CN113358546A - 一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法 - Google Patents
一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，该检测方法针对自身免疫性周围神经病相关的24项神经节苷脂待检测标志抗体进行联合检测，该联合检测方法将微球和流式细胞分析技术相结合，包括：1)血清样本准备；2)分别准备24种捕获抗体、24种微球；3)对微球进行激活；4)将捕获抗体与微球进行偶联反应，形成24种偶联微球；5)对24种偶联微球进行封闭处理后，混合；6)加入血清样本进行抗原抗体特异性免疫结合反应；7)荧光免疫反应；8)流式细胞仪进行检测分析，实现了对24项神经节苷脂待检测标志抗体的一次性检测，所需样本量更少且操作时间短，结果可重复性好、特异性强、灵敏度高，适合在临床检测中广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法。
背景技术
自身免疫性周围神经炎是神经病变的一种，引起的原因主要是自身免疫紊乱等问题所造成的，它会损害到周围神经也可能会造成类似感冒或者是发热的症状出现，同时也可能会造成手脚部位麻木，刺痛的感觉，自身免疫性周围神经病中较常见的包括:慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)，急性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(AIDP)，多灶性运动神经病(MMN)，上述疾病发病机制中包括固有免疫细胞、适应性免疫细胞和细胞因子的异常，自身抗体攻击等。
抗周围神经膜表面糖脂抗体与自身免疫介导的急性和慢性多发性周围神经病有密切关系，此类抗体包括抗神经节苷脂抗体和抗硫脂抗体，神经节苷脂是一大类含有脑苷脂、葡萄糖、半乳糖和一个或多个唾液酸残基的鞘糖脂，为周围神经所独有。临床上对自身免疫性周围神经病的诊断主要通过神经节苷脂抗体谱24项进行检测，神经节苷脂抗体谱24项具体为GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GQ1b、GT1b、GM4、GD2、GD3、GT1a、Sulfatide的IgG、IgM抗体，临床上神经节苷脂抗体谱24项的检测用于吉兰巴雷综合征谱系病、GQ1b抗体综合征、多灶性运动神经病等的辅助诊断。
目前，临床上对于神经节苷脂抗体谱24项的检测主要通过免疫印迹法进行测定，免疫印迹法是聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原，再转移至膜支持物上，然后与血清温育，该方法可以将多种不同分子量的抗原印制到同一试剂膜带上，来检测一系列自身抗体，该方法的不足在于费时较长，而且需要用X射线底片或化学发光成像仪显示结果。
发明内容
本发明的目的在于：针对以上现有技术所述的现有神经节苷脂抗体24项的检测方法所存在的技术问题，本发明提供一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，该检测方法将微球和流式分析技术相结合，对GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM等24项神经节苷脂抗体指标实现了联合检测，且该方法检测所需样本量更少，并大大缩短了操作时间，同时其特异性强，灵敏度较高，可实现多参数分析。
本发明采用的技术方案如下：一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，该检测方法将微球分析和流式分析技术相结合，针对GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM等24项神经节苷脂抗体指标进行联合检测，具体步骤如下：
1)血清样本准备：采集受试者的空腹静脉血，于室温静置离心分离出血清，检测备用；
2)准备与24项神经节苷脂待检测标志抗体相对应的捕获抗体，捕获抗体相当于抗原，用于与血清样本中的待检测标志抗体进行抗原抗体免疫结合反应；
3)准备24种微球，对微球进行激活，所述微球是一种表面含有羧基的聚苯乙烯微球，每一种所述微球通过不同的荧光染料进行编码标记；
4)将步骤2)中准备的捕获抗体加入到步骤3)激活的微球中进行偶联反应，一种捕获抗体对应一种颜色的微球，各自进行偶联反应，最终形成24种偶联微球；
5)步骤4)偶联反应完成后，对封闭液对微球进行封闭处理，封闭微球上未结合捕获抗体的位点，封闭处理完成后，将24种偶联微球进行混合，形成一个包含有24种偶联有不同捕获抗体的偶联微球的混合反应体系；
6)将步骤1)制备得到的血清样本加入步骤5)制备得到的偶联微球混合反应体系中，偶联在各自微球上的24种捕获抗体会与血清样本中的24种标志抗体相结合，发生抗原抗体特异性免疫结合反应，血清标本中的24种待检测标志抗体与24种偶联微球结合之后，在微球上会形成待测标志抗体与捕获抗体相结合的抗原抗体复合物；
7)将步骤6)完成后的反应进行洗涤，用于清洗掉不反应的血清蛋白，加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG，所加入的FITC标记的羊抗鼠IgG会与微球上形成的抗原抗体复合物相结合，即微球上会形成捕获抗体-待检测标志抗体-FITC标记的羊抗鼠IgG的多元复合物，所述FITC标记的羊抗鼠IgG用于对待检测标志抗体的荧光定量分析；
8)将步骤7)结合反应完成后得到的微球，通过流式细胞仪进行检测分析，流式细胞仪进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各组编码的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。
步骤2)中所述24项神经节苷脂待检测标志抗体具体为：GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM。
步骤2)中所述捕获抗体具体为：鼠抗人GM1-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM1-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgG单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgM单克隆抗体，所述捕获抗体均可在市场上进行直接购买。
步骤3)中所述微球可在市场上直接进行购买，所述每种微球规格约为：1.25×107个/mL。
步骤3)中所述对微球的激活通过微球激活缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐及硫化N-羟基琥珀酰亚胺的加入进行激活，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为50mg/mL，可以从市场进行直接购买，使用微球激活缓冲液配置成相应浓度。
具体地，步骤3)中所述对微球的激活方法具体为：取微球原液，离心去上清，加入微球洗涤缓冲液，混匀，离心取上清，加入微球激活缓冲液，重悬，混匀，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光摇动，进行微球上羧基的活化反应，反应完成，加入1×PBS缓冲液，混匀，离心去上清，加入1×PBS缓冲液，重悬，混匀，即得到激活后的微球。步骤3)对微球进行激活中所使用的微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成，所使用的微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4。
步骤4)中所述偶联微球具体为：微球1-GM1-IgG、微球2-GM1-IgM、微球3-GM2-IgG、微球4-GM2-IgM、微球5-GM3-IgG、微球6-GM3-IgM、微球7-GD1a-IgG、微球8-GD1a-IgM、微球9-GD1b-IgG、微球10-GD1b-IgM、微球11-GQ1b-IgG、微球12-GQ1b-IgM、微球13-GT1b-IgG、微球14-GT1b-IgM、微球15-GM4-IgG、微球16-GM4-IgM、微球17-GD2-IgG、微球18-GD2-IgM、微球19-GD3-IgG、微球20-GD3-IgM、微球21-GT1a-IgG、微球22-GT1a-IgM、微球23-Sulfatide-IgG、微球24-Sulfatide-IgM。
步骤5)对微球进行封闭所使用的封闭液通过1×PBS缓冲液、牛血清白蛋白及叠氮化钠配制而成，所述牛血清白蛋白与1×PBS缓冲液之间的料液比为10g/l、所述叠氮化钠与1×PBS缓冲液之间的料液比0.5g/l，配制方法具体为：向pH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮化钠，混匀即可。
本发明提供的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法的检测原理为：本检测方法针对临床上用于辅助诊断吉兰巴雷综合征谱系病、GQ1b抗体综合征、多灶性运动神经病等自身免疫性周围神经疾病的24种神经节苷脂标志抗体的进行检测，对24种不同的待检测标志抗体通过24种具有不同荧光染料标记的微球进行一次性检测，激活后的24种微球与24种捕获抗体相偶联，捕获抗体相当于抗原，与血清样本中的24种待检标志抗体发生抗原抗体特异性免疫反应，待检测的标志抗体将结合在偶联有对应的捕获抗体的微球上，后续加入的FITC标记的羊抗鼠IgG，会与微球上形成的抗原抗体复合物相结合，形成捕获抗体-待检测标志抗体-FITC标记的羊抗鼠IgG的多元复合物，流式细胞仪进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各组编码的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，该检测方法将微球和流式分析技术相结合，对GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM等24项神经节苷脂抗体指标实现了联合检测；
(2)该检测方法首先是通过24种具有不同荧光染料标记的微球与24种捕获抗体进行偶联，捕获抗体相当于抗原，会分别与血清样本中的24种待检标志抗体发生抗原抗体特异性免疫反应，待检测的标志抗体将结合在偶联有对应的捕获抗体的微球上，加入的FITC标记的羊抗鼠IgG，会在微球上形成捕获抗体-待检测标志抗体-FITC标记的羊抗鼠IgG的多元复合物，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各组编码的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度，与临床常规的检测方法相比较，该方法检测所需样本量更少，也进一步缩短了操作时间，同时该检测方法的特异性强、灵敏度也较高，可实现对24项神经节苷脂抗体指标的多参数分析；
(3)该检测方法中，因为多种具有不同荧光颜色的微球可以放在同一个反应体系内，所以一次可同时检测多种生理病理指标，对于一次需要检测多种抗体而言，该检测方法与传统逐个检测的方式在效率有很大的不同。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提供了一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，该检测方法将微球分析和流式分析技术相结合，针对GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM等24项神经节苷脂抗体指标进行联合检测。
本实施例针对一份血清样本中的24项神经节苷脂抗体指标进行联合检测提供具体实施方式，具体实施步骤如下：
1)血清样本准备：采集受试者的空腹静脉血2ml，于室温静置，4000r/min，离心5分钟，分离出血清，检测备用；
2)从市场购买与24项神经节苷脂待检测标志抗体相对应的24种捕获抗体，24项神经节苷脂待检测标志抗体分别为：GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM；购买的24种捕获抗体分别为：鼠抗人GM1-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM1-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgG单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgM单克隆抗体，所购买的捕获抗体的初始浓度均为0.2mg/ml；
3)从市场购买24种通过不同荧光染料编码标记的微球，所购买的微球原液的规格约为1.25×107个/mL，对不同的微球分别进行激活，微球的激活通过微球激活缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐及硫化N-羟基琥珀酰亚胺的加入进行激活，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为50mg/mL，可以从市场进行直接购买，使用微球激活缓冲液配置成相应浓度，微球激活的步骤具体如下：
取其中一种购买的微球原液2000μL于离心管中，10000r/min，离心6-8min，弃上清；向弃上清的离心管中加入2000μL的微球洗涤缓冲液(微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成)，采用实验室常规的洗涤方式即可(如漩涡震荡15秒，超声清洗15秒)，洗涤后，10000r/min，离心6-8min，弃上清；向弃上清的离心管中加入2000μL的微球激活缓冲液(微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4)，将微球重悬于微球激活缓冲液中，加入200μL1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基和200μL硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光摇晃8-10min，以实现对微球上羧基的充分活化；微球上羧基的活化反应完成后，向离心管中加入2000μL 1×PBS缓冲液，震荡15秒混匀，10000r/min，离心6-8min，弃上清；向离心管中加入2000μL 1×PBS缓冲液，将微球重悬于2000μL 1×PBS缓冲液中，震荡、清洗20秒，10000r/min，离心6-8min，弃上清，将微球重悬于2000μL 1×PBS缓冲液中，即得到激活的微球。其余23种微球均采用上述方法进行激活；
4)取步骤2)中准备的捕获抗体400μL加入到100μL步骤3)激活的微球中，用1×PBS缓冲液调节最终体积至1000μL进行偶联反应，偶联反应完成，10000转/分，离心6-8min，去上清，再向偶联反应罐中加入1000μL1×PBS缓冲液，将微球重悬于缓冲液中，即完成微球与捕获抗体的偶联，一种捕获抗体对应一种颜色的微球，各自进行偶联反应，最终形成了24种偶联有捕获抗体的微球；
5)步骤4)偶联反应完成后，对封闭液对微球进行封闭处理，封闭微球上未结合捕获抗体的位点，所使用的微球封闭液配制方法为：向1mlpH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白10g和叠氮化钠0.5g，混匀即可，配制的量可根据需要具体调配，封闭处理方法为：将步骤4)的微球缓冲液，10000转/分，离心6-8min，弃上清，向微球中加入1500μL微球封闭缓冲液，10000转/分，离心6-8min，去上清，后再将微球重悬于500μL微球封闭缓冲液，至此完成整个偶联反应，得到偶联微球，其余23种捕获抗体的偶联方法同上，封闭处理完成后，分别取200μL偶联微球加入流式管中，将24种偶联微球进行混合进行混合，最终形成一个包含有微球1-GM1-IgG、微球2-GM1-IgM、微球3-GM2-IgG、微球4-GM2-IgM、微球5-GM3-IgG、微球6-GM3-IgM、微球7-GD1a-IgG、微球8-GD1a-IgM、微球9-GD1b-IgG、微球10-GD1b-IgM、微球11-GQ1b-IgG、微球12-GQ1b-IgM、微球13-GT1b-IgG、微球14-GT1b-IgM、微球15-GM4-IgG、微球16-GM4-IgM、微球17-GD2-IgG、微球18-GD2-IgM、微球19-GD3-IgG、微球20-GD3-IgM、微球21-GT1a-IgG、微球22-GT1a-IgM、微球23-Sulfatide-IgG、微球24-Sulfatide-IgM等24种偶联有不同捕获抗体的偶联微球的混合反应体系；
6)取100μL步骤1)制备得到的血清样本加入步骤5)制备得到的偶联微球混合反应体系中，温育反应时间1h，偶联在各自微球上的24种捕获抗体与血清样本中的24种标志抗体相结合，发生抗原抗体特异性免疫结合反应，血清标本中的24种待检测标志抗体与24种偶联微球结合之后，在微球上会形成待测标志抗体与捕获抗体相结合的抗原抗体复合物，为了后续对所检测的标志抗体进行定量分析，需要利用上述微球与血清样本同样的反应方法，开展24种待检测标志抗体的标准品的系列对照实验，24种待检测的标志抗体对应的标准品可直接在市场进行购买；
7)将步骤6)完成后的反应进行洗涤，洗涤方法参照微球激活过程中的洗涤方法，用于清洗掉不反应的血清蛋白，加入5000μL的FITC标记的羊抗鼠IgG，FITC标记的羊抗鼠IgG的加入量相对整个反应体系过量就可以，所加入的FITC标记的羊抗鼠IgG会与微球上形成的抗原抗体复合物相结合，即微球上会形成捕获抗体-待检测标志抗体-FITC标记的羊抗鼠IgG的多元复合物，FITC标记的羊抗鼠IgG用于对待检测标志抗体的荧光定量分析；
8)将步骤7)结合反应完成后得到的微球，通过流式细胞仪进行检测分析，流式细胞仪进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各组编码的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。
以上为一份血清样本中24项神经节苷脂待检测标志抗体的联合检测具体实施方式，可根据血清样本的数量参照上述进行具体实施。
效果实施例
为了进一步验证本发明所提供的针对诊断自身免疫性周围神经病的24项神经节苷脂待检测标志抗体GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM进行联合检测方法的有效性和可行性，将依照上述具体实施方式中的实施步骤对24种神经节苷脂待检测标志抗体进行联合检测的结果与目前临床上常规使用的免疫印迹法测定的结果进行对比，该对比例采用了20个血清样品进行比较，以±s(pg/mL)表示，结果如下表所示：
表1联合检测方法与免疫印迹法对比实验结果表
根据以上结果表明，本发明提供的针对诊断自身免疫性周围神经病的24项神经节苷脂待检测标志抗体GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM进行联合检测方法与临床常规使用的免疫印迹法测定所得到的检测结果无显著差异，表明本发明提供的联合检测方法具备可行性及有效性；其次，通过该发明提供的联合检测方法对24项神经节苷脂待检测标志抗体进行20个血清样本进行测定所得到的结果数值之间的波动性较小，表明本方法的重复性也较好，值得在临床检测中广泛推广使用。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，所述检测方法针对GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM 24项神经节苷脂抗体指标采用微球和流式分析技术相结合的方式进行联合检测。
2.根据权利要求1所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，所述检测方法具体步骤如下：
1)血清样本准备：采集受试者的空腹静脉血，于室温静置离心分离出血清，检测备用；
2)准备与24项神经节苷脂待检测标志抗体相对应的捕获抗体，捕获抗体相当于抗原，用于与血清样本中的待检测标志抗体进行抗原抗体免疫结合反应；
3)准备24种微球，对微球进行激活；
4)将步骤2)中准备的捕获抗体加入到步骤3)激活的微球中进行偶联反应，一种捕获抗体对应一种颜色的微球，各自进行偶联反应，最终形成24种偶联微球；
5)步骤4)偶联反应完成后，对封闭液对微球进行封闭处理，封闭微球上未结合捕获抗体的位点，封闭处理完成后，将24种偶联微球进行混合，形成一个包含有24种偶联有不同捕获抗体的偶联微球的混合反应体系；
6)将步骤1)制备得到的血清样本加入步骤5)制备得到的偶联微球混合反应体系中，偶联在各自微球上的24种捕获抗体会与血清样本中的24种标志抗体相结合，发生抗原抗体特异性免疫结合反应，血清标本中的24种待检测标志抗体与24种偶联微球结合之后，在微球上会形成待测标志抗体与捕获抗体相结合的抗原抗体复合物；
7)将步骤6)完成后的反应进行洗涤，用于清洗掉不反应的血清蛋白，加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG，所加入的FITC标记的羊抗鼠IgG会与微球上形成的抗原抗体复合物相结合，即微球上会形成捕获抗体-待检测标志抗体-FITC标记的羊抗鼠IgG的多元复合物；
8)将步骤7)结合反应完成后得到的微球，通过流式细胞仪进行检测分析。
3.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤3)中所述微球是一种表面含有羧基的聚苯乙烯微球，每一种所述微球通过不同的荧光染料进行编码标记。
4.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤8)中利用流式细胞仪对微球进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各组编码的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。
5.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤2)中所述24项神经节苷脂待检测标志抗体具体为：GM1-IgG、GM1-IgM、GM2-IgG、GM2-IgM、GM3-IgG、GM3-IgM、GD1a-IgG、GD1a-IgM、GD1b-IgG、GD1b-IgM、GQ1b-IgG、GQ1b-IgM、GT1b-IgG、GT1b-IgM、GM4-IgG、GM4-IgM、GD2-IgG、GD2-IgM、GD3-IgG、GD3-IgM、GT1a-IgG、GT1a-IgM、Sulfatide-IgG、Sulfatide-IgM。
6.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤2)中所述捕获抗体具体为：鼠抗人GM1-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM1-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GQ1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1b-IgM单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgG单克隆抗体、鼠抗人GM4-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD2-IgM单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgG单克隆抗体、鼠抗人GD3-IgM单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgG单克隆抗体、鼠抗人GT1a-IgM单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgG单克隆抗体、鼠抗人Sulfatide-IgM单克隆抗体。
7.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤3)中所述微球在市场上直接进行购买，每种所述微球规格约为：1.25×107个/mL。
8.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤3)中所述对微球的激活通过微球激活缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐及硫化N-羟基琥珀酰亚胺的加入进行激活，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为50mg/mL。
9.根据权利要求8所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤3)中所述对微球的激活方法具体为：取微球原液，离心去上清，加入微球洗涤缓冲液，混匀，离心取上清，加入微球激活缓冲液，重悬，混匀，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光摇动，进行微球上羧基的活化反应，反应完成，加入1×PBS缓冲液，混匀，离心去上清，加入1×PBS缓冲液，重悬，混匀，即得到激活后的微球。步骤3)对微球进行激活中所使用的微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成，所使用的微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4。
10.根据权利要求2所述的一种自身免疫性周围神经病相关抗体的联合检测方法，其特征在于，步骤5)所述对微球进行封闭所使用的封闭液通过1×PBS缓冲液、牛血清白蛋白及叠氮化钠配制而成，所述牛血清白蛋白与1×PBS缓冲液之间的料液比为10g/l、所述叠氮化钠与1×PBS缓冲液之间的料液比0.5g/l，配制方法具体为：向pH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮化钠，混匀。
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