TW201943727A - 單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原IgE的檢測方法 - Google Patents
單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原IgE的檢測方法Info
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Abstract
本發明在此揭示一種應用方式,將不同已標記之單域結合蛋白,應用於微量免疫檢測上。這種應用方式除了不同於傳統的單株抗體或多株抗體在微量免疫檢測上的使用模式,並且同時提升了檢測的靈敏度、專一性,更提高了反應的速率,大幅的縮短了檢測過程所需的時間。在內容中以偵測IgE為實施範例,描述了針對IgE有專一性結合反應的單域結合蛋白,在不同的組合下可以大幅改善微量免疫反應檢測的性能。
Description
本發明係為一種屬於臨床醫學檢測領域中的免疫檢測方式改良。利用多種特定結構的單域結合蛋白組合取代常用的單株抗體或多株抗體,應用於微量免疫反應檢測,優化條件後可以達成增加反應速率,使反應變快、且提高檢驗試劑的靈敏度以及專一性。
免疫檢測技術(Immunoassay),或稱免疫診斷技術(Immuno-diagnostics)是利用抗原抗體之間的特異性免疫反應來測定免疫狀態、檢測各種疾病的診斷方法。現在最常使用的微量免疫檢測,又能同時檢測多項目的檢測包括了蛋白質生物晶片,以及Luminex公司發展出的螢光微粒偵測(Luminex xMAP)。基本上都做到了以免疫學方法原理,將抗體或抗原點製晶片表面的小點內,或者是包覆在螢光微粒上,可以迅速的跟待測物反應,在一個反應中可以同時偵測數十到數百個偵測標的物。然而在這些同時多標的檢測的試劑開發過程,常遇到的困擾是由於極度的微量化,使用的單株或多株抗體之標示物,發出來的訊號極弱,必須要使用較高靈敏度的光學或其他偵測儀來偵測反應的結果。所以如何反應中以各種 方式增加反應速率,或者增加短時間內的反應強度,會是重要的研究課題。
由於免疫學的進展,1975年首度有學者提出,以融合瘤技術製造只針對單一抗原反應的單一種抗體,稱之為單株抗體(monoclonal antibody)。在1980以後,單株抗體因為蛋白質新藥的發展而積極發展,再加上抗原結合位點(antigen-binding sites)概念被加入人源抗體IgG的Fc片段以後,顯著的降低了單株抗體分子的大小,也增加了單株抗體藥物的實用性。之後在生技界以及製藥界,無不想盡辦法找是否有更合適的分子,比單株抗體的更小更穩定的分子,並且能專一性結合在標的物上,如單鏈變異區段(singe chain variable freagment)。1989年,Hamers-Casterman等偶然發現單峰駱駝血液中有半數的抗體是重鏈抗體(heavy-chain antibodies,HCAbs),它是一種缺失了輕鏈的重鏈二聚體抗體。1997年,Ghahroudi等利用噬菌體展示技術獲得駱駝重鏈可變區片段(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因庫,經多輪淘選後得到了只含有一個結構域的最小單元抗原結合蛋白片段,被稱為單域抗體(single-domain antibodies,sdAbs)。
單域抗體是抗體分子的最小抗原結合單元,僅由一個可變結構域或一個僅協助靶標結合的工程化的恒定結構域組成。此類抗體衍生物現今技術已知的,包括來源於駱駝科和鯊魚類動物中天然產生的可變區,以及工程化的人源抗體中重鏈或輕鏈的可變區或恒定區結構域。單域抗體為約110個胺基酸的肽鏈,包含了一般完整抗體中的一個重鏈可變域(VH)。它們對抗原的特異性程度與完整的抗體相似,但熱穩定性好,在清潔劑和高濃度尿素環境下穩定。在藥物學上來說,相對於完整抗體,單 域抗體的分子質量更低,這使其更容易滲透到組織中。同時由於更容易通過腎臟清除,因此其藥代動力學半衰期也更短。此外由於它們沒有可結晶區,因此無法通過補體系統引發細胞毒性。所以在藥物學的研究和應用上,近20年來他的研究非常廣泛,也有數個已經初期開發完成進入臨床試驗的單域抗體藥物。
在檢測上,單域抗體的相關應用,雖然具有較佳的熱穩定性以及分子量小,但是一開始所受到的矚目就沒有如此之高。一方面由於傳統的免疫學檢測方式,高親和性的單株抗體應用,在傳統平臺上的表現已經非常穩定,困擾僅在於抗體本身熱穩定性問題。而一般抗體其較長的重鏈Fc部分可以提供酵素等分子進行鍵結,又可用於吸附於固態載體如膠體金、乳膠粒子上,甚至於在特定平台上還可以鍵結一些連接分子(linker)。所以在免疫檢測上的應用,雖然在某些特定的癌製篩檢應用於分子感測器上,或者是細胞染色上有較佳的表現以及相關研究,然而實質上並未有商品化的產品直接產出。
微量化的免疫檢測,現在主流以蛋白質生物晶片以及螢光微粒偵測為主。因為方法學上的不同,「反應速率」以螢光微粒偵測的反應快均質性高,偵測方法以流式細胞儀相同概念進行同時多顆粒螢光標記的判讀,佔有一定的速度優勢。在「多標的檢測」上,因為蛋白質晶片是同時在一個固態表面如玻璃或者是硝化纖維膜上,可以根據偵測標的項目的總數,進行較大規模的增加,只要在操作許可範圍以及偵測靈敏度許可範圍下,蛋白質晶片在同時檢測項目上,佔有了絕對的優勢。但是兩個系統在、反應穩定性、反應速率上的研究,一直有各自的進展。
在蛋白質晶片的反應速率上,臨床檢體通常是以液態形式參與免疫檢測反應,這些檢體包括了血清、血漿、唾液、尿液等各式體液。在液態的反應系統內,如果反應用的抗體或抗原固定於固態表面,則抗體抗原本身的碰撞機率,決定了反應完成的速度。無論多株抗體或者是單株抗體,因為抗體本身的大小,在反應速率上會有一定的限制,如果使用較小的蛋白質或胜肽鏈來取代抗體,則有可能提高反應的速率,達成醫療檢測時對於反應速度的需求。另外,在液態系統的主要反應速率決定因子在於溫度、反應分子相對濃度、反應物的分子大小、反應物間之親和力、反應物之間的空間障礙等。在蛋白質晶片系統中,除了改善抗體或小分子蛋白的分子大小之外,在液態系統中如果可以提升反應溫度、增加反應分子之相對濃度,克服分子間的立體空間障礙,極可能提升反應速率,甚至於同時提高靈敏度以及特異性。
在蛋白質晶片的應用上,一次檢測多標的物是最大的優勢,因而在臨床上如果有多種標的物必須同時進行篩選,就會是重要的應用方向,這些檢測包括過敏原檢測、自體免疫疾病、癌症相關多標的篩檢等。在過敏原上檢測上的應用,蛋白質晶片與傳統常用的兩步驟酵素免疫分析法,基本原理相同。兩種方式都是將過敏原蛋白質固定於固態表面,之後將待測血清檢體進行適當濃度稀釋後,直接與固態表面的過敏原蛋白進行抗體抗原反應。反應完成後,與過敏原反應的免疫球蛋白E(IgE)會黏附於過敏原上,然後經過清洗沖掉待測物,再加入已經經過標示的單株抗體與IgE反應。最後再進行標示物的訊號測定,在蛋白質晶片上常見的標示物為螢光分子如Cy3,Cy5,Alexa等。其中最重要的訊號強弱與雜訊控制,在單 株抗體與免疫球蛋白的適當濃度、反應完成度以及反應時間。在商業上也曾經除了使用單株抗體來針對IgE做反應追蹤之外,也曾經有Heska公司在專利US00US5945294中敘述,以IgE在人類細胞上的反應受器(Fc receptor),但是其專利申請範圍僅應用於寵物動物的IgE檢測,並且只應用於傳統的酵素免疫檢測法,並且僅應用於該公司的收檢檢測上,應該是受限於Fc receptor的本身性質,沒有辦法提升太多的檢測靈敏度。因為在寵物的血清中,特異性針對過敏原有反應的IgE濃度,通常是人類的5~10倍,靈敏度不需要太高。另外,國際上針對抗IgE的單域抗體多有研究,然而這些研究中,都偏重於抗IgE單域抗體在體內的存在時間(延遲代謝速率),以及人源化以後的蛋白質藥物應用層面。很明確應用於「IgE檢測」的目的上,並沒有深入去研究和開發。
有鑑於此,本發明以檢測過敏原用的蛋白質晶片檢測方法為實例,提出一種以多個已標記的單域結合蛋白,應用於蛋白質晶片相關微量免疫檢測的模式,得以使蛋白質晶片檢測法的反應速率、靈敏度及專一性上升,達到提升效能的目的。
本發明之主要目的,係在於提供一種單域結合蛋白的應用方法,取代蛋白質晶片例常使用的多株抗體或單株抗體,提升其反應速率、靈敏度及專一性。
在蛋白質晶片應用於臨床時,通常使用多株抗體或者是單株抗體,抗體上面標示特定螢光物質或酶,用於追蹤反應結果。當其針對之 標的物留存於蛋白質晶片上時,抗體會與標的物結合。當操作者以特定光學儀器讀取訊號時,標示於抗體上面的螢光物質會產生訊號,或者酶與加入呈色的反應底物(substrate)產生冷光訊號,操作者讀取訊號強度得以瞭解抗體反應的強度,進而知悉偵測標的物的多寡,是一種定量偵測反應。其中抗體的親和性強弱、抗體本身是否可以到達標的物的結合位置、以及反應系統的均質性,都會影響最終的訊號結果。本發明中以單域結合蛋白,取代多株抗體及單株抗體的角色,擔任反應結果追蹤的抗體。
在本發明中,揭示了數個應用於蛋白質晶片的單域結合蛋白胺基酸序列、其螢光物質的標示方法以及使用的方式。這些單域結合蛋白與蛋白質晶片組成的試劑套組,和原始由單株抗體和蛋白質晶片組成的套組進行比較,可以發現在反應速率、靈敏度以及專一性上,都有顯著的提升。
在本發明中,揭示一種蛋白質晶片的製作過程。這種蛋白質晶片可應用於臨床醫學檢測或者是動物檢測,針對多品項的過敏原檢測,是將純化過的過敏原蛋白,經過特定的固定方式將過敏原蛋白黏著於玻璃材質的試片上。檢測的對象檢體是血清、血漿或者是全血,其中的針對過敏原有特異性反應的IgE(specific IgE,sIgE)是主要的偵測對象。將檢體與蛋白質晶片上的過敏原反應後,sIgE會黏附於各過敏原蛋白上,再以本發明所提的其中一個或數個單域抗體與黏附在晶片過敏原上的sIgE進行反應後,即可以雷射掃描儀讀取單域抗體上標示的螢光強度。螢光可以反映出受檢檢體內,是否有針對特定過敏原有反應的sIgE,並且螢光強度可以推測出受檢人sIgE的多寡,間接了解受檢者過敏的嚴重程度,是一種臨床醫學上 的定量檢測。
第1圖係為本發明中過敏原蛋白質晶片的品項及點製示意圖。
第2圖係為本發明中過敏原蛋白質晶片以特定卡匣固定示意圖。
第3圖係為本發明中單域結合蛋白於過敏原蛋白質晶片之單獨性能測試。
第4圖係為本發明中單域結合蛋白分組混合性能測試之圖。
第5圖係為本發明中單域結合蛋白分組混合性能測試,測定血清經過稀釋2,4,8,16倍,其反應訊號與對照組比對圖。
第6圖係為本發明中單域結合蛋白反應縮時實驗之圖。
本發明之單域抗體係一種特定序列的蛋白質,此類蛋白質可以針對特定抗原標的物進行反應,此反應可以取代現有常用的單株抗體或多株抗體,在臨床或動物檢驗加以應用。在本發明的實施例中,此類蛋白質經過資料庫搜尋、克隆方式設計、最後利用大腸桿菌大量表現出蛋白質,經過純化後,進行螢光物質的標記,最後可應用於檢測中。
【實施例】
實施例1. 抗人類IgE單域結合蛋白的設計與克隆
開始設計前,在美國國家衛生研究院的生物資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、生物資訊資源入口網(https://www.expasy.org/)以及美國專利資料庫上,搜尋針對人類IgE的單株抗體及單域抗體,進行序列的分析。這些序列基本上具有七段相連的序列,依照性質為骨架區(framework region,FR)以及互補決定區(Complementarity-determining region,CDR),依照排列分別為蛋白質氮端(N)-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,以這些序列為範本,依照胺基酸本身特性,設計不同的氨基酸序列進行後續的和成動作。除了要跟標的物人類IgE可以有反應之外,因為後續使用的需求,還必須注意幾個設計重點:(1)整段蛋白質中,為了後續螢光物質的標記,必須留下較多的離胺酸(Lysine,K)於骨架區(framework region,FR)中,或在蛋白質鏈碳端(C terminal)加上少數離胺酸(Lysine,K),以提高後續螢光物的標示效能。(2)在整段蛋白質中,為了避免螢光標物質影響互補決定區(Complementarity-determining region,CDR)的效能,所以盡量在設計時在互補決定區不選擇離胺酸(Lysine,K)於序列中。(3)由於未來須使用於檢驗使用,能夠進行量產應用,設計中必須加入提供純化的特定序列如His tag,GST tag。(4)考量多數資料庫中三級結構模擬完成時,發現蛋白質氮端(N terminal)如果添加的過長的序列,會嚴重影響前段蛋白質的三級結構型態,所以序列在骨架序列1(FR1)之前不要設計過多胺基酸。
設計完成後,將胺基酸序列逆向翻譯為DNA序列,並且委託進行商業化DNA序列和成。合成完之DNA,使用pET22 plasmid為載體(pET22,為Merck Millipore公司Novagen系列商標產品),送入大腸桿菌E. coli Rosetta gami B(Merck Millipore公司Novagen系列商標產品)進行表現。利用IPTG誘導表現出來的蛋白質皆直接可溶,可利用超音波震盪法將菌體打破,再利用His tag管柱進行純化。經過純化後的蛋白即我方所需之單域結合蛋白,其特性與資料庫所可以找到的單域抗體表現出來相似。本發明中經過測試的單域蛋白,其序列如序列表之表一。
實施例2. 單域結合蛋白的螢光物標記
純化完成的每一個單域結合蛋白,利用Vivaspin 6離心濃縮管,在4℃下以1000g的離心機加以離心,濃縮至大於1mg/ml之濃度。以Cy3 mono-reactive Dye Pack(此為GE,Amersham Biosciences的產品)或類似的螢光標記套組加以標記。依照標記套組的說明標示階段完成後,可利用PD-10管柱(此為GE,Amersham Biosciences的產品)進行中產物的純化分離。對照組採用抗IgE的單株抗體(此為Biocheck公司產品,Anti human IgE mAb #70188),也進行同樣步驟的標記。將的標記完成之單域結合蛋白-Cy3產物,與對照用之單株抗體-Cy3產物,分別稀釋1000倍備用。
實施例3. 過敏原蛋白質晶片的製作
3.1 過敏原的抽取純化與製作
過敏原(allergen,又稱為變應原、過敏物、致敏原、致敏物)是指能引起過敏的物質。嚴格地說,過敏原是一種能促進在特應性個體發生第一型過敏反應的非寄生抗原。這些會引起過敏的物質,依照入侵人體的途徑,大致上分為吸入性、食入性、侵入性及接觸性幾大類。常見的吸入性過敏原包含:動物皮毛、毛屑,花粉、黴菌、塵螨、昆蟲;食入性 的包含常見肉類、豆類、穀類、堅果類、奶蛋類、蔬菜水果等各類食物外,還包含藥物。侵入性的過敏原包含昆蟲類、節肢動物類之毒液。
取得過敏原原料後,先將過敏原原料以無菌水清洗,去除外部髒汙(如:血液、黏液、土壤等),以避免汙染物影響後續的過敏原萃取。將洗淨後之過敏原原料,浸泡於抑菌溶液中(包含但不限於0.01% NaN3或0.05% proclin 300之磷酸生理食鹽緩衝液),以降低過敏原原料中的微生物含量,以利於後續過敏原萃取和儲存時的穩定性。再將過敏原原料從抑菌溶液中取出並初步風乾或乾燥後,依照過敏原原料特性將體積較大者分成數個以上不等的較小部位,進行攪拌、研磨、打漿等均質化步驟。經均質化之過敏原原料,以冷凍乾燥法移除其內所含之水分,增加過敏原的保存期間。
取冷凍乾燥後的過敏原原料粉末,依照各類過敏原不同之性質,與與不同之萃取緩衝液混合均勻,再將混合液以液態氮氣和加熱培養箱急速地冷凍與解凍,迫使過敏原自細胞組織內釋放至混合液中。將混合液經離心將過敏原溶液與不溶物分層,將上方的過敏原溶液移至透析膜中,藉由透析膜之半通透特性,針對過敏原進行濃縮與緩衝液置換步驟。經透析後之過敏原樣品溶液,在調整至1mg/ml等適當濃度後,即可使用於過敏原蛋白質晶片製作之原料。
3.2 過敏原蛋白質生物晶片的製備
將人類IgE標準品以2.5,5,10ug/ml的濃度,(低[L]、中[M]、高[H])的濃度,以磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffer saline,PBS)稀釋,做為特異性過敏原IgE反應之對照組。將實施例3.1製作完成的過敏原, 加入已添加界面活性劑(<0.1%,Tween20或Triton X100)之點片磷酸生理食鹽緩衝液調整至適當濃度(<1mg/ml)。將這些濃度調整完成的過敏原以及對照組,同時點在NEXTERION® Slide Glass B(Schott公司的系列產品)的玻片上。每個過敏原及對照組點製三重複,每個點的大小約為350um。點製完成後,以1%酪蛋白磷酸緩衝液(casein phosphate buffer,pH7.5)封閉。為方便後續檢驗使用,封閉完成的過敏原蛋白質晶片,需要放進超低濕乾燥箱進行乾燥24小時以上,並以特定卡匣加以固定,封入已經有乾燥劑的鋁箔袋內,儲存備用。本發明中使用6種,30種過敏原進行點製,品項及點製示意圖請參見圖1,以特定卡匣加以固定,以便後續進行血清反應使用,請參見圖2。以上述方法製成之蛋白質晶片,曾進行過相關臨床測試,比對試劑為AllergyScreen(此為Mediwiss公司的特異性過敏原IgE檢測試劑套組)。經過比對,於塵蟎、貓毛、蛋白、蝦、蟹五個過敏原,其陽性一致率皆大於90%,信賴區間約為90~99.6%之間。特異性IgE的分析靈敏度(analytical sensitivity,檢測極限)約在3.5IU/ml,約等於0.84ng/ml。螢光強度(fluorescence intensity)訊號有效範圍200~65535,有效偵測訊號3.5IU/ml~100IU/ml。
實施例4. 單域結合蛋白於過敏原蛋白質晶片之性能測試
將實施例3中的單域結合蛋白-Cy3標記產物,分成兩組,分別為第一組1.1 E02A2,1.2.E03B1兩個單域結合蛋白產物,以及第二組2.1 E04A1,2.2 E05A2,挑選E30B1及E04A1混合加入性能測試,並且與對照組加以比對。
性能測試的方法是將實施例3.2製備完成的過敏原蛋白質生 物晶片取出,加入測試用血清Ab-E15477,於37度下反應30分鐘後,然後以吐恩-磷酸生理食鹽緩衝液(phosphate buffer saline-1% tween,PBST)進行沖洗6次。沖洗完成後將各組單域結合蛋白-Cy3,以及對照組單株抗體-Cy3加入反應,經過37度反應30分鐘後,再度以PBST清洗六次,拆卸晶片外卡匣後,以高純氮氣吹乾晶片,1小時內以「晶心Luxscan 10K」微陣列芯片掃描儀(北京博澳晶典生物技術)掃描晶片上的訊號,觀察血清中各過敏原品項所得之數值,數值的計算必須扣除反應背景值。結果(參見圖3)明確發現,單一獨立的各個單域結合蛋白的訊號,顯然都略差於單株抗體的訊號數值。但是明顯的,各訊號數值呈一定比例,並未有個別過大差異的狀況存在。
實施例5. 單域結合蛋白分組混合性能測試
將上述實施例3中已經完成的單域結合蛋白-Cy3產物,挑選第一組和第二組各一個,以濃度比1:1混和在一起進行性能測試。對照組則採用單株抗體-Cy3產物,兩倍體積加入反應之中,以及混合兩個不同的來源(Abcam,Biocheck兩家公司之mouse anti human IgE mAb)之抗人類IgE單株抗體-Cy3產物進行反應。將實施例3.2製備完成的過敏原蛋白質生物晶片取出,加入測試用血清Ab-E15477(此為AbBaltis Ltd公司allergy positive系列質控品),於37度下反應30分鐘後,然後以吐恩-磷酸生理食鹽緩衝液(phosphate buffer saline-1% tween,PBST)進行沖洗6次。沖洗完成後將各組單域結合蛋白-Cy3,以及對照組單株抗體-Cy3加入反應,經過37度反應30分鐘後,再度以PBST清洗六次,拆卸晶片外卡匣後,以高純氮氣吹乾晶片,1小時內以「晶心Luxscan 10K」微陣列芯片掃描儀(北京博奧晶典生物技術) 掃描晶片上的訊號,觀察血清中各過敏原品項所得之數值,數值的計算必須扣除反應背景值。。
從試驗結果1.2.E03A2加上2.1 E04A1得知(參見圖4),在單域結合蛋白-Cy3混合後的反應結果,優於使用單株抗體-Cy3,不論是哪一組結果。添加兩倍體積的對照組,加入反應的末濃度,雖然比實施例4之反應末濃度提升為2倍,但是經過反應訊號值並沒有太多的提升。而加入不同來源的兩個單株抗體Cy3產物,也很明顯無法再大幅提升訊號值。但是在混合兩種不同的單域蛋白Cy3產物進行反應時,其結果比僅使用一種單域蛋白的結果訊號較強,也比所有對照組的反應強。
在學理上的推測,可能因為單株抗體的分子比單域結合蛋白大,而且約為14~16倍。不同的單株抗體如果要結合上IgE的不同特定區段時,彼此之間的Fc段或者其他結構區域,可能會互相干擾或影響,導致沒有辦法兩個抗體同時對一個IgE進行結合反應。但是在單域結合蛋白的組合上,這樣的狀況似乎輕微許多,所以不同序列的單域結合蛋白,可以在不干擾彼此的狀況下,同時結合到IgE特定的結合區域上。此一結果大大的提升了有效的訊號,在檢體稀釋2倍、4倍、8倍、16倍時,明確的提升的偵測極限(參見圖5),應用在臨床時,可以很明確的提升靈敏度。
實施例6. 單域結合蛋白反應縮時實驗
此部分縮時實驗,測試的方法是將實施例3.2製備完成的過敏原蛋白質生物晶片取出,加入測試用血清Ab-E15477,同時加入混合的單域結合蛋白Cy3產物進行反應,對照組以單株抗體-Cy3加入反應。依照反應時間分成三組進行試驗,經過37度反應10,30,60分鐘後,分別以PBST清 洗六次,拆卸晶片外卡匣後,以高純氮氣吹乾晶片,1小時內以「晶心Luxscan 10K」微陣列芯片掃描儀(北京博澳晶典生物技術)掃描晶片上的訊號,觀察血清中各過敏原品項所得之數值,數值的計算必須扣除反應背景值。
此試驗的概念如同傳統的酶聯免疫法中的一步法(one step ELISA),是將所有液態系統內所有可能的反應物,一次性的加到反應系統中。如果反應物是一對抗體抗原,其分子量差異並不大,其結果可能會不如預期。本試驗之結果(參見圖6)很明確的可以見到,單株抗體對照組在僅反應10分鐘的狀況下,其反應幾乎連一半都尚未完成。但是在60分鐘後,可以比對的是實施例4的結果,顯然在單株抗體Cy3產物上不適合這樣的反應模式。但是在單域結合蛋白Cy3的反應測試上,在30分鐘以後,反應強度就已經接近了原本實施例5(圖4)的結果,60分鐘後訊號會再提高,但是比例不多。
此試驗的結果,明確的知道在混合了不同種類的單域蛋白,在檢測IgE的蛋白質晶片上,可以縮短整體反應的時間將近一半,並且可以讓使用操作者同步進行檢體和二次抗體標示物的反應,時間縮短但是其偵測訊號並不會下降,甚至於其偵測極限由實施例5(參見圖3)可以得知還可能加強。
雖然,本發明前述之實施方式及實施例揭露如上,然其並非用以限訂本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內所為之更動與潤飾,均屬於本發明專利範圍之主張。關於本發明所界定之專利範圍請參考所附之請求項。
Claims (10)
- 一種單域結合蛋白,用於檢測特異性過敏原IgE,其特徵在於,所述單域結合蛋白選自E02A2、E03B1、E04A1或E05A2,它們的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1-4所示,或SEQ ID NO:1-4所示序列C端去掉6個His標籤形成的序列。
- 一種用於檢測特異性過敏原IgE的單域結合蛋白組合,其特徵在於,所述組合為選自單域結合蛋白E02A2、E03B1、E04A1或E05A2中的至少兩種組合,它們的氨基酸序列同請求項1中所述。
- 一種用於檢測特異性過敏原IgE的檢測試劑、試劑盒或蛋白質晶片,其包括如請求項1所述之單域結合蛋白或其組合。。
- 如請求項3所述之檢測試劑、試劑盒或蛋白質晶片,其特徵在於,所述單域結合蛋白是經過螢光物質標記的單域結合蛋白。
- 一種如請求項1所述之單域結合蛋白,其單獨或組合使用的以下任一種應用:1)特異性過敏原IgE的蛋白質晶片檢測中的應用;2)製備特異性過敏原IgE檢測試劑中的應用;3)特異性過敏原IgE ELISA免疫分析檢測中的應用;4)製備特異性過敏原IgE的側向流檢驗試紙條中的應用。
- 一種用於特異性過敏原IgE的檢測方法,其特徵在於,所述檢測是指基於蛋白質晶片的微量免疫檢測;包括以下步驟:1)將過敏原蛋白質固定於固相載體表面;2)將待測血樣或IgE標準品進行適當濃度稀釋後,直接與固相載體表面 上的過敏原蛋白進行抗體抗原反應;3)反應完成後,清洗反應產物,再向反應產物中加入至少一種預先經過螢光標記的所述單域結合蛋白,與黏附在固相載體表面過敏原蛋白質上的IgE進行反應後,根據終產物的螢光強度,與所述血樣或IgE標準品中IgE的存在或數量相關聯。
- 根據請求項6所述的方法,其特徵在於,步驟(1)具體為:先將過敏原原料以無菌水清洗,洗淨後的過敏原原料浸泡於抑菌溶液中,再將過敏原原料從抑菌溶液中取出乾燥後,進行均質化處理,然後冷凍乾燥得到過敏原原料粉末;然後,依照各類過敏原不同的特性,與不同的萃取緩衝液混合均勻,再將混合液依次用液氮和加熱方法急速地冷凍與解凍,使得過敏原自細胞組織內釋放至混合液中;混合液經離心,收集上清過敏原溶液,將上清轉移至透析袋中進行透析;經透析後的過敏原溶液,調整至適當濃度後,點制於固相載體表面,經酪蛋白緩衝液封閉後,乾燥即得包被有過敏原蛋白質的固相載體。
- 根據請求項6所述的方法,其特徵在於,步驟(2)-(3)具體為:將待測血樣或IgE標準品進行適當濃度稀釋後,直接與固相載體表面上的過敏原蛋白進行抗體抗原反應;反應完成後,用PBST緩衝液清洗反應產物,再向反應產物中加入至少一種預先經過Cy3標記的所述單域結合蛋白,與黏附在固相載體表面過敏原蛋白質上的IgE進行反應後,再用PBST緩衝液清洗反應產物,乾燥後,根據終產物的螢光強度,與所述血樣或IgE標準品中IgE的存在或數量相關聯。
- 根據請求項6所述的方法,其特徵在於,步驟(3)中反應完成後,清洗 反應產物,再向反應產物中加入E02A2和E04A1兩種預先經過螢光標記的所述單域結合蛋白,與黏附在固相載體表面過敏原蛋白質上的IgE進行反應。
- 如請求項6-9任一項所述的方法,其特徵在於,所述血樣選自血清、血漿或全血,如請求項1所述之單域結合蛋白,其特徵包括:標記完成之單域結合蛋白,可以應用於蛋白質生物晶片檢測。
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TW107112159A TW201943727A (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原IgE的檢測方法 |
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CN108535493A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-14 | 北京康亿鸿科技发展有限公司 | 特异性过敏原IgE的检测方法 |
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