CN110172087B - 一种o抗原亲和介质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种O抗原亲和介质及其制备方法和应用，所述O抗原亲和介质包括超大孔介质和沙门氏菌的O抗原，所述O抗原化学固定在超大孔介质表面。本发明的O抗原亲和基质制备过程简单，纯化操作简便，效率高，利用该亲和介质和纯化方法制备出的抗体对O抗原具有高特异性，可用于辅助沙门氏菌诊断等应用。

Description

一种O抗原亲和介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫分析领域，涉及一种亲和层析介质及其制备方法和应用，尤其涉及一种O抗原亲和介质及其制备方法和应用。
背景技术
鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒等是由沙门氏菌引起的动物疾病，导致禽业的重大经济损失。沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌，是细菌性食物中毒的重要致病菌，部分沙门氏菌还出现了人畜共患的现象，甚至导致感染和死亡，引起了高度关注。
鸡白痢、鸡伤寒等禽病的防控手段中最主要和根本的方法是淘汰病禽，净化根除，封闭饲养。禽病种类多且呈现群发性，因此关键在于在疫病发生的早期进行快速准确的诊断，避免病情的延误和扩大，而这有赖于诊断技术的水平和条件。目前已经有大量研究致力于开发沙门氏菌的诊断技术，例如传统方法全血玻板凝集试验(PAT)、PCR扩增检测、采用胶体金试剂卡检测抗原、ELISA方法测定抗体等。
CN106086209A公开了一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，该发明的试剂盒能快速高通量鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法。
CN107860911A公开了致病性沙门氏菌测试条的制备方法，所述测试条包括基材PVC、玻璃纤维和硝酸纤维膜，基材PVC板上固定有第一覆膜、引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，硝酸纤维膜上包被有检测区和质控区，引水玻璃纤维和载体玻璃纤维上覆盖有第二覆膜，吸水棉浆板上覆盖有第三覆膜；制备方法：制备纯化的单克隆抗体、制备胶体金颗粒、制备标记物、包被纤维膜、组装测试条；测试条采用胶体金免疫层析检测法，将免疫反应的特异性、层析方法的快速性、以及胶体金颗粒作为示踪物的直观性等诸多优点结合在一起，实现对致病性沙门氏菌简便快速检测。
CN106093409A公开了基于沙门氏菌核心多糖单克隆抗体SQX6D8的检测食品中沙门氏菌属的胶体金试纸条的制备方法，以高碘酸钠法合成的鼠伤寒沙门氏菌脂多糖(LPS)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物作为胶体金试纸条测试线(T线)的包被原，以沙门氏菌核心多糖单克隆抗体SQX6D8作为金标抗体。该沙门氏菌胶体金试纸条方法采用间接竞争原理进行检测，并且沙门氏菌属核心多糖特异性单克隆抗体保证了方法对属内沙门氏菌均有交叉同时对属外细菌无交叉反应，为食品中沙门氏菌属的全面、简便、快速检测提供了分析手段。
在以上方法中，抗原抗体反应的ELISA方法或胶体金试剂卡方法的诊断技术在操作简便性和灵敏度上都具有优势，是最适合养殖户和现场操作的诊断方法。ELISA或胶体金试剂卡的诊断方法中，通常需要用到针对沙门氏菌抗原的抗体。所用抗体通常来源于利用菌体或利用提取的沙门氏菌的脂多糖免疫动物所得的多克隆抗体。然而这样获得的抗体混合物往往能部分非特异性的与其它非沙门氏菌的部分组成，例如革兰氏阴性菌脂多糖的组成部分脂质A结合，这样就导致诊断的重复性及特异性较差，影响了疫病的检测结果准确性。在抗体的纯化中，最常用的方法包括硫酸铵沉淀，ProteinA亲和层析纯化等。然而这些方法都无法区分不同特异性的抗体。
因此，提供一种针对沙门氏菌特异性抗体纯化的介质以及相应的制备方法具有重要意义和广阔应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种O抗原亲和介质及其制备方法和应用，本发明的O抗原亲和基质制备过程简单，纯化操作简便，效率高，利用该亲和介质和纯化方法制备出的抗体对O抗原具有高特异性，可用于沙门氏菌的诊断等应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种O抗原亲和介质，所述O抗原亲和介质包括超大孔介质和沙门氏菌的O抗原，所述O抗原化学固定在超大孔介质表面。
细菌脂多糖分为类脂A、核心多糖以及O侧链多糖，其中O多糖暴露在外部。现有技术中多用沙门氏菌脂多糖作为抗原，分离纯化得到多克隆抗体或特异性抗体混合物。然而发明人在实践过程中发现，这样获得的抗体往往能部分非特异性的与其它非沙门氏菌的部分组成，降低了检测特异性。
核心多糖以及O侧链多糖共同组成了O抗原，为抗原决定因子，在菌属之间有特异性，是细菌血清分类的基础，因此O抗原的检测是抗原检测中最核心的部分，本发明的O抗原亲和介质可以高特异性地结合沙门氏菌特异性抗体，通过将沙门氏菌O抗原化学固定在超大孔介质表面，提高特异性抗体吸附效率和得率，具体来说化学固定是利用介质表面基团进行活化(例如羟基)，与O-抗原的基团发生化学反应，将O-抗原通过化学键稳定连接在介质表面。
优选地，所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌或猪伤寒沙门氏菌中的任一种或至少两种的组合。
本发明中，主要针对禽畜易感的沙门氏菌进行研究，从鸡白痢沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌或猪伤寒沙门氏菌中提取O抗原制备得到O抗原亲和介质，利用该抗原亲和介质纯化得到的沙门氏菌特异性抗体可用于检测相应的沙门氏菌。
优选地，超大孔介质的基质包括聚苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物、琼脂糖或纤维素中的任一种或至少两种的组合，优选为聚苯乙烯。
本发明中采用超大孔介质作为载体，通过特异性选择合适的基质，提高介质对特异性抗体的吸附效率。
优选地，所述聚苯乙烯修饰有羟基。
本发明中，聚苯乙烯经过羟基修饰，技术手段包括物理镀层法包括静电吸附作用、疏水作用吸附等，以及化学偶联镀层法，将琼脂糖，葡聚糖等带有羟基的亲水性大分子修饰到表面。羟基修饰是为使基质更加亲水，并引入羟基基团，可以有效进行活化，便于O抗原的化学固定，并具有减少抗体的疏水非特异性吸附的优势。
优选地，所述超大孔介质的孔径为100-800nm，例如可以是100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm或800nm，优选为200-700nm，进一步优选为280-400nm。
优选地，所述O抗原的分子量范围为5-1000kDa，例如可以是5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa或1000kDa，优选为300-800kDa。
现有技术中，由于沙门氏菌抗体分子量较小，约为160kDa，颗粒粒径10nm左右，因此，对沙门氏菌抗体纯化所用的亲和层析介质均为小孔径介质，而本发明中，发明人对介质孔径和O抗原的理化性质对特异性抗体纯化效果的影响进行了考察与设计，通过特异性选择O抗原的分子量配合超大孔介质的孔径，避免因为O抗原的空间位阻及介质孔径对抗体结合的空间位阻影响特异性抗体结合导致收率低的问题。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的O抗原亲和介质的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取沙门氏菌的O抗原；
(2)采用环氧氯丙烷对超大孔介质进行环氧活化；
(3)O抗原配基接枝。
优选地，步骤(1)所述提取的方法为酸水解法。
优选地，所述酸水解法包括如下步骤：
(a1)将菌体以1:(8-12)的体积比加入0.8％～1.0％(w/v)的氯化钠溶液重悬菌体，混匀后加入0.8％-1％(v/v)的乙酸，使溶液最终的pH为3.5-4.7，于100℃下煮沸5-8h，结束后用28％的NH4OH进行中和，使得最终pH为6-7，最后离心获取上清；
(b1)在步骤(a)所得的上清中加入pH 2.5-3.0柠檬酸缓冲液至最终浓度为10-30mM，接着在室温下放置25-35min，通过离心弃去沉淀得到上清液；
(c1)在步骤(b)所得上清液中分别加入Na2HPO4、甲醇和CaCl2，至最终浓度分别为15-20mM、20-26％和180-220mM，在室温下混匀并静置25-35min，然后离心弃去沉淀得到上清液；
(d1)将步骤(c)所得上清液-80℃中冷冻后进行冻干。
本发明采用酸水解法对O抗原进行提取，避免引入脂多糖中的类脂A，发明人通过综合优化每个步骤的顺序以及参数，使得既能有效去除类脂A，又防止多糖被过分水解，导致O抗原分子量降低，通过本发明的方法提取得到的O抗原可以用于后续O抗原亲和介质的制备。
优选地，步骤(1)所述O抗原的分子量范围为5-1000kDa，优选为300-800kDa。
优选地，所述超大孔介质的孔径为100-800nm，优选为200-700nm，进一步优选为280-400nm。
优选地，步骤(2)所述环氧活化包括如下步骤：
(a2)用20％-70％的二甲基亚砜清洗抽干后的超大孔介质微球；
(b2)依次加入环氧氯丙烷、氢氧化钠、超纯水，使环氧氯丙烷、氢氧化钠终浓度分别为8-12％(w/v)和0.6-1.0M，将含有介质的悬浮液置于恒温空气浴摇床上在170r/min下振荡反应2-3h，反应温度为35-45℃；
(c2)依次用异丙醇及去离子水冲洗。
优选地，步骤(3)所述配基接枝包括如下步骤：
(a3)称取O抗原冻干粉按照(8-14):1(w/v)的比例溶解于0.2M氢氧化钠溶液中；
(b3)按照(3-5):10(w/v)的比例加入带有环氧基的活化的超大孔介质，置于恒温空气浴摇床上在35-45℃振荡反应20-26h。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的O抗原亲和介质在沙门氏菌O抗原特异性抗体纯化分离中的应用。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述O抗原亲和介质纯化O抗原特异性抗体的方法，包括如下步骤：
1)平衡：平衡缓冲液浓度为10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠；
2)吸附：将含多克隆抗体的样品换液至10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠的缓冲液中，与亲和层析介质通过静态吸附或者层析柱吸附；
3)洗脱：采用pH2.5-3.0，5-15mM的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为含O抗原特异性抗体的收集液。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的方法纯化得到的O抗原特异性抗体。
第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的O抗原特异性抗体在制备诊断沙门氏菌的试剂和/或试剂盒中的应用。
第七方面，本发明提供一种检测沙门氏菌的ELISA方法，包括将第五方面所述O抗原特异性抗体吸附在固相载体表面的步骤。
第八方面，本发明提供一种胶体金试剂卡，所述试剂卡包被如第五方面所述O抗原特异性抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的O抗原亲和介质解决了O抗原接枝后的空间位阻问题，显著提高了亲和纯化所得特异性抗体的产量；
(2)本发明提供的O抗原亲和介质的制备方法较为简单，纯化操作过程简单，具有很高的可操作性和技术价值；
(3)本发明的介质纯化所得的O抗原特异性抗体对沙门氏菌重要抗原O具有高亲和力及特异性，避免了因为非特异性抗体与抗原的结合而造成的对结果的影响。
附图说明
图1为本发明实验逻辑框图；
图2为实施例2中GPC分析提取的O抗原的分子量分布图谱；
图3为实施例5中最优O抗原亲和介质的特异性检测结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明实验逻辑框图见图1，以下实施例中采用的材料不限于所述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。
实施例1 O抗原的提取与纯化
O抗原配基的制备具体的步骤为：
(1)酸解：取一定体积灭活鸡白痢沙门氏菌标准型抗原溶液进行离心，收集菌体，取离心后收集的湿菌20g，以1：8～1：12加入0.8％～1.0％(w/v)的氯化钠溶液重悬菌体，混匀后加入0.8％～1％(v/v)的乙酸，使溶液最终的pH为3.5～4.7，于100℃下煮沸5～8h。结束后用28％的NH4OH进行中和，使得最终pH为6～7。最后离心获取上清，具体条件为10000rpm，40min。
(2)浓缩换液：使用15mL，30kDa的超滤管对溶剂进行置换，依次用20倍体积1MNaCl和10倍体积水进行换液，并最终浓缩到11mL左右。
(3)去除蛋白核酸：配置柠檬酸缓冲液(pH 2.5～3.0，200mM)，加入至上一步得到的一定体积(10mL)的溶液中，使得最终浓度为18～22mM，pH在3左右。接着在室温下放置30±5min，通过离心(10000rpm，15℃，50min)弃去沉淀得到上清液。
(4)去除核酸：分别配置500mM Na2HPO4，甲醇和5M CaCl2，在室温下加入到10mL步骤(3)所得上清液中，使得三者的最终浓度分别为15～20mM，20～26％，180～220mM。在室温下混匀并静置30±5min，然后离心(10000rpm，15℃，50min)弃去沉淀得到上清液。
(5)再次进行换液浓缩：采用30kDa的超滤管通过10倍体积水对溶剂进行置换，最终将体积浓缩到10mL。取1mL进行留样，剩余样品在-80℃中冷冻后进行冻干。
经过上述提取过程，有效去除脂多糖中类脂A，保留O抗原(核心多糖和O侧链多糖)，通过提取过程中各阶段的总糖含量即可获知O抗原的浓度，采用苯酚-硫酸比色法测定提取及纯化过程中的总糖浓度，对结果进行计算及分析，结果见表1。
表1
Figure BDA0002081017230000091
整个提取和纯化过程结束后O抗原的最终收率为13.64％，纯化得到的溶液中糖浓度高，达到2.07mg/mL，分别为蛋白质浓度和核酸浓度的86倍和122倍，同时具有高纯度，可以作为接枝的配基进行下一步实验。
实施例2 O抗原的鉴定
通过凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)检测纯化后的O-抗原，得到其分子量的分布范围。选用的色谱柱为TSKgel GMPWXL，采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测器，设置检测条件如下：测定的样品浓度为2mg/mL，上样量为100μL，流动相为H2O，流速0.6mL/min，时长30min，结果见图2。将不同分子量的葡聚糖标品，包括500K，40K，5K，1K分别进行检测，通过对比标准品和待测样品色谱图中保留时间判断提取的O抗原的分子量范围。
由图2可知，提取出的O抗原主要分为两个尺寸范围，出峰时间分别在12.99min和19.8min。根据葡聚糖标品的分子量和出峰时间，可知较短的多糖分子量介于5K到40K之间，较大的多糖分子量位于500K左右。
实施例3超大孔介质的活化及O接枝
首先采用环氧氯丙烷对超大孔聚苯乙烯介质进行环氧活化。量取保存于20％(v/v)乙醇溶液中的超大孔介质7mL(沉降体积)置于G3烧结玻璃漏斗中，用过量蒸馏水反复洗涤除去乙醇后真空抽干。称取7g抽滤后的介质，依次用20％，50％和70％的二甲基亚砜水溶液进行清洗，每次清洗后真空抽干清洗液。称取5g DMSO处理后的球，置于50mL的锥形瓶中，然后依次加入环氧氯丙烷(ECH)，氢氧化钠，超纯水，使溶液总体积为20mL，ECH和氢氧化钠终浓度分别为8～12％(w/v)和0.6～1.0M。将含有介质的悬浮液置于恒温空气浴摇床上在170r/min下振荡反应2～3h，反应温度为35～45℃。反应结束后将介质置于玻璃漏斗中先用过量异丙醇进行洗涤，之后用大量去离子水冲洗，抽干备用。介质上的环氧基修饰密度用硫代硫酸钠滴定法测定，环氧基密度为29μmol/g。由于O抗原分子量较大，所制备的超大孔介质的环氧基密度比较适中，利于O抗原有效接枝。
称取8～14mg O抗原冻干粉溶解于1mL 0.2M氢氧化钠溶液中，接着加入带有环氧基的活化基质0.4g，置于恒温空气浴摇床上在40℃震荡反应20～26h。结束后用大量去离子水清洗介质并抽干，制备得到O-抗原接枝的特异性亲和介质。通过测定接枝前后溶液中的糖浓度进行计算得到接枝O抗原量为4.5mg。用异硫氰酸荧光素(FITC)可以与-OH，-NH2等化学基团结合，对O抗原进行标记。根据激光共聚焦显微镜下进行观察结果，O抗原已成功接枝到超大孔介质上，且O抗原在介质上均匀分布。
实施例4 O抗原亲和介质纯化O特异性抗体
利用实施例3制备的O抗原亲和介质纯化O特异性抗体，纯化过程可以分为静态吸附和动态吸附两种模式，得到的抗体完全一致。
1、利用静态吸附法进行纯化的步骤如下：
1)平衡：取0.5mL制备得到的特异性亲和介质，通过离心柱用平衡缓冲液：10～50mM磷酸缓冲液(pH 6.5～7.5，50～100mM NaCl)不断清洗；
2)吸附：将清洗后的介质加入2mL浓度为0.5mg/mL换液至10～50mM磷酸缓冲液，pH6.5～7.5，含50～100mM氯化钠缓冲液的多抗IgG溶液中，于25℃中，100rpm下吸附24h；
3)淋洗：通过离心柱离心得到吸附后微球及蛋白溶液，将介质用平衡缓冲液清洗后2个柱体积并收集清洗液，将穿透蛋白液与淋洗液混合，测定反应前后的蛋白浓度计算蛋白结合量；
4)洗脱：采用10mM柠檬酸缓冲液(pH 2.5～3.0)进行洗脱，收集洗脱液，即为含O抗原特异性抗体的收集液。
2、利用动态吸附法进行纯化的步骤如下：
1)平衡：取0.5mL制备得到的特异性亲和介质装填制成层析柱，以0.3mL/min的流速采用平衡缓冲液：10～50mM磷酸缓冲液(pH 6.5～7.5，50～100mM NaCl)冲洗平衡5-10个柱体积。
2)吸附：取2mL，0.5mg/mL的多抗IgG溶液上样到平衡好的特异性亲和层析柱中，流速为0.3mL/min，接收穿透液。
3)淋洗：通过平衡液淋洗2～3个柱体积，接收淋洗液与穿透液混合并测定其浓度，用于计算层析前后吸附的蛋白量。
4)洗脱：采用10mM柠檬酸缓冲液(pH 2.5～3.0)进行洗脱，收集洗脱液，即为含O特异性免疫球蛋白的收集液。
实施例5
本实施例对超大孔介质的孔径对亲和介质纯化效果的影响，以及提取的O抗原分子量对亲和介质纯化效果的影响进行考察。
1、采用GPC对实施例2中的具有不同分子量范围的O抗原进行分离。
2、按照实施例3的方法对孔径200-700nm的超大孔介质进行两种分子量范围的O分子量的接枝，并以常见琼脂糖介质Sepharose 6B进行相同操作作为对照。采用实施例4中的静态吸附纯化法对血清中的特异性抗体进行纯化，血清中的IgG根据电泳计算总量约为1mg。比较不同介质纯化获得的O特异性抗体的总量，结果如表2所示。
表2
编号 介质种类 O抗原分子量(K) 孔径(nm) 洗脱后蛋白量(μg)
1 超大孔 5-40 ～200 138
2 超大孔 5-40 ～370 124
3 超大孔 5-40 ～700 78
4 琼脂糖 5-40 ～30 19
5 超大孔 ～500 ～200 169
6 超大孔 ～500 ～370 218
7 超大孔 ～500 ～700 94
8 琼脂糖 ～500 ～30 8
从表2可以看出，当使用常用的琼脂糖介质作为亲和层析基质时，几乎难以吸附纯化得到IgG抗体，而使用超大孔径的介质作为基质时则可以吸附得到特异性抗体，尽管不同孔径的介质接枝的是相同分子量范围的O抗原。这可能是由于在孔径较小的介质中，血清中的其它杂蛋白以及大部分的非O抗原特异性抗体在介质孔道中的空间位阻效应导致特异性抗体难以与多糖结合。在超大孔介质中，随着制备的介质的孔道增加，纯化所得抗体量先增加后降低，在370nm时效果最佳，且具有较高分子量的O抗原接枝的效果更佳，表明介质孔道的大小和接枝O抗原的分子量大小共同作用于最终纯化效果。
3、对最优O抗原亲和介质进行特异性检测
采用370nm孔径超大孔介质及500K的O抗原制备得到的亲和介质对含有沙门氏菌多克隆抗体的血清进行纯化，并以人IgG做对照，考察亲和介质的特异性，结果见图3，其中，第1泳道为含有多克隆抗体的血清，160kDa位置为要纯化的目标特异性抗体，但样品中还包括些许白蛋白等杂质，第2泳道为用本发明制备的亲和介质纯化后所得沙门氏菌O抗原特异性抗体，仅在160kDa位置出现目的条带，第3泳道为人IgG标准品(购于洛阳市佰泰科生物技术有限公司)，且所述人IgG经过ProteinA纯化，第4泳道为用本发明制备的亲和介质纯化人IgG的洗脱液。由图3可知，对比第1和2泳道，说明亲和介质可以特异性纯化目标抗体，条带单一；对比第3和4泳道，尽管都是IgG，但没有任何人IgG被本发明所制备的O抗原亲和介质吸附，洗脱液中没有任何条带(第4泳道)，表明所制备的亲和层析介质的特异性显著。
实施例6
本实施例对O抗原亲和介质纯化所得O特异性抗体的亲和力进行评价，验证是否纯化所得抗体为O特异性抗体。评价方法采用ELISA方法。
在包被板中加入50μL用50mM，pH 9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释后的10μg/mL的O抗原或脂多糖(LPS)，在4℃下包被过夜。结束后用PBST(含有0.05％(w/v)吐温20的0.01MPBS缓冲液，具体配置过程为：取8g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，用超纯水溶解定容至1L，调pH 7.4后进行抽滤)洗涤三次，从板上除去包被缓冲液。将板用100μL含1％BSA的PBST在37℃下封闭1小时，之后用PBST洗涤三次。接着进行一抗孵育，将血清用PBST进行系列稀释后，取50μL加入孔板中于37℃温育1小时。用PBST洗涤板5次后，加入50μL缀合的1：5000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合的IgG，并将板在37℃再孵育1小时。洗板7次，每孔加50μL TMB显色液，室温显色15min，之后每孔加25μL，2M H2SO4终止反应，终止反应30min以内于450nm处读取吸光度。
分别用O抗原包被和脂多糖(LPS)包被的ELISA板检测实施例5中采用370nm孔径超大孔介质及500K的O抗原制备得到的亲和介质对血清进行静态吸附纯化，经洗脱得到的特异性IgG及静态吸附后未吸附的含有多克隆抗体的上清，扣除缓冲液空白后的吸光度结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002081017230000141
由表3可知，对比检测通过本发明纯化得到的O抗原特异性亲和抗体的结果，包被O抗原和包被LPS的ELISA均能测得较高的抗体滴度，但由于LPS中还有脂质A，因此在相同包被量下，O抗原的测定灵敏度更高。对比纯化剩余多克隆抗体上清的检测结果，由于绝大部分的O抗原特异性抗体已通过层析收集，因此剩余上清中能与O抗原结合的抗体量极少，而仍然有其它非特异性抗体能与LPS结合，测定结果较高。以上结果表明，纯化所得的O抗原特异性抗体的特异性较高，且利用亲和层析介质能收集绝大部分的特异性抗体。
实施例7
本实施例描述利用本发明制备的O抗原亲和介质纯化所得特异性抗体用作胶体金试纸条特异性诊断禽病相关沙门氏菌的应用。
首先制备胶体金颗粒。取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml 1％氯化金，加热沸腾；取3-5mL的1％柠檬酸钠加入上述溶液中；混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红。量取胶体金，快速搅拌中加入0.2M K2CO3溶液，混匀后，快速搅拌中分别加入相同量的纯化所得O特异性抗体混合均匀后，反应30分钟。充分反映后在搅拌中加入金标记过程终止液，继续搅拌30分钟直至混匀，9000转离心6分钟，收集沉淀并用金工作液定容至总体积的1/10。
试纸条由样品板、络台板、硝酸膜及吸收板四部分组成。样品板和络合板用玻璃纤维，吸收板用吸水滤纸。玻璃纤维膜加胶体金探针，硝酸膜上包被亲和层析收获特异性抗体、ProteinA纯化血清所得多克隆抗体及冻干葡萄球菌A蛋白(SPA)(对照带)。层析条组装将吸收扳、样品板及处理后的络合板、硝酸膜先后叠加，组装成完整的层析条。检测程序及结果判读层析条的样品板端插人纯培养菌悬液约1cm，当液体上行到吸收板耐，取出平放。经过一定时间(20min)后，捕获带和对照带均出现红色为阳性，只对照带出现红色为阴性。
用本发明亲和层析介质及纯化条件收获的鸡白痢沙门氏菌及猪伤寒沙门氏菌O抗原特异性抗体混合后制备的胶体金试剂卡检测大肠杆菌(4株)、志贺氏菌(2株)、枸橼酸杆菌(2株)、变形杆菌(6株)、耶尔森氏菌(3株)，未观察到交叉反应；而检测猪伤寒沙门氏菌(6株)、鸡白痢沙门氏菌(2株)，均得阳性结果。
用ProteinA纯化血清所得多克隆抗体制备的胶体金试剂卡检测猪伤寒沙门氏菌(6株)、鸡白痢沙门氏菌(2株)均为阳性结果，检测大肠杆菌(4株)、志贺氏菌(2株)、枸橼酸杆菌(2株)、变形杆菌(6株)、耶尔森氏菌(3株)中有1株志贺氏菌出现交叉反应。
综上，本发明的O抗原亲和介质能高特异性吸附沙门氏菌特异性抗体，利用O抗原亲和介质纯化所得特异性抗体对沙门氏菌的检测特异性高，可用于检查沙门氏菌，包括但不限于ELISA法、胶体金试剂卡法等，用途广泛，具有广阔前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种O抗原亲和介质，其特征在于，所述O抗原亲和介质包括超大孔介质和沙门氏菌的O抗原，所述O抗原化学固定在超大孔介质表面；
所述沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌或猪伤寒沙门氏菌中的任一种或至少两种的组合；
超大孔介质的基质为聚苯乙烯；
所述超大孔介质的孔径为200-400nm；
所述O抗原的分子量范围为5-800kDa。
2.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取沙门氏菌的O抗原；
(2)采用环氧氯丙烷对超大孔介质进行环氧活化；
(3)O抗原配基接枝。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述提取的方法为酸水解法；
所述酸水解法包括如下步骤：
(a1)将菌体以1:(8-12)的体积比加入0.8％～1.0％(w/v)的氯化钠溶液重悬菌体，混匀后加入0.8％-1％(v/v)的乙酸，使溶液最终的pH为3.5-4.7，于100℃下煮沸5-8h，结束后用28％的NH4OH进行中和，使得最终pH为6-7，最后离心获取上清；
(b1)在步骤(a1)所得的上清中加入pH 2.5-3.0柠檬酸缓冲液至最终浓度为10-30mM，接着在室温下放置25-35min，通过离心弃去沉淀得到上清液；
(c1)在步骤(b1)所得上清液中分别加入Na2HPO4、甲醇和CaCl2，至最终浓度分别为15-20mM、20-26％和180-220mM，在室温下混匀并静置25-35min，然后离心弃去沉淀得到上清液；
(d1)将步骤(c1)所得上清液-80℃中冷冻后进行冻干。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述环氧活化包括如下步骤：
(a2)用20％-70％的二甲基亚砜清洗抽干后的超大孔介质微球；
(b2)依次加入环氧氯丙烷、氢氧化钠、超纯水，使环氧氯丙烷、氢氧化钠终浓度分别为8-12％(w/v)和0.6-1.0M，将含有介质的悬浮液置于恒温空气浴摇床上在170r/min下振荡反应2-3h，反应温度为35-45℃；
(c2)依次用异丙醇及去离子水冲洗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述配基接枝包括如下步骤：
(a3)称取O抗原冻干粉按照(8-14):1(w/v)的比例溶解于0.2M氢氧化钠溶液中；
(b3)按照(3-5):10(w/v)的比例加入带有环氧基的活化的超大孔介质，置于恒温空气浴摇床上在35-45℃振荡反应20-26h。
6.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质在沙门氏菌O抗原特异性抗体纯化分离中的应用。
7.一种如权利要求1所述的O抗原亲和介质纯化O抗原特异性抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)平衡：平衡缓冲液浓度为10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠；
2)吸附：将含多克隆抗体的样品换液至10-50mM磷酸缓冲液，pH6.5-7.5，含50-100mM氯化钠的缓冲液中，与亲和层析介质通过静态吸附或者层析柱吸附；
3)洗脱：采用pH2.5-3.0，5-15mM的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为含O抗原特异性抗体的收集液。
8.一种如权利要求7所述的方法纯化得到的O抗原特异性抗体。
9.一种如权利要求8所述的O抗原特异性抗体在制备诊断沙门氏菌的试剂和/或试剂盒中的应用。
10.一种非诊断目的的检测沙门氏菌的ELISA方法，其特征在于，包括将权利要求8所述O抗原特异性抗体吸附在固相载体表面的步骤。
11.一种胶体金试剂卡，其特征在于，所述试剂卡包被如权利要求8所述O抗原特异性抗体。
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