQDAMMADHLV(서열번호 18)
> 살모넬라 LT2 FepE
MPSLNVKQEKNQSFAGYSLPPANSHEIDLFSLIEVLWQAKRRILATVFAFACVGLLLSFLLPQKWTSQAIVTPAESVQWQGLERTLTALRVLDMEVSVDRGSVFNLFIKKFSSPSLLEEYLRSSPYVMDQLKGAQIDEQDLHRAIVLLSEKMKAVDSNVGKKNETSLFTSWTLSFTAPTREEAQKVLAGYIQYISDIVVKETLENIRNQLEIKTRYEQEKLAMDRVRLKNQLDANIQRLHYSLEIANAAGIKRPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGISRKLEIEKGVTDVAEIDGDLRNRQYHVEQLAAMNVSDVKFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIIILAALIGGMMACGGVLLRHAMVSRKMENALAIDERLV(서열번호 19)
일부 양태에서, 개질된 당류(상응하는 야생형 당류에 비해 개질됨)는 그람 음성 박테리아 중 그람 음성 박테리아로부터의 wzz 과 단백질(예컨대 fepE)을 발현시킴에 의해 및/또는 제2 wzz 유전자(예컨대 wzzB)를 스위칭 오프(switching off)(즉 억제, 제거, 소거)함에 의해 중간 길이 또는 긴 길이의 O-항원 쇄를 갖는 고분자량 당류, 예컨대 지다당류를 생성함으로써 생산될 수 있다. 예컨대, 개질된 당류는 wzz2를 발현시키고(과발현일 필요는 없음) wzz1을 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 또는, 대안으로, 개질된 당류는 wzzfepE를 발현시키고(과발현일 필요는 없음) wzzB를 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 또 다른 양태에서, 개질된 당류는 wzzB를 발현시키되(과발현일 필요는 없음) wzzfepE를 스위칭 오프함으로써 생산될 수 있다. 또 다른 양태에서, 개질된 당류는 fepE를 발현시킴에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는, wzz 과 단백질은 숙주 세포에 대해 이종인 균주로부터 유래한다.
한 양상에서, 본 발명은 그람 음성 박테리아에서 wzz 과 단백질, 바람직하게는 fepE를 발현시킴에 의해, 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 반복 단위의 증가를 갖는 중간 길이 또는 긴 길이의 O-항원 쇄를 갖는 고분자량 당류를 생성함에 의해 생산된 당류에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명은 그람 음성 박테리아로부터의 wzz 과 단백질(예컨대 wzzB)을 발현시키는(과발현일 필요는 없음) 배양에서 그람 음성 박테리아에 의해, 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 반복 단위의 증가를 갖는 중간 길이 또는 긴 길이의 O-항원 쇄를 갖는 고분자량 당류를 생성함에 의해 생산된 당류에 관한 것이다. 상응하는 야생형 당류에 비해 증가된 수의 반복 단위를 갖는 추가 예시적인 당류에 관해서는 하기 O-다당류 및 O-항원의 설명을 참고한다. 목적하는 쇄 길이는 소정 백신 구축물의 맥락에서 향상된 또는 최대의 면역원성을 생산하는 것이다.
또 다른 양태에서, 당류는 표 1로부터 선택되는 어느 하나의 식을 포함하되, 이때, 당류에서 반복 단위 n의 수는 상응하는 야생형 O-다당류에서의 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 초과 반복 단위보다 크다. 바람직하게는, 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 반복 단위의 증가를 포함한다. 당류의 길이의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 핵 자기 공명, 질량 분광학, 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 재조합 에셔리키아 콜라이 숙주 세포에서 생산된 당류에 관한 것으로서, 이때, 내인성 wzz O-항원 길이 조절제(예컨대 wzzB)에 대한 유전자는 삭제되고, 재조합 에셔리키아 콜라이 숙주 세포에 이종인 그람 음성 박테리아로부터의 (제2) wzz 유전자(예컨대 살모넬라 fepE)에 의해 대체되어 중간 길이 또는 긴 길이의 O-항원 쇄를 갖는 고분자량 당류, 예컨대 지다당류가 생성된다. 일부 양태에서, 재조합 에셔리키아 콜라이 숙주 세포는 살모넬라, 바람직하게는 살모넬라 엔테리카로부터의 wzz 유전자를 포함한다.
한 양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 wzz과 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA 내의 통합된 유전자로서 wzz과 단백질에 대한 이종 유전자를 포함한다. 에셔리키아 콜라이 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정하게 발현시키는 방법 및 이종 유전자를 에셔리키아 콜라이 숙주 세포의 염색체에 통합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 숙주 세포는 안정하게 유지되는 플라스미드 벡터로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 또 다른 양태에서, 숙주 세포는 숙주 세포의 염색체 DNA 내의 통합된 유전자로서 O-항원에 대한 이종 유전자를 포함한다. 에셔리키아 콜라이 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포에서 플라스미드 벡터를 안정하게 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 및 이종 유전자를 에셔리키아 콜라이 숙주 세포 및 살모넬라 숙주 세포의 염색체에 통합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
한 양상에서, 재조합 숙주 세포는 탄소 공급원을 포함하는 배지에서 배양된다. 에셔리키아 콜라이를 배양하기 위한 탄소 공급원은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 탄소 공급원은 당 알코올, 폴리올, 알돌 당 또는 케토 당, 예컨대 비제한적으로 아라비노스, 셀로바이오스, 프럭토스, 글루코스, 글리세롤, 이노시톨, 락토스, 말토스, 만니톨, 만노스, 람노스, 라피노스, 솔비톨, 솔보스, 수크로스, 트레할로스, 피루베이트, 숙시네이트 및 메틸아민을 포함한다. 바람직한 양태에서, 재비는 글루코스를 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 폴리올 또는 알돌 당, 예컨대 만니톨, 이노시톨, 솔보스, 글리세롤, 솔비톨, 락토스 및 아라비노스를 탄소 공급원으로서 포한한다. 탄소 공급원 모두는 배양의 시작 전 배지에 첨가될 수 있거나, 배양 동안 단계적으로 또는 연속적으로 첨가될 수 있다.
재조합 숙주 세포에 대한 예시적인 배양 배지는 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O중 어느 하나로부터 선택되는 원소를 포함한다. 바람직하게는, 배지는 KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, 나트륨 시트레이트, Na2SO4, 아스파트산, 글루코스, MgSO4, FeSO4-7H2O, Na2MoO4-2H2O, H3BO3, CoCl2-6H2O, CuCl2-2H2O, MnCl2-4H2O, ZnCl2 및 CaCl2-2H2O를 포함한다.
본원에 사용되는 배지는 고체 또는 액체, 합성(즉 인공) 또는 천연일 수 있고, 재조합 숙주 세포의 배양에 충분한 영양소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 배지는 액체 배지이다.
일부 양태에서, 배지는 적합한 무기 염을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 배지는 미량 영양소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 배지는 추가 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 배지는 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 에셔리키아 콜라이를 배양하기에 적합한 무기 염, 미량 영양소, 성장 인자 및 보충 탄소 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
일부 양태에서, 배지는 적절하다면 추가적인 성분, 예컨대 펩톤, N-Z 아민, 효소성 대두 가수분해물, 추가적인 효모 추출물, 몰트 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 배지는 이러한 추가적인 구성요소, 예컨대 펩톤, N-Z 아민, 효소성 대두 가수분해물, 추가적인 효모 추출물, 몰트 추출물, 보충 탄소 공급원 및 다양한 비타민을 포함하지 않는다.
적합한 보충 탄소 공급원의 예는 비제한적으로 기타 탄화수소, 예컨대 글루코스, 프럭토스. 만니톨, 전분 또는 전분 가수분해물, 셀룰로스 가수분해물 및 당밀, 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산 및 푸마르산; 및 알코올, 예컨대 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 솔비톨을 포함한다.
일부 양태에서, 배지는 질소 공급원을 추가로 포함한다. 에셔리키아 콜라이를 배양하기에 적합한 질소 공급원은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 질소 공급원의 예는 비제한적으로 암모니아, 예컨대 암모니아 기체 및 수성 암모니아; 무기산 또는 유기산의 암모늄 염, 예컨대 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 설페이트 및 암모늄 아세테이트; 우레아; 니트레이트 또는 니트레이트 염, 및 기타 질소-함유 물질, 예컨대 아미노산(순수 또는 미정제 제제), 육류 추출물, 펩톤, 어분, 어류 가수분해물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물, 효모 추출물, 건조 효모, 에탄올-효모 증류물, 대두분 및 면실분 등을 포함한다.
일부 양태에서, 배지는 무기 염을 포함한다. 적합한 무기 염의 예는 비제한적으로 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 앙간, 철, 코발트, 아연, 구리, 몰리브덴, 텅스텐 및 기타 미량 원소, 및 인산을 포함한다.
일부 양태에서, 배지는 적절한 성장 인자를 포함한다. 적절한 미량 영양소 및 성장 인자 등의 예는 비제한적으로 조효소 A, 파토텐산, 피리독신-HCl, 비오틴, 티아민, 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드, DL-6,8-티옥산, 엽산, 비타민 B12, 기타 비타민, 아미노산, 예컨대 시스테인 및 하이드록시프롤린, 염기, 예컨대 아데닌, 우라실, 구아닌, 티민 및 시토신, 나트륨 티오설페이트, p- 또는 r-아미노벤조산, 나이아신아미드 및 니트릴로아세테이트 등을 포함하고, 이는 순수 또는 부분 정제된 화합물이거나 천연 물질로서 존재한다. 양은 당업계에 공지되어 있는 방법 및 기법에 따라 당업자에 의해 실험적으로 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, (상응하는 야생형 당류에 비해) 본원에 기재된 개질된 당류는 합성적으로, 예컨대 시험관내 생산된다. 당류의 합성적 생산 또는 합성은 비용-집약적 및 시간-집약적 생산 공정의 회피를 용이하게 할 수 있다. 한 양태에서, 당류는, 예컨대 순차적 글리코실화 전략, 또는 적합하게 보호된 모노당류 중간체로부터 순차적 글리코실화 전략과 [3+2] 블록 합성 전략의 조합을 사용함에 의해 합성된다. 예컨대, 티오글리코시드 및 글리코실 트라이클로로아세트이미데이트 유도체가 글리코실화에서 글리코실 공여체로서 사용될 수 있다. 한 양태에서, 시험관내 합성되는 당류는 재조합 수단에 의해, 예컨대 전술한 wzz 과 단백질의 조작에 의해 생산된 당류와 동일한 구조를 갖는다.
(재조합 또는 합성적 수단에 의해) 생산된 당류는 임의의 에셔리키아 콜라이 혈청형, 예컨대 하기 에셔리키아 콜라이 혈청형 중 어느 하나로부터 유래하는 구조를 포함한다: O1(예컨대 O1A, O1B, 및 O1C), O2, O3, O4(예컨대 O4:K52 및 O4:K6), O5(예컨대 O5ab 및 O5ac (균주 180/C3)), O6(예컨대 O6:K2; K13; K15 및 O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18(예컨대 O18A, O18ac, O18A1, O18B, 및 O18B1), O19, O20, O21, O22, O23(예컨대 O23A), O24, O25(예컨대 O25a 및 O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45(예컨대 O45 및 O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D1, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73(예컨대 O73 (균주 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, 및 O187.
전형적으로, 개별 다당류는 당업계에 공지되어 있는 방법, 예컨대 투석, 농축 조작, 투석여과 조작, 접선 유동 여과, 침전, 용리, 원심분리, 침전, 한외여과, 심층 여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 다원(mutimodal) 이온교환 크로마토그래피, DEAE 및 소수성 상호작용 크로마토그래피)를 통해 정제된다(다당류-단백질 접합체의 양에 대해 농축됨). 바람직하게는, 다당류는 접선 유동 여과를 포함하는 방법을 통해 정제된다.
정제된 다당류는 활성화되어(예컨대 화학적으로 활성화되어) (예컨대 담체 단백질에 직접적으로, 또는 링커(linker), 예컨대 eTEC 스페이서(spacer)를 통해) 반응할 수 있게 된 후, 본 발명의 당접합체에 혼입되고, 이는 본원에 추가로 기재된 바와 같다.
하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 당류는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터 유래하되, 이때, 상기 혈청형은 O25a이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O25b이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O1A이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O2이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O6이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O17이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O15이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O18A이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O75이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O4이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O16이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O13이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O7이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O8이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 혈청형은 O9이다.
본원에 사용된, 상기 제시된 임의의 혈청형에 대한 언급은 당업계에 공지되어 있는 반복 단위 구조(O-단위, 후술됨)를 포함하고 상응하는 혈청형에 대해 고유한 혈청형을 지칭한다. 예컨대, 용어 용어 "O25a" 혈청형(당업계에 혈청형 "O25"로도 공지되어 있음)은 표 1에 제시된 식 O25를 포괄하는 혈청형을 지칭한다. 또 다른 예로서, 용어 "O25b" 혈청형은 표 1에 제시된 식 O25b를 포괄하는 혈청형을 지칭한다.
달리 특정이 없는 한, 본원에 사용된 혈청형은, 예컨대 용어 식 "O18"이 식 O18A, 식 O18ac, 식 18A1, 식 O18B, 및 식 O18B1를 포괄하도록 총칭한다.
본원에 사용된 용어 "O1"은 표 1에 따른 식명에서 총칭 "O1"을 포함하는 식의 총, 예컨대 각각이 표 1에 제시된 식 O1A, 식 O1A1, 식 O1B, 및 식 O1C 중 어느 하나를 포괄하도록 총칭한다. 따라서, "O1 혈청형"은 식 O1A, 식 O1A1, 식 O1B, 및 식 O1C 중 어느 하나를 포괄하는 혈청형을 총칭한다.
본원에 사용된 용어 "O6"은 표 1에 따른 식명에서 총칭 "O6"을 포함하는 식의 총, 예컨대 각각이 표 1에 제시된 식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 중 어느 하나를 포괄하도록 총칭한다. 따라서, "O6 혈청형"은 식 O6:K2; K13; K15; 및 O6:K54 중 어느 하나를 포괄하는 혈청형을 총칭한다.
표 1에 따른 식명에서의 총칭을 포함하는 식의 종을 총칭하는 용어의 다른 예는 하기를 포함한다: "O4", "O5", "O18", 및 "O45".
본원에 사용된 용어 "O2"는 표 1에 제시된 식 O2를 지칭한다. 용어 "O2 O-항원"은 표 1에 제시된 식 O2를 포괄하는 당류를 지칭한다.
상기 제시된 혈청형으로부터의 O-항원에 대한 본원에 사용된 지칭은 상응하는 혈청형명에 의해 표지된 식을 포괄하는 당류를 지칭한다. 예컨대, 용어 "O25B O-항원"은 표 1에 제시된 식 O25B를 포괄하는 당류를 지칭한다.
또 다른 예로서, 용어 "O1 O-항원"은 용어 "O1"을 포함하는 식, 예컨대 각각이 표 1에 제시된 식 O1A, 식 O1A1, 식 O1B 및 식 O1C를 포괄하는 당류를 지칭한다.
또 다른 예로서, 용어 "O6 O-항원"은 용어 "O6"을 포함하는 식, 예컨대 각각이 표 1에 제시된 식 O6:K2; 식 O6:K13; 식 O6:K15 및 식 O6:K54를 포괄하는 당류를 지칭한다.
O-다당류
본원에 사용된 용어 "O-다당류"는 O-항원을 포함하는 임의의 구조를 지칭하되, 상기 구조는 전체 세포 또는 지질 A를 포함하지 않는다. 예컨대, 한 양태에서, O-다당류는 지다당류를 지칭하는데, 이때, 지질 A가 결합되어 있지 않다. 지질 A를 제거하는 단계는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 산의 첨가에 의한 열처리를 포함한다. 예시적인 공정은 100℃에서 90분 동안 1% 아세트산에 의한 처리를 포함한다. 이러한 공정은 지질 A를 단리하여 제거하는 공정과 조합된다. 지질 A를 단리하는 예시적인 공정은 초원심분리를 포함한다.
한 양태에서, O-다당류는 O-항원으로 이루어진 구조를 지칭하고, 이러한 경우, O-다당류는 용어 O-항원과 동의어이다. 하나의 바람직한 양태에서, O-다당류는 코어 당류가 없는 O-항원의 반복 단위를 포함하는 구조를 지칭한다. 따라서, 한 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 양태에서, O-다당류는 O-항원 및 코어 당류를 포함하는 구조를 지칭한다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 O-항원, 코어 당류 및 KDO 모이어티를 포함하는 구조를 지칭한다.
코어 올리고당류를 포함하는 O-다당류를 LPS로부터 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, LPS의 정제 후, 정제된 LPS는 100℃에서 90분 동안 1%(v/v) 아세트산 중 가열 후, 4℃에서 5시간 동안 142,000 x g에서 초원심분리에 의해 가수분해될 수 있다. O-다당류를 함유하는 상청액은 동결건조되어 4℃에서 보관된다. 특정 양태에서, O-다당류의 간단한 정제를 가능하게 하는 캡슐 합성 유전제의 제거가 설명된다.
O-다당류는 비제한적으로, LPS로부터 지질 A를 제거하는 온화한 산 가수분해를 포함하는 방법에 의해 단리될 수 있다. 다른 양태는 O-다당류 제제화(preparation)에 대한 제제로서 하이드라진을 사용함을 포함할 수 있다. LPS의 제제화는 당업계에 공지되어 있다.
특정 양태에서, wzz 단백질(예컨대 wzzB)를 발현하는(과발현일 필요는 없음) 야생형, 조작 또는 약화 그람 음성 박테리아 균주로부터 정제된 O-다당류가 접합체 백신의 제조에서의 사용을 위해 제공된다. 바람직한 양태에서, O-다당류 쇄는 접합체 또는 복합체 백신으로서의 백신 항원으로서 사용을 위해 wzz 단백질을 발현하는(과발현일 필요는 없음) 그람 음성 박테리아 균주로부터 정제된다.
한 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 41배, 42배, 43배, 44배, 45배, 46배, 47배, 48배, 49배, 50배, 51배, 52배, 53배, 54배, 55배, 56배, 57배, 58배, 59배, 60배, 61배, 62배, 63배, 64배, 65배, 66배, 67배, 68배, 69배, 70배, 71배, 72배, 73배, 74배, 75배, 76배, 77배, 78배, 79배, 80배, 81배, 82배, 83배, 84배, 85배, 86배, 87배, 88배, 89배, 90배, 91배, 92배, 93배, 94배, 95배, 96배, 97배, 98배, 99배, 100배 또는 그 초과 증가된 분자량을 갖는다. 바람직한 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 최소 1배 최대 5배 증가된 분자량을 갖는다. 바람직한 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 최소 2배 최대 4배 증가된 분자량을 갖는다. 상응하는 야생형 O-다당류에 비한 O-다당류의 분자량의 증가는 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 관련되어 있다. 한 양태에서, O-다당류의 분자량의 증가는 wzz 과 단백질에 기인한다.
한 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 kDa 또는 그 초과 증가된 분자량을 갖는다. 한 양태에서, O-폴리본 발명의 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 최소 1 최대 200 kDa 증가된 분자량을 갖는다 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 5 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 12 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 15 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 18 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 21 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 22 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 30 최대 200 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 1 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 5 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 12 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 15 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 100 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 1 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 5 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 12 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 15 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 18 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 30 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 90 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 12 최대 85 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 75 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 70 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 60 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 50 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 49 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 48 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 47 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 10 최대 46 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 45 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 44 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 43 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 42 kDa 증가된다. 한 양태에서, 분자량은 최소 20 최대 41 kDa 증가된다. 상응하는 야생형 O-다당류에 비한 O-다당류의 분자량의 이러한 증가는 바람직하게는 O-항원 반복 단위의 수의 증가와 관련되어 있다. 한 양태에서, O-다당류의 분자량의 증가는 wzz 과 단백질에 기인한다.
또 다른 양태에서, O-다당류는 표 1로부터 선택되는 어느 하나의 식을 포함하는데, 이때, O-다당류에서 반복 단위 n의 수는 상응하는 야생형 O-다당류에서 반복 단위의 수보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 초과 반복 단위 크다. 바람직하게는, 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 반복 단위의 증가를 포함한다.
O-항원
O-항원은 그람 음성 박테리아의 외막의 지다당류(LPS)의 부분이다. O-항원은 세포 표면 상에 있고 가변적인 세포 구성 성분이다. O-항원의 가변성은 그람 음성 박테리아의 혈청형에 대한 기반을 제공한다. 현재의 에셔리키아 콜라이 혈청형 설계는 O-다당류 1 내지 181을 포함한다.
O-항원은 올리고당류 반복 단위(O-단위)를 포함하고, 통상적으로, 이의 야생형 구조는 광범위한 당으로부터의 2 내지 8개의 잔기를 함유한다. 예시적인 에셔리키아 콜라이 O-항원의 O-단위는 표 1에 제시된다. 예시적인 클레브시엘라 뉴모니에 O-항원의 O-단위는 표 1a에 제시된다.
한 양태에서, 본 발명의 당류는 하나의 올리고당류 단위일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 당류는 관련 혈청형의 하나의 반복 올리고당류 단위이다. 이러한 양태에서, 당류는 식 O8, 식 O9a, 식 O9, 식 O20ab, 식 O20ac, 식 O52, 식 O97 및 식 O101 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 당류는 올리고당류일 수 있다. 올리고당류는 적은 개수의 반복 단위(전형적으로 5 내지 15개 반복 단위)를 갖고, 전형적으로, 합성적으로 또는 다당류의 가수분해에 의해 유도된다. 이러한 양태에서, 당류는 식 O8, 식 O9a, 식 O9, 식 O20ab, 식 O20ac, 식 O52, 식 O97 및 식 O101 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명 및 본 발명의 면역원성 조성물에서의 모든 당류는 다당류이다. 고분자량 다당류는 항원성 표면 상에 존재하는 에피토프에 기인하여 특정 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 고분자량 다당류의 단리 및 정제는 바람직하게는 본 발명의 접합체, 조성물및 방법에서의 사용에 고려된다.
일부 양태에서, 각각의 개별 O-항원 중합체에서의 반복 O-단위의 수(및 이에 따른 중합체 쇄의 길이 및 분자량)는 wzz 쇄 길이 조절제인 내막 단백질에 의존한다. 상이한 wzz 단백질은 상이한 범위의 형식 길이(modal length)(4 내지 >100 반복 단위)를 부여한다. 용어 "형식 길이"는 반복 O-단위의 수를 지칭한다. 빈번히, 그람 음성 박테리아는 2개의 구별되는 OAg 형식 쇄 길이를 부여하는 2개의 상이한 wzz 단백질(긴 1개 및 짧은 1개)을 갖는다. 그람 음성 박테리아에서 wzz 과 단백질(예컨대 wzzB)의 발현(과발현일 필요는 없음)은 O-항원 길이의 조작을 가능하게 하여, 특정 길이 범위의 O-항원의 박테리아 생산을 이동 또는 편향시키고, 고수율의 고분자량 지다당류의 생산을 증대시킨다. 한 양태에서, 본원에 사용된 "짧은" 형식 길이는 적은 수, 예컨대 1 내지 20의 반복 O-단위를 지칭한다. 한 양태에서, 본원에 사용된 "긴" 형식 길이는 20 초과 내지 최대 40의 반복 O-단위의 수를 지칭한다. 한 양태에서, 본원에 사용된 "매우 긴" 형식 길이는 40 초과의 O-단위를 지칭한다.
한 양태에서, 생산되는 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 10 반복 단위, 15 반복 단위, 20 반복 단위, 25 반복 단위, 30 반복 단위, 35 반복 단위, 40 반복 단위, 45 반복 단위, 50 반복 단위, 55 반복 단위, 60 반복 단위, 65 반복 단위, 70 반복 단위, 75 반복 단위, 80 반복 단위, 85 반복 단위, 90 반복 단위, 95 반복 단위 또는 100 반복 단위의 증가를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 초과 반복 단위의 증가를 갖는다. 바람직하게는, 당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 반복 단위의 증가를 포함한다.
당류에서 반복 단위의 수를 측정하는 방법 또한 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 반복 단위의 수(또는 식에서 "n")는 (코어 당류 또는 KDO 잔기의 분자량 없이) 다당류의 분자량을 반복 단위의 분자량(즉, 예컨대 표 1에 제시된 상응하는 식에서의 구조의 분자량, 이는 상기 식 내의 각각의 모노당류의 분자량의 합으로서 이론적으로 계산될 수 있음)으로 나눔으로써 계산될 수 있다.
식 내의 각각의 모노당류의 분자량은 당업계에 공지되어 있다. 식 O25b의 반복 단위의 분자량은 약 862 Da이다. 식 O1a의 반복 단위의 분자량은 약 845 Da이다. 식 O2의 반복 단위의 분자량은 약 829 Da이다. 식 O2의 반복 단위의 분자량은 약 893 Da이다. 접합체 내의 반복 단위의 수를 측정할 때, 담체 단백질 분자량 및 단백질:다당류 비는 계산 내로 인수화(factoring)된다. 본원에 정의된 "n"은 다당류 분자에서 반복 단위의 수(표 1의 괄호 안에 표시됨)를 지칭한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 생물학적 거대분자에서, 반복 단위는 불완전 반복, 예컨대 결여 분지(missing branch)의 영역과 산재(interspersing)할 수 있다. 또한, 박테리아와 같은 천연 공급원으로부터 단리되고 정제된 다당류가 크기 및 분지화에 있에서 이종일 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 경우, n은 집단 내 분자에 대한 n에 대해 평균 또는 중간 값을 표시할 수 있다.
한 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 O-항원의 최소 1 반복 단위의 증가를 가질 수 있다. O-항원의 반복 단위는 표 1 및 표 1a에 제시되어 있다. 한 양태에서, O-다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 초과의 총 반복 단위를 포함한다. 바람직하게는, 당류는 최소 3 내지 최대 80의 총 반복 단위를 갖는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 상응하는 야생형 O-다당류에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 초과의 반복 단위를 갖는다. 한 양태에서, 당류는 O-항원을 포함하고, 이때, 임의의 O-항원 식(예컨대 표 1에 제시된 식)에서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 최대 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50의 정수이다. 임의의 최소값 및 임의의 최대값은 범위를 한정하도록 조합될 수 있다. 예시적인 범위는, 예컨대 최소 1 내지 최대 1000; 최소 10 내지 최대 500; 및 최소 20 내지 최대 80, 바람직하게는 최대 90을 포함한다. 하나의 바람직한 양태에서, n은 최소 31 내지 최대 90이다. 바람직한 양태에서, n은 40 내지 90, 보다 바람직하게는 60 내지 85이다.
한 양태에서, 당류는 O-항원을 포함하고, 이때, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 1 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 5 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 10 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 25 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 50 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 75 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 100 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 125 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 150 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 175 최대 200이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 1 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 5 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 10 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 25 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 50 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 75 최대 100이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 1 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 5 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 10 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 20 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 25 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 30 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 40 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 50 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 30 최대 90이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 85이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 75이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 70이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 60이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 50이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 49이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 48이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 47이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 35 최대 46이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 36 최대 45이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 37 최대 44이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 38 최대 43이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 39 최대 42이다. 한 양태에서, O-항원 식 중 어느 하나에서 n은 최소 39 최대 41이다.
예컨대, 한 양태에서, 당류에서 n은 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90, 가장 바람직하게는 40이다. 또 다른 양태에서, n은 최소 35 내지 최대 60이다. 예컨대, 한 양태에서, n은 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60 중 어느 하나, 바람직하게는 50이다. 또 다른 바람직한 양태에서, n은 최소 55 내지 최대 75이다. 예컨대, 한 양태에서, n은 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69, 가장 바람직하게는 60이다.
당류 구조는 당업계에 공지되어 있는 방법 및 도구, 예컨대, NMR, 예를 들어 1D, 1H, 및/또는 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY, 및/또는 HMQC에 의해 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 접합 전 정제된 다당류는 5 kDa 내지 400 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 이러한 양태에서, 당류 has a 분자량 of 10 kDa 내지 400 kDa; 5 kDa 내지 400 kDa; 5 kDa 내지 300 kDa; 5 kDa 내지 200 kDa; 5 kDa 내지 150 kDa; 10 kDa 내지 100 kDa; 10 kDa 내지 75 kDa; 10 kDa 내지 60 kDa; 10 kDa 내지 40 kDa; 10 kDa 내지 100 kDa; 10 kDa 내지 200 kDa; 15 kDa 내지 150 kDa; 12 kDa 내지 120 kDa; 12 kDa 내지 75 kDa; 12 kDa 내지 50 kDa; 12 내지 60 kDa; 35 kDa 내지 75 kDa; 40 kDa 내지 60 kDa; 35 kDa 내지 60 kDa; 20 kDa 내지 60 kDa; 12 kDa 내지 20 kDa; 또는 20 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 양태에서, 다당류는 7 kDa 내지 15 kDa; 8 kDa 내지 16 kDa; 9 kDa 내지 25 kDa; 10 kDa 내지 100; 10 kDa 내지 60 kDa; 10 kDa 내지 70 kDa; 10 kDa 내지 160 kDa; 15 kDa 내지 600 kDa; 20 kDa 내지 1000 kDa; 20 kDa 내지 600 kDa; 20 kDa 내지 400 kDa; 30 kDa 내지 1,000 kDa; 30 kDa 내지 60 kDa; 30 kDa 내지 50 kDa 또는 5 kDa 내지 60 kDa의 분자량을 갖는다. 임의의 상기 범위 내의 임의의 전체 정수는 본 발명의 양태로서 고려된다.
본원에 사용된 용어 다당류 또는 담체 단백질-다당류 접합체의 "분자량"은 다각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.
다당류는 보통의 정제 절체 동안 약간 감소할 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 다당류는 접합 전 사이징 기법을 거칠 수 있다. 기계적 또는 화학적 사이징이 사용될 수 있다. 화학적 가수분해가 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 사이징은 고압 균질화 전단(High Pressure Homogenization Shearing)을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 언급된 분자량 범위는 접합 전(예컨대 활성화 전) 정제된 다당류를 지칭한다.
에셔리키아 콜라이 혈청군/혈청형 및 O-단위 모이어티
혈청군/혈청형　 모이어티 구조(O-단위) 본원에서 지칭되는 모이어티 구조　
O1A, O1A1　 [→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-ManNAc-(1→2)] n 식 O1A
O1B　 [→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-ManNAc-(1→2)] n 　 식 O1B　
O1C　 [→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-ManNAc-(1→2)] n 식 O1C　
O2　 [→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-d-Fuc3NAc-(1→2)] n 식 O2　
O3　 [β-l-RhaNAc(1→4)α-d-Glc-(1→4)｜｜→3)-β-d-GlcNAc-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O3　
O4:K52　 [→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→] n 　 식 O4:K52　
O4:K6　 [α-d-Glc-(1→3)｜→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→] n 식 O4:K6　
O5ab　 [→4)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc(1→] n 　 식 O5ab　
O5ac(균주 180/C3)　 [→2)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc(1→] n 식 O5ac(균주 180/C3)　
O6:K2; K13; K15　 [→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-Glc-(1→2)] n 식 O6:K2; K13; K15　
O6:K54　 [→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-GlcNAc-(1→2)] n 식 O6:K54　
O7　 [α-l-Rha-(1→3)｜→3)-β-d-Qui4NAc-(1→2)-α-d-Man-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O7　
O10　 [→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-d-Fuc4N아실-(1→2) 아실=아세틸(60%) 또는 (R)-3-하이드록시부티릴(40%)] n 식 O10　
O16　 [→2)-β-d-Galf-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-Rha2Ac-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O16　
O17　 [α-d-Glc-(1→6)｜→6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→] n 식 O17　
O18A, O18ac　 [→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-GlcNAc-(1→3)] n 식 O18A, 식 O18ac　
O18A1　 [α-d-Glc-(1→6)｜→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-GlcNAc-(1→3)] n 식 O18A1　
O18B　 [→3)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-Glc-(1→3)] n 　 식 O18B　
O18B1　 [α-d-Glc-(1→4)｜→3)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→｜β-d-Glc-(1→3)] n 식 O18B1　
O21　 [β-d-Gal-(1→4)｜→3)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→｜β-d-GlcNAc-(1→2)] n 　 식 O21　
O23A　 [α-d-Glc-(1→6)｜→6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-GlcNAc(1→3)] n 식 O23A　
O24　 [→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→｜α-d-Glc-(1→2)] n 식 O24　
O25/O25a　 [β-d-Glc-(1→6)｜→4)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-l-Rha-(1→3)] n 식 O25a　
O25b β-Glcp-
1
↓
6
[α-Rhap-(1→3)-α-Glcp-(1→3)-α-Rhap2OAc-(1→3)-β-GlcpNAc-] n 		식 O25b　
O26　 [→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O26　
O28　 [→2)-(R)-Gro-1-P→4)-β-d-GlcNAc-(1→3)-β-d-Galf2Ac-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O28　
O36 [α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Fucp
1
↓
3
→4)-α-D-Manp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n 		식 O36
O44　 [α-d-Glc-(1→4)｜→6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→] n 식 O44　
O45　 [→2)-β-d-Glc-(1→3)-α-l-6dTal2Ac-(1→3)-α-d-FucNAc-(1→] n 식 O45　
O45rel　 [→2)-β-d-Glc-(1→3)-α-l-6dTal2Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O45rel　
O54 [→4)-α-d-GalpA-(1→2)-α-l-Rhap-(1→2)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Galp-(1→3)-β-d-GlcpNAc-(1→]n 식 O54
O55　 [→6)-β-d-GlcNAc-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→｜α-Col-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)] n 식 O55　
O56　 [→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-d-Gal-(1→2)] n 식 O56　
O57 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GlcpNAc-(1→]n
2 4
↑ ↑
1 1
α-D-GalpA2/3Ac β-D-Glcp 		식 O57
O58　 [3-O-[(R)-1-카복시ethyl]-α-l-Rha-(1→3)｜→4)-α-d-Man-(1→4)-α-d-Man2Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O58　
O64　 [β-d-Gal-(1→6)｜→3)-α-d-ManNAc-(1→3)-β-d-GlcA-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→] n 식 O64　
O68 [α-L-Rhap α-D-Glcp
1 1
↓ ↓
3 3
→6)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-β-D-Manp-(1→3)-α-D-GlcpNAC-(1→]n 		식 O68
O69　 [→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O69　
O73(균주 73-1)　 [α-d-Glc-(1→3)｜→4)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GalNAc(1→] n 식 O73(균주 73-1)　
O74 →6)-α-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GalpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n
[β-D-Fucp3NAc-(1→3)		 식 O74
O75　 [β-d-Man-(1→4)｜→3)-α-d-Gal-(1→4)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O75　
O76 [→4)-β-d-GlcpA-(1→4)-β-d-GalpNAc3Ac-(1→4)-α-d-GalpNAc-(1→3)-β-d-GalpNAc-(1→]n 식 O76
O77　 [→6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→] n 식 O77　
O78　 [→4)-β-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-Man-(1→4)-α-d-Man-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O78　
O86　 [α-d-Gal-(1→3)｜→4)-α-l-Fuc-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O86　
O88　 [α-l-6dTal-(1→3)｜→4)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O88　
O90　 [→4)-α-l-Fuc2/3Ac-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O90　
O98　 [→3)-α-l-QuiNAc-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-α-l-QuiNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O98　
O104　 [→4)-α-d-Gal-(1→4)-α-Neu5,7,9Ac3-(2→3)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 　 식 O104　
O111　 [α-Col-(1→6)｜→4)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-Col-(1→3)] n 식 O111　
O113　 [→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-Gal-(1→3)] n 식 O113　
O114　 [→4)-β-d-Qui3N(N-아세틸-l-세릴)-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→] n 식 O114　
O119　 [β-d-RhaNAc3NFo-(1→3)｜→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-Gal-(1→4)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O119　
O121　 [→3)-β-d-Qui4N(N-아세틸-glycyl)-(1→4)-α-d-GalNAc3AcA6N-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O121　
O124　 [4-O-[(R)-1-카복시ethyl]-β-d-Glc-(1→6)-α-d-Glc(1→4) ｜→3)-α-d-Gal-(1→6)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O124　
O125　 [α-d-Glc-(1→3)｜→4)-β-d-GalNAc-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-l-Fuc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→｜β-d-Gal-(1→3)] n 식 O125　
O126　 [→2)-β-d-Man-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-l-Fuc-(1→2)] n 식 O126　
O127　 [→2)-α-l-Fuc-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→] n 식 O127　
O128　 [α-l-Fuc-(1→2)｜→6)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O128　
O136　 [→4)-β-Pse5Ac7Ac-(2→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→β-Pse5Ac7Ac=5,7-다이아세트아미도-3,5,7,9-테트라데옥시-l-글리세로-β-l-만노-노눌로손산(nonulosonic acid)] n 식 O136　
O138　 [→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O138　
O140 [α-D-Galf-(1→2)-α-L-Rhap
1
↓
4
→3)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→]n 		식 O140
O141　 [α-l-Rha-(1→3) ｜→4)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man6Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜β-d-GlcA-(1→2)] n 식 O141　
O142　 [→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→｜β-d-GlcNAc-(1→3)] n 식 O142　
O143　 [→2)-β-d-GalA6R3,4Ac-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ R=1,3-다이하이드록시-2-프로필아미노] n 식 O143　
O147　 [→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→4)-β-d-GalA-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O147　
O149　 [→3)-β-d-GlcNAc-(S)-4,6Py-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→(S)-4,6Py=4,6-O-[(S)-1-카복시에틸리덴]-] n 식 O149　
O152　 [β-l-Rha-(1→4)｜→3)-α-d-GlcNAc-(1-P→6)-α-d-Glc-(1→2)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O152　
O157　 [→2)-α-d-Rha4NAc-(1→3)-α-l-Fuc-(1→4)-β-d-Glc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→] n 식 O157　
O158　 [α-d-Glc-(1→6)｜→4)-α-d-Glc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→｜α-l-Rha-(1→3)] n 식 O158　
O159　 [α-l-Fuc-(1→4)｜→3)-β-d-GlcNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-α-l-Fuc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O159　
O164　 [β-d-Glc-(1→6)-α-d-Glc(1→4)｜→3)-β-d-Gal-(1→6)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 식 O164　
O173　 [α-l-Fuc-(1→4)｜→3)-α-d-Glc-(1-P→6)-α-d-Glc-(1→2)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 　 식 O173　
62D1, 에르위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)로서 제안됨　 [α-d-Gal(1→6)｜→2)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-FucNAc-(1→] n 식 62D1
O22　 [→6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→4)-β-d-GalNAc3Ac-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→] n 　 식 O22　
O35　 [→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→｜α-d-GalNAcA6N-(1→2)] n 식 O35　
O65　 [→2)-β-d-Qui3NAc-(1→4)-α-d-GalA6N-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-β-d-GalA-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O65　
O66　 [→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→2)-β-d-Glc3Ac-(1→3)-α-l-6dTal-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→] n 식 O66　
O83　 [→6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→6)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O83　
O91　 [→4)-α-d-Qui3N아실-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-GlcA6NGly-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ 아실=(R)-3-하이드록시부티릴] n 식 O91　
O105　 [β-d-Ribf-(1→3) ｜→4)-α-d-GlcA2Ac3Ac-(1→2)-α-l-Rha4Ac-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc6Ac-(1→] n 식 O105　
O116　 [→2)-β-d-Qui4NAc-(1→6)-α-d-GlcNAc-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O116　
O117　 [→4)-β-d-GalNAc-(1→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→] n 　 식 O117　
O139　 [β-d-Glc-(1→3)｜→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-GalA-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O139　
O153　 [→2)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-α-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O153　
O167　 [α-d-Galf-(1→4)｜→2)-β-d-GalA6N(l)Ala-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→2)-β-d-Galf-(1→5)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→] n 식 O167　
O172　 [→3)-α-l-FucNAc-(1→4)-α-d-Glc6Ac-(1-P→4)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→] n 식 O172　
O8　 [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-β-d-Man-(1→] n 식 O8
O9a　 [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→] n 식 O9a
O9　 [→2)-[α-d-Man-(1→2)]2-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→] n 식 O9
O20ab　 [→2)-β-d-Ribf-(1→4)-α-d-Gal-(1→] n 식 O20ab
O20ac　 [α-d-Gal-(1→3)｜→2)-β-d-Ribf-(1→4)-α-d-Gal-(1→] n 식 O20ac
O52　 [→3)-β-d-Fucf-(1→3)-β-d-6dmanHep2Ac-(1→] n 식 O52
O97　 [→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→ ｜｜ β-d-Xulf-(2→2)β-d-Xulf-(2→2)] n 식 O97
† β-d-6dmanHep2Ac는 2-O-아세틸-6-데옥시-β-d-만노-헵토피라노실임.
‡ β-d-Xulf는 β-d-트레오(threo)-펜토퓨라노실임.
코어 올리고당류
코어 올리고당류는 야생형 에셔리키아 콜라이 LPS의 지질 A와 O-항원 사이에 위치한다. 보다 구체적으로, 코어 올리고당류는 다당류의 부분이고, 이는 야생형 에셔리키아 콜라이의 O-항원과 지질 A 사이에 결합을 포함한다. 상기 결합은 가장 내부의 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 잔기의 헤미케탈(hemiketal) 작용기와 지질 A의 GlcNAc-잔기의 하이드록실 기 사이의 케토시드성(ketosidic) 결합을 포함한다. 코어 올리고당류 영역은 야생형 에셔리키아 콜라이 균주 중 고도의 유사성을 나타낸다. 통상적으로, 이는 제한된 수의 당을 포함한다. 코어 올리고당류는 내부 코어 영역 및 외부 코어 영역을 포함한다.
보다 구체적으로, 내부 코어는 주로 L-글리세로-D-만노-헵토스(헵토스) 및 KDO 잔기로 구성된다. 내부 코어는 고도로 보존된다. KDO 잔기는 하기 식 KDO를 포함한다.
Figure pct00001
코어 올리고당류의 외부 영역은 내부 코어 영역보다 많은 변형, 및 에셔리키아 콜라이에서 5개의 화학형을 차별화하는 상기 영역에서의 차이를 나타낸다: R1, R2, R3, R4 및 K-12. HepII는 내부 코어 올리고당류의 마지막 잔기이다. 외부 코어 올리고당류 모두는 구조적 테마(theme)를 공유하지만((헥소스)3 탄수화물 골격 및 2개의 측쇄 잔기), 골격 및 성질, 위치, 및 측쇄 잔기의 연결에 있어서의 헥소스의 순서는 모두 상이할 수 있다. R1 및 R4 외부 코어 올리고당류에 대한 구조는 매우 유사하되, 단지 단일 β-연결된 잔기에서만 상이하다.
야생형 에셔리키아 콜라이의 코어 올리고당류는 원위(distal) 올리고당류의 구조에 근거한 기술분야 내에서 하기 5개의 상이한 화학형으로 분류된다: 에셔리키아 콜라이 R1, 에셔리키아 콜라이 R2, 에셔리키아 콜라이 R3, 에셔리키아 콜라이 R4 및 에셔리키아 콜라이 K12.
바람직한 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 당접합체를 포함하고, 이때, O-다당류는 O-항원에 결합된 코어 올리고당류를 포함한다. 한 양태에서, 조성물은 코어 에셔리키아 콜라이 화학형 에셔리키아 콜라이 R1, 에셔리키아 콜라이 R2, 에셔리키아 콜라이 R3, 에셔리키아 콜라이 R4 및 에셔리키아 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 최소 2개의 코어 에셔리키아 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 최소 3개의 코어 에셔리키아 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 최소 4개의 코어 에셔리키아 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 5개 모두의 코어 에셔리키아 콜라이 화학형에 대한 면역 반응을 유도한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 당접합체를 포함하고, 이때, O-다당류는 O-항원에 결합된 코어 올리고당류를 포함하지 않는다. 한 양태에서, 코어 올리고당류를 포함하지 않는 O-다당류를 갖는 당접합체에 불구하고, 조성물은 코어 에셔리키아 콜라이 화학형 에셔리키아 콜라이 R1, 에셔리키아 콜라이 R2, 에셔리키아 콜라이 R3, 에셔리키아 콜라이 R4 및 에셔리키아 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도한다.
에셔리키아 콜라이 혈청형은 5개의 화학형 중 1개에 따라 특성규명될 수 있다. 표 2는 화학형에 따라 특성규명된 예시적인 혈청형을 제시한다. 굵은 글씨체의 혈청형은 지시되는 코어 화학형과 가장 빈번히 관련되는 혈청형을 표시한다. 따라서, 바람직한 양태에서, 조성물은 코어 에셔리키아 콜라이 화학형 에셔리키아 콜라이 R1, 에셔리키아 콜라이 R2, 에셔리키아 콜라이 R3, 에셔리키아 콜라이 R4 및 에셔리키아 콜라이 K12 중 적어도 어느 하나에 대한 면역 반응을 유도하고, 이는 각각의 상응하는 에셔리키아 콜라이 혈청형 중 어느 하나에 대한 면역 반응을 포함한다.
코어 혈청형 및 관련된 에셔리키아 콜라이 혈청형
코어 화학형 혈청형
R1 O25a, O6, O2, O1, O75, O4, O16, O8, O18, O9, O13, O20, O21, O91 및 O163.
R2 O21, O44, O11, O89, O162, O9
R3 O25b, O15, O153, O21, O17, O11, O159, O22 O86, O93
R4 O2, O1, O86, O7, O102, O160, O166
K-12 O25b, O16
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 식 O25a, 식 O6, 식 O2, 식 O1, 식 O75, 식 O4, 식 O16, 식 O8, 식 O18, 식 O9, 식 O13, 식 O20, 식 O21, 식 O91 및 식 O163을 갖는 당류로부터 선택되는 R1 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 100이다. 일부 양태에서 상기 조성물 중 당류는 에셔리키아 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 식 O25a, 식 O6, 식 O2, 식 O1, 식 O75, 식 O4, 식 O16, 식 O18, 식 O13, 식 O20, 식 O21, 식 O91 및 식 O163을 갖는 당류로부터 선택되는 R1 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 당류는 당류 내에 에셔리키아 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 식 O21, 식 O44, 식 O11, 식 O89, 식 O162 및 식 O9를 갖는 당류로부터 선택되는 R2 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 당류는 당류 내에 에셔리키아 콜라이 R2 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 식 O25b, 식 O15, 식 O153, 식 O21, 식 O17, 식 O11, 식 O159, 식 O22, 식 O86 및 식 O93을 갖는 당류로부터 선택되는 R3 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 당류는 당류 내에 에셔리키아 콜라이 R3 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 예컨대 식 O2, 식 O1, 식 O86, 식 O7, 식 O102, 식 O160 및 식 O166을 갖는 당류로부터 선택되는 R4 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 100, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 당류는 당류 내에 에셔리키아 콜라이 R4 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 K-12 화학형(예컨대 식 O25b를 갖는 당류 및 식 O16을 갖는 당류로부터 선택됨)을 갖는 당류로부터 선택되는 R4 화학형을 갖는 혈청형으로부터 유도된 구조를 포함하는 당류를 포함하고, 이때 n은 1 내지 1000, 바람직하게는 31 내지 100, 보다 바람직하게는 35 내지 90, 가장 바람직하게는 35 내지 65이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 당류는 당류 내에 에셔리키아 콜라이 K-12 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 당류는 코어 당류를 포함한다. 따라서, 한 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R1 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R2 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R3 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R4 코어 모이어티를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 K12 코어 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 당류는 코어 당류를 포함하지 않는다. 따라서, 한 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R1 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R2 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R3 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 R4 코어 모이어티를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, O-다당류는 에셔리키아 콜라이 K12 코어 모이어티를 포함하지 않는다.
클레브시엘라 뉴모니에로부터 유래하는 당류 및/또는 폴리펩티드 또는 이의 단편
클레브시엘라 뉴모니에는 요관 감염, 균혈증 및 폐혈증을 야기하는 것으로 공지된 그람 음성 병원체이다. 한 양상에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 O1(및 d-Gal-III 변이체), O2(및 d-Gal-III 변이체), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 및 O12로부터 선택되는 최소 1개의 클레브시엘라 뉴모니에 혈청형이거나 이로부터 유래하는 최소 1개의 당류를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본원에 개시된 임의의 조성물은 클레브시엘라 뉴모니에 타입 I 섬모(fimbrial) 단백질 또는 이의 면역원성 단편으로부터 유래하는 폴리펩티드; 및 클레브시엘라 뉴모니에 타입 III 섬모 단백질 또는 이의 면역원성 단편으로부터 선택되는 클레브시엘라 뉴모니에로부터 유래하는 폴리펩티드를 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 클레브시엘라 뉴모니에 O1 및 O2 항원은 동종중합체 갈락토스 단위(또는 갈락탄)을 함유한다. 클레브시엘라 뉴모니에 O1 및 O2 항원 각각은 D-갈락탄 I 단위(종종 O2a 반복 단위로서 지칭됨)를 함유하지만, O1 항원은 D-갈락탄 II 캡(cap) 구조를 갖는다는 점에서 상이하다. D-갈락탄 III(d-Gal-III)은 D-갈락탄 IO1 항원의 변이체이다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O1로부터 유래하는 당류는 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O1로부터 유래하는 당류는 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O1로부터 유래하는 당류는 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위, 및 [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O1로부터 유래하는 당류는 [→3)-β-D-Galf-(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→]의 반복 단위(D-Gal-III 반복 단위로서 지칭됨)를 포함한다.
일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O2로부터 유래하는 당류는 [→3)-α-Galp-(1→3)-β-Galf-(1→]의 반복 단위(클레브시엘라 뉴모니에 혈청형 O2a 항원의 요소(element)일 수 있음)를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O2로부터 유래하는 당류는 [→3)-β-GlcpNAc-(1→5)-β-Galf-(1→]의 반복 단위(클레브시엘라 뉴모니에 혈청형 O2c 항원의 요소일 수 있음)를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O2로부터 유래하는 당류는 (1→4)-연결된 Galp 잔기의 측쇄 첨가에 의한 O2a 반복 단위의 변형(클레브시엘라 뉴모니에 혈청형 O2afg 항원의 요소일 수 있음)을 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O2로부터 유래하는 당류는 (1→2)-연결된 Galp 잔기의 측쇄 첨가에 의한 O2a 반복 단위의 변형(클레브시엘라 뉴모니에 혈청형 O2aeh 항원의 요소일 수 있음)을 포함한다.
메커니즘 또는 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 클레브시엘라 뉴모니에 혈청형의 O-항원 다당류 구조는 각각 에셔리키아 콜라이 혈청형 O9a(식 O9a) 및 O8(식 O8)과 동일한 것으로 당업계에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O4로부터 유래하는 당류는 [→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]의 반복 단위를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O4로부터 유래하는 당류는 [→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]의 반복 단위를 포함한다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O8 혈청형으로부터 유래하는 당류는 클레브시엘라 뉴모니에 O2a와 동일한 반복 단위 구조를 포함하지만, 비화학량론적으로 O-아세틸화된다. 일부 양태에서, 클레브시엘라 뉴모니에 O12 혈청형으로부터 유래하는 당류는 [α-Rhap-(1 →3)-β-GlcpNAc]의 반복 단위를 포함한다.
[표 1a]
클레브시 엘라 뉴모니에 혈청군/ 혈청형 및 O-단위 모이어티
Figure pct00002
본원에 사용된 용어 "약"은 값, 예컨대 언급된 농도 범위, 시간 틀, 분자량, 온도 또는 pH의 통계적으로 유의한 범위 내를 의미한다. 이러한 범위는 차수(order of magnitude) 내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 보다 더 전형적으로 5% 이내 또는 1% 이내의 소정 값 또는 범위일 수 있다. 일부 경우, 이러한 범위는소정 값 또는 범위의 측정 및/또는 결정에 사용되는 표준적인 방법의 전형적인 시험 오차 내일 수 있다. 용어 "약"에 의해 포괄되는 허용가능한 변동은 연구의 특정 시스템에 의존할 것이고, 당업자에게 용이하게 이해될 수 있다. 본원에서 범위가 언급되는 경우마다, 상기 범위 내의 모든 수도 본 발명의 양태로서 간주된다.
본원에서 용어 "포함하는" 및 "포함한다"는 매 경우마다 용어 "~로 본질적으로 이루어진", "~로 본질적으로 이루어진다", "~로 이루어지는" 및 "~로 이루어진다"로 임의적으로 대체가능하도록 본 발명자들에 의해 의도된 것이다.
"면역원성 양", "면역적 효과량", "치료 효과량", "예방 효과량" 또는 "용량" 각각은 본원에서 상호대체가능하게 사용되고, 일반적으로는 면역 반응, 즉 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응, 또는 둘다를 유발하기에 충분한 양의 항원 또는 면역원성 조성물을 지칭하고, 이는 당업자에게 공지된 표준적인 분석에 의해 측정되는 바와 같다.
본원의 임의의 범위 내의 전체 정수는 본 발명의 양태로서 간주된다.
본원에 인용된 모든 참조 또는 특허 출원은 본원에 참조로 혼입된다.
본 발명은 하기 실시예에 예시된다. 하기 실시예는 달리 상세 설명되지 않는 경우를 제외하고는, 당업자에게 공지되고 통상적인 표준 기법을 사용하여 수행된다. 실시예는 예시적인 것이고, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 에셔리키아 콜라이(이. 콜라이) 및 살모넬라 엔테리카 균주
임상 균주 및 유도체가 하기 표 3에 열거된다. 추가의 참조 균주는 O25K5H1, 임상 O25a 혈청형 균주; 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 균주 LT2를 포함한다.
에셔리키아 콜라이(Escherichia coli, E. coli) 균주에서의 유전자 녹아웃(이는, 표적화된 개방-판독 프레임을 제거하지만, 짧은 scar 서열을 남김)을 구성하였다.
후속적으로, 가수분해된 O-항원 쇄와 핵심 당은, 단순함을 위해, O-다당류(OPS)로 표시된다.
Figure pct00003
실시예 2: WZZB , FEPE 및 O-항원 유전자 클러스터 클로닝을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머
Figure pct00004
실시예 3: 플라스미드
플라스미드 벡터 및 서브클론이 하기 표 5에 열거된다. 다양한 에셔리키아 콜라이 및 살모넬라 wzzB 및 fepE 유전자를 포함하는 PCR 단편을 정제된 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 인비트로겐(Invitrogen) PCR(등록상표)블런트(Blunt) 클로닝 키트에 제공된 고 복제수(copy number) 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 상기 플라스미드는 pUC 레플리콘을 기반으로 하다. 프라이머 P3 및 P4를 사용하여, 에셔리키아 콜라이 wzzB 유전자를 이의 고유 프로모터로 증폭시켰으며, 각각 UDP-글루코스-6-탈수소효소 및 포스포리보실아데닌 뉴클레오티드 가수분해효소를 코딩하는 근위 및 원위 유전자의 영역에 결합하도록 설계하였다(진뱅크(Genbank) MG1655 NC_000913.3에 주석을 달음). 살모넬라 fepE 유전자와 프로모터를 함유하는 PCR 단편을, 전술된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 이용가능한 진뱅크게놈 서열 또는 내부적으로 생성된 전체 게놈 데이터(GAR2401 및 O25K5H1의 경우)를 기반으로 유사(analogous) 에셔리키아 콜라이 fepE 프라이머를 설계하였다. 저 복제수 플라스미드 pBAD33을 사용하여, 아라비노스 프로모터의 제어 하에 O-항원 생합성 유전자를 발현시켰다. 먼저, 5' 프로모터 및 3',6-포스포글루코네이트 탈수소효소(gnd) 유전자에 상동인 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭된 긴 PCR 단편의 클로닝(깁슨(Gibson) 방법을 통해)을 용이하게 하도록, 상기 플라스미드를 변형시켰다.
Figure pct00005
실시예 4: O-항원 정제
발효 배양액(fermentation broth)을 아세트산으로 최종 농도 1 내지 2%(최종 pH 4.1)로 처리하였다. 이렇게 산-처리된 배양액을 2시간 동안 100℃로 가열함으로써, OAg의 추출 및 탈지질화를 달성하였다. 산 가수분해가 끝날 무렵에, 이 배치(batch)를 주위 온도로 냉각시키고, 14% NH4OH를 최종 pH 6.1까지 가했다. 이렇게 중화된 배양액을 원심분리하고, 농축액을 수집하였다. 상기 농축액에 인산나트륨 중 CaCl2를 가하고, 생성된 슬러리를 실온에서 30분 동안 배양하였다.
원심분리에 의해 고체를 제거하고, 이 농축액을 10-kDa 막(membrane)을 사용하여 12배 농축하고, 이어서 물에 대해 2회의 정용여과를 수행하였다. 이어서, OAg를 함유하는 미투과물(retentate)을 탄소 필터를 사용하여 정제하였다. 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트로 1:1(v/v) 희석하였다. 최종 암모늄 설페이트 농도는 2 M이었다. 이렇게 암모늄 설페이트-처리된 탄소 여액을, 유동 완충액으로서의 2 M 암모늄 설페이트를 갖는 막을 사용하여 추가로 정제하였다. OAg를 유동 관통(flow through) 중에 수집하였다. 긴 OAg의 경우, HIC 여액을 농축하고, 이어서 5-kDa 막을 사용하여 물(20 정용여과 부피(diavolume))에 대해 완충액을 교환하였다. 짧은(고유) OAg 다당류의 경우, MWCO를 추가로 줄여 수율을 높였다.
또 다른 실시양태에서, 원심분리에 의해 고체를 제거하고, 이 농축액을 10-kDa 막을 사용하여 12배 농축하고, 이어서 물 또는 20 내지 25 mM NaCl(pH 7.2 내지 7)을 함유하는 20 내지 25 mM Tris 완충액에 대해 2회의 정용여과를 수행하였다. 이어서, OAg를 함유하는 미투과물을 탄소 필터를 사용하여 정제하였다. 탄소 여액을 이온교환(IEX) 막 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 이어서, IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트로 1:1(v/v) 희석하였다. 최종 암모늄 설페이트 농도는 2 M이었다. 이렇게 암모늄 설페이트-처리된 IEX 여액을, 유동 완충액으로서의 2 M 암모늄 설페이트를 갖는 HIC 막을 사용하여 추가로 정제하였다. OAg를 유동 관통 중에 수집하였다. HIC 여액을 농축하고, 이어서 5-kDa 막을 사용하여 물(20 정용여과 부피)에 대해 완충액을 교환하였다.
실시예 5 내지 17의 배경: 본원에 예시된 실시예는, 내부/외부 올리고당을 함유할 수 있는 모든 혈청형의 O-항원 다당류(O-항원 또는 O-Ag로도 지칭됨)를 정제하기 위한 플랫폼-기반 공정을 보여준다.
본원에 기재된 정제 공정은 단쇄 및 장쇄 O-Ag 다당류 둘 다에 적용할 수 있다. 본원에 제공된 대부분의 실시예는, 각각 에셔리키아 콜라이 혈청형 O8 및 O9에 대한 단쇄 O-Ag인 실시예 10 및 11을 제외하고는, 장쇄 O-Ag에 대한 것이다.
실시예 5: 에셔리키아 콜라이 O-항원 다당류의 정제 방법
1. O-항원의 방출
본 과정은, 발효 완료 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 상기 O-Ag를 방출시킨다. 이는, 혈청형 O25b 세포 배양의 조질 현탁액을 아세트산으로 1.0%(v/v)의 최종 농도로 처리함으로써(이는 pH가 약 4.0이 되게 함) 달성하였다. 이어서, 이 산성 배양액을 100℃의 온도로 가열하고 2.0시간 동안 배양하였다. 생성물이 방출된 후, 이 배치를 20 내지 30℃의 주위 온도로 냉각시켰다.
O25b O-Ag에 대한 방출 조건을 추가로 개선하기 위해, pH, 온도, %KDO에 대한 유지 시간, 농도, 분자량(MW) 및 O-아세테이트의 영향을 조사하도록 실험 계획(DOE)을 설정하였다. DOE 연구에서 조사된 인자가 하기 표 1-1에 제시된다. 본 연구의 경우, 초기 농도, KDO의 상한 및 O-아세테이트의 상한을 각각 3.5 mg/mL, 2% 및 1.0 mM로 설정하였다.
Figure pct00006
각각 1.0, 2.0, 2.5 및 4.0시간의 시점에서 농도, %KDO 및 O-아세테이트의 예측 반응을 평가하였다. 80℃의 온도 조건(이 경우, MW가 큼)을 제외하고 모든 조건에서 분자량은 약 50 내지 54 kDa로 단조로웠다. 이는 아마도 생성물의 불완전한 방출로 인한 것일 수 있으며, 이 경우 O-Ag는 세포 성분 또는 기타 비-특이적 표면 다당류와 관련일 있을 수 있다. 따라서, DOE 모델은 상기 조건에서 MW에 대한 예측 응답을 제공할 수 없다. 4.0시간의 시점에서는, 상기 범위 내에 %KDO가 없었다.
상기 DOE 결과를 기반으로, 산 가수분해 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 유지 시간으로 재설정하였다. 이러한 방출 조건을 후속 실시예에서 O-Ag 다당류의 다른 모든 혈청형에 사용하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 상기 방출된 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 청징(clarification) 장치 조작의 효율성을 향상시킨다. 상기 단계 1로부터의 생성물의 방출 후 산성화된 배양액을 10% 명반(Alum) 용액으로 최종 농도 2%(w/v)로 처리하고, 황산을 사용하여 pH를 추가로 3.2로 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 임의의 작은 입자를 제거하였다. 심층 여액은 UFDF-1의 초기 정제로 보냈다.
다르게는, 상기 산성화된 배양액을 pH 6.0 내지 7.0으로 중화시켰다. 중화된 여액을 12,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 중화된 상청액을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 상기 중화된 여액은 생성물 품질에 대한 부정적인 영향 없이 4℃에서 적어도 1주일 동안 저장할 수 있다. 상기 배치가 정제될 준비가 되면, 상기 중화된 여액을 전술된 단락에 기재된 응집 과정으로 처리할 것이다. 본 실시예에 예시된 후속 정제 단계는, 달리 제시되지 않는 한, 이러한 응집 방법을 사용한다.
생성물을 함유하는 중화된 여액과 응집 후 심층 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그래피 프로파일의 비교를 수행하였다. 굴절률(RI) 및 UV 280 검출 결과 둘 다로부터, 상기 응집 단계는 발효 배지로부터 유래된 상당량의 불순물을 제거하였다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 2로부터의 심층 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트(Sartocon Hydrosart) 막을 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 처리되는 심층 여액의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 이러한 조작의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 이들 정용여과 단계 둘 다에 대해 10이었다. UFDF로부터의 미투과물을 수집하고, 분석하였다. UFDF 실행 동안의 전도도 및 UV 프로파일은, 투과액에 대한 UV 신호의 상당한 강하로 입증되는 바와 같이, 대부분의 저분자량 뿐만 아니라 UV-관련 불순물이 본 제1 정용여과 동안 제거되었음을 나타낸다. RI 및 UV 검출 둘 다에 대해 심층 여액과 UFDF-1 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준도 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터는, 탄소 필터 면적(m2) 당, UFDF-1 미투과물으로부터의 약 150 g의 O-Ag 적재량(loading)으로 사용하였다. 상기 탄소 필터를 먼저 물로 세척하고, 이어서 필터 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 정용여과 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liters per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 필터를 상기 완충액으로 세척하고, 생성물을 함유하는 세척액을 포함하는 여액을 탄소 여액으로서 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물 및 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI 및 UV280 관련 불순물이 제거되었고 탄소 여액이 시각적으로 무색이 되었음을 나타냈다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 원래, 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위한 혈청형 O2 및 O6 O-항원을 위해 개발되었다(실시예 6 및 15 참조). 따라서, 이온교환(IEX) 막 크로마토그래피를 사용하여 이들 분자의 정전기적 상호작용 특성을 조사함으로써, 비-혈청형 특이적 외부 또는 세포내 다당류로부터 불순물을 제거할 수 있다.
여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어(Millipure)의 나트리플로(NatriFlo) 막 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤(Sartorius Stedim)의 사르토바인드(Sartobind) Q 막도 사용할 수 있다. 본원에 예시된 모든 실시예는, 달리 제시되지 않는 한, IEX 막 크로마토그래피에 나트리플로 막(또는 이후에 HD-Q로 지칭됨)을 사용하였다.
상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이전 단계로부터의 탄소 여액을, MV(mL) 당 탄소 여액 중 약 200 내지 250 mg의 O-Ag를 사용하여, 30 내지 40 mL/min의 유속으로 상기 막을 통해 펌핑하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 20 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.2)의 고 염 완충액으로 세척하였다. IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV280 프로파일을 수득하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척 동안 용리된 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다.
상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 세척 크로마토그램이 생성물 피크와 동일한 체류 시간에 작은 피크를 나타냄을 보여준다. 이는, 상기 미지의 성분이 O25b O-Ag보다 더 강한 이온 강도를 가짐을 시사하다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 단계 4로부터의 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트(AS)의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 상기 AS-처리된 탄소 여액을 40-mL/분의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 상기 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 완충액 세척액과 함께 유동 관통 유출물을 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 다르게는, 본 HIC 여과 단계를 또한 상기 단계 4로부터의 IEX 여액에 대해서도 수행할 수 있다.
HIC 정제를 위한 아크타 아밴트(AKTA Avant) 크로마토그래피 실행을 분석하였다. 생성물은 상기 유동 관통 유출물 중에 존재하였으며, 세척수에서 나타난 피크는 상기 HIC 막에 결합된 비-명시된 소수성 관련 불순물이었다. 상기 탄소 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상기 탄소 여액에 존재하는 작은 프론트 숄더(front shoulder) 불순물 피크가 본 HIC 여과 단계에 의해 제거되었음을 보여준다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 상기 생성물을 목적하는 농도로 농축하며, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합(conjugation)용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름(cross-flow) 속도 및 TMP는 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서의 투과액의 전도도 및 UV280 신호를 분석하였다. 10 DV 후, 상기 전도도는 정상 상태에 도달하였으며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다.
HIC 여액과 UFDF-2 후 최종 정제된 O25b O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 하기 표 1-2는 최종 정제된 O25b O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00007
실시예 6. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O6의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정의 완료 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출한다. O25b에 대해 수행된 DOE 연구(실시예 5 참조)에 기초하여, 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 유지 시간이다. 아세트산을 사용하였으며, 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
생성물 및 응집 후 심층 여액을 함유하는 산성화된 배양액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그래피 프로파일의 비교를 분석하였다. 굴절률(RI) 및 UV 280 검출은, 본 응집 단계가 발효 배지로부터 유래된 상당량의 불순물을 제거했음을 나타낸다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 2로부터의 심층 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 20 및 10이었다. 심층 여액과 UFDF-1 미투과물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교는, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 불순물이 본 정용여과 동안 제거되었음을 나타낸다. 그러나, RI 크로마토그램에서 생성물 피크와 관련된 큰 프론트 숄더 불순물 피크가 존재하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소 필터를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액에서 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 단일 통과 방식으로 여과하였다. 이어서, 상기 필터를 상기 완충액으로 세척하고, 생성물을 함유하는 여액/세척액을 수집하였다. 상기 UFDF 미투과물 및 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI 및 UV280 관련 불순물이 제거되었고 탄소 여액이 문언적으로 무색이 되었음을 보여준다. 그러나, 탄소 여액에는 여전히 프론트 숄더 불순물 피크가 존재하였다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). HD-Q 막을 먼저, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV)의 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 100 내지 250 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(20 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.2)으로 세척하였다.
상기 탄소 여액 및 IEX 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 생성물 피크와 관련된 큰 프론트 숄더 피크가 탄소 여액으로부터 제거되었음을 나타낸다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 이전 단계로부터의 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막을 통해 여과하였다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
상기 HIC 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상기 탄소 여액에 존재하는 작은 프론트 숄더 불순물 피크가 본 HIC 여과 단계에 의해 제거되었음을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 이전 HIC 정제 단계로부터의 암모늄 설페이트를 바람직한 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 사리토리우스부터의 사르토콘 하이드로사르트의 5-kDa 분자량 컷오프 막을 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다.
HIC 여액 및 UFDF-2 분석 후 최종 정제된 O6 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 하기 표-2-1은 최종 정제된 O6 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00008
실시예 7. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O75의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10 및 15였다. 중화된 여액, 응집 후 심층 여액 및 UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 숙주 세포 단백질 및 저분자량 불순물을 제거하기 위한 응집 및 UFDF-1의 효과는 RI 및 UV280 크로마토그램 둘 다에 의해 입증되었다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액 세척액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상당량의 UV-관련 저분자량 불순물이 제거되었음을 보여준다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). IEX 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 200 내지 250 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(20 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.2)으로 세척하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일을 분석하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척액에서 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다.
상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 용리 샘플이 생성물 피크 아래에 이중 피크를 나타냄을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
상기 IEX 여액, HIC 여액, HIC 세척수 및 정제된 O75 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 세척수 샘플도 SEC-HPLC의 생성물과 동일한 체류 시간에 용리되는 피크를 나타냄을 보여주며, 이는, IEX 여액에 존재할 가능성이 있는 더 높은 소수성을 갖는 소량의 미지의 성분을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-1 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀(pool)을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O75 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표-3-1은 최종 정제된 O75 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00009
실시예 8. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O1의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag(실시예 5 참조)에 대해 수행된 DOE 결과에 기초하여, O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
응집 후 중화된 여액과 심층 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 이 데이터는, 상당량의 불순물이 본 응집 단계에 의해 제거되었음을 나타낸다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용한 한외여과 및 정용여과에 의한 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작한다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10 및 15였다. UFDF-1 후 심층 여액과 농축액의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 숙주 세포 단백질 및 저분자량 불순물을 제거하기 위한 응집 및 UFDF-1의 효과는 RI 및 UV280 크로마토그램 둘 다에 의해 입증되었다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 여과 후, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 세척액을 탄소 여액으로서 합쳤다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI 크로마토그래피 프로파일이 많이 변경되지 않았지만 상당량의 UV 및 색상 관련 불순물이 제거되었음을 나타낸다.
5. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거하고, 내독소 수준이 최소 수준으로 유지되도록 한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 상기 AS-처리된 탄소 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막을 통해 여과하였다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 탄소 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, SEC-HPLC 프로파일에 기초한 검출가능한 개선이 존재하지는 않지만 내독소 수준이 상당히 감소했음을 나타낸다.
6. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 사리토리우스부터의 사르토콘 하이드로사르트 5-kDa 막을 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-1로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O1 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 4-1은 최종 정제된 O1 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00010
실시예 9. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 15의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다. 응집 후 중화된 여액과 심층 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10이었다. 실제 실험 UFDF 실행은, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 불순물이 본 정용여과 동안 제거되었음을 나타내며, 이는 UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램에서도 입증되었다. 숙주 세포 단백질 및 저분자량 불순물을 제거하기 위한 응집 및 UFDF-1의 효과는 RI 및 UV280 크로마토그램 둘 다에 의해 입증되었다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상당량의 저분자량 불순물이 제거되었음을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 200 내지 250 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(25 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.5)으로 세척하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일을 분석하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척 동안 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다. 상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 용리 샘플이 생성물과 유사한 체류 시간에 작은 이중 피크를 나타냄을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. HIC 막 여과에 대한 전도도 및 UV의 크로마토그래피 프로파일을 분석하였다. 수세척 단계에서 가시적인 피크가 나타났으며, 이는, HIC 막에 결합된 미량의 비-명시된 소수성 성분을 나타낸다.
상기 IEX 여액, HIC 여액, HIC 수세척 및 정제된 O15 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 세척수 샘플이 SEC-HPLC에서 생성물보다 약간 전에 용리되는 이중 피크를 나타냈으며, 이는, 일부 미지의 성분이 HD-Q 스트림에 존재함을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호는, 10 DV 후 전도도가 정상 상태에 도달함을 나타내며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다. 최종 정제된 O15 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 5-1은 최종 정제된 O15 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00011
실시예 10. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O8의 정제
1. O-항원의 방출
혈청형 O8은 단쇄 O-항원이며, 분자량은 10 내지 15-kDa 범위일 것으로 예상된다. 그러나, 개시된 정제 과정이 모든 단쇄 에셔리키아 콜라이 O-Ag에도 적용된다. 본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10이었다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 탄소 여과 후 생성물 피크가 감소했다는 사실은, 탄소 필터가 비-특이적 흡착 모드로 설계되었음을 나타내는 것이다. 그럼에도 불구하고, 색 관련 불순물은 대부분 제거되었다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로(HD-Q) 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 200 내지 250 g의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(20 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.2)으로 세척하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일을 분석하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척 동안 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다.
상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 용리 샘플이 생성물과 유사한 체류 시간에 작은 이중 피크를 나타냄을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. HIC 막 여과에 대한 전도도 및 UV의 크로마토그래피 프로파일을 분석하였다. 수세척 단계에서 가시적인 피크가 나타났으며, 이는, HIC 막에 결합된 미량의 비-명시된 소수성 성분을 나타낸다.
상기 IEX 여액, HIC 여액, HIC 세척수 및 정제된 O8 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 세척수 샘플이 SEC-HPLC에서 생성물보다 약간 앞서 용리되는 이중 피크를 나타냄을 보여주었으며, 이는, HD-Q 스트림에 존재하는 단지 매우 소량의 미지의 성분을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 200 LMH 및 0.5 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O8 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 6-1은 최종 정제된 O8 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00012
실시예 11. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O9의 정제
1. O-항원의 방출
혈청형 O9는 또한 단쇄 O-항원이며, 분자량은 10 내지 15-kDa 범위일 것으로 예상된다. 개시된 정제 공정을 사용하였다. 본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다. 중화된 여액과 심층 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그래피 프로파일의 비교를 분석하였다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10이었다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 탄소 여과 후 생성물 피크가 감소했다는 사실은, 탄소 필터가 비-특이적 흡착 모드로 설계되었음을 나타내는 것이다. 그럼에도 불구하고, 색 관련 불순물은 대부분 제거되었다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로(HD-Q) 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 200 내지 250 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(20 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.2)으로 세척하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일을 분석하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척 동안 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다. 상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 용리 샘플이 생성물과 유사한 체류 시간에 작은 피크를 나타냄을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 상기 HIC 막 여과에 대한 전도도 및 UV의 크로마토그래피 프로파일을 분석하였다.
상기 IEX 여액, HIC 여액, HIC 세척수 및 정제된 O8 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 세척수 샘플이 RI 검출에서 가시적인 피크를 나타내지 않음을 보여주며, 이는, IEX 스트림에 소수성 관련 성분이 존재하지 않음을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 200 LMH 및 0.5 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O9 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 7-1은 최종 정제된 O9 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00013
실시예 12. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O21의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 18이었다. 실제 실험 UFDF 실행은, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 불순물이 본 정용여과 동안 제거되었음을 나타낸다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 숙주 세포 단백질 및 저분자량 불순물을 제거하기 위한 응집 및 UFDF-1의 효과는 RI 및 UV280 크로마토그램 둘 다에 의해 입증되었다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R55SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상당량의 UV-관련 저분자량 불순물이 제거되었음을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 150 내지 200 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액과 2단계 세척으로 세척하였으며, 제1 단계 세척은 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5) 완충액을 사용하였고, 제2 단계 세척은 25 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.5) 고 염 완충액을 사용하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일은, 상기 막에 결합된 일부 미지의 음-하전된 불순물이 존재하였고 후속적으로 용리 단계 동안 제거되었음을 나타낸다.
상기 탄소 여액, IEX 여액, 및 제1 및 제2 단계 세척 용리액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은 각각, 상기 세척 단계 샘플로부터의 두 용리액이 생성물의 프로파일과 다른 프로파일(RI 및 UV 크로마토그램 모두에서)을 나타냄을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 상기 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호는, 10 DV 후에 전도도가 정상 상태에 도달했음을 나타내며, 이는 완충액 교환의 완료를 나타낸다. 최종 정제된 O21 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 8-1은 최종 정제된 O21 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00014
실시예 13. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O4의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
본 단계의 주요 목적은, 생성물을 포함하는 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 정화 공정의 효율성을 향상시킨다. 실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액에 대해 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 기타 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다. 중화된 여액과 심층 여액의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 18이었다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R55SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 상당량의 UV-관련 저분자량 불순물이 제거되었음을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로(HD-Q) 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 150 내지 200 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액과 2단계 세척으로 세척하였으며, 제1 단계 세척은 20 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5) 완충액을 사용하였고, 제2 단계 세척은 25 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.5) 고 염 완충액을 사용하였다. 상기 탄소 여액 및 IEX 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 여액을 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하였으며, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
HIC 막 크로마토그래피 실행에 대한 전도도 및 UV 프로파일은, 소수성 관련 불순물이 HIC 막에 결합되었고 후속적으로 물로 세척되었음을 나타낸다. 상기 HIC 여액 및 HIC 세척에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O4 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 9-1은 최종 정제된 O4 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00015
실시예 14. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O2의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액으로부터 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 18이었다. 하기 표 10-1은, FDF-1의 UV 및 전도도 프로파일을 제시하며, 대부분의 UV-관련 저분자량 불순물이 본 제1 정용여과 동안 제거되었음을 알 수 있다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 75 내지 125 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 본 탄소 여과가 잔류 색 및 저분자량 불순물을 제거하는 데 매우 효과적임을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 50 내지 100 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액과 2단계 세척으로 세척하였으며, 제1 단계 세척은 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5) 완충액을 사용하였고, 제2 단계 세척은 25 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.5) 고 염 완충액을 사용하였다. IEX 막 크로마토그래피에 대한 UV 및 전도도 프로파일을 분석하였다. 이는, 고 염 세척 사이클에서 용리되어지는 피크가 존재함을 상술하며, 상기 막에 결합된 소량의 불순물이 있음을 나타낸다. 상기 탄소 여액 및 IEX 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 최종 농도 1.2 M로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 여액을 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하였으며, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 상기 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O2 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 10-1은 최종 정제된 O2 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00016
실시예 15. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O11의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액으로부터 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 18이었다. UFDF-1에 대한 UV 및 전도도 프로파일은, 대부분의 UV-관련 저분자량 불순물이 본 제1 정용여과 동안 제거되었음을 나타낸다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R55SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 방식으로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다. 상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 본 탄소 여과가 잔류 색 및 저분자량 불순물을 제거하는 데 매우 효과적임을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 100 내지 125 mg의 O-Ag로 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액과 2단계 세척으로 세척하였으며, 제1 단계 세척은 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5) 완충액을 사용하였고, 제2 단계 세척은 25 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.5) 고 염 완충액을 사용하였다. IEX 막 크로마토그래피에 대한 UV 및 전도도 프로파일을 분석하였다. 이는, 상기 고 염 세척 단계에서 용리되어지는 피크가 존재함을 상술하며, 상기 막에 결합된 미지의 불순물이 존재함을 나타낸다. 상기 탄소 여액, IEX 여액 및 2개의 고 염 세척 샘플에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 여액을 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하였으며, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. 상기 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물로 정용여과하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O11 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 11-1은 최종 정제된 O11 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00017
실시예 16. 에셔리키아 콜라이 O-항원 혈청형 O18의 정제
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 응집
실시예 5에서 "응집" 부문 하에 기재된 산 가수분해 후 중화된 여액으로부터 응집을 수행하였다. 상기 중화된 여액에 10% 명반 용액을 2%(w/v)의 최종 농도로 가하고, 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하였다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다. 하기 표 12-1은, 상기 중화된 여액 및 응집 후 심층 여액의 SEC-HPLC 크로마토그램을 제시한다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작하였다. 처리되는 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 20 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.5)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 18이었다. 심층 여액과 UFDF-1 후 미투과물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R55SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 200 내지 250 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물, 및 세척액을 포함하는 탄소 여액 및 탄소 벌크에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 본 탄소 여과가 잔류 색 및 저분자량 불순물을 제거하는 데 매우 효과적임을 나타낸다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 100 내지 150 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액 및 2단계 세척으로 세척하였으며, 제1 단계 세척은 25 mM Tris/25 mM NaCl(pH 7.4) 완충액을 사용하였고, 제2 단계 세척은 25 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 7.4) 고 염 완충액을 사용하였다. IEX 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램(상단 크로마토그램)을 분석하였다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 여액을 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하였으며, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. HIC 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV280 프로파일을 분석하였다. 소량의 소수성 성분이 HIC 막에 결합되었으며, 이는 후속적으로 물로 세척되어졌다. 상기 HIC 여액 및 HIC 세척액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
7. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 300 LMH 및 0.5 내지 1.0 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다. 최종 정제된 O18 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 프로파일을 분석하였다. 하기 표 12-1은 최종 정제된 O18 O-Ag의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00018
실시예 17. 응집 부재 하의 에셔리키아 콜라이 O-항원의 정제
이전 12개 실시예에 기재된 에셔리키아 콜라이 O-항원 다당류에 대한 정제 공정의 강건성을 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은, 동일한 정제 공정이 명반 용액을 응집제로서 사용하지 않고도 공급물 스트림에 대해 동등하게 효과적임을 보여주었다. 이러한 청징 과정을 입증하기 위해 O2, O6 및 O25b O-Ag의 혈청형을 사용하였다.
1. O-항원의 방출
본 과정은 발효 과정 후 산 가수분해로 시작하여 지다당류(LPS)로부터 O-Ag를 방출시킨다. 혈청형 O25b O-Ag에 대해 수행된 이러한 DOE 결과에 기초하여(실시예 5 참조), O-항원의 모든 혈청형에 대한 산 가수분해에 사용된 조건은 3.8±0.1의 pH, 95±5℃의 온도 및 2.0시간의 배양 시간이었다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다.
2. 혈청형 O25b에 대한 산 처리
산 가수분해 후, 이 배치를 주위 온도로 냉각시켰다. 황산을 사용하여 pH를 3.2로 추가 조정하고, 이 배치를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 응집된 배치와 달리 약간의 흐림(haziness)를 보였고, 이어서 이 흐린 상청액을 0.2-μm 필터로 여과하였다. 생성된 심층 여액은 시각적으로 투명하엿으며, 이를, 실시예 5 내지 16에 기술된 UFDF-1, 탄소 여과, IEX 막 크로마토그래피, HIC 여과 및 UFDF-2를 포함하는 후속 정제 처리 단계로 보냈다.
하기 표 13-1은 명반 응집 단계의 존재 또는 부재 하에 정제된 O25b O-Ag에 대한 품질 속성의 비교를 보여준다.
Figure pct00019
3. 혈청형 O2 및 O6에 대한 산 처리
실시예 5의 부문 1에 기재된 공정에 의해 수득된 중화된 여액에 대해 혈청형 O2 및 O6 O-Ag에 대한 산 처리를 수행하였다. 중화된 여액의 pH를 3.2로 조정하고, 이어서 이 배치를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 이들 혈청형 둘 다의 상청액은 각각의 응집된 용액에 비해 역시 약간의 흐림을 나타냈다. 그러나, 상기 상청액을 0.2-μm 필터로 여과한 후, 생성된 여액은 시각적으로 투명해졌다. 이어서, 심층 여액을, 실시예 5 내지 16에 기재된 UFDF-1, 탄소 여과, IEX 막 크로마토그래피, HIC 여과 및 UFDF-2를 포함하는 후속 정제 처리 단계로 보냈다.
하기 표 13-2 및 13-3은 각각, 명반 응집 단계의 존재 또는 부재 하에 정제된 O2 및 O6 O-Ag에 대한 품질 속성의 비교를 보여준다.
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 18: 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A 다당류(Nm_A 폴리)의 정제 방법
1. 응집 및 청징
본 과정은, 55℃로 1시간 동안 열처리된 네이쎄리아 메닌지티디스 세포 배양으로 시작하여, 세포 표면으로부터 다당류를 방출시킨다. 이어서, 방출된 생성물을 포함하는 세포 배양액을 응집 처리하였다. 본 단계의 주요 목적은, 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 청징 장치 조작의 효율성을 향상시킨다.
5 M CaCl2 용액을 발효 배양액에 0.2 M의 최종 CaCl2 농도로 가함으로써 응집을 달성하였다. 이렇게 CaCl2-처리된 용액을 가벼운 혼합 하에 50 내지 70℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 이 배치를 주위 온도로 냉각시키고, 이어서 20℃에서 30분 동안 15,000xg로 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 청징된 여액을 UFDF-1의 초기 정제로 보냈다.
2. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 1로부터의 청징된 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막을 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 처리되는 청징된 여액의 양은 전형적으로막 면적(m2) 당 약 55 g의 다당류였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 15배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 제1 정용여과를 위한 25 mM 시트레이트/50 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 제2 정용여과를 위한 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)이었다. 이들 2개의 정용여과 단계에 대한 정용여과 부피(DV)의 수치는 각각 10 및 20이었다. UFDF로부터의 미투과물을 수집하고, 분석하였다. UFDF 실행 동안의 전도도 및 UV 프로파일은, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 저분자량 불순물이 본 정용여과 동안 제거되었음을 나타낸다.
3. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 300 내지 600 g의, UFDF-1 미투과물로부터의 Nm_A 폴리의 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소 필터를 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)의 정용여과 완충액으로 필터 면적(m2) 당 약 20 L로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 내지 75 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 탄소 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 상기 필터를 상기 완충액으로 세척하고, 생성물을 함유하는 세척액을 포함하는 여액을 탄소 여액으로서 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물 및 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI 및 UV280 관련 불순물이 제거되었으며 탄소 여액이 시각적으로 무색이 되었음을 보여준다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 잔류 지질 다당류(내독소))을 제거한다. 사르토바인드 페닐 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 단계 3으로부터의 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 1.5 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 1.5 M 암모늄 설페이트(AS)의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 상기 AS-처리된 탄소 여액을 분당 0.2 내지 1.0 막 부피(MV)의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
HIC 정제를 위한 아크타 아밴트 크로마토그래피 실행을 분석하였다. 생성물은 유동 관통 유출물 중에 존재하였으며, 세척수에서 나타난 피크는 상기 HIC 막에 결합된 비-명시된 소수성 관련 불순물이었다. 상기 탄소 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 소수성 불순물이 HIC 여과 단계에 의해 제거되었음을 나타낸다.
5. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 10-kDa 분자량 컷오프(MWCO) 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 수행하였다.
HIC 여액을 약 10 내지 15배 농축하고, 이어서 약 10 내지 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 100 내지 500 LMH 및 0.5 내지 1.5 bar로 설정하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호를 분석하였다. 10 DV 후, 전도도는 정상 상태에 도달하였으며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다.
UFDF-2를 0.2-μm 여과 처리한 후 최종 정제된 Nm_A 다당류 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 하기 표 14는 최종 정제된 Nm_A 다당류의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00022
실시예 19: 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C 다당류(Nm-C 폴리)의 정제 방법
1. 응집 및 청징
본 과정은, 55℃로 1시간 동안 열처리된 네이쎄리아 메닌지티디스 세포 배양으로 시작하여, 세포 표면으로부터 다당류를 방출시킨다. 이어서, 방출된 생성물을 포함하는 세포 배양액을 응집 처리하였다. 본 단계의 주요 목적은, 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 청징 장치 조작의 효율성을 향상시킨다.
이는, 농축된 CaCl2 용액을 발효 배양액에 가하고 최종 CaCl2 농도를 0.3M로 조정함으로써 달성된다. 이렇게 CaCl2-처리된 용액을 가벼운 혼합 하에 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 이 배치를 주위 온도로 냉각시키고, 이어서 20℃에서 30분 동안 12,000 내지 14,000g로 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적절한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 청징된 여액을 UFDF-1의 초기 정제로 보냈다.
2. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 1로부터의 청징된 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막을 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 처리되는 청징된 여액의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 약 40 g의 다당류였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 15배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에서 사용되는 완충액은 25 mM 시트레이트/50 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 물 또는 다른 바람직한 완충액의 제2 정용여과였다. 정용여과 부피의 수치는 이들 정용여과 단계 둘 다에 대해 10 내지 20이었다. UFDF로부터의 미투과물을 수집하고, 분석하였다. UFDF 실행 동안의 전도도 및 UV 프로파일을 검토하여, 투과액의 UV 신호에 대한 상당한 강하로 입증되는 바와 같이, 본 제1 정용여과 동안 UV-관련 불순물뿐만 아니라 대부분의 저분자량 물질이 제거되었음을 확인하였다. 청징된 여액과 UFDF-1 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 RI 및 UV 검출 둘 다에 대해 분석하였다.
3. 이온교환 크로마토그래피(IEX)
여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로 막 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막도 사용할 수 있다.
상기 막을 먼저 20 mM Tris(pH 8.0, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이전 단계로부터의 탄소 여액을 20 mM Tris 농도로 조정하고, MV(mL) 당 약 70 mg의 다당류를 사용하여 0.2 내지 1.0 MV/min의 유속으로 상기 막을 통해 펌핑하였다. 이어서, 상기 막을 10 내지 30 MV의 평형 완충액으로 세척하였다. 20 mM Tris/1.0 M NaCl(pH 8.0, 약 13 MV 및 이어서 15 MV)의 50% 고 염 완충액에서 100%의 고 염 완충액까지 선형 구배로 용리를 수행하였다. 2개의 용리 피크에 해당하는 용리 분획들을 별도로 풀링하고, SEC-HPLC로 분석하였다. UFDF-1에서 나타난 고분자량 불순물은 IEX 막에 의해 포획되고, 제1 용리 동안 제거되었다. 제2 용리 부분은 대부분 생성물을 포함하였다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 잔류 지질 다당류(내독소))을 제거한다. 사르토바인드 페닐 막을 HIC 단계에 사용하였다. IEX 크로마토그래피로부터의 용리액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 최종 농도 1.5 M로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 1.5 M 암모늄 설페이트(AS)의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 용리액을 분당 0.2 내지 1.0 막 부피(MV)의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
HIC 정제를 위한 아크타 아밴트 크로마토그래피 실행을 분석하였다. 생성물은 유동 관통 유출물 중에 존재하였으며, 세척수에서 나타난 피크는 상기 HIC 막에 결합된 비-명시된 소수성 관련 불순물이었다.
5. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 10-kDa 분자량 컷오프(MWCO) 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 수행하였다.
HIC 여액을 약 10 내지 15배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름과 TMP를 전형적으로 각각 100 내지 500 LMH 및 0.5 내지 1.5 bar로 설정하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호를 분석하였다. 10 DV 후, 전도도는 정상 상태에 도달하였으며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다. UFDF-2 후 최종 정제된 Nm_C 다당류를 0.2-μm 여과 처리하였다. 하기 표 15는 최종 정제된 Nm_C 다당류의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00023
실시예 20: 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W 다당류(Nm-W 폴리)의 정제 방법
1. 응집 및 청징
본 과정은, 55℃로 1시간 동안 열처리된 네이쎄리아 메닌지티디스 세포 배양으로 시작하여, 세포 표면으로부터 다당류를 방출시킨다. 이어서, 방출된 생성물을 포함하는 세포 배양액을 응집 처리하였다. 본 단계의 주요 목적은, 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 청징 장치 조작의 효율성을 향상시킨다.
이는, 상기 발효 배양액에 5 M CaCl2 용액을 가하여 최종 CaCl2 농도를 0.2 M로 조정함으로써 달성된다. 이렇게 CaCl2-처리된 용액을 가벼운 혼합 하에 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 이 배치를 주위 온도로 냉각시키고, 이어서 20℃에서 30분 동안 14,000g로 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적절한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 청징된 여액을 UFDF-1의 초기 정제로 보냈다.
2. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 1로부터의 청징된 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막을 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 정제된 여액의 처리량은 막 면적(m2) 당 약 84 g의 다당류였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 15배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 25 mM 시트레이트/50 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 물 또는 다른 바람직한 완충액을 사용한 제2 정용여과였다. 정용여과 부피의 수치는 각각, 제1 정용여과에 대해 10 및 제2 정용여과에 대해 20이었다. UFDF로부터의 미투과물을 수집하고, 분석하였다. UFDF 실행 동안의 전도도 및 UV 프로파일은, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 불순물이 본 제1 정용여과 동안 제거되었음을 나타내며, 이는 투과액의 UV 신호에 대한 상당한 강하에 의해 입증된다.
3. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 1,000 g의, UFDF-1 미투과물로부터의 Nm-W 폴리 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소 필터를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 필터 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 60 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 필터를 상기 완충액으로 세척하고, 생성물을 함유하는 세척액을 포함하는 여액을 탄소 여액으로서 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물 및 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI, UV280 관련 및 저분자량 불순물이 탄소 필터에 의해 제거되었음을 나타낸다. 상기 탄소 여액은 육안으로 무색이 되었다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 잔류 지질 다당류(내독소))을 제거한다. 사르토바인드 페닐 막을 HIC 단계에 사용하였다. 3단계의 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 1.5 내지 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 HIC 막에 적재된 Nm_W 다당류의 양은 막 부피(MV)(mL) 당 약 30 내지 116 mg이었다. 상기 페닐 막을 먼저 암모늄 설페이트(AS)의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 상기 AS-처리된 탄소 여액을 분당 0.2 내지 1.0 막 부피(MV)의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
HIC 정제를 위한 아크타 아밴트 크로마토그래피 실행을 분석하였다. 생성물은 유동 관통 유출물 중에 존재하였으며, 세척수에서 나타난 피크는 상기 HIC 막에 결합된 비-명시된 소수성 관련 불순물이었다. 상기 탄소 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 소수성 불순물이 본 HIC 여과 단계에 의해 제거되었음을 나타낸다.
5. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 10-kDa 분자량 컷오프(MWCO) 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 수행하였다.
HIC 여액을 약 10 내지 15배 농축하고, 이어서 약 10 내지 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름과 TMP를 전형적으로 각각 100 내지 500 LMH 및 0.5 내지 1.5 bar로 설정하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호를 분석하였다. 10 DV 후, 전도도는 정상 상태에 도달하였으며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다.
상기 HIC 여액 및 UFDF-2를 0.2-μm 여과 처리한 후 최종 정제된 Nm_W 다당류에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 하기 표 16은 최종 정제된 Nm_W 다당류의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00024
실시예 21: 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y 다당류(Nm-Y 폴리)의 정제 방법
1. 응집 및 청징
본 과정은, 55℃로 1시간 동안 열처리된 네이쎄리아 메닌지티디스 세포 배양으로 시작하여, 세포 표면으로부터 다당류를 방출시킨다. 이어서, 방출된 생성물을 포함하는 세포 배양액을 응집 처리하였다. 본 단계의 주요 목적은, 배양액으로부터 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시키는 것이다. 이는 또한 하류 청징 장치 조작의 효율성을 향상시킨다.
이는, 5 M CaCl2 용액을 발효 배양액에 가하여 최종 CaCl2 농도를 0.2 M로 조정함으로써 달성된다. 이렇게 CaCl2-처리된 용액을 가벼운 혼합 하에 50 내지 70℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 이 배치를 주위 온도로 냉각시키고, 이어서 20℃에서 40분 동안 15,000g로 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적절한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 청징된 여액을 UFDF-1의 초기 정제로 보냈다.
2. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
상기 단계 1로부터의 청징된 여액을 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막을 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)를 통해 추가로 정제하였다. 정제된 여액의 처리량은 막 면적(m2) 당 약 20 g의 다당류였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 15배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 25 mM 시트레이트/50 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris-HCl/0.1 M NaCl(pH 8.0)을 사용한 제2 정용여과였다. 정용여과 부피의 수치는 각각, 제1 정용여과의 경우 12, 및 제2 정용여과의 경우 25였다. UFDF로부터의 미투과물을 수집하고, 분석하였다. UFDF 실행 동안의 전도도 및 UV 프로파일은, 대부분의 저분자량 및 UV-관련 불순물이 본 제1 정용여과 동안 제거되었음을 나타내며, 이는 투과액의 UV 신호에 대한 상당한 강하에 의해 입증된다.
3. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M R32SP 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 885 g의, UFDF-1 미투과물로부터의 Nm-Y 폴리의 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소 필터를 먼저 물로 세척하고, 이어서 필터 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 정용여과 완충액을 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 72 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 필터를 상기 완충액으로 세척하고, 생성물을 함유하는 세척액을 포함하는 여액을 탄소 여액으로서 수집하였다.
상기 UFDF 미투과물 및 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, RI, UV280 관련 및 저분자량 불순물이 탄소 필터에 의해 제거되었음을 나타낸다. 상기 탄소 여액은 육안으로 무색이 되었다.
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(예컨대, 잔류 지질 다당류(내독소))을 제거한다. 사르토바인드 페닐 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 단계 3으로부터의 탄소 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 1.75 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 HIC 막에 적재된 Nm_Y 다당류의 양은 막 부피(MV)(mL) 당 약 40 mg이었다. 상기 페닐 막을 먼저 암모늄 설페이트(AS)의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 상기 AS-처리된 탄소 여액을 분당 0.2 내지 1.0 막 부피(MV)의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 완충액 세척액과 함께 유출물을 통한 흐름을 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다.
HIC 정제를 위한 아크타 아밴트 크로마토그래피 실행을 분석하였다. 생성물은 유동 관통 유출물 중에 존재하였으며, 세척수에서 나타난 피크는 상기 HIC 막에 결합된 비-명시된 소수성 관련 불순물이었다. 상기 탄소 여액 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 소수성 관련 불순물이 HIC 여과 단계에 의해 제거되었음을 나타낸다.
5. 한외여과/정용여과-2(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 10-kDa 분자량 컷오프(MWCO) 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하여 수행하였다.
HIC 여액을 약 10 내지 15배 농축하고, 이어서 약 25의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 및 TMP를 전형적으로 각각 300 내지 400 LMH 및 0.5 내지 1.5 bar로 설정하였다. 정용여과 동안 DV의 함수로서 투과액의 전도도 및 UV280 신호를 분석하였다. 10 DV 후, 전도도는 정상 상태에 도달하였으며, 이는, 완충액 교환이 완료되었음을 나타낸다.
UFDF-2를 0.2-μm 여과 처리한 후 최종 정제된 Nm_Y 다당류 및 HIC 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램의 비교를 분석하였다. 하기 표 17은 최종 정제된 Nm_Y 다당류의 품질 속성을 요약한 것이다.
Figure pct00025
실시예 22: 클레브시엘라 O-항원 다당류의 정제에 대한 설명
1. O-항원의 방출
클레브시엘라 O1 및 O2 O-항원(Kleb O-Ag)은 단쇄 O-항원이며, 분자량은 8.0 내지 16.0-kDa 범위일 것으로 예상된다. 실시예 5 내지 17에서 에셔리키아 콜라이 O-Ag에 대해 설명된 정제 과정을 Kleb O-Ag에도 적용한다. 발효 후, 3.8±0.1의 pH, 95℃±5℃ 및 2.0시간의 배양 시간에서의 산 가수분해를 통해 지다당류(LPS)로부터 클레브시엘라 O1 및 O2 O 항원을 방출시켰다. 본 단계는 발효 탱크에서 수행하였다. 이 조건은 지질-A와 LPS의 코어 올리고당 사이의 산-불안정 결합을 분할할 것이다(실시예 5 참조).
2. 응집
상기 단계 1에서 개시된 바와 같은 Kleb O-Ag 방출 후, 상기 배양액을 주위 온도로 냉각시키고, 10% 명반 용액으로 최종 농도 2.0%(w/v)로 처리하고, pH를 3.2로 추가 조정하였다. 본 응집 단계는 세포 잔해, 숙주 세포 단백질 및 핵산을 침전시킬 것이다. 응집된 슬러리를 주위 온도에서 1.0시간 동안 배양하고, 이어서 12,000 내지 14,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 0.2-μm 필터 또는 다른 적합한 심층 필터로 여과하여, 용액에 들어올 수 있는 작은 입자를 제거하였다. 이 심층 여액을 UFDF-1의 다음 단계로 보냈다.
3. 한외여과/정용여과-1(UFDF-1)
5-kDa 또는 10-kDa 사르토콘 하이드로사르트 막 카세트를 사용하는 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 의해 상기 심층 여액(상기 단계 2로부터)으로 정제를 시작한다. 처리된 재료의 양은 전형적으로 막 면적(m2) 당 15 내지 30 L였다. 본 작업의 목적은, (i) 상기 용액을 10 내지 20배 농축함으로써 부피를 감소시키고, (ii) 정용여과를 통해 발효 배지를 목적하는 완충액으로 교체함으로써 완충액을 교환하는 것이다. 본 단계에 사용된 완충액은 20 mM 시트레이트/0.1 M NaCl(pH 6.0) 및 이어서 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2)의 제2 완충액이었다. 정용여과 부피의 수치는 각각의 정용여과 단계에 대해 각각 10 내지 18이었다. UFDF-1 후 미투과물의 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다.
4. 탄소 여과
본 장치 조작은 숙주 세포 불순물(예컨대, 단백질 및 핵산) 뿐만 아니라 착색된 불순물의 수준을 감소시킨다(WO2008118752 참조). 3M 탄소 필터를 탄소 필터 면적(m2) 당 약 100 내지 150 g의 O-Ag 적재량으로 사용하였다. 상기 탄소를 먼저 물로 세척하고, 이어서 정용여과 완충액으로 막 면적(m2) 당 약 20 L의 완충액으로 세척하였다. 이어서, UFDF-1로부터의 미투과물을 단일 통과 모드로 50 LMH(liter per m2 per hour)의 유속으로 여과하였다. 이어서, 상기 탄소 필터를 완충액으로 세척하였다. 생성물을 함유하는 여액 및 완충액을 수집하였다.
상기 탄소 여액에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램을 분석하였다. 탄소 여과 후 생성물 피크가 감소했다는 사실은, 탄소 필터가 비-특이적 흡착 모드로 설계되었음을 나타내는 것이다. 그럼에도 불구하고, 색 관련 불순물은 대부분 제거되었다.
5. IEX 막 크로마토그래피
본 단계는 비-특이적 음-하전된 불순물을 제거하기 위해 개발되었다(실시예 5의 IEX 막 크로마토그래피 부문 참조). 여기에 사용된 IEX 막은 밀리퓨어의 나트리플로(HD-Q) 카세트였다. 다르게는, 사르토리우스 스테딤의 사르토바인드 Q 막 또는 3M의 엠페이즈 에이이엑스 하이브리드(Emphaze AEX Hybrid) 정화기도 사용할 수 있다. 상기 막을 먼저 20 mM Tris/20 mM NaCl(pH 7.2, 전형적으로 20 내지 30 막 부피(MV))로 평형화시켰다. 이어서, 상기 탄소 여액을 MV(mL) 당 약 75 내지 250 mg의 O-Ag로 상기 막에 적재하였다. 생성물을 포함하는 유동 관통 유출물 또는 여액을 수집하였다. 상기 막을 평형 완충액으로 세척하고, 이어서 고 염 완충액(20 mM Tris/1.0 M NaCl, pH 7.2)으로 세척하였다.
IEX 막 크로마토그래피 실행의 전도도 및 UV 프로파일을 분석하였다. 상기 프로파일에서, UV 신호는 고 염 세척 동안 피크를 나타냈으며, 이는, 상기 탄소 여액에 존재하는 미지의 음-하전된 불순물이 있음을 나타낸다. 상기 탄소 여액, IEX 여액 및 고 염 세척 유출물에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 고 염 용리 샘플 및 고 염 세척 샘플이 고분자량 불순물을 함유함을 보여준다.
6. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
본 장치 조작은, 소수성 특성을 갖는 임의의 불순물(상기 산 가수분해 단계로부터 남은 잔류 지질 A)을 제거한다. 사르토바인드 페닐 150-mL 막을 HIC 단계에 사용하였다. 상기 IEX 여액을 4.0 M 암모늄 설페이트(AS) 용액으로 2.0 M의 최종 농도로 처리하였다. 상기 페닐 막을 먼저 2.0 M 암모늄 설페이트의 유동 완충액으로 평형화시켰다. 이렇게 AS-처리된 IEX 여액을 40 내지 60 mL/min의 유속으로 상기 HIC 막에 강제 통과시켰다. 이어서, 상기 HIC 막을 유동 완충액 및 이어서 세척수로 세척하였다. 유동 관통 유출물을 완충액 세척액과 함께 HIC 여액으로서 수집하고, 분석을 위해 상기 세척수도 수집하였다. HIC 막 여과에 대한 전도도 및 UV의 크로마토그래피 프로파일을 분석하였다.
상기 IEX 여액, HIC 여액, HIC 세척수 및 정제된 O8 O-Ag에 대한 SEC-HPLC 크로마토그램은, 세척수 샘플이 RI 검출에서 가시적인 피크를 나타내지 않음을 보여주며, 이는, IEX 스트림에 소수성 관련 물질이 존재하지 않음을 나타낸다.
7. 한외여과/정용여과(UFDF-2)
본 장치 조작은 생성물을 목적하는 농도로 농축하고, 암모늄 설페이트를 목적하는 완충액 또는 접합용 물로 대체한다. 본 단계는 5-kDa 분자량 컷오프 필터를 사용하여 수행하였다.
상기 HIC 여액을 약 10배 농축하고, 이어서 약 20의 정용여과 부피(DV)의 물을 사용하여 정용여과하였다. UFDF-2 실행에 대한 교차-흐름 속도 및 TMP를 전형적으로 각각 200 LMH 및 0.5 bar로 설정하였다. UFDF-2로부터의 미투과물을 세척액과 함께 수집하였다. 최종 풀을 0.2-μm 필터를 통해 여과하였다.
배양액 중 방출-후 O-Ag 및 정제-후 4가지 변이체의 최종 정제된 Kp O-Ag의 SEC-HPLC 크로마토그램은, 에셔리키아 콜라이 O-Ag에 대해 개발된 플랫폼-기반 정제 공정이 고품질 생성물을 생산하는데 효과적임을 보여준다(도 1 내지 4).
하기 표 18은 천연 K p 균주에 의해 생산된 정제된 K p O-Ag의 품질 속성의 요약을 제공한다.
Figure pct00026
본 발명의 특정 양태는 하기 번호부여된 문단에 제시됨
1. 박테리아 다당류 및 오염물을 포함하는 용액으로부터 상기 박테리아 다당류를 정제하는 방법으로서, 응집 단계를 포함하는 방법.
2. 1에 있어서, 응집제가 다가 양이온을 포함하는, 방법.
3. 2에 있어서, 다가 양이온이 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
4. 2에 있어서, 응집제가 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 다가 양이온의 혼합물인, 방법.
5. 2에 있어서, 응집제가 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상의 다가 양이온의 혼합물인, 방법.
6. 2에 있어서, 응집제가 알루미늄, 철, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 4개의 다가 양이온의 혼합물인, 방법.
7. 1에 있어서, 응집제가 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 폴리에틸렌이민(PEI), 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함하는, 방법.
8. 1에 있어서, 응집제가 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 1에 있어서, 응집제가 폴리에틸렌이민(PEI) 인, 방법.
10. 1에 있어서, 응집제가 명반을 포함하는, 방법.
11. 1에 있어서, 응집제가 명반인, 방법.
12. 1에 있어서, 응집제가 칼륨 명반을 포함하는, 방법.
13. 1에 있어서, 응집제가 칼륨 명반인, 방법.
14. 1에 있어서, 응집제가 나트륨 명반을 포함하는, 방법.
15. 1에 있어서, 응집제가 나트륨 명반인, 방법.
16. 1에 있어서, 응집제가 암모늄 명반을 포함하는, 방법.
17. 1에 있어서, 응집제가 암모늄 명반인, 방법.
18. 1에 있어서, 응집제가 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 폴리에틸렌이민(PEI), 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 제제의 혼합물인, 방법. 한 양태에서, 응집제는 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
19. 1에 있어서, 응집제가 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 폴리에틸렌이민(PEI), 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 제제의 혼합물인, 방법.
20. 1에 있어서, 응집제가 명반(예컨대 칼륨 명반, 나트륨 명반 또는 암모늄 명반), 알루미늄 클로로하이드레이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 옥사이드, 수산화칼슘, 철(II) 설페이트(제1철 설페이트), 철(III) 클로라이드(제2철 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 개질된 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 제제의 혼합물인, 방법.
21. 1에 있어서, 응집제가 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라 씨(서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸 씨(Strychnos potatorum seed)(니르말리 너트 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함하는, 방법. 한 양태에서, 응집제가 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라 씨(서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸 씨(니르말리 너트 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
22. 1에 있어서, 응집제가 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라 씨(서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸 씨(니르말리 너트 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제인, 방법. 한 양태에서, 응집제는 키토산, 부레풀, 모링가 올레이페라 씨(서양 고추냉이 나무), 젤라틴, 스트리크노스 포테이토룸 씨(니르말리 너트 나무), 구아검 및 알기네이트(예컨대 갈색 해조류 추출물) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
23. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 0.1 내지 약 20%(w/v)인, 방법.
24. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 0.5 내지 약 10%(w/v)인, 방법.
25. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 1 내지 약 5%(w/v)인, 방법.
26. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10%(w/v)인, 방법.
27. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 10.5, 약 11.0, 약 11.5, 약 12.0, 약 12.5, 약 13.0, 약 13.5, 약 14.0, 약 14.5, 약 15.0, 약 15.5, 약 16.0, 약 16.5, 약 17.0, 약 17.5, 약 18.0, 약 18.5, 약 19.0, 약 19.5 또는 약 20.0%(w/v)
28. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 0.5, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5 또는 약 5.0%(w/v)
29. 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 농도가 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0%(w/v)로 사용되는, 방법.
30. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 수초(예컨대 1 내지 10초) 내지 약 1개월의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
31. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 2초 내지 약 2주의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
32. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 1분 내지 약 1주의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
33. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간 또는 약 24시간 내지 약 2일의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
34. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
35. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
36. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 15분 내지 약 3시간의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
37. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 30분 내지 약 120분의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
38. 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 약 2초, 약 10초, 약 30초, 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분, 약 160분, 약 170분, 약 3.0시간, 약 3.5시간, 약 4.0시간, 약 4.5시간, 약 5.0 시간, 약 5.5시간, 약 6.0 시간, 약 6.5시간, 약 7.0시간, 약 7.5시간, 약 8.0시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일 또는 약 15일의 시간에 걸쳐 첨가되는, 방법.
39. 1 내지 38에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 교반 첨가되는, 방법.
40. 1 내지 38에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 교반하에 첨가되는, 방법.
41. 1 내지 38에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 온화한 교반하에 첨가되는, 방법.
42. 1 내지 38에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집제가 격렬한 교반하에 첨가되는, 방법.
43. 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 다운스트림 가공 전 응집체가 침강하도록 용액이 일정 시간 동안 유지되는, 방법.
44. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 수초(예컨대 2 내지 10초) 내지 약 1분의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
45. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 2이상, 약 3이상, 약 4이상, 약 5이상, 약 10이상, 약 15이상, 약 20이상, 약 25이상, 약 30이상, 약 35이상, 약 40이상, 약 45이상, 약 50이상, 약 55이상, 약 60이상, 약 65이상, 약 70이상, 약 75이상, 약 80이상, 약 85이상, 약 90이상, 약 95이상, 약 100이상, 약 105이상, 약 110이상, 약 115이상, 약 120이상, 약 125이상, 약 130이상, 약 135이상, 약 140이상, 약 145이상, 약 150이상, 약 155 또는 약 160분 이상의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
46. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 침강 시간이 1주 미만인, 방법.
47. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380, 약 1440분, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일 또는 약 6일 내지 1주의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
48. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 수초(예컨대 1 내지 10초) 내지 약 1개월의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
49. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 2초 내지 약 2주의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
50. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 1분 내지 약 1주의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
51. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간 또는 약 24시간 내지 약 2일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
52. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
53. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 110분, 약 120분, 약 130분, 약 140분, 약 150분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간 내지 약 1일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
54. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 15분 내지 약 3시간의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
55. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 30분 내지 약 120분의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
56. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 10초, 약 30초, 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분, 약 160분, 약 170분, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일 또는 약 15일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
57. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380 또는 약 1440분 내지 2일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
58. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5분 내지 약 1일의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
59. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5분 내지 약 120분의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
60. 1 내지 43에 있어서 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분 또는 약 160분의 침강 시간에 의해 수행되는, 방법.
61. 43 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 교반없이 수행되는, 방법.
62. 43 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 교반하에 수행되는, 방법.
63. 43 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 온화한 교반하에 수행되는, 방법.
64. 43 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 격렬한 교반하에 수행되는, 방법.
65. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 산성 pH에서 수행되는, 방법.
66. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 7.0 미만, 6.0 미만, 5.0 미만 또는 4.0 미만의 pH에서 수행되는, 방법.
67. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 7.0 내지 1.0의 pH에서 수행되는, 방법.
68. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 5.5 내지 2.5, 5.0 내지 2.5, 4.5 내지 2.5, 4.0 내지 2.5, 5.5 내지 3.0, 5.0 내지 3.0, 4.5 내지 3.0, 4.0 내지 3.0, 5.5 내지 3.5, 5.0 내지 3.5, 4.5 내지 3.5 또는 4.0 내지 3.5 의 pH에서 수행되는, 방법.
69. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 5.5, 약 5.0, 약 4.5, 약 4.0, 약 3.5, 약 3.0, 약 2.5, 약 2.0, 약 1.5 또는 약 1.0 의 pH에서 수행되는, 방법.
70. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 4.0, 약 3.5, 약 3.0 또는 약 2.5 의 pH에서 수행되는, 방법.
71. 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 약 3.5 의 pH에서 수행되는, 방법.
72. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH가 산성화 용액과 산에 의해 수득되는, 방법.
73. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH가 산성화 용액과 HCl, H3PO4, 시트르산, 아세트산, 아질산 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산에 의해 수득되는, 방법.
74. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH가 산성화 용액과 아미노산에 의해 수득되는, 방법.
75. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH가 산성화 용액과 글리신, 알라닌 및 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 의해 수득되는, 방법.
76. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH가 산성화 용액과 황산에 의해 수득되는, 방법.
77. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산이 교반하에 첨가되는, 방법.
78. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산이 온화한 교반하에 첨가되는, 방법.
79. 65 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 산이 격렬한 교반하에 첨가되는, 방법.
80. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
81. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
82. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
83. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
84. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
85. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
86. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
87. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
88. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
89. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
90. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
91. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
92. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
93. 43 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
94. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
95. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
96. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
97. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
98. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
99. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
100. 72 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 산성화 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
101. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
102. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
103. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
104. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
105. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
106. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
107. 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 침강 단계가 존재하는 경우, 상기 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
108. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집체의 첨가 및 산성화 단계가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
109. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
110. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
111. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
112. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
113. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
114. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가 및 산성화 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
115. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
116. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
117. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 20℃의 온도에서 수행되는, 방법.
118. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 30℃ 내지 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
119. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
120. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
121. 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 응집제의 첨가, 침강 및 산성화 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
122. 1 내지 71, 80 내지 93 또는 101 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 pH 조정없이 응집제를 첨가함을 포함하는, 방법.
123. 1 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 응집 단계가 응집제를 첨가함, pH를 조정함 용액을 침강시킴을 포함하는, 방법.
124. 123에 있어서, 응집제가 pH 조정 전 첨가되는, 방법.
125. 123에 있어서, pH가 응집체 첨가 전 조정되는, 방법.
126. 123에 있어서, pH가 응집체 첨가 및 용액 침강 전 조정되는, 방법.
127. 123에 있어서, 응집제가 첨가되고, 용액이 침강된 후, pH가 조정되는, 방법.
128. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 디캔테이션, 침전, 여과 또는 원심분리에 의해 청징되는, 방법.
129. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 디캔테이션에 의해 청징되는, 방법.
130. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 하이드로사이클론(hydrocyclone)에 의해 청징되는, 방법.
131. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 침전에 의해 청징되는, 방법.
132. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 부유선별에 의해 청징되는, 방법.
133. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 여과
134. 1 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 응집 후 현탁액이 원심분리에 의해 청징되는, 방법.
135. 127 내지 134에 있어서, 다당류-함유 용액이 보관을 위해 수집되는, 방법.
136. 127 내지 134에 있어서, 다당류-함유 용액이 추가적인 가공을 위해 수집되는, 방법.
137. 127 내지 134에 있어서, 다당류-함유 용액이 보관된 후, 추가로 가공되는, 방법.
138. 134 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 원심분리가 연속 원심분리인, 방법.
139. 134 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 원심분리가 버켓(bucket) 원심분리인, 방법.
140. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 1,000 g, 약 2,000 g, 약 3,000 g, 약 4,000 g, 약 5,000 g, 약 6,000 g, 약 8,000 g, 약 9,000 g, 약 10,000 g, 약 11,000 g, 약 12,000 g, 약 13,000 g, 약 14,000 g, 약 15,000 g, 약 16,000 g, 약 17,000 g, 약 18,000 g, 약 19,000 g, 약 20,000 g, 약 25,000 g, 약 30,000 g, 약 35,000 g, 약 40,000 g, 약 50,000 g, 약 60,000 g, 약 70,000 g, 약 80,000 g, 약 90,000 g, 약 100,000 g, 약 120,000 g, 약 140,000 g, 약 160,000 g 또는 약 180,000 g로 원심분리되는, 방법.
141. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 8,000 g, 약 9,000 g, 약 10,000 g, 약 11,000 g, 약 12,000 g, 약 13,000 g, 약 14,000 g, 약 15,000 g, 약 16,000 g, 약 17,000 g, 약 18,000 g, 약 19,000 g, 약 20,000 g 또는 약 25,000 g로 원심분리되는, 방법.
142. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 5,000 g 내지 약 25,000 g로 원심분리되는, 방법.
143. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 8,000 g 내지 약 20,000 g로 원심분리되는, 방법.
144. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 10,000 g 내지 약 15,000 g로 원심분리되는, 방법.
145. 134 내지 139에 있어서, 현탁액이 약 10,000 g 내지 약 12,000 g로 원심분리되는, 방법.
146. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 2분 이상, 3분 이상, 4분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 25분 이상, 30분 이상, 35분 이상, 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상, 55분 이상, 60분 이상, 65분 이상, 70분 이상, 75분 이상, 80분 이상, 85분 이상, 90분 이상, 95분 이상, 100분 이상, 105분 이상, 110분 이상, 115분 이상, 120분 이상, 125분 이상, 130분 이상, 135분 이상, 140분 이상, 145분 이상, 150분 이상, 155분 이상 또는 160분 이상 동안 원심분리되는, 방법.
147. 146에 있어서, 현탁액이 24시간 미만 동안 원심분리되는, 방법.
148. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약 140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320 또는 약 1380분 내지 1440분 동안 원심분리되는, 방법.
149. 바람직하게는 현탁액이 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 60, 약 90, 약 120, 약 180, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480 또는 약 540분 내지 약 600분 동안 원심분리되는, 방법.
150. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5분 내지 약 3시간 동안 원심분리되는, 방법.
151. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5분 내지 약 120분 동안 원심분리되는, 방법.
152. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분 또는 약 155분 내지 약 160분 동안 원심분리되는, 방법.
153. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분 또는 약 55분 내지 약 60분 동안 원심분리되는, 방법.
154. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 120, 약
Figure pct00027
-Glc140, 약 160, 약 180, 약 220, 약 240, 약 300, 약 360, 약 420, 약 480, 약 540, 약 600, 약 660, 약 720, 약 780, 약 840, 약 900, 약 960, 약 1020, 약 1080, 약 1140, 약 1200, 약 1260, 약 1320, 약 1380분 또는 약 1440분 동안 원심분리되는, 방법.
155. 134 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 현탁액이 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 65분, 약 70분, 약 75분, 약 80분, 약 85분, 약 90분, 약 95분, 약 100분, 약 105분, 약 110분, 약 115분, 약 120분, 약 125분, 약 130분, 약 135분, 약 140분, 약 145분, 약 150분, 약 155분 또는 약 160분 동안 원심분리되는, 방법.
156. 134 내지 138 및 140 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 원심분리가 연속 원심분리이고, 공급 속도가 50 내지 5000 mL/분, 100 내지 4000 mL/분, 150 내지 3000 mL/분, 200 내지 2500 mL/분, 250 내지 2000 mL/분, 300 내지 1500 mL/분, 300 내지 1000 mL/분, 200 내지 1000 mL/분, 200 내지 1500 mL/분, 400 내지 1500 mL/분, 500 내지 1500 mL/분, 500 내지 1000 mL/분, 500 내지 2000 mL/분, 500 내지 2500 mL/분 또는 1000 내지 2500 mL/분인, 방법.
157. 134 내지 138 및 140 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 원심분리가 연속 원심분리이고, 공급 속도가 약 10, 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 약 1500, 약 1650, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3250, 약 3500, 약 3750, 약 4000, 약 4250, 약 4500 또는 약 5000 mL/분인, 방법.
158. 1 내지 157에 있어서, 다당류-함유 용액이 여과되는, 방법.
159. 158항에 있어서, 여과가 심층여과, 활성탄을 통한 여과, 크기여과, 정용여과 및 한외여과로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
160. 158항에 있어서, 여과 단계가 정용여과인, 방법.
161. 160항에 있어서, 여과가 접선 유동 여과인, 방법.
162. 158항에 있어서, 여과가 심층여과인, 방법.
163. 162에 있어서, 심층 필터 디자인이 카세트, 카트리지, 심층(예컨대 모래 필터) 및 렌즈형 필터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
164. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 100 μm, 약 0.05 내지 100 μm, 약 0.1 내지 100 μm, 약 0.2 내지 100 μm, 약 0.3 내지 100 μm, 약 0.4 내지 100 μm, 약 0.5 내지 100 μm, 약 0.6 내지 100 μm, 약 0.7 내지 100 μm, 약 0.8 내지 100 μm, 약 0.9 내지 100 μm, 약 1 내지 100 μm, 약 1.25 내지 100 μm, 약 1.5 내지 100 μm, 약 1.75 내지 100 μm, 약 2 내지 100 μm, 약 3 내지 100 μm, 약 4 내지 100 μm, 약 5 내지 100 μm, 약 6 내지 100 μm, 약 7 내지 100 μm, 약 8 내지 100 μm, 약 9 내지 100 μm, 약 10 내지 100 μm, 약 15 내지 100 μm, 약 20 내지 100 μm, 약 25 내지 100 μm, 약 30 내지 100 μm, 약 40 내지 100 μm, 약 50 내지 100 μm 또는 약 75 내지 100 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
165. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 75 μm, 약 0.05 내지 75 μm, 약 0.1 내지 75 μm, 약 0.2 내지 75 μm, 약 0.3 내지 75 μm, 약 0.4 내지 75 μm, 약 0.5 내지 75 μm, 약 0.6 내지 75 μm, 약 0.7 내지 75 μm, 약 0.8 내지 75 μm, 약 0.9 내지 75 μm, 약 1 내지 75 μm, 약 1.25 내지 75 μm, 약 1.5 내지 75 μm, 약 1.75 내지 75 μm, 약 2 내지 75 μm, 약 3 내지 75 μm, 약 4 내지 75 μm, 약 5 내지 75 μm, 약 6 내지 75 μm, 약 7 내지 75 μm, 약 8 내지 75 μm, 약 9 내지 75 μm, 약 10 내지 75 μm, 약 15 내지 75 μm, 약 20 내지 75 μm, 약 25 내지 75 μm, 약 30 내지 75 μm, 약 40 내지 75 μm 또는 약 50 내지 75 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
166. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 50 μm, 약 0.05 내지 50 μm, 약 0.1 내지 50 μm, 약 0.2 내지 50 μm, 약 0.3 내지 50 μm, 약 0.4 내지 50 μm, 약 0.5 내지 50 μm, 약 0.6 내지 50 μm, 약 0.7 내지 50 μm, 약 0.8 내지 50 μm, 약 0.9 내지 50 μm, 약 1 내지 50 μm, 약 1.25 내지 50 μm, 약 1.5 내지 50 μm, 약 1.75 내지 50 μm, 약 2 내지 50 μm, 약 3 내지 50 μm, 약 4 내지 50 μm, 약 5 내지 50 μm, 약 6 내지 50 μm, 약 7 내지 50 μm, 약 8 내지 50 μm, 약 9 내지 50 μm, 약 10 내지 50 μm, 약 15 내지 50 μm, 약 20 내지 50 μm, 약 25 내지 50 μm, 약 30 내지 50 μm, 약 40 내지 50 μm 또는 약 50 내지 50 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
167. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 25 μm, 약 0.05 내지 25 μm, 약 0.1 내지 25 μm, 약 0.2 내지 25 μm, 약 0.3 내지 25 μm, 약 0.4 내지 25 μm, 약 0.5 내지 25 μm, 약 0.6 내지 25 μm, 약 0.7 내지 25 μm, 약 0.8 내지 25 μm, 약 0.9 내지 25 μm, 약 1 내지 25 μm, 약 1.25 내지 25 μm, 약 1.5 내지 25 μm, 약 1.75 내지 25 μm, 약 2 내지 25 μm, 약 3 내지 25 μm, 약 4 내지 25 μm, 약 5 내지 25 μm, 약 6 내지 25 μm, 약 7 내지 25 μm, 약 8 내지 25 μm, 약 9 내지 25 μm, 약 10 내지 25 μm, 약 15 내지 25 μm 또는 약 20 내지 25 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
168. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 10 μm, 약 0.05 내지 10 μm, 약 0.1 내지 10 μm, 약 0.2 내지 10 μm, 약 0.3 내지 10 μm, 약 0.4 내지 10 μm, 약 0.5 내지 10 μm, 약 0.6 내지 10 μm, 약 0.7 내지 10 μm, 약 0.8 내지 10 μm, 약 0.9 내지 10 μm, 약 1 내지 10 μm, 약 1.25 내지 10 μm, 약 1.5 내지 10 μm, 약 1.75 내지 10 μm, 약 2 내지 10 μm, 약 3 내지 10 μm, 약 4 내지 10 μm, 약 5 내지 10 μm, 약 6 내지 10 μm, 약 7 내지 10 μm, 약 8 내지 10 μm 또는 약 9 내지 10 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
169. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 8 μm, 약 0.05 내지 8 μm, 약 0.1 내지 8 μm, 약 0.2 내지 8 μm, 약 0.3 내지 8 μm, 약 0.4 내지 8 μm, 약 0.5 내지 8 μm, 약 0.6 내지 8 μm, 약 0.7 내지 8 μm, 약 0.8 내지 8 μm, 약 0.9 내지 8 μm, 약 1 내지 8 μm, 약 1.25 내지 8 μm, 약 1.5 내지 8 μm, 약 1.75 내지 8 μm, 약 2 내지 8 μm, 약 3 내지 8 μm, 약 4 내지 8 μm, 약 5 내지 8 μm, 약 6 내지 8 μm 또는 약 7 내지 8 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
170. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 5 μm, 약 0.05 내지 5 μm, 약 0.1 내지 5 μm, 약 0.2 내지 5 μm, 약 0.3 내지 5 μm, 약 0.4 내지 5 μm, 약 0.5 내지 5 μm, 약 0.6 내지 5 μm, 약 0.7 내지 5 μm, 약 0.8 내지 5 μm, 약 0.9 내지 5 μm, 약 1 내지 5 μm, 약 1.25 내지 5 μm, 약 1.5 내지 5 μm, 약 1.75 내지 5 μm, 약 2 내지 5 μm, 약 3 내지 5 μm 또는 약 4 내지 5 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
171. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 약 1.75 내지 2 μm, 약 2 내지 2 μm, 약 3 내지 2 μm 또는 약 4 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
172. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
173. 158, 159, 162 및 163 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 약 0.05 내지 50 μm, 0.1 내지 25 μm 0.2 내지 10, μm 0.1 내지 10 μm, 0.2 내지 5 μm 또는 0.25 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
174. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 2500 L/m2, 5 내지 2500 L/m2, 10 내지 2500 L/m2, 25 내지 2500 L/m2, 50 내지 2500 L/m2, 75 내지 2500 L/m2, 100 내지 2500 L/m2, 150 내지 2500 L/m2, 200 내지 2500 L/m2, 300 내지 2500 L/m2, 400 내지 2500 L/m2, 500 내지 2500 L/m2, 750 내지 2500 L/m2, 1000 내지 2500 L/m2, 1500 내지 2500 L/m2 또는 2000 내지 2500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
175. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 1000 L/m2, 5 내지 1000 L/m2, 10 내지 1000 L/m2, 25 내지 1000 L/m2, 50 내지 1000 L/m2, 75 내지 1000 L/m2, 100 내지 1000 L/m2, 150 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
176. 155 내지 156 또는 159 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 750 L/m2, 5 내지 750 L/m2, 10 내지 750 L/m2, 25 내지 750 L/m2, 50 내지 750 L/m2, 75 내지 750 L/m2, 100 내지 750 L/m2, 150 내지 750 L/m2, 200 내지 750 L/m2, 300 내지 750 L/m2, 400 내지 750 L/m2 또는 500 내지 750 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
177. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 500 L/m2, 5 내지 500 L/m2, 10 내지 500 L/m2, 25 내지 500 L/m2, 50 내지 500 L/m2, 75 내지 500 L/m2, 100 내지 500 L/m2, 150 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
178. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 400 L/m2, 5 내지 400 L/m2, 10 내지 400 L/m2, 25 내지 400 L/m2, 50 내지 400 L/m2, 75 내지 400 L/m2, 100 내지 400 L/m2, 150 내지 400 L/m2, 200 내지 400 L/m2 또는 300 내지 400 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
179. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 300 L/m2, 5 내지 300 L/m2, 10 내지 300 L/m2, 25 내지 300 L/m2, 50 내지 300 L/m2, 75 내지 300 L/m2, 100 내지 300 L/m2, 150 내지 300 L/m2 또는 200 내지 300 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
180. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 200 L/m2, 5 내지 200 L/m2, 10 내지 200 L/m2, 25 내지 200 L/m2, 50 내지 200 L/m2, 75 내지 200 L/m2, 100 내지 200 L/m2 또는 150 내지 200 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
181. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 100 L/m2, 5 내지 100 L/m2, 10 내지 100 L/m2, 25 내지 100 L/m2, 50 내지 100 L/m2 또는 75 내지 100 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
182. 158, 159 및 162 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 심층 필터가 1 내지 50 L/m2, 5 내지 50 L/m2, 10 내지 50 L/m2 또는 25 내지 50 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
183. 158, 159, 162 및 182 중 어느 하나에 있어서, 공급 속도가 1 내지 1000 LMH(L/m2/h), 10 내지 1000 LMH, 25 내지 1000 LMH, 50 내지 1000 LMH, 100 내지 1000 LMH, 125 내지 1000 LMH, 150 내지 1000 LMH, 200 내지 1000 LMH, 250 내지 1000 LMH, 300 내지 1000 LMH, 400 내지 1000 LMH, 500 내지 1000 LMH, 600 내지 1000 LMH, 700 내지 1000 LMH, 800 내지 1000 LMH 또는 900 내지 1000 LMH인, 방법.
184. 158, 159, 162 및 182 중 어느 하나에 있어서, 공급 속도가 1 내지 500 LMH, 10 내지 500 LMH, 25 내지 500 LMH, 50 내지 500 LMH, 100 내지 500 LMH, 125 내지 500 LMH, 150 내지 500 LMH, 200 내지 500 LMH, 250 내지 500 LMH, 300 내지 500 LMH 또는 400 내지 500 LMH인, 방법.
185. 158, 159, 162 및 182 중 어느 하나에 있어서, 공급 속도가 1 내지 400 LMH, 10 내지 400 LMH, 25 내지 400 LMH, 50 내지 400 LMH, 100 내지 400 LMH, 125 내지 400 LMH, 150 내지 400 LMH, 200 내지 400 LMH, 250 내지 400 LMH 또는 300 내지 400 LMH인, 방법.
186. 158, 159, 162 및 182 중 어느 하나에 있어서, 공급 속도가 1 내지 250
LMH, 10 내지 250 LMH, 25 내지 250 LMH, 50 내지 250 LMH, 100 내지 250 LMH, 125 내지 250 LMH, 150 내지 250 LMH 또는 200 내지 250 LMH인, 방법.
187. 158, 159, 162 및 182 중 어느 하나에 있어서, 공급 속도가 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 25, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 310, 약 320, 약 330, 약 340, 약 350, 약 360, 약 370, 약 380, 약 390, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950 또는 약 1000 LMH인, 방법.
188. 158 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 마이크로여과되는, 방법.
189. 188에 있어서, 마이크로여과가 데드-엔드 여과인, 방법.
190. 188에 있어서, 마이크로여과가 접선 마이크로여과인, 방법.
191. 188 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.45 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 또는 약 1.75 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
192. 188 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.45 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
193. 188 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
194. 188 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.45 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
195. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 5000 L/m2, 200 내지 5000 L/m2, 300 내지 5000 L/m2, 400 내지 5000 L/m2, 500 내지 5000 L/m2, 750 내지 5000 L/m2, 1000 내지 5000 L/m2, 1500 내지 5000 L/m2, 2000 내지 5000 L/m2, 3000 내지 5000 L/m2 또는 4000 내지 5000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
196. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 2500 L/m2, 200 내지 2500 L/m2, 300 내지 2500 L/m2, 400 내지 2500 L/m2, 500 내지 2500 L/m2, 750 내지 2500 L/m2, 1000 내지 2500 L/m2, 1500 내지 2500 L/m2 또는 2000 내지 2500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
197. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 1500 L/m2, 200 내지 1500 L/m2, 300 내지 1500 L/m2, 400 내지 1500 L/m2, 500 내지 1500 L/m2, 750 내지 1500 L/m2 또는 1000 내지 1500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
198. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 1250 L/m2, 200 내지 1250 L/m2, 300 내지 1250 L/m2, 400 내지 1250 L/m2, 500 내지 1250 L/m2, 750 내지 1250 L/m2 또는 1000 내지 1250 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
199. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
200. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 750 L/m2, 200 내지 750 L/m2, 300 내지 750 L/m2, 400 내지 750 L/m2 또는 500 내지 750 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
201. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 600 L/m2, 200 내지 600 L/m2, 300 내지 600 L/m2, 400 내지 600 L/m2 또는 400 내지 600 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
202. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
203. 188 내지 194 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 약 1500, 약 1550, 약 1600, 약 1650, 약 1700, 약 1750, 약 1800, 약 1850, 약 1900, 약 1950, 약 2000, 약 2050, 약 2100, 약 2150, 약 2200, 약 2250, 약 2300, 약 2350, 약 2400, 약 2450 또는 약 2500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
204. 158 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 추가 처리되는, 방법.
205. 158 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 한외여과에 의해 추가 처리되는, 방법.
206. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 1000 kDa인, 방법.
207. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 750 kDa인, 방법.
208. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 500 kDa인, 방법.
209. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 300 kDa인, 방법.
210. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 100 kDa인, 방법.
211. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 50 kDa인, 방법.
212. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 30 kDa인, 방법.
213. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 1000 kDa, 약 10 kDa 내지 1000 kDa 약 20 kDa 내지 1000 kDa, 약 30 kDa 내지 1000 kDa, 약 40 kDa 내지 1000 kDa, 약 50 kDa 내지 1000 kDa, 약 75 kDa 내지 1000 kDa, 약 100 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 200 kDa 내지 1000 kDa, 약 300 kDa 내지 1000 kDa, 약 400 kDa 내지 1000 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa 또는 약 750 kDa 내지 1000 kDa인, 방법.
214. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 500 kDa, 약 10 kDa 내지 500 kDa, 약 20 kDa 내지 500 kDa, 약 30 kDa 내지 500 kDa, 약 40 kDa 내지 500 kDa, 약 50 kDa 내지 500 kDa, 약 75 kDa 내지 500 kDa, 약 100 kDa 내지 500 kDa, 약 150 kDa 내지 500 kDa, 약 200 kDa 내지 500 kDa, 약 300 kDa 내지 500 kDa 또는 약 400 kDa 내지 500 kDa인, 방법.
215. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 5 kDa 내지 300 kDa, 약 10 kDa 내지 300 kDa, 약 20 kDa 내지 300 kDa, 약 30 kDa 내지 300 kDa, 약 40 kDa 내지 300 kDa, 약 50 kDa 내지 300 kDa, 약 75 kDa 내지 300 kDa, 약 100 kDa 내지 300 kDa, 약 150 kDa 내지 300 kDa 또는 약 200 kDa 내지 300 kDa인, 방법.
216. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 100 kDa, 약 10 kDa 내지 100 kDa, 약 20 kDa 내지 100 kDa, 약 30 kDa 내지 100 kDa, 약 40 kDa 내지 100 kDa, 약 50 kDa 내지 100 kDa 또는 약 75 kDa 내지 100 kDa인, 방법.
217. 204 또는 205에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 750 kDa 또는 약 1000 kDa인, 방법.
218. 204 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계의 농축 계수가 약 1.5 내지 약 10인, 방법.
219. 204 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 농축 계수가 약 2 내지 약 8인, 방법.
220. 204 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 농축 계수가 약 2 내지 약 5인, 방법.
221. 204 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 농축 계수가 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0인, 방법.
222. 204 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 농축 계수가 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6인, 방법.
223. 204 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
224. 204 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
225. 204 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
226. 204 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
227. 158 내지 226 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 여과물이 정용여과에 의해 처리되는, 방법.
228. 227에 있어서, 대체 용액이 물인, 방법.
229. 227에 있어서, 대체 용액이 물 중 염수인, 방법.
230. 229에 있어서, 염이 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
231. 229에 있어서, 염이 나트륨 클로라이드인, 방법.
232. 229에 있어서, 대체 용액이 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM 또는 약 500 mM의 나트륨 클로라이드인, 방법.
233. 227에 있어서, 대체 용액이 완충 용액인, 방법.
234. 227에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산(ACES), 아세트산의 염(아세테이트), N-(2-아세트아미도)-이미노다이아세트산(ADA), 2-아미노에탄설폰산(AES, 타우린), 암모니아, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP), 2-아미노-2-메틸 내지 1,3-프로판다이올(AMPD), 암메다이올, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(AMPSO), N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 나트륨 수소 카보네이트(바이카보네이트), N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-글리신(바이신), [비스-(2-하이드록시에틸)-이미노]-트리스-(하이드록시메틸메탄)(비스-트리스), 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판(비스-트리스-프로판), 붕산, 다이메틸아르신산(카코딜레이트), 3-(사이클로헥실아미노)-프로판설폰산(CAPS), 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO), 나트륨 카보네이트(카보네이트), 사이클로헥실아미노에탄설폰산(CHES), 시트르산의 염(시트레이트), 3-[N-비스(하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(DIPSO), 포름산의 염(포르메이트), 글리신, 글리실글리신, N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-에탄설폰산(HEPES), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산(HEPPS, EPPS), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 이미다졸, 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(MOPS), 3-(N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 인산의 염(포스페이트), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), 피리딘, 숙신산의 염(숙시네이트), 3-{[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판설폰산(TAPS), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트라이에탄올아민(TEA), 2-[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-에탄설폰산(TES), N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신(트라이신) 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
235. 227에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 아세트산의 염(아세테이트), 시트르산의 염(시트레이트), 포름산의 염(포르메이트), 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 인산의 염(포스페이트) 및 숙신산의 염(숙시네이트)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
236. 227에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 시트르산의 염(시트레이트) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
237. 227에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 숙신산의 염(숙시네이트)인, 방법.
238. 234 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 염이 나트륨 염인, 방법.
239. 234 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 염이 칼륨 염인, 방법.
240. 233 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 4.0 내지 11.0, 약 5.0 내지 10.0, 약 5.5 내지 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 약 6.0 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0 또는 약 6.0 내지 7.5인, 방법.
241. 233 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0인, 방법.
242. 233 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0인, 방법.
243. 226 내지 231 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 6.5, 약 7.0 또는 약 7.5인, 방법.
244. 233 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH는 약 7.0인, 방법.
245. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 100 mM, 약 0.1 mM 내지 100 mM, 약 0.5 mM 내지 100 mM, 약 1 mM 내지 100 mM, 약 2 mM 내지 100 mM, 약 3 mM 내지 100 mM, 약 4 mM 내지 100 mM, 약 5 mM 내지 100 mM, 약 6 mM 내지 100 mM, 약 7 mM 내지 100 mM, 약 8 mM 내지 100 mM, 약 9 mM 내지 100 mM, 약 10 mM 내지 100 mM, 약 11 mM 내지 100 mM, 약 12 mM 내지 100 mM, 약 13 mM 내지 100 mM, 약 14 mM 내지 100 mM, 약 15 mM 내지 100 mM, 약 16 mM 내지 100 mM, 약 17 mM 내지 100 mM, 약 18 mM 내지 100 mM, 약 19 mM 내지 100 mM, 약 20 mM 내지 100 mM, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 30 mM 내지 100 mM, 약 35 mM 내지 100 mM, 약 40 mM 내지 100 mM, 약 45 mM 내지 100 mM, 약 50 mM 내지 100 mM, 약 55 mM 내지 100 mM, 약 60 mM 내지 100 mM, 약 65 mM 내지 100 mM, 약 70 mM 내지 100 mM, 약 75 mM 내지 100 mM, 약 80 mM 내지 100 mM, 약 85 mM 내지 100 mM, 약 90 mM 내지 100 mM 또는 약 95 mM 내지 100 mM인, 방법.
246. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 50 mM, 약 0.1 mM 내지 50 mM, 약 0.5 mM 내지 50 mM, 약 1 mM 내지 50 mM, 약 2 mM 내지 50 mM, 약 3 mM 내지 50 mM, 약 4 mM 내지 50 mM, 약 5 mM 내지 50 mM, 약 6 mM 내지 50 mM, 약 7 mM 내지 50 mM, 약 8 mM 내지 50 mM, 약 9 mM 내지 50 mM, 약 10 mM 내지 50 mM, 약 11 mM 내지 50 mM, 약 12 mM 내지 50 mM, 약 13 mM 내지 50 mM, 약 14 mM 내지 50 mM, 약 15 mM 내지 50 mM, 약 16 mM 내지 50 mM, 약 17 mM 내지 50 mM, 약 18 mM 내지 50 mM, 약 19 mM 내지 50 mM, 약 20 mM 내지 50 mM, 약 25 mM 내지 50 mM, 약 30 mM 내지 50 mM, 약 35 mM 내지 50 mM, 약 40 mM 내지 50 mM 또는 약 45 mM 내지 50 mM인, 방법.
247. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 25 mM, 약 0.1 mM 내지 25 mM, 약 0.5 mM 내지 25 mM, 약 1 mM 내지 25 mM, 약 2 mM 내지 25 mM, 약 3 mM 내지 25 mM, 약 4 mM 내지 25 mM, 약 5 mM 내지 25 mM, 약 6 mM 내지 25 mM, 약 7 mM 내지 25 mM, 약 8 mM 내지 25 mM, 약 9 mM 내지 25 mM, 약 10 mM 내지 25 mM, 약 11 mM 내지 25 mM, 약 12 mM 내지 25 mM, 약 13 mM 내지 25 mM, 약 14 mM 내지 25 mM, 약 15 mM 내지 25 mM, 약 16 mM 내지 25 mM, 약 17 mM 내지 25 mM, 약 18 mM 내지 25 mM, 약 19 mM 내지 25 mM 또는 약 20 mM 내지 25 mM인, 방법.
248. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 15 mM, 약 0.1 mM 내지 15 mM, 약 0.5 mM 내지 15 mM, 약 1 mM 내지 15 mM, 약 2 mM 내지 15 mM, 약 3 mM 내지 15 mM, 약 4 mM 내지 15 mM, 약 5 mM 내지 15 mM, 약 6 mM 내지 15 mM, 약 7 mM 내지 15 mM, 약 8 mM 내지 15 mM, 약 9 mM 내지 15 mM, 약 10 mM 내지 15 mM, 약 11 mM 내지 15 mM, 약 12 mM 내지 15 mM, 약 13 mM 내지 15 mM 또는 약 14 mM 내지 15 mM인, 방법.
249. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 10 mM, 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 2 mM 내지 10 mM, 약 3 mM 내지 10 mM, 약 4 mM 내지 10 mM, 약 5 mM 내지 10 mM, 약 6 mM 내지 10 mM, 약 7 mM 내지 10 mM, 약 8 mM 내지 10 mM 또는 약 9 mM 내지 10 mM인, 방법.
250. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM인, 방법.
251. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM인, 방법.
252. 233 내지 244 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 10 mM인, 방법.
253. 233 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 킬레이트제를 포함하는, 방법.
254. 233 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 명반 킬레이트제를 포함하는, 방법.
255. 233 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 에틸렌다이아민-N,N'-다이프로피온산 다이하이드로클로라이드(EDDP), 에틸렌다이아민테트라키스(메틸렌설폰산)(EDTPO), 니트릴로트리스(메틸렌포스폰산)(NTPO), 이미노다이아세트산(IDA), 하이드록시이미노다이아세트산(HIDA), 니트릴로트라이아세트산(NTP), 트라이에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 다이머캅토숙신산(DMSA), 2,3-다이머캅토-1-프로판설폰산(DMPS), α리포산(ALA), 니트릴로트라이아세트산(NTA), 티아민테트라하이드로퓨르퓨르일다이설파이드(TTFD), 다이머캅롤, 페니실아민, 데페록사민(DFOA), 데페라시록스, 포스포네이트, 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트제를 포함하는, 방법.
256. 233 내지 255 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트제를 포함하는, 방법.
257. 233 내지 254 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA)를 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
258. 233 내지 254 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 시트르산의 염(시트레이트)을 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
259. 233 내지 254 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 나트륨 시트레이트를 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
260. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 1 내지 500 mM인, 방법.
261. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도는 2 내지 400 mM인, 방법.
262. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 400 mM인, 방법.
263. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 200 mM인, 방법.
264. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 100 mM인, 방법.
265. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 50 mM인, 방법.
266. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 30 mM인, 방법.
267. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM인, 방법.
268. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM인, 방법.
269. 253 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM인, 방법.
270. 233 내지 269 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 염을 포함하는, 방법.
271. 270에 있어서, 염이 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
272. 270에 있어서, 염이 나트륨 클로라이드인 방법.
273. 270 내지 272 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 나트륨 클로라이드를 1 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250 또는 약 300 mM으로 포함하는, 방법.
274. 227 내지 273 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50인, 방법.
275. 227 내지 273 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100인, 방법.
276. 227 내지 273 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15인, 방법.
277. 227 내지 276 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
278. 227 내지 276 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다.
279. 227 내지 276 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
280. 227 내지 276 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
281. 204 내지 277 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
282. 204 내지 277 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행된다.
283. 204 내지 277 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
284. 204 내지 277 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
285. 1 내지 284 중 어느 하나에 있어서, 다당류를 함유하는 용액(예컨대 상청액, 여과물 또는 농축물)이 활성탄 여과 단계에 의해 처리되는, 방법.
286. 285에 있어서, 활성탄이 분말, 과립 탄소층, 압착된 탄소 블럭 또는 압출된 탄소 블럭(예컨대 노리트(Norit) 활성 차콜 참고)의 형태인, 방법.
287. 286에 있어서, 활성탄이 약 0.1 내지 20%(중량 부피), 1 내지 15%(중량 부피), 1 내지 10%(중량 부피), 2 내지 10%(중량 부피), 3 내지 10%(중량 부피), 4 내지 10%(중량 부피), 5 내지 10%(중량 부피), 1 내지 5%(중량 부피) 또는 2 내지 5%(중량 부피)로 첨가되는, 방법.
288. 286 또는 287에 있어서, 혼합물이 교반되고 방치되는, 방법.
289. 286 또는 287에 있어서, 혼합물이 교반되고 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 45, 약 60, 약 90, 약 120, 약 180, 약 240분 또는 그 이상 동안 방치되는, 방법.
290. 286 내지 289 중 어느 하나에 있어서, 이어서, 활성탄이 제거되는, 방법.
291. 286 내지 290 중 어느 하나에 있어서, 활성탄이 원심분리 또는 여과에 의해 제거되는, 방법.
292. 285에 있어서, 용액이 매트릭스 내에 부동화된 활성탄을 통해 여과되는, 방법.
293. 285에 있어서, 매트릭스가 용액에 투과성인 다공성 필터 매질인, 방법.
294. 292 내지 293 중 어느 하나에 있어서, 매트릭스가 지지체 물질을 포함하는, 방법.
295. 292 내지 293 중 어느 하나에 있어서, 매트릭스가 결합제 물질을 포함하는, 방법.
296. 294 내지 295 중 어느 하나에 있어서, 지지체 물질이 합성 중합체인, 방법.
297. 294 내지 295 중 어느 하나에 있어서, 지지체 물질이 천연 유래 중합체인 방법.
298. 296에 있어서, 합성 중합체가 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 또는 폴리메틸 메트아크릴레이트 중 임의의 하나를 포함하는, 방법.
299. 296에 있어서, 합성 중합체가 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 및 폴리메틸 메트아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
300. 297에 있어서, 천연 유래 중합체가 셀룰로스, 다당류, 덱스트란 또는 아가로스 중 임의의 하나를 포함하는, 방법.
301. 297에 있어서, 천연 유래 중합체가 셀룰로스, 다당류, 덱스트란 및 아가로스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
302. 294 내지 301 중 어느 하나에 있어서, 중합체 지지체 물질이 존재하는 경우, 상기 중합체 지지체 물질이 역학적 강성을 제공하기 위한 섬유 네트워크 형태인, 방법.
303. 294 내지 302 중 어느 하나에 있어서, 결합제 물질이 존재하는 경우, 상기 결합제 물질이 수지인, 방법.
304. 292 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 매트릭스가 막 시트의 형태인, 방법.
305. 292 내지 304 중 어느 하나에 있어서, 매트릭스 내에 부동화된 활성탄이 유동-통과 탄소 카트리지 형태인, 방법.
306. 304에 있어서, 막 시트가 나선형으로 꼬인, 방법.
307. 292 내지 306 중 어느 하나에 있어서, 수개의 디스크가 서로 적층되는, 방법.
308. 307에 있어서, 적층된 디스크의 형태가 렌즈형인, 방법.
309. 292 내지 308 중 어느 하나에 있어서, 탄소 필터 내의 활성탄이 토탄, 갈탄, 목재 또는 코코넛 껍질로부터 유래하는, 방법.
310. 292 내지 309 중 어느 하나에 있어서, 활성탄이 하우징 내에 위치되어 독립적인 필터 단위를 형성하는, 방법.
311. 292 내지 310 중 어느 하나에 있어서, 활성탄이 셀룰로스 매트릭스를 포함하되, 여기에 활성탄 분말이 포획되고 그 자리에서 수지-결합되는, 방법.
312. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 100 μm, 약 0.05 내지 100 μm, 약 0.1 내지 100 μm, 약 0.2 내지 100 μm, 약 0.3 내지 100 μm, 약 0.4 내지 100 μm, 약 0.5 내지 100 μm, 약 0.6 내지 100 μm, 약 0.7 내지 100 μm, 약 0.8 내지 100 μm, 약 0.9 내지 100 μm, 약 1 내지 100 μm, 약 1.25 내지 100 μm, 약 1.5 내지 100 μm, 약 1.75 내지 100 μm, 약 2 내지 100 μm, 약 3 내지 100 μm, 약 4 내지 100 μm, 약 5 내지 100 μm, 약 6 내지 100 μm, 약 7 내지 100 μm, 약 8 내지 100 μm, 약 9 내지 100 μm, 약 10 내지 100 μm, 약 15 내지 100 μm, 약 20 내지 100 μm, 약 25 내지 100 μm, 약 30 내지 100 μm, 약 40 내지 100 μm, 약 50 내지 100 μm 또는 약 75 내지 100 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
313. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 50 μm, 약 0.05 내지 50 μm, 약 0.1 내지 50 μm, 약 0.2 내지 50 μm, 약 0.3 내지 50 μm, 약 0.4 내지 50 μm, 약 0.5 내지 50 μm, 약 0.6 내지 50 μm, 약 0.7 내지 50 μm, 약 0.8 내지 50 μm, 약 0.9 내지 50 μm, 약 1 내지 50 μm, 약 1.25 내지 50 μm, 약 1.5 내지 50 μm, 약 1.75 내지 50 μm, 약 2 내지 50 μm, 약 3 내지 50 μm, 약 4 내지 50 μm, 약 5 내지 50 μm, 약 6 내지 50 μm, 약 7 내지 50 μm, 약 8 내지 50 μm, 약 9 내지 50 μm, 약 10 내지 50 μm, 약 15 내지 50 μm, 약 20 내지 50 μm, 약 25 내지 50 μm, 약 30 내지 50 μm, 약 40 내지 50 μm 또는 약 50 내지 50 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
314. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 25 μm, 약 0.05 내지 25 μm, 약 0.1 내지 25 μm, 약 0.2 내지 25 μm, 약 0.3 내지 25 μm, 약 0.4 내지 25 μm, 약 0.5 내지 25 μm, 약 0.6 내지 25 μm, 약 0.7 내지 25 μm, 약 0.8 내지 25 μm, 약 0.9 내지 25 μm, 약 1 내지 25 μm, 약 1.25 내지 25 μm, 약 1.5 내지 25 μm, 약 1.75 내지 25 μm, 약 2 내지 25 μm, 약 3 내지 25 μm, 약 4 내지 25 μm, 약 5 내지 25 μm, 약 6 내지 25 μm, 약 7 내지 25 μm, 약 8 내지 25 μm, 약 9 내지 25 μm, 약 10 내지 25 μm, 약 15 내지 25 μm 또는 약 20 내지 25 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
315. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 10 μm, 약 0.05 내지 10 μm, 약 0.1 내지 10 μm, 약 0.2 내지 10 μm, 약 0.3 내지 10 μm, 약 0.4 내지 10 μm, 약 0.5 내지 10 μm, 약 0.6 내지 10 μm, 약 0.7 내지 10 μm, 약 0.8 내지 10 μm, 약 0.9 내지 10 μm, 약 1 내지 10 μm, 약 1.25 내지 10 μm, 약 1.5 내지 10 μm, 약 1.75 내지 10 μm, 약 2 내지 10 μm, 약 3 내지 10 μm, 약 4 내지 10 μm, 약 5 내지 10 μm, 약 6 내지 10 μm, 약 7 내지 10 μm, 약 8 내지 10 μm 또는 약 9 내지 10 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
316. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 8 μm, 약 0.05 내지 8 μm, 약 0.1 내지 8 μm, 약 0.2 내지 8 μm, 약 0.3 내지 8 μm, 약 0.4 내지 8 μm, 약 0.5 내지 8 μm, 약 0.6 내지 8 μm, 약 0.7 내지 8 μm, 약 0.8 내지 8 μm, 약 0.9 내지 8 μm, 약 1 내지 8 μm, 약 1.25 내지 8 μm, 약 1.5 내지 8 μm, 약 1.75 내지 8 μm, 약 2 내지 8 μm, 약 3 내지 8 μm, 약 4 내지 8 μm, 약 5 내지 8 μm, 약 6 내지 8 μm 또는 약 7 내지 8 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
317. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 5 μm, 약 0.05 내지 5 μm, 약 0.1 내지 5 μm, 약 0.2 내지 5 μm, 약 0.3 내지 5 μm, 약 0.4 내지 5 μm, 약 0.5 내지 5 μm, 약 0.6 내지 5 μm, 약 0.7 내지 5 μm, 약 0.8 내지 5 μm, 약 0.9 내지 5 μm, 약 1 내지 5 μm, 약 1.25 내지 5 μm, 약 1.5 내지 5 μm, 약 1.75 내지 5 μm, 약 2 내지 5 μm, 약 3 내지 5 μm 또는 약 4 내지 5 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
318. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 약 1.75 내지 2 μm, 약 2 내지 2 μm, 약 3 내지 2 μm 또는 약 4 내지 2 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
319. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
320. 285 내지 311 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 필터가 약 0.05 내지 50 μm, 0.1 내지 25 μm 0.2 내지 10, μm 0.1 내지 10 μm, 0.2 내지 5 μm 또는 0.25 내지 1 μm의 공칭 μm 등급을 갖는, 방법.
321. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 500 LMH, 10 내지 500 LMH, 15 내지 500 LMH, 20 내지 500 LMH, 25 내지 500 LMH, 30 내지 500 LMH, 40 내지 500 LMH, 50 내지 500 LMH, 100 내지 500 LMH, 125 내지 500 LMH, 150 내지 500 LMH, 200 내지 500 LMH, 250 내지 500 LMH, 300 내지 500 LMH 또는 400 내지 500 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
322. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 200 LMH, 10 내지 200 LMH, 15 내지 200 LMH, 20 내지 200 LMH, 25 내지 200 LMH, 30 내지 200 LMH, 40 내지 200 LMH, 50 내지 200 LMH, 100 내지 200 LMH, 125 내지 200 LMH 또는 150 내지 200 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
323. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 150 LMH, 10 내지 150 LMH, 15 내지 150 LMH, 20 내지 150 LMH, 25 내지 150 LMH, 30 내지 150 LMH, 40 내지 150 LMH, 50 내지 150 LMH, 100 내지 150 LMH 또는 125 내지 150 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
324. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 100 LMH, 10 내지 100 LMH, 15 내지 100 LMH, 20 내지 100 LMH, 25 내지 100 LMH, 30 내지 100 LMH, 40 내지 100 LMH, 또는 50 내지 100 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
325. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 75 LMH, 5 내지 75 LMH, 10 내지 75 LMH, 15 내지 75 LMH, 20 내지 75 LMH, 25 내지 75 LMH, 30 내지 75 LMH, 35 내지 75 LMH, 40 내지 75 LMH, 45 내지 75 LMH, 50 내지 75 LMH, 55 내지 75 LMH, 60 내지 75 LMH, 65 내지 75 LMH 또는 70 내지 75 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
326. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 1 내지 50 LMH, 5 내지 50 LMH, 7 내지 50 LMH, 10 내지 50 LMH, 15 내지 50 LMH, 20 내지 50 LMH, 25 내지 50 LMH, 30 내지 50 LMH, 35 내지 50 LMH, 40 내지 50 LMH 또는 45 내지 50 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
327. 285 내지 320 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과가 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 225, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 950 또는 약 1000 LMH의 공급 속도로 수행되는, 방법.
328. 285 내지 327 중 어느 하나에 있어서, 용액이 활성탄 필터에 의해 처리되되, 상기 필터가 5 내지 1000 L/m2, 10 내지 750 L/m2, 15 내지 500 L/m2, 20 내지 400 L/m2, 25 내지 300 L/m2, 30 내지 250 L/m2, 40 내지 200 L/m2 또는 30 내지 100 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
329. 285 내지 327 중 어느 하나에 있어서, 용액이 활성탄 필터에 의해 처리되되, 상기 필터는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225, 약 250, 약 275, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 또는 약 1000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
330. 285 내지 329 중 어느 하나에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 활성탄 여과 단계가 수행되는, 방법.
331. 285 내지 329 중 어느 하나에 있어서, 1, 2 또는 3회의 활성탄 여과 단계가 수행되는, 방법.
332. 285 내지 329 중 어느 하나에 있어서, 1 또는 2회의 활성탄 여과 단계가 수행되는, 방법.
333. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
334. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
335. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 2, 3, 4 또는 5개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
336. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 2개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
337. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 3개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
338. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 4개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
339. 285 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 용액이 5개의 일련의 활성탄 필터로 처리되는, 방법.
340. T285 내지 339 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과 단계가 단일 경로 모드로 수행되는, 방법.
341. T285 내지 339 중 어느 하나에 있어서, 활성탄 여과 단계가 재순환 모드로 수행되는, 방법.
342. 341에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 사이클의 활성탄 여과가 수행되는, 방법.
343. 341에 있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 사이클의 활성탄 여과가 수행되는, 방법.
344. 341에 있어서, 2 또는 3 사이클의 활성탄 여과가 수행되는, 방법.
345. 341에 있어서, 2 사이클의 활성탄 여과가 수행되는, 방법.
346. 285 내지 345 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 추가로 여과되는, 방법.
347. 285 내지 345 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 마이크로여과되는, 방법.
348. 347에 있어서, 마이크로여과가 데드-엔드 여과(수직 여과)인, 방법.
349. 347에 있어서, 마이크로여과가 접선 마이크로여과인 방법.
350. 347 내지 349 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01 내지 2 μm, 약 0.05 내지 2 μm, 약 0.1 내지 2 μm, 약 0.2 내지 2 μm, 약 0.3 내지 2 μm, 약 0.4 내지 2 μm, 약 0.45 내지 2 μm, 약 0.5 내지 2 μm, 약 0.6 내지 2 μm, 약 0.7 내지 2 μm, 약 0.8 내지 2 μm, 약 0.9 내지 2 μm, 약 1 내지 2 μm, 약 1.25 내지 2 μm, 약 1.5 내지 2 μm, 또는 약 1.75 내지 2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
351. 347 내지 349 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01 내지 1 μm, 약 0.05 내지 1 μm, 약 0.1 내지 1 μm, 약 0.2 내지 1 μm, 약 0.3 내지 1 μm, 약 0.4 내지 1 μm, 약 0.45 내지 1 μm, 약 0.5 내지 1 μm, 약 0.6 내지 1 μm, 약 0.7 내지 1 μm, 약 0.8 내지 1 μm 또는 약 0.9 내지 1 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
352. 347 내지 349 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.45, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2.0 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
353. 343 내지 345 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
354. 347 내지 353 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 6000 L/m2, 200 내지 6000 L/m2, 300 내지 6000 L/m2, 400 내지 6000 L/m2, 500 내지 6000 L/m2, 750 내지 6000 L/m2, 1000 내지 6000 L/m2, 1500 내지 6000 L/m2, 2000 내지 6000 L/m2, 3000 내지 6000 L/m2 또는 4000 내지 6000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
355. 347 내지 353 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 4000 L/m2, 200 내지 4000 L/m2, 300 내지 4000 L/m2, 400 내지 4000 L/m2, 500 내지 4000 L/m2, 750 내지 4000 L/m2, 1000 내지 4000 L/m2, 1500 내지 4000 L/m2, 2000 내지 4000 L/m2, 2500 내지 4000 L/m2, 3000 내지 4000 L/m2, 3000 내지 4000 L/m2 또는 3500 내지 4000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
356. 347 내지 353 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 3750 L/m2, 200 내지 3750 L/m2, 300 내지 3750 L/m2, 400 내지 3750 L/m2, 500 내지 3750 L/m2, 750 내지 3750 L/m2, 1000 내지 3750 L/m2, 1500 내지 3750 L/m2, 2000 내지 3750 L/m2, 2500 내지 3750 L/m2, 3000 내지 3750 L/m2, 3000 내지 3750 L/m2 또는 3500 내지 3750 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
357. 347 내지 353 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 100 내지 1250 L/m2, 200 내지 1250 L/m2, 300 내지 1250 L/m2, 400 내지 1250 L/m2, 500 내지 1250 L/m2, 750 내지 1250 L/m2 또는 1000 내지 1250 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
358. 347 내지 353 중 어느 하나에 있어서, 마이크로여과 필터가 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 550, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1600, 약 1700, 약 1800, 약 1900, 약 2000, 약 2100, 약 2200, 약 2300, 약 2400, 약 2500, 약 2600, 약 2700, 약 2800, 약 2900, 약 3000, 약 3100, 약 3200, 약 3300, 약 3400, 약 3500, 약 3600, 약 3700, 약 3800, 약 3900, 약 4000, 약 4100, 약 4200, 약 4300, 약 4400, 약 4500, 약 4600, 약 4700, 약 4800, 약 4900, 약 5000, 약 5250, 약 5500, 약 5750 또는 약 6000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
359. 1 내지 358 중 어느 하나에 있어서, 다당류-함유 용액 또는 여과물이 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가 정제되는, 방법.
360. 359에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 페닐 막, 부틸-아가로스, 페닐-아가로스, 옥틸-아가로스, 부틸 유기 중합체 수지, 페닐 유기 중합체 수지, 에터 유기 중합체 수지, 폴리프로필렌글리콜 유기 중합체 수지 및 헥실 유기 중합체 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 수소성 흡착제를 사용하여 수행되는, 방법.
361. 360에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 페닐 막을 사용하여 수행되는, 방법.
362. 361에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사르토바인드(Sartobind: 등록상표) 페닐 막 또는 사이티바(Cytiva: 등록상표) 페닐 흡착제 막을 사용하여 수행되는, 방법.
363. 359 내지 362 중 어느 하나에 있어서, 다당류-함유 용액 또는 여과물이 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9 또는 약 7.0 M로부터 선택되는 염 농도를 갖는 전개 완충액을 수득하기 위한 염을 포함하는 평형 완충액에 의해 처리되는, 방법.
364. 363에 있어서, 전개 완충액의 pH가 약 4.0 내지 약 8.0인, 방법.
365. 364에 있어서, 전개 완충액의 pH가 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0인, 방법.
366. 363 내지 365 중 어느 하나에 있어서, 염이 암모늄 설페이트, 나트륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트, 나트륨 설페이트, 나트륨 시트레이트 및 나트륨 클로라이드로부터 선택되는, 방법.
367. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 6.0±2.0에서 약 0.5 M 내지 약 3.0 M로 구성된 농도로 암모늄 설페이트를 포함하는, 방법.
368. 367에 있어서, 전개 완충액이 약 6.0의 pH에서 약 1.0 M 내지 약 2.0 M로 구성된 농도로 암모늄 설페이트를 포함하는, 방법.
369. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 7.0±1.5에서 약 0.5 M 내지 약 3.0 M로 구성된 농도로 나트륨 포스페이트를 포함하는, 방법.
370. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 7.0±1.5에서 약 0.5 M 내지 약 3.0 M로 구성된 농도로 칼륨 포스페이트를 포함하는, 방법.
371. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 6.0±2.0에서 약 0.1 M 내지 약 0.75 M로 구성된 농도로 나트륨 설페이트를 포함하는, 방법.
372. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 6.0±2.0에서 약 0.1 M 내지 약 1.5 M로 구성된 농도로 나트륨 시트레이트를 포함하는, 방법.
373. 363에 있어서, 전개 완충액이 pH 7.0±1.5에서 약 0.5 M 내지 약 5.0 M로 구성된 농도로 나트륨 클로라이드를 포함하는, 방법.
374. 363 내지 373 중 어느 하나에 있어서, 소수성 흡착제가 전개 완충액에 의해 평형화되는, 방법.
375. 360 내지 374 중 어느 하나에 있어서, 소수성 흡착제가 페닐 막이고, 유속이 약 0.1 내지 약 20 막 부피/분, 약 0.1 내지 약 10 막 부피/분, 약 0.2 내지 약 10 막 부피/분, 약 0.2 내지 약 5 막 부피/분 또는 약 0.1 내지 약 1 막 부피/분으로 구성되는, 방법.
376. 375에 있어서, 유속이 약 0.1 내지 약 1.0 막 부피/분으로 구성되는, 방법.
377. 376에 있어서, 유속이 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9 또는 약 1.0 막 부피/분으로 구성되는, 방법.
378. 363 내지 375 중 어느 하나에 있어서, 소수성 흡착제가 전개 완충액에 의해 세척되는, 방법.
379. 285 내지 378 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 한외여과 및/또는 정용여과에 의해 추가 청징되는, 방법.
380. 285 내지 378 중 어느 하나에 있어서, 여과물이 한외여과에 의해 추가 청징되는, 방법.
381. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 1000 kDa인, 방법.
382. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 750 kDa인, 방법.
383. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 500 kDa인, 방법.
384. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 300 kDa인, 방법.
385. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 100 kDa인, 방법.
386. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 50 kDa인, 방법.
387. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 10 kDa 내지 30 kDa인, 방법.
388. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 1000 kDa, 약 10 kDa 내지 1000 kDa 약 20 kDa 내지 1000 kDa, 약 30 kDa 내지 1000 kDa, 약 40 kDa 내지 1000 kDa, 약 50 kDa 내지 1000 kDa, 약 75 kDa 내지 1000 kDa, 약 100 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 200 kDa 내지 1000 kDa, 약 300 kDa 내지 1000 kDa, 약 400 kDa 내지 1000 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa 또는 약 750 kDa 내지 1000 kDa인, 방법.
389. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 500 kDa, 약 10 kDa 내지 500 kDa, 약 20 kDa 내지 500 kDa, 약 30 kDa 내지 500 kDa, 약 40 kDa 내지 500 kDa, 약 50 kDa 내지 500 kDa, 약 75 kDa 내지 500 kDa, 약 100 kDa 내지 500 kDa, 약 150 kDa 내지 500 kDa, 약 200 kDa 내지 500 kDa, 약 300 kDa 내지 500 kDa 또는 약 400 kDa 내지 500 kDa인, 방법.
390. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 300 kDa, 약 10 kDa 내지 300 kDa, 약 20 kDa 내지 300 kDa, 약 30 kDa 내지 300 kDa, 약 40 kDa 내지 300 kDa, 약 50 kDa 내지 300 kDa, 약 75 kDa 내지 300 kDa, 약 100 kDa 내지 300 kDa, 약 150 kDa 내지 300 kDa 또는 약 200 kDa 내지 300 kDa인, 방법.
391. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa 내지 100 kDa, 약 10 kDa 내지 100 kDa, 약 20 kDa 내지 100 kDa, 약 30 kDa 내지 100 kDa, 약 40 kDa 내지 100 kDa, 약 50 kDa 내지 100 kDa 또는 약 75 kDa 내지 100 kDa인, 방법.
392. 379 또는 380에 있어서, 한외여과 막의 분자량 컷 오프가 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 20 kDa, 약 30 kDa, 약 40 kDa, 약 50 kDa, 약 60 kDa, 약 70 kDa, 약 80 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 110 kDa, 약 120 kDa, 약 130 kDa, 약 140 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 750 kDa 또는 약 1000 kDa인, 방법.
393. 379 내지 381 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계의 농축 계수가 약 1.5 내지 약 10.0인, 방법.
394. 379 내지 381 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계의 농축 계수가 약 2.0 내지 약 8.0 인, 방법.
395. 379 내지 381 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계의 농축 계수가 약 2.0 내지 약 5.0 인, 방법.
396. 379 내지 381 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계의 농축 계수가 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5 또는 약 10.0. 한 양태에서, 농축 계수는 약 2.0, 약 3.0, 약 4.0, 약 5.0, 또는 약 6.0인, 방법.
397. 379 내지 396 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
398. 379 내지 396 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
399. 379 내지 396 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
400. 379 내지 396 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
401. 379 내지 396 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 여과물이 정용여과에 의해 처리되는, 방법.
402. 401에 있어서, 대체 용액이 물인, 방법.
403. 401에 있어서, 대체 용액이 물 중 염수인, 방법.
404. 403에 있어서, 염이 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
405. 403에 있어서, 염이 나트륨 클로라이드인, 방법.
406. 403에 있어서, 대체 용액이 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM 또는 약 500 Mm의 나트륨 클로라이드인, 방법.
407. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액인, 방법.
408. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산(ACES), 아세트산의 염(아세테이트), N-(2-아세트아미도)-이미노다이아세트산(ADA), 2-아미노에탄설폰산(AES, 타우린), 암모니아, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP), 2-아미노-2-메틸 내지 1,3-프로판다이올(AMPD), 암메다이올, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(AMPSO), N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 나트륨 수소 카보네이트(바이카보네이트), N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-글리신(바이신), [비스-(2-하이드록시에틸)-이미노]-트리스-(하이드록시메틸메탄)(비스-트리스), 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판(비스-트리스-프로판), 붕산, 다이메틸아르신산(카코딜레이트), 3-(사이클로헥실아미노)-프로판설폰산(CAPS), 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산(CAPSO), 나트륨 카보네이트(카보네이트), 사이클로헥실아미노에탄설폰산(CHES), 시트르산의 염(시트레이트), 3-[N-비스(하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(DIPSO), 포름산의 염(포르메이트), 글리신, 글리실글리신, N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-에탄설폰산(HEPES), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산(HEPPS, EPPS), N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 이미다졸, 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(MOPS), 3-(N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 인산의 염(포스페이트), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), 피리딘, 숙신산의 염(숙시네이트), 3-{[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판설폰산(TAPS), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트라이에탄올아민(TEA), 2-[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-에탄설폰산(TES), N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신(트라이신) 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
409. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 아세트산의 염(아세테이트), 시트르산의 염(시트레이트), 포름산의 염(포르메이트), 말산의 염(말레이트), 말레산의 염(말리에이트), 인산의 염(포스페이트) 및 숙신산의 염(숙시네이트)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
410. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 시트르산의 염(시트레이트)인, 방법.
411. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 숙신산의 염(숙시네이트)인, 방법.
412. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 인산의 염(포스페이트)인, 방법.
413. 408 내지 412 중 어느 하나에 있어서, 염이 나트륨 염인, 방법.
414. 408 내지 412 중 어느 하나에 있어서, 염은 칼륨 염인, 방법.
415. 401에 있어서, 대체 용액이 완충 용액이되, 완충제가 칼륨 포스페이트인, 방법.
416. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 4.0 내지 11.0, 약 5.0 내지 10.0, 약 5.5 내지 9.0, 약 6.0 내지 8.0, 약 6.0 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0 또는 약 6.0 내지 7.5인, 방법.
417. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 약 9.0, 약 9.5, 약 10.0, 약 10.5 또는 약 11.0인, 방법.
418. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0인, 방법.
419. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 6.5, 약 7.0 또는 약 7.5인, 방법.
420. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 6.0인, 방법.
421. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH는 약 6.5인, 방법.
422. 401 내지 415 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 pH가 약 7.0인, 방법.
423. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 100 mM, 약 0.1 mM 내지 100 mM, 약 0.5 mM 내지 100 mM, 약 1 mM 내지 100 mM, 약 2 mM 내지 100 mM, 약 3 mM 내지 100 mM, 약 4 mM 내지 100 mM, 약 5 mM 내지 100 mM, 약 6 mM 내지 100 mM, 약 7 mM 내지 100 mM, 약 8 mM 내지 100 mM, 약 9 mM 내지 100 mM, 약 10 mM 내지 100 mM, 약 11 mM 내지 100 mM, 약 12 mM 내지 100 mM, 약 13 mM 내지 100 mM, 약 14 mM 내지 100 mM, 약 15 mM 내지 100 mM, 약 16 mM 내지 100 mM, 약 17 mM 내지 100 mM, 약 18 mM 내지 100 mM, 약 19 mM 내지 100 mM, 약 20 mM 내지 100 mM, 약 25 mM 내지 100 mM, 약 30 mM 내지 100 mM, 약 35 mM 내지 100 mM, 약 40 mM 내지 100 mM, 약 45 mM 내지 100 mM, 약 50 mM 내지 100 mM, 약 55 mM 내지 100 mM, 약 60 mM 내지 100 mM, 약 65 mM 내지 100 mM, 약 70 mM 내지 100 mM, 약 75 mM 내지 100 mM, 약 80 mM 내지 100 mM, 약 85 mM 내지 100 mM, 약 90 mM 내지 100 mM 또는 약 95 mM 내지 100 mM인, 방법.
424. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 50 mM, 약 0.1 mM 내지 50 mM, 약 0.5 mM 내지 50 mM, 약 1 mM 내지 50 mM, 약 2 mM 내지 50 mM, 약 3 mM 내지 50 mM, 약 4 mM 내지 50 mM, 약 5 mM 내지 50 mM, 약 6 mM 내지 50 mM, 약 7 mM 내지 50 mM, 약 8 mM 내지 50 mM, 약 9 mM 내지 50 mM, 약 10 mM 내지 50 mM, 약 11 mM 내지 50 mM, 약 12 mM 내지 50 mM, 약 13 mM 내지 50 mM, 약 14 mM 내지 50 mM, 약 15 mM 내지 50 mM, 약 16 mM 내지 50 mM, 약 17 mM 내지 50 mM, 약 18 mM 내지 50 mM, 약 19 mM 내지 50 mM, 약 20 mM 내지 50 mM, 약 25 mM 내지 50 mM, 약 30 mM 내지 50 mM, 약 35 mM 내지 50 mM, 약 40 mM 내지 50 mM 또는 약 45 mM 내지 50 mM인, 방법.
425. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 25 mM, 약 0.1 mM 내지 25 mM, 약 0.5 mM 내지 25 mM, 약 1 mM 내지 25 mM, 약 2 mM 내지 25 mM, 약 3 mM 내지 25 mM, 약 4 mM 내지 25 mM, 약 5 mM 내지 25 mM, 약 6 mM 내지 25 mM, 약 7 mM 내지 25 mM, 약 8 mM 내지 25 mM, 약 9 mM 내지 25 mM, 약 10 mM 내지 25 mM, 약 11 mM 내지 25 mM, 약 12 mM 내지 25 mM, 약 13 mM 내지 25 mM, 약 14 mM 내지 25 mM, 약 15 mM 내지 25 mM, 약 16 mM 내지 25 mM, 약 17 mM 내지 25 mM, 약 18 mM 내지 25 mM, 약 19 mM 내지 25 mM 또는 약 20 mM 내지 25 mM인, 방법.
426. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 15 mM, 약 0.1 mM 내지 15 mM, 약 0.5 mM 내지 15 mM, 약 1 mM 내지 15 mM, 약 2 mM 내지 15 mM, 약 3 mM 내지 15 mM, 약 4 mM 내지 15 mM, 약 5 mM 내지 15 mM, 약 6 mM 내지 15 mM, 약 7 mM 내지 15 mM, 약 8 mM 내지 15 mM, 약 9 mM 내지 15 mM, 약 10 mM 내지 15 mM, 약 11 mM 내지 15 mM, 약 12 mM 내지 15 mM, 약 13 mM 내지 15 mM 또는 약 14 mM 내지 15 mM인, 방법.
427. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM 내지 10 mM, 약 0.1 mM 내지 10 mM, 약 0.5 mM 내지 10 mM, 약 1 mM 내지 10 mM, 약 2 mM 내지 10 mM, 약 3 mM 내지 10 mM, 약 4 mM 내지 10 mM, 약 5 mM 내지 10 mM, 약 6 mM 내지 10 mM, 약 7 mM 내지 10 mM, 약 8 mM 내지 10 mM 또는 약 9 mM 내지 10 mM인, 방법.
428. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM인, 방법.
429. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 또는 약 50 mM인, 방법.
430. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 30 mM인, 방법.
431. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 25 mM인, 방법.
432. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 20 mM인, 방법.
433. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 15 mM인, 방법.
434. 407 내지 422 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 완충제의 농도가 약 10 mM인, 방법.
435. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 킬레이트제를 포함하는, 방법.
436. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 명반 킬레이트제를 포함하는, 방법.
437. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 에틸렌다이아민-N,N'-다이프로피온산 다이하이드로클로라이드(EDDP), 에틸렌다이아민테트라키스(메틸렌설폰산)(EDTPO), 니트릴로트리스(메틸렌포스폰산)(NTPO), 이미노다이아세트산(IDA), 하이드록시이미노다이아세트산(HIDA), 니트릴로트라이아세트산(NTP), 트라이에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 다이머캅토숙신산(DMSA), 2,3-다이머캅토-1-프로판설폰산(DMPS), α리포산(ALA), 니트릴로트라이아세트산(NTA), 티아민테트라하이드로퓨르퓨르일다이설파이드(TTFD), 다이머캅롤, 페니실아민, 데페록사민(DFOA), 데페라시록스, 포스포네이트, 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트제를 포함하는, 방법.
438. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌다이아민-N,N',N'-트라이아세트산(EDTA-OH), 하이드록시 에틸렌다이아민 트라이아세트산(HEDTA), 에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1,2-사이클로헥산다이아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(CyDTA), 다이에틸렌트라이아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DTPA), 1,3-다이아미노프로판-2-올-N,N,N',N'-테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌다이아민-N,N'-비스(2-하이드록시페닐아세트산)(EDDHA), 시트르산의 염(시트레이트) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트제를 포함하는, 방법.
439. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 에틸렌다이아민테트라이세테이트(EDTA)를 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
440. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 시트르산의 염(시트레이트)을 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
441. 401 내지 434에 있어서, 대체 용액이 나트륨 시트레이트를 킬레이트제로서 포함하는, 방법.
442. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 1 내지 500 mM인, 방법.
443. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 2 내지 400 mM인, 방법.
444. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 400 mM인, 방법.
445. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 200 mM인, 방법.
446. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 100 mM인, 방법.
447. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 50 mM인, 방법.
448. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 10 내지 30 mM인, 방법.
449. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 또는 약 100 mM인, 방법.
450. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM인, 방법.
451. 435 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액 중 킬레이트제의 농도가 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM인, 방법.
452. 407 내지 451 중 어느 하나에 있어서, 대체 용액이 염을 포함하는, 방법.
453. 452에 있어서, 염이 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
454. 452에 있어서, 염이 나트륨 클로라이드인, 방법.
455. 432 내지 434에 있어서, 대체 용액이 나트륨 클로라이드를 1 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 250 또는 약 300 mM로 포함하는, 방법.
456. 401 내지 455 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50인, 방법.
457. 401 내지 455 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100인, 방법.
458. 401 내지 455 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 부피의 수치가 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15인, 방법.
459. 401 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
460. 401 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
461. 401 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
462. 401 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 정용여과 단계가 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
463. 379 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 20℃ 내지 약 90℃의 온도에서 수행되는, 방법.
464. 379 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 35℃ 내지 약 80℃의 온도, 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 65℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 60℃의 온도, 약 50℃ 내지 약 55℃의 온도, 약 45℃ 내지 약 55℃ 또는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행되는, 방법.
465. 379 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃의 온도에서 수행되는, 방법.
466. 379 내지 458 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 정용여과 단계가 수행되는 경우 약 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
467. 379 내지 466 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 사이징에 의해 균질화되는, 방법.
468. 379 내지 466 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 기계적 사이징되는, 방법.
469. 379 내지 466 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 고압 균질화 전단되는, 방법.
470. 379 내지 466 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 화학적 가수분해되는, 방법.
471. 379 내지 470 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 표적 분자량으로 사이징되는, 방법.
472. 379 내지 471 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 약 5 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징되는, 방법.
473. 379 내지 471 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 약 10 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징되는, 방법.
474. 379 내지 471 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 약 50 kDa 내지 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징되는, 방법.
475. 379 내지 471 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 약 50 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 50 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 50 kDa 내지 약 750 kDa; 약 50 kDa 내지 약 500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 100 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 100 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 100 kDa 내지 약 750 kDa; 약 100 kDa 내지 약 500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 200 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 200 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 200 kDa 내지 약 750 kDa; 또는 약 200 kDa 내지 약 500 kDa. 추가의 이러한 양태에서, 정제된 다당류는 약 250 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 250 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 250 kDa 내지 약 750 kDa; 약 250 kDa 내지 약 500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 300 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 300 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 300 kDa 내지 약 750 kDa; 약 300 kDa 내지 약 500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 4,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 3,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 3,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,250 kDa; 약 500 kDa 내지 약 2,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,750 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,500 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,250 kDa; 약 500 kDa 내지 약 1,000 kDa; 약 500 kDa 내지 약 750 kDa; 또는 약 500 kDa 내지 약 600 kDa의 분자량으로 사이징되는, 방법.
476. 379 내지 471 중 어느 하나에 있어서, 정제된 다당류 용액이 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 약 30 kDa, 약 35 kDa, 약 40 kDa, 약 45 kDa, 약 50 kDa, 약 75 kDa, 약 90 kDa, 약 100 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 350 kDa, 약 400 kDa, 약 450 kDa, 약 500 kDa, 약 550 kDa, 약 600 kDa, 약 650 kDa, 약 700 kDa, 약 750 kDa, 약 800 kDa, 약 850 kDa, 약 900 kDa, 약 950 kDa, 약 1000 kDa, 약 1250 kDa, 약 1500 kDa, 약 1750 kDa, 약 2000 kDa, 약 2250 kDa, 약 2500 kDa, 약 2750 kDa, 약 3000 kDa, 약 3250 kDa, 약 3500 kDa, 약 3750 kDa 또는 약 4,000 kDa의 분자량으로 사이징되는.
477. 1 내지 476에 있어서, 정제된 다당류 용액이 멸균여과되는, 방법.
478. 477에 있어서, 멸균여과가 데드-엔드 여과인, 방법.
479. 477에 있어서, 멸균여과가 접선 여과인, 방법.
480. 477 내지 479 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 0.01내지 0.2 μm, 약 0.05내지 0.2 μm, 약 0.1내지 0.2 μm 또는 약 0.15내지 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
481. 477 내지 479 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 0.05, 약 0.1, 약 0.15 또는 약 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
482. 477 내지 479 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 0.2 μm의 공칭 보유 범위를 갖는, 방법.
483. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 25 내지 1500 L/m2, 50 내지 1500 L/m2, 75 내지 1500 L/m2, 100 내지 1500 L/m2, 150 내지 1500 L/m2, 200 내지 1500 L/m2, 250 내지 1500 L/m2, 300 내지 1500 L/m2, 350 내지 1500 L/m2, 400 내지 1500 L/m2, 500 내지 1500 L/m2, 750 내지 1500 L/m2, 1000 내지 1500 L/m2 또는 1250 내지 1500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
484. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 25 내지 1000 L/m2, 50 내지 1000 L/m2, 75 내지 1000 L/m2, 100 내지 1000 L/m2, 150 내지 1000 L/m2, 200 내지 1000 L/m2, 250 내지 1000 L/m2, 300 내지 1000 L/m2, 350 내지 1000 L/m2, 400 내지 1000 L/m2, 500 내지 1000 L/m2 또는 750 내지 1000 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
485. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 25 내지 500 L/m2, 50 내지 500 L/m2, 75 내지 500 L/m2, 100 내지 500 L/m2, 150 내지 500 L/m2, 200 내지 500 L/m2, 250 내지 500 L/m2, 300 내지 500 L/m2, 350 내지 500 L/m2 또는 400 내지 500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
486. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 25 내지 300 L/m2, 50 내지 300 L/m2, 75 내지 300 L/m2, 100 내지 300 L/m2, 150 내지 300 L/m2, 200 내지 300 L/m2 또는 250 내지 300 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
487. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 25 내지 250 L/m2, 50 내지 250 L/m2, 75 내지 250 L/m2, 100 내지 250 L/m2 또는 150 내지 250 L/m2, 200 내지 250 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
488. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 25 내지 100 L/m2, 50 내지 100 L/m2 또는 75 내지 100 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
489. 477 내지 482 중 어느 하나에 있어서, 필터가 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400 또는 약 1500 L/m2의 필터 용량을 갖는, 방법.
490. 1 내지 489 중 어느 하나에 있어서, 수득된 정제된 다당류가 액체 용액 중 존재하는, 방법.
491. 1 내지 489 중 어느 하나에 있어서, 수득된 정제된 다당류가 건조된 분말인, 방법.
492. 1 내지 489 중 어느 하나에 있어서, 수득된 정제된 다당류 용액이 동결건조되는, 방법.
493. 1 내지 489 및 492 중 어느 하나에 있어서, 수득된 정제된 다당류 용액이 동결건조된 케이크인, 방법.
494. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 캡슐 다당류, 서브(sub)-캡슐 다당류 또는 지다당류인, 방법.
495. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 캡슐 다당류인, 방법.
496. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스타필로코커스 아우레우스로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
497. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스타필로코커스 아우레우스 타입 5로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
498. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스타필로코커스 아우레우스 타입 8로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
499. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 엔테로코커스 페칼리스로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
500. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 헤모필러스 인플루엔제 타입 b로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
501. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
502. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX) 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
503. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
504. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
505. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
506. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
507. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
508. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
509. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 아갈락티에(그룹 B 스트렙토코커스(GBS))로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
510. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 GBS 타입 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII로 이루어진 군으로부터 선택되는 캡슐 다당류인, 방법.
511. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 장병독성 에셔리키아 콜라이 그룹(EEC Group)의 에셔리키아 콜라이 균주 부분으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
512. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 장병독성 에셔리키아 콜라이 그룹(EEC Group), 예컨대 에셔리키아 콜라이 - 장독소원성(ETEC), 에셔리키아 콜라이 - 장병원성(EPEC), 에셔리키아 콜라이 - O157:H7 장출혈성(EHEC) 또는 에셔리키아 콜라이 - 장출혈성(EIEC)의 에셔리키아 콜라이 균주 부분으로부터의 캡슐 다당류인, 방법. 한 양태에서, 박테리아 캡슐 다당류의 공급원은 요로병원성 에셔리키아 콜라이(UPEC)이다.
513. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 O157:H7, O26:H11, O111:H- 및 O103:H2로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
514. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 O6:K2:H1 및 O18:K1:H7로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
515. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 O45:K1, O17:K52:H18, O19:H34 및 O7:K1로 이루어진 군으로부터 선택되는 에셔리키아 콜라이 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
516. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이 혈청형 O104:H4로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
517. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이 혈청형 O1:K12:H7로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
518. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이 혈청형 O127:H6으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
519. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이 혈청형 O139:H28로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
520. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 에셔리키아 콜라이 혈청형 O128:H2로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
521. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
522. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 29, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 72 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
523. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 29, 31, 33F, 35B, 35F, 38, 72 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
524. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 혈청형 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
525. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 1로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
526. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 2로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
527. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 3으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
528. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 4로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
529. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 5로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
530. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 6A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
531. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 6B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
532. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 6C로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
533. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 7F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
534. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 8로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
535. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 9V로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
536. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 9N으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
537. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 10A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
538. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 11A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
539. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 12F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
540. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 14로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
541. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 15A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
542. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 15B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
543. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 15C로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
544. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 16F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
545. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 17F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
546. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 18C로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
547. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
548. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
549. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 20으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
550. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 20A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
551. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 20B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
552. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 22F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
553. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 23A로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
554. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 23B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
555. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 23F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
556. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 24B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
557. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 29로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
558. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 29로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
559. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 31로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
560. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 33F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
561. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 34로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
562. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 35B로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
563. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 35F로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
564. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 38로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
565. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 72로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
566. 1 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 73으로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
567. 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 정제된 박테리아 다당류.
568. 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능한 정제된 박테리아 다당류.
569. 항원으로서 사용하기 위한 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 정제된 박테리아 다당류.
570. 담체 단백질에 접합된 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 정제된 박테리아 다당류.
571. 담체 단백질에 추가 접합된 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 정제된 박테리아 다당류.
572. 1 내지 566 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 정제된 박테리아 다당류의 당접합체.
573. 567 내지 568 중 어느 하나의 정제된 다당류를 포함하는 면역원성 조성물.
574. 571 내지 572 중 어느 하나의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
575. 본원에 개시된 임의의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
576. 본원에 개시된 임의의 당접합체의 조합을 포하하는 면역원성 조성물.
577. 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenA), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 W135(MenW135), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 Y(MenY), 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 X(MenX) 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 C(MenC)로부터의 캡슐 다당류로부터의 캡슐 다당류 및 오염물을 포함하는 용액으로부터 상기 다당류를 정제하는 방법으로서, 응집 단계 및 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
578. 577에 있어서, 크로마토그래피 단계가 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계인, 방법.
579. 578에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계가 359 내지 378 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 방법.
580. 578, 및 2 내지 493 중 어느 하나의 방법.
581. 578 내지 580 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 다당류가 네이쎄리아 메닌지티디스 혈청군 A(MenC)로부터의 캡슐 다당류인, 방법.
582. 581에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 전에 이온교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
583. 582에 있어서, 활성화된 탄소 여과 단계를 포함하지 않는 방법.
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Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln 115 120 125 Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala 130 135 140 Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn 145 150 155 160 Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys 165 170 175 Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 180 185 190 Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn 195 200 205 Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met 225 230 235 240 Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr 245 250 255 Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp 260 265 270 Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile 275 280 285 Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu 290 295 300 Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu 305 310 315 320 Arg Asn Tyr Asn Ala Lys 325 <210> 24 <211> 327 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 24 Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu 1 5 10 15 Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met 20 25 30 Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr 35 40 45 Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln 50 55 60 Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu 65 70 75 80 Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile 85 90 95 Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn 100 105 110 Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln 115 120 125 Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala 130 135 140 Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala 145 150 155 160 Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys 165 170 175 Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln 180 185 190 Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp 195 200 205 Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr 210 215 220 Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile 225 230 235 240 Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln 245 250 255 Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp 260 265 270 Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg 275 280 285 Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu 290 295 300 Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg 305 310 315 320 Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu 325

Claims (11)

  1. 발효 후, 박테리아　유래 당류 및 오염물을 포함하는 용액으로부터 상기　박테리아　유래 당류를 정제하는 방법으로서,
    (a) 산　가수분해;
    (b) 제1　한외여과/정용여과-(UFDF-1);
    (b) 탄소　여과;
    (c)　크로마토그래피; 및
    (d) 제2　한외여과/정용여과-(UFDF-2)
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (a)의 산 가수분해 후, 응집(flocculation) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 (c)의 크로마토그래피가 이온교환(IEX) 막 크로마토그래피,　소수성　상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아가 그람 양성 박테리아인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    박테리아가　스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)　및　클로스트리디움(Clostridium)　중 어느 하나인, 방법.
  6. 박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오젠스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 그룹 C & G 스트렙토코커스(Group C & G Streptococcus)　또는　스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)　중　어느 하나인, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아가　그람　음성 박테리아인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    박테리아가 헤모필러스(Haemophilus), 네이쎄리아(Neisseria), 에셔리키아(Escherichia) 또는 클레브시엘라(Klebsiella)　중 어느 하나인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    박테리아가　헤모필러스 인플루엔제(Haemophilus influenzae),　네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis),　에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는　클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)인,　방법.
  10. 제9항에 있어서,
    박테리아가　식 O1, 식 O1A, 식 O1B, 식 O1C, 식 O2, 식 O3, 식 O4, 식 O4:K52, 식 O4:K6, 식 O5, 식 O5ab, 식 O5ac, 식 O6, 식 O6:K2; K13; K15, 식 O6:K54, 식 O7, 식 O8, 식 O9, 식 O10, 식 O11, 식 O12, 식 O13, 식 O14, 식 O15, 식 O16, 식 O17, 식 O18, 식 O18A, 식 O18ac, 식 O18A1, 식 O18B, 식 O18B1, 식 O19, 식 O20, 식 O21, 식 O22, 식 O23, 식 O23A, 식 O24, 식 O25, 식 O25a, 식 O25b, 식 O26, 식 O27, 식 O28, 식 O29, 식 O30, 식 O32, 식 O33, 식 O34, 식 O35, 식 O36, 식 O37, 식 O38, 식 O39, 식 O40, 식 O41, 식 O42, 식 O43, 식 O44, 식 O45, 식 O45, 식 O45rel, 식 O46, 식 O48, 식 O49, 식 O50, 식 O51, 식 O52, 식 O53, 식 O54, 식 O55, 식 O56, 식 O57, 식 O58, 식 O59, 식 O60, 식 O61, 식 O62, 식 62D1, 식 O63, 식 O64, 식 O65, 식 O66, 식 O68, 식 O69, 식 O70, 식 O71, 식 O73, 식 O73, 식 O74, 식 O75, 식 O76, 식 O77, 식 O78, 식 O79, 식 O80, 식 O81, 식 O82, 식 O83, 식 O84, 식 O85, 식 O86, 식 O87, 식 O88, 식 O89, 식 O90, 식 O91, 식 O92, 식 O93, 식 O95, 식 O96, 식 O97, 식 O98, 식 O99, 식 O100, 식 O101, 식 O102, 식 O103, 식 O104, 식 O105, 식 O106, 식 O107, 식 O108, 식 O109, 식 O110, 식 O111, 식 O112, 식 O113, 식 O114, 식 O115, 식 O116, 식 O117, 식 O118, 식 O119, 식 O120, 식 O121, 식 O123, 식 O124, 식 O125, 식 O126, 식 O127, 식 O128, 식 O129, 식 O130, 식 O131, 식 O132, 식 O133, 식 O134, 식 O135, 식 O136, 식 O137, 식 O138, 식 O139, 식 O140, 식 O141, 식 O142, 식 O143, 식 O144, 식 O145, 식 O146, 식 O147, 식 O148, 식 O149, 식 O150, 식 O151, 식 O152, 식 O153, 식 O154, 식 O155, 식 O156, 식 O157, 식 O158, 식 O159, 식 O160, 식 O161, 식 O162, 식 O163, 식 O164, 식 O165, 식 O166, 식 O167, 식 O168, 식 O169, 식 O170, 식 O171, 식 O172, 식 O173, 식 O174, 식 O175, 식 O176, 식 O177, 식 O178, 식 O179, 식 O180, 식 O181, 식 O182, 식 O183, 식 O184, 식 O185, 식 O186 및 식 O187 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를　갖는 당류를 포함하는　에셔리키아 콜라이인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    박테리아가　식 K.O1.1, 식 K.O1.2, 식 K.O1.3, 식 K.O1.4, 식 K.O2.1, 식 K.O2.2, 식 K.O2.3, 식 K.O2.4, 식 K.O3, 식 K.O4, 식 K.O5, 식 K.O7, 식 K.O12 및 식 K.O8 중 어느 하나로부터 선택되는 구조를 갖는 당류를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니에인, 방법.
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