CN113358864A - 一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，该检测方法将微球分析技术和流式分析技术相结合，针对aCL‑IgG、aCL‑IgM、aCL‑IgA、β2‑GPI‑IgG、β2‑GPI‑IgM、β2‑GPI‑IgA、PS‑IgM、PS‑IgG、PT‑IgM、PT‑IgG、PI‑IgM、PI‑IgG等12种抗磷脂抗体指标进行联合检测，该检测方法包括：1)血清样本准备；2)准备、激活微球；3)准备捕获抗体；4)偶联；5)抗原抗体结合；6)荧光标记反应；7)流式检测，与现有常规临床检测方法相比较，该检测方法对诊断抗磷脂综合征的12种抗磷脂标志抗体指标实现了联合检测，所需样本量更少且操作时间较短，可进行多参数分析，同时其特异性强及灵敏度高也极高，进一步提高了抗磷脂抗体指标的检测水平和标准化程度。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法。
背景技术
抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)，是一种以反复发生的血栓形成事件和流产为主要临床特征，并伴有血清中抗磷脂抗体存在的临床综合征。临床中抗磷脂综合征是一种非器官特异性自身免疫性疾病，其主要的临床症状表现为持续性抗磷脂抗体阳性伴有血栓形成和病理妊娠，APS临床表现复杂多样，除对孕妇产生较大的不良影响外，也可累及全身多个器官和系统，故对该病早期诊断以及及时治疗尤为重要，需要采取良好的治疗配合，为提升治疗效果，则需要明确相关的指标表达水平，从而采取针对性的治疗方案，随着研究的深入，凝血功能指标抗磷脂抗体检测成为目前常用的检测方式，在新修订的APS诊断标准中，也明确将抗磷脂抗体的检测纳入APS诊断标准。
目前，对于抗磷脂抗体综合征检测的相关抗磷脂抗体指标主要有抗心磷脂抗体(aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA)、抗β2糖蛋白I抗体(β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA)、抗磷脂酰丝氨酸抗体(PS-IgM、PS-IgG)、抗凝血素抗体(PT-IgM、PT-IgG)、抗磷脂酰肌醇抗体(PI-IgM、PI-IgG)，抗心磷脂抗体(aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA)、抗β2糖蛋白I抗体(β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA)指标的检测辅助诊断抗磷脂综合征(APS)，侧重于2反复流产、死胎、血栓、血小板降低等，抗磷脂酰丝氨酸抗体(PS-IgM、PS-IgG)、抗凝血素抗体(PT-IgM、PT-IgG)、抗磷脂酰肌醇抗体(PI-IgM、PI-IgG)指标的检测辅助诊断抗磷脂综合征，侧重于血栓症，血小板减少，习惯性流产等；
即抗磷脂抗体综合征进行检测的抗磷脂抗体指标包括aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗体。
首先，对于抗磷脂抗体指标的检测对于APS的诊断意义重大，然而由于抗磷脂抗体存在显著的异质性，抗磷脂抗体指标的检测水平、检测方法标准化程度较低以及不同实验室间检测结果一致性较差的问题，一定程度上限制了抗磷脂抗体的检测以及其临床应用，其次，临床上针对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标的检测主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定，ELISA法是先将自身抗原固定在固相表面上，然后测定各孔杯内与血清自身抗体的相互作用，显色后通过酶标仪进行定量测定的方法，该方法是对一系列抗体采用一一测定的方式进行，此种测定方法针对多个抗体进行测定时，麻烦且耗时，且存在一定的结果一致性的问题。
发明内容
本发明的目的在于：针对以上现有技术所述的现有抗磷脂抗体指标的检测存在的技术问题，本发明提供一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，该检测方法是将微球分析技术和流式分析技术相结合，对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标实现了联合检测，与现有常规临床检测方法相比较，该检测方法所需样本量更少且操作时间缩短，且可对样本指标进行多参数分析，同时其特异性强及灵敏度高也极高，进一步提高了抗磷脂抗体指标的检测水平和标准化程度。
本发明采用的技术方案如下：一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，所述检测方法将微球分析技术和流式分析技术相结合，对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标进行联合检测，具体步骤如下:
1)血清样本准备：采集受试者的空腹静脉血，于室温静置凝固后离心分离出血清；
2)准备、激活微球：准备微球，将微球进行激活；
3)准备捕获抗体：准备与抗磷脂标志抗体对应的捕获抗体，所述捕获抗体相当于抗原，用于与血清中待检测的抗磷脂标志抗体进行抗原抗体特异性结合反应；
4)偶联：将步骤3)中准备好的捕获抗体与步骤2)中已激活的微球进行偶联结合反应，偶联结合反应完成后，对微球上未结合捕获抗体的位点用封闭液进行封闭处理，封闭处理后将各种偶联有捕获抗体的微球进行混合；
5)抗原抗体结合：将步骤1)中制备的血清样本加入到步骤4)的混合微球中进行反应，混合微球上偶联的捕获抗体与血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体发生抗原抗体特异性免疫结合反应，以此将血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体识别出来；
6)荧光标记反应：步骤5)的抗原抗体特异性免疫结合反应完成后，对反应液进行洗涤，以此将不反应的血清蛋白清洗掉，向反应中加入FITC标记的羊抗鼠IgG进行反应，加入的所述FITC标记的羊抗鼠IgG抗体会与步骤5)中已固定在微球表面的抗磷脂标志抗体相结合，以此实现对抗磷脂标志抗体的荧光定量分析；
7)流式检测：步骤6)的荧光反应完成后，对反应液进行洗涤，采用流式细胞仪对微球反应液进行检测，通过检测不同微球中FITC荧光素强度，对血清中标志抗体进行定量分析，通过检测微球自身的荧光颜色对血清中标志抗体进行定性分析。
步骤2)中所述微球是一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，每一种所述微球自带的荧光颜色不一样，所述方法所使用的微球具体为12种具有不用荧光颜色的羧基化聚苯乙烯微球，所述微球可以从相关生物制品公司直接购买。
步骤2)中激活微球的方法具体为：取微球原液，离心去上清后，向微球中加入微球洗涤缓冲液，震荡、混匀，离心去上清后，将微球重悬于微球激活缓冲液中，以达到对微球的激活，震荡、混匀进行激活，向激活后的微球加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光震摇，反应完成后，然后向微球中加入1×PBS缓冲液，高速摇晃，离心去上清后，将微球重悬于1×PBS缓冲液中，旋涡震荡，即完成微球的激活。所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺使用微球激活缓冲液进行配置，浓度均为50mg/mL。
步骤2)中激活微球所使用的微球洗涤缓冲液的配制方法为：由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20直接混合配制而成。所述微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4。
步骤3)中所使用的捕获抗体分别为：鼠抗人aCL-IgG单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgM单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgA单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgG单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgM单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgA单克隆抗体、鼠抗人PS-IgM单克隆抗体、鼠抗人PS-IgG单克隆抗体、鼠抗人PT-IgM单克隆抗体、鼠抗人PT-IgG单克隆抗体、鼠抗人PI-IgM单克隆抗体、鼠抗人PI-IgG单克隆抗体共12种；步骤3)中所述抗磷脂标志抗体分别为：aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG共12种，所述捕获抗体与抗磷脂标志抗体相对应，所述捕获抗体可以从相关的生物制品公司直接购买。
步骤4)中所使用的封闭液配制方法为：向pH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮化钠，混匀即可，所述加入牛血清白蛋白、叠氮化钠的混合料液比分别为10g/l、0.5g/l。
步骤4)中激活的微球与捕获抗体偶联的具体方式为：将捕获抗体原液加入到激活的微球中，用1×PBS缓冲液调节反应的体积，室温避光摇震反应，离心去上清，向偶联反应后的微球中加入洗涤缓冲液，对偶联反应进行洗涤，洗涤后即可得到偶联有捕获抗体的微球，即分别为：微球1-aCL-IgG、微球2-aCL-IgM、微球3-aCL-IgA、微球4-β2-GPI-IgG、微球5-β2-GPI-IgM、微球6-β2-GPI-IgA、微球7-PS-IgM、微球8-PS-IgG、微球9-PT-IgM、微球10-PT-IgG、微球11-PI-IgM、微球12-PI-IgG。
一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法的检测原理具体为：针对12种抗磷脂标志抗体预先准备的12种微球自身具有不同的荧光颜色，激活后的12种不同颜色的微球分别与12种捕获抗体发生偶联，捕获抗体实质上是一种与血清样本中待检测抗磷脂标志抗体相对应的抗原，利用抗原抗体特异性结合反应，以此对血清样本中的抗磷脂标志抗体进行检测，最后利用微球自身携带的不同种荧光颜色实现对血清样本中抗磷脂标志抗体的定性分析，微球上的捕获抗体与血清样本中的抗磷脂标志抗体发生抗原抗体特异性结合反应后，通过向反应中加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，加入的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体会与结合在微球上的抗磷脂标志抗体相结合，以此实现对所检测的抗磷脂标志抗体实现定量标记，最终通过流式细胞仪进行结果检测以实现血清样本中的抗磷脂标志抗体的定性和定量分析。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标实现了联合检测，与现有常规临床对12种抗体进行一一检测的方法相比较，该检测方法所需样本量更少且操作时间缩短，且该检测方法将最新的微球分析技术和流式分析技术相结合运用到抗磷脂综合征相关抗体的检测中，特异性强及灵敏度高也极高，对样本指标实现了多参数分析的同时，也进一步解决了临床上对于抗磷脂抗体指标的检测水平和标准化程度不够的问题；
(2)临床上，目前对抗磷脂标志抗体的检测主要是采用ELISA，对于12种抗磷脂抗体指标的检测进行一一检测，最终得出综合的检测结果，如此操作麻烦且比较费时间，而本发明采用最新的微球分析技术和流式分析技术相结合，对诊断抗磷脂综合征相关的标志抗体指标的测定在同一个反应体系中进行，所以一次可同时完成12种抗体的检测，这与传统逐个检测的方式效率有很大的不同；
(3)在本发明提供的检测方法中，每个聚苯乙烯微球上都以共价结合的方式偶联捕获抗体分子，因其检测是在微球表面进行，且针对一种标志物检测约1500个微球，产生的信号就强，而且在流式微球联合检测分析法中加入异硫氰酸荧光素(FITC)提高了检测的敏感性，其灵敏度明显比现有临床常规使用的酶学显色的方法更高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，该检测方法将微球分析技术和流式分析技术相结合，实现对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标进行联合检测。
本实施例提供一个血清样本检测12种抗磷脂抗体指标的联合检测方式，具体实施步骤如下:
1)血清样本准备
采集受试者的空腹静脉血，于室温静置凝固后离心分离出血清，具体离心分离条件为3000r/min，5分钟，离心后，分离出血清方式备用即可；
2)准备、激活微球
从市场购买12种具有不同荧光颜色的聚苯乙烯微球，该微球是一种表面含有羧基的聚苯乙烯微球，每种微球的粒径均一，微球原液的规格约为1.25×107个/mL，然后对购买的微球原液进行激活，每一种微球采用同样的激活方法，所取的量可根据需要加减，步骤具体如下：
取其中一种购买的微球原液1500μL于离心管中，15000r/min，离心3min，弃上清；向弃上清的离心管中加入1500μL的微球洗涤缓冲液(微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成)，采用实验室常规的洗涤即可(如漩涡震荡10秒，超声清洗10秒)，洗涤后，15000r/min，离心3min，弃上清；向弃上清的离心管中加入1500μL的微球激活缓冲液(微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4)，将微球重悬于微球激活缓冲液中，气候向离心管中分别加入100μL EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)和100μLSulfo-NHS(硫化N-羟基琥珀酰亚胺)(EDC和Sulfo-NHS均用微球激活缓冲液进行配置，浓度均为50mg/mL)，所加入的EDC为可溶于水的碳二亚胺，本步骤中主要用作羧基的活化试剂，室温避光摇晃10min，以实现对微球上羧基的充分活化；微球上羧基的活化反应完成后，向离心管中加入2000μL 1×PBS缓冲液，高速震荡10秒，15000r/min，离心3min，弃上清；向离心管中加入1500μL1×PBS缓冲液，将微球重悬于1500μL 1×PBS缓冲液中，震荡、清洗15秒，15000r/min，离心3min，弃上清，此步骤主要是对激活后微球的洗涤步骤，向离心管中加入1500μL 1×PBS缓冲液，将微球重悬于1500μL 1×PBS缓冲液中，即得到激活的微球。其余11种的微球对照上述步骤完成；
3)准备捕获抗体
从市场购买12种捕获抗体，分别为：鼠抗人aCL-IgG单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgM单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgA单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgG单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgM单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgA单克隆抗体、鼠抗人PS-IgM单克隆抗体、鼠抗人PS-IgG单克隆抗体、鼠抗人PT-IgM单克隆抗体、鼠抗人PT-IgG单克隆抗体、鼠抗人PI-IgM单克隆抗体、鼠抗人PI-IgG单克隆抗体共12种，购买的捕获抗体原液浓度为0.2mg/ml；
4)偶联
取步骤2)制得的激活的微球200μL加入反应管中，再取步骤3)购买的捕获抗体鼠抗人aCL-IgG单克隆抗体原液100μL加入微球中，用1×PBS调节最终体积至800μL，室温避光摇震进行偶联反应，反应时间为1.5-2小时，反应完成，15000转/分，离心3分钟，去上清，可向反应管中加入800μL的1×PBS缓冲液重复洗涤步骤，上述为微球与捕获抗体的偶联过程；
偶联结合反应完成后，对微球上未结合捕获抗体的位点用封闭液进行封闭处理，封闭处理步骤为：将上述偶联反应完成，洗涤后的微球重悬于500μL微球封闭缓冲液中，漩涡振荡20秒，室温避光摇震20min，15000转/分，离心3分钟，弃上清，向反应管中加入1000μL微球封闭缓冲液(微球封闭缓冲液配制方法为：向pH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮化钠，混匀即可，所述加入牛血清白蛋白、叠氮化钠的混合料液比分别为10g/l、0.5g/l)，15000转/分，离心5分钟，去上清，后再将微球重悬于500μL微球封闭缓冲液，最终得到微球1-aCL-IgG，其余11中捕获抗体的偶联方法同上；
最终得到：微球2-aCL-IgM、微球3-aCL-IgA、微球4-β2-GPI-IgG、微球5-β2-GPI-IgM、微球6-β2-GPI-IgA、微球7-PS-IgM、微球8-PS-IgG、微球9-PT-IgM、微球10-PT-IgG、微球11-PI-IgM、微球12-PI-IgG；
分别取200μL通过以上步骤制备得到的分别偶联有不同捕获抗体的12种微球进行混合，最终得到包含有：微球1-aCL-IgG、微球2-aCL-IgM、微球3-aCL-IgA、微球4-β2-GPI-IgG、微球5-β2-GPI-IgM、微球6-β2-GPI-IgA、微球7-PS-IgM、微球8-PS-IgG、微球9-PT-IgM、微球10-PT-IgG、微球11-PI-IgM、微球12-PI-IgG的2400μL的混合反应体系；
5)抗原抗体结合
将步骤1准备的样品血清100μL加入步骤4)的混合反应体系中进行文娱反应，反应时间40min-50min，混合微球上偶联的捕获抗体会与血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体发生抗原抗体特异性免疫结合反应，以此将血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体识别出来，在此步骤中，为了后续对所检测的标志抗体进行定量分析，需要利用微球与血清样本同样的方法，开展12种待检测的抗磷脂抗体的标准品的系列对照实验，标准品可直接在市场进行购买，标准品包括：aCL-IgG标准品、aCL-IgM标准品、aCL-IgA标准品、β2-GPI-IgG标准品、β2-GPI-IgM标准品、β2-GPI-IgA标准品、PS-IgM标准品、PS-IgG标准品、PT-IgM标准品、PT-IgG标准品、PI-IgM标准品、PI-IgG标准品，此处不再展开；
6)荧光标记反应
将步骤5)反应完成后的反应液进行洗涤，以此将不反应的血清蛋白清洗掉，向洗涤后的反应管中加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG，加入的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体会与步骤5)中已固定在微球表面的抗磷脂标志抗体相结合，以此实现对抗磷脂标志抗体的荧光定量分析；
7)流式检测
步骤6)的荧光反应完成后，对反应液进行洗涤，采用流式细胞仪对微球反应液进行检测，通过检测不同微球中FITC荧光素强度，根据12种抗磷脂标志抗体的标准品系列对照实验制备标准曲线，对血清中标志抗体进行定量分析，通过检测微球自身的荧光颜色对血清中标志抗体进行定性分析。
以上为一份血清样本中12种抗磷脂标志抗体的联合检测方法，可根据血清样本的数量参照上述进行具体实施。
效果实施例
为了进一步验证本发明所提供的针对诊断抗磷脂综合征的12种抗磷脂标志抗体指标aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG进行联合检测方法的有效性和可行性，将依照上述具体实施方式中的实施步骤对12种抗磷脂标志抗体指标进行联合检测的结果与目前临床上常规使用的ELISA法试剂盒测定的结果进行对比，该对比例采用了20个血清样品进行比较，以x±s(pg/mL)表示，结果如下表所示：
表1联合检测方法与ELISA对比实验结果表
| 抗体名称 | 实施例1 | ELISA法 |
| n | 20 | 20 |
| aCL-IgG | 6.05±0.37 | 6.62±3.37 |
| aCL-IgM | 7.57±0.67 | 7.00±1.04 |
| aCL-IgA | 5.41±0.06 | 5.46±3.81 |
| β2-GPI-IgG | 6.79±0.14 | 5.39±2.17 |
| β2-GPI-IgM | 6.83±0.32 | 7.85±2.68 |
| β2-GPI-IgA | 9.48±1.48 | 9.34±5.51 |
| PS-IgM | 32.64±1.47 | 33.36±7.19 |
| PS-IgG | 9.87±0.98 | 8..95±2.67 |
| PT-IgM | 9.08±1.27 | 8.57±3.42 |
| PT-IgG | 9.75±0.14 | 10.05±1.42 |
| PI-IgM | 8.84±0.22 | 8.95±1.69 |
| PI-IgG | 11.38±1.47 | 11.44±8.62 |
根据以上结果表明，本发明提供的针对诊断抗磷脂综合征的12种抗磷脂标志抗体指标aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG进行联合检测方法与临床常规使用的ELISA法试剂盒测定法所得到的检测结果无显著差异，表明本发明提供的联合检测方法具备可行性及有效性；其次，从上表中可以得出，本发明所提供的对12种抗体进行检测得到的检测结果之间的波动性更小，通过ELISA测定所得到的检测结果之间的数值波动性更大，表明，通过本发明所提供的联合检测方法对抗磷脂综合征的12种抗磷脂标志抗体指标进行检测的标准化程度也更高。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法将微球分析技术和流式分析技术相结合，所述检测方法针对aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG等12种抗磷脂抗体指标进行联合检测。
2.根据权利要求1所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体步骤如下:
1)血清样本准备：采集受试者的空腹静脉血，于室温静置凝固后离心分离出血清；
2)准备、激活微球；
3)准备捕获抗体：准备与抗磷脂标志抗体对应的捕获抗体，所述捕获抗体相当于抗原，用于与血清中待检测的抗磷脂标志抗体进行抗原抗体特异性结合反应；
4)偶联：将步骤3)中准备好的捕获抗体与步骤2)中已激活的微球进行偶联结合反应，偶联结合反应完成后，对微球上未结合捕获抗体的位点用封闭液进行封闭处理，封闭处理后将各种偶联有捕获抗体的微球进行混合；
5)抗原抗体结合：将步骤1)中制备的血清样本加入到步骤4)的混合微球中进行反应，混合微球上偶联的捕获抗体与血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体发生抗原抗体特异性免疫结合反应，以此将血清样本中待检测的抗磷脂标志抗体识别出来；
6)荧光标记反应：步骤5)的抗原抗体特异性免疫结合反应完成后，对反应液进行洗涤，向反应中加入FITC标记的羊抗鼠IgG进行反应，进行对抗磷脂标志抗体的荧光定量分析；
7)步骤6)的荧光反应完成后，对反应液进行洗涤，采用流式细胞仪对微球反应液进行检测。
3.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述微球是一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，每一种所述微球自带的荧光颜色不一样。
4.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)所述微球具体为12种具有不用荧光颜色的羧基化聚苯乙烯微球，所述微球可以从相关生物制品公司直接购买。
5.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述激活微球的方法具体为：取微球原液，离心去上清后，向微球中加入微球洗涤缓冲液，震荡、混匀，离心去上清后，将微球重悬于微球激活缓冲液中，以达到对微球的激活，震荡、混匀进行激活，向激活后的微球加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光震摇，反应完成后，然后向微球中加入1×PBS缓冲液，高速摇晃，离心去上清后，将微球重悬于1×PBS缓冲液中，旋涡震荡，即完成微球的激活。所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺使用微球激活缓冲液进行配置，浓度均为50mg/mL。
6.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤2)中激活微球所使用的微球洗涤缓冲液的配制方法为：由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20直接混合配制而成，所述微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH2PO4。
7.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤3)中所使用的捕获抗体分别为：鼠抗人aCL-IgG单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgM单克隆抗体、鼠抗人aCL-IgA单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgG单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgM单克隆抗体、鼠抗人β2-GPI-IgA单克隆抗体、鼠抗人PS-IgM单克隆抗体、鼠抗人PS-IgG单克隆抗体、鼠抗人PT-IgM单克隆抗体、鼠抗人PT-IgG单克隆抗体、鼠抗人PI-IgM单克隆抗体、鼠抗人PI-IgG单克隆抗体共12种；步骤3)中所述抗磷脂标志抗体分别为：aCL-IgG、aCL-IgM、aCL-IgA、β2-GPI-IgG、β2-GPI-IgM、β2-GPI-IgA、PS-IgM、PS-IgG、PT-IgM、PT-IgG、PI-IgM、PI-IgG共12种，所述捕获抗体与抗磷脂标志抗体相对应，所述捕获抗体可以从相关的生物制品公司直接购买。
8.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤4)中所使用的封闭液配制方法为：向pH值7.4的1×PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮化钠，混匀，所述加入牛血清白蛋白、叠氮化钠的混合料液比分别为10g/l、0.5g/l。
9.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤4)中激活的微球与捕获抗体偶联的具体方式为：将捕获抗体原液加入到激活的微球中，用1×PBS缓冲液调节反应的体积，室温避光摇震反应，离心去上清，向偶联反应后的微球中加入洗涤缓冲液，对偶联反应进行洗涤，洗涤后即可得到偶联有捕获抗体的微球，即分别为：微球1-aCL-IgG、微球2-aCL-IgM、微球3-aCL-IgA、微球4-β2-GPI-IgG、微球5-β2-GPI-IgM、微球6-β2-GPI-IgA、微球7-PS-IgM、微球8-PS-IgG、微球9-PT-IgM、微球10-PT-IgG、微球11-PI-IgM、微球12-PI-IgG。
10.根据权利要求2所述的一种抗磷脂综合征相关抗体的检测方法，其特征在于，步骤7)中通过流式细胞仪进行检测的方法具体为：通过检测不同微球中FITC荧光素强度，对血清中标志抗体进行定量分析，通过检测微球自身的荧光颜色对血清中标志抗体进行定性分析。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115060887A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-16 | 阿维森纳(广州)健康科技有限公司 | 一种提高复发性流产和反复种植失败诊断率的方法及应用 |
| CN115420892A (zh) * | 2022-10-31 | 2022-12-02 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 联合检测IgG型抗心磷脂抗体和IgM型抗心磷脂抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法 |
| DE102023130152B3 (de) | 2022-10-31 | 2024-05-02 | DiYalab ZJG Biotech Co. Ltd. | Verfahren zur Herstellung von fluoreszierenden immunchromatographischen Teststreifen für den kombinierten Nachweis von Anticardiolipin-Antikörpern des IgG-Typs und Anticardiolipin-Antikörpern des IgM-Typs |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210907 |