TW201943730A - 應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法 - Google Patents
應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法Info
- Publication number
- TW201943730A TW201943730A TW107112160A TW107112160A TW201943730A TW 201943730 A TW201943730 A TW 201943730A TW 107112160 A TW107112160 A TW 107112160A TW 107112160 A TW107112160 A TW 107112160A TW 201943730 A TW201943730 A TW 201943730A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- detection
- protein
- domain binding
- binding protein
- reaction
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本發明在此揭示一種單域結合蛋白的應用,針對微量免疫反應的檢測,提供了一個較傳統使用多株抗體或單株抗體較果更為良好的檢測方式。在內容中並且描述了一個微量免疫檢測的實施方式,並以偵測IgE為實施範例,描述了針對IgE有專一性結合反應的單域結合蛋白,可以大幅改善微量免疫反應檢測的性能,增強反應穩定度,提高反應速率,增加免疫檢測套組的熱穩定性。
Description
本發明係為一種屬於臨床醫學檢測領域中的免疫檢測方式改良。利用特定結構的單域結合蛋白取代常用的單株抗體,應用於微量免疫反應檢測,優化條件後可以達成增加反應穩定度、且提高檢驗試劑的熱穩定度。
免疫檢測技術(Immunoassay),或稱免疫診斷(Immuno-diagnostics)技術是利用抗原抗體之間的特異性免疫反應來測定免疫狀態、檢測各種疾病的診斷方法。免疫檢測技術的發展經歷了放射免疫分析技術(Radioimmunoassay,RIA)、免疫膠體金技術(Immunogold assay)、酶聯免疫分析技術(Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)、螢光免疫分析技術(Fluorescence immunoassay,FIA)和化學發光免疫分析技術(Chemo-luminesce Immunoassay,CLIA),它們的主要差別在於對抗原或抗體進行標記以放大、定量檢測反應信號的方法不同。
從臨床學的角度來說,免疫診斷可應用於檢查傳染性疾病、免疫性疾病、腫瘤和其他臨床各科疾病。臨床使用的免疫檢測技術,應用品項多範圍廣,靈敏度與再現性都高,所以在疾病的檢測上能較為精確的 提供醫療上的判斷方向。近年來於臨床使用的體外診斷試劑(In-Vitro diagnostic kit),在醫療診斷上提供超過一半的疾病相關訊息。按檢驗原理或檢驗方法的不同,主要分為:臨床檢驗、生物化學檢驗、免疫學檢驗、微生物檢驗、核酸與分子檢驗、即時檢驗(POCT)。其中占比最大、市場份額最大的是免疫學檢驗部分,使用的就是免疫檢測技術。因而,在免疫檢測技術上的改良與改善,是多數體外診斷試劑廠商最注重的課題。免疫檢測的方式朝向簡單化、小型化、自動化、縮短檢測時間、減少檢體取樣量(檢體微量化)、提高檢測靈敏度、同反應能多項目檢測等方向進行改善,以期在醫療診斷的使用上能有更大的突破。
現在最常使用的微量免疫檢測,又能同時檢測多項目的檢測包括了蛋白質生物晶片,以及Luminex公司發展出的螢光微粒偵測(Luminex xMAP)。基本上都做到了以免疫學方法原理,將抗體或抗原點製晶片表面的小點內,或者是包覆在螢光微粒上,可以迅速的跟待測物反應,在一個反應中可以同時偵測數十到數百個偵測標的物。然而在這些同時多標的檢測的試劑開發過程,常遇到的困擾是由於極度的微量化,使用的單株或多株抗體之標示物,發出來的訊號極弱,必須要使用較高靈敏度的光學或磁學偵測儀來偵測反應的結果。另外,由於抗體本身也是一種蛋白質,各種蛋白質本身的抗熱差異性非常大,在試劑製造完成後,可能因為儲存或運輸的條件不佳,導致抗體活性的下降造成試劑本身的穩定度不佳,甚至檢測結果失準。所以如何增加穩定度以及加速反應,是重要的研究方向。
單域結合蛋白(single domain binding protein)的研究起始於1980年代,針對特定的生物分子,包含DNA的結合蛋白、酵母菌poly A結合 蛋白等,其中最為突出的就是單域抗體(single domain antibody)。由於免疫學的進展,1975年首度有學者提出,以融合瘤技術製造只針對單一抗原反應的單一種抗體,稱之為單株抗體(monoclonal antibody)。在1980以後,單株抗體因為蛋白質新藥的發展而積極發展,再加上抗原結合位點(antigen-binding sites)概念被加入人源抗體IgG的Fc片段以後,顯著的降低了單株抗體分子的大小,也增加了單株抗體藥物的實用性。之後在生技界以及製藥界,無不想盡辦法找是否有更合適的分子,比單株抗體的更小更穩定的分子,並且能專一性結合在標的物上。1989年,Hamers-Casterman等偶然發現駱駝(單峰駝)血液中有半數的抗體是重鏈抗體(heavy-chain antibodies,HCAbs),它是一種缺失了輕鏈的重鏈二聚體抗體。1997年,Ghahroudi等利用噬菌體展示技術獲得駱駝重鏈可變區片段(variable domain of heevy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因庫,經多輪淘選後得到了只含有一個結構域的最小單元抗原結合蛋白片段,被稱為單域抗體(single-domain antibodies,sdAbs)。這種橢球形的小分子抗體的直徑僅2.5nm,長4nm,相對分子品質僅15kDa,因此發展此技術的公司Ablynx公司團隊將其命名為納米抗體(nanobodies,Nabs)。
單域抗體是抗體分子的最小抗原結合單元,僅由一個可變結構域或一個僅協助靶標結合的工程化的恒定結構域組成。此類抗體衍生物現今技術已知的,包括來源於駱駝科和鯊魚類動物中天然產生的可變區,以及工程化的人源抗體中重鏈或輕鏈的可變區或恒定區結構域。單域抗體為約110個胺基酸的肽鏈,包含了一般完整抗體中的一個重鏈可變域(VH)。它們對抗原的特異性程度與完整的抗體相似,但熱穩定性好,在 清潔劑和高濃度尿素環境下穩定。從駱駝和鯊魚的抗體中獲得的單域抗體脂溶性較差,而更易溶於水。在藥物學上來說,相對於完整抗體,單域抗體的分子質量更低,這使其更容易滲透到組織中。同時由於更容易通過腎臟清除,因此其藥代動力學半衰期也更短。此外由於它們沒有可結晶區,因此無法通過補體系統引發細胞毒性。所以在藥物學的研究和應用上,近20年來他的研究非常廣泛,也有數個已經初期開發完成進入臨床試驗的單域抗體藥物。
在檢測上,單域抗體的相關應用,雖然具有較佳的熱穩定性以及分子量小,但是一開始所受到的矚目就沒有如此之高。一方面由於傳統的免疫學檢測方式,高親和性的單株抗體應用,在傳統平臺上的表現已經非常穩定,困擾僅在於抗體本身熱穩定性問題。而一般抗體其較長的重鏈Fc部分可以提供酵素等分子進行鍵結,又可用於吸附於固態載體如膠體金、乳膠粒子上,甚至於在特定平台上還可以鍵結一些連接分子(linker)。所以在免疫檢測上的應用,雖然在某些特定的癌製篩檢應用於分子感測器上,或者是細胞染色上有較佳的表現以及相關研究,然而實質上並未有商品化的產品直接產出。
微量化的免疫檢測,現在發展主流以蛋白質生物晶片以及螢光微粒偵測為主。因為方法學上的不同,反應速率以螢光微粒偵測的反應快均質性高,偵測方法以瘤式細胞儀相同概念進行同時多顆粒螢光標記的判讀,佔有一定的速度優勢。在多標的檢測上,因為蛋白質晶片是同時在一個固態表面如玻璃或者是硝化纖維膜上,可以根據偵測標的項目的總數,進行較大規模的增加,只要在操作許可範圍以及偵測靈敏度許可範圍 下,蛋白質晶片在同時檢測項目上,佔有了絕對的優勢。但是兩個系統在熱穩定性、反應穩定性、反應速率上的研究,一直有各自的進展。
在蛋白質晶片的產品發展過程中,熱穩定度以及定量檢測的變異度一向是被詬病的問題。一則是因為生物晶片的發展,一開始起始於DNA晶片,在整個製造流程一直到臨床應用的操作上,DNA本身的生物分子特性,熱穩定度極佳。而被檢測的DNA標的,因為需要經過聚合酶連鎖反應(polymerase chain reation,PCR)放大近億倍,其放大之絕對誤差很大,所以除了同步監測的實時聚合酶連鎖反應(real time PCR),定量是沒有太大意義的。但是蛋白質是生理反應的直接角色,其本身在身體內的總量,常常與疾病本身發生一定的關聯性,定量的檢測意義較大。在生物晶片從DNA晶片,細胞晶片等等發展過程中,其定性意義大於定量意義。然則發展到蛋白質晶片時,定量就成了重要的課題,而反應穩定性是定量的基礎要求。
在蛋白質晶片的反應速率上,臨床檢體通常是以液態形式參與免疫檢測反應,這些檢體包括了血清、血漿、唾液、尿液等各式體液。在液態的反應系統內,如果反應用的抗體或抗原固定於固態表面,則抗體抗原本身的碰撞機率,決定了反應完成的速度。無論多株抗體或者是單株抗體,因為抗體本身的大小,在反應速率上會有一定的限制,如果使用較小的蛋白質或胜肽鏈來取代抗體,則有可能提高反應的速率,達成醫療檢測時對於反應速度的需求。在蛋白質晶片的應用上,一次檢測多標的物是最大的優勢,因而在臨床上如果有多種標的物必須同時進行篩選,就會是重要的應用方向,這些檢測包括過敏原檢測、自體免疫疾病、癌症相關多標的篩檢等。
在過敏原上檢測上的應用,蛋白質晶片與傳統常用的兩步驟酵素免疫分析法,基本原理相同。兩種方式都是將過敏原蛋白質固定於固態表面,之後將待測血清檢體進行適當濃度稀釋後,直接與固態表面的過敏原蛋白進行抗體抗原反應。反應完成後,與過敏原反應的免疫球蛋白E(IgE)會黏附於過敏原上,然後經過清洗沖掉待測物,再加入已經經過標示的單株抗體與IgE反應。最後再進行標示物的訊號測定,在蛋白質晶片上常見的標示物為螢光分子如Cy3,Cy5,Alexa等。其中最重要的訊號強弱與雜訊控制,在單株抗體與免疫球蛋白的適當濃度、反應完成度以及反應時間。在商業上也曾經除了使用單株抗體來針對IgE做反應追蹤之外,也曾經有Heska公司在專利US00US5945294中敘述,以IgE在人類細胞上的反應受器(Fc receptor),但是其專利申請範圍僅應用於寵物動物的IgE檢測,並且只應用於傳統的酵素免疫檢測法,並且僅應用於該公司的收檢檢測上,應該是受限於Fc receptor的本身性質,沒有辦法提升太多的檢測靈敏度。因為在寵物的血清中,特異性針對過敏原有反應的IgE濃度,通常是人類的5~10倍,需要的靈敏度就不需要太高。若是採用跟單株抗體較為類似的單域抗體,其可行性顯然會較為提升。
國際上針對抗IgE的單域抗體,已經多有研究。國際專利PCT申請案WO2004041865描述了針對IgE的具體的單域抗體蛋白構建體,其包含至少一個針對IgE的VH或人源化的VH和至少一個針對血清蛋白如(人)血清白蛋白的單域抗體,由於存在結合血清白蛋白的單域抗體,與相對應的單獨的針對IgE的VHH's相比,所述蛋白構建體具有增加的體內半衰期。其中SEQ ID NO's:22-24給出了此類雙特異性:抗-IgE以及抗-血清白蛋 白構建體的實例。國際專利PCT申請案WO2004041867描述了針對IgE的VHH's(例如,參見WO2004041867的SEQ ID NO’s:1-11)。進一步提及這些VHH's可以被人源化,並且可以適當地與一種或多種針對血清蛋白如血清白蛋白的VHM's連接,從而提供具有增加的半衰期以及與VHH's和單域抗體相關的有利特性的蛋白構建體。這些單域抗體在商業上,又被稱為納米抗體(Nanobody)和納米抗體(Nanobodies),是埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的所註冊的商標。以上這些的研究,重點都偏重於抗IgE單域抗體,在體內的存在時間(延遲代謝速率),以及人源化以後的蛋白質藥物應用層面。很明確應用於IgE檢測的目的上,並沒有深入去研究和開發。
有鑑於此,當知在現有技術當中,是否能解決目前單株抗體或多株抗體的在微量免疫檢測上的缺點,即是本發明所欲解決之問題之所在。本發明以檢測過敏原用的蛋白質晶片檢測方法為實例,提出一種單域結合蛋白的設計以及應用於蛋白質晶片相關微量免疫檢測的模式,得以使蛋白質晶片檢測法的反應穩定度、反應速率及熱穩定度上升。
本發明之主要目的,係在於提供一類單域結合蛋白的應用方法,取代蛋白質晶片傳統使用的多株抗體或單株抗體,提升其性能穩定度、反應速率及熱穩定度。
為達上述之目的,本發明在此揭示數種單域結合蛋白,E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2,它們的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1-6所示,或SEQ ID NO:1-6所示序列的C端連6個His標籤形 成的序列。此類蛋白一般統稱為單域抗體。在蛋白質晶片應用於臨床時,通常使用多株抗體或者是單株抗體,抗體上面標示特定螢光物質或酶,用於追蹤反應結果。當其針對的標的物留存於蛋白質晶片上時,抗體會與標的物結合。當操作者以特定光學儀器讀取訊號時,標示於抗體上面的螢光物質會產生訊號,或者酶與加入呈色的反應底物(substrate)產生冷光訊號,操作者讀取訊號強度得以瞭解抗體反應的強度,進而知悉偵測標的物的多寡,是一種定量偵測反應。其中抗體的親和性強弱、抗體本身是否可以到達標的物的結合位置、以及反應系統的均質性,都會影響最終的訊號結果。本發明中以單域抗體,取代多株抗體及單株抗體的角色,擔任反應結果追蹤的抗體。
在本發明中,揭示了數個應用於蛋白質晶片的單域抗體胺基酸序列、其設計和生產方式以及螢光物質的標示方法。這些單域抗體與蛋白質晶片組成的試劑套組,和原始由單株抗體和蛋白質晶片組成的套組進行比較,可以發現在性能穩定度、熱穩定度以及反應速率上,都有顯著的提升。
在本發明中所提之蛋白質晶片,可應用於臨床醫學檢測或者是動物檢測,針對多品項的過敏原檢測。檢測的對象檢體是血清、血漿或者是全血,其中的針對過敏原有特異性反應的IgE(specific IgE,sIgE)是主要的偵測對象。將檢體與蛋白質晶片上的過敏原反應後,sIgE會黏附於各過敏原蛋白上,再以本發明所提的其中一個或數個單域抗體與黏附在晶片過敏原上的sIgE進行反應後,即可以雷射掃描儀讀取單域抗體上標示的螢光強度。螢光可以反映出受檢檢體內,是否有針對特定過敏原有反應的sIgE,並 且螢光強度可以推測出受檢人sIgE的多寡,間接了解受檢者過敏的嚴重程度,是一種臨床醫學上的定量檢測。
第1圖係為本發明中單域結合蛋白性能測試,酶聯反應法之圖。
第2圖係為本發明中單域結合蛋白性能測試,生物晶片法之圖。
第3圖係為本發明中單域結合蛋白熱穩定度測試之圖。
第4圖係為本發明中單域結合蛋白反應穩定度測試之圖。
本發明之單域抗體係一種特定序列的蛋白質,此類蛋白質可以針對特定抗原標的物進行反應,此反應可以取代現有常用的單株抗體或多株抗體,在臨床或動物檢驗加以應用。在本發明的實施例中,此類蛋白質經過資料庫搜尋、克隆方式設計、最後利用大腸桿菌大量表現出蛋白質,經過純化後,進行螢光物質的標記,最後可應用於檢測中。
【實施例】
實施例1. 抗人類IgE單域結合蛋白的設計與克隆
開始設計前,在美國國家衛生研究院的生物資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、生物資訊資源入口網(https://www.expasy.org/)以及美國專利資料庫上,搜尋針對人類IgE的單株抗體及單域抗體,進行序列的分析。這些序列基本上具有七段相連的序列,依照性質為骨架區 (framework region,FR)以及互補決定區(Complementarity-determining region,CDR),依照排列分別為蛋白質氮端(N)-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,以這些序列為範本,依照胺基酸本身特性,設計不同的氨基酸序列進行後續的和成動作。除了要跟標的物人類IgE可以有反應之外,因為後續使用的需求,還必須注意幾個設計重點:(1)整段蛋白質中,為了後續螢光物質的標記,必須留下較多的離胺酸(Lysine,K)於骨架區(framework region,FR)中,或在蛋白質鏈碳端(C terminal)加上少數離胺酸(Lysine,K),以提高後續螢光物的標示效能。(2)在整段蛋白質中,為了避免螢光標物質影響互補決定區(Complementarity-determining region,CDR)的效能,所以盡量在設計時在互補決定區不選擇離胺酸(Lysine,K)於序列中。(3)由於未來須使用於檢驗使用,能夠進行量產應用,設計中必須加入提供純化的特定序列如His tag,GST tag。(4)考量多數資料庫中三級結構模擬完成時,發現蛋白質氮端(N terminal)如果添加的過長的序列,會嚴重影響前段蛋白質的三級結構型態,所以序列在骨架序列1(FR1)之前不要設計過多胺基酸。
設計完成後,將胺基酸序列逆向翻譯為DNA序列,並且委託進行商業化DNA序列和成。合成完之DNA,使用pET22 plasmid為載體(pET22,為Merck Millipore公司Novagen系列商標產品),送入大腸桿菌E.coli Rosetta gami B(Merck Millipore公司Novagen系列商標產品)進行表現。利用IPTG誘導表現出來的蛋白質皆直接可溶,可利用超音波震盪法漿菌體打破,再利用His tag管柱進行純化。經過純化後的蛋白即我方所需之單域結合蛋白,其特性與資料庫所可以找到的單域抗體表現出來相似。本發明中經過測試的單域蛋白E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或 E05A2,其序列如序列表之表一。
實施例2. 單域結合蛋白的標記
純化完成的每一個單域結合蛋白,利用Vivaspin 6離心濃縮管,在4℃下以1000g的離心機加以離心,濃縮至大於1mg/ml之濃度。濃縮後的各單域結合蛋白,依照試驗類型,可以不同種標示物加以標記。
2.1 單域結合蛋白的酵素標記
使用商用的酵素標記套組,即可進行單域結合蛋白的酵素標記,本發明中單域結合蛋白的基礎效能測試,以辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase,HRP)進行酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進行活性測試。發明中以Lighting-Link HRP套組(Innova Biosciences公司產品),進行單域結合蛋白的酵素標記。將1mg/ml濃度,以純化的單域結合蛋白,以分子數量1:1,1:2,1:4之不同比例,加入酵素套組中。反應三小時後,加入50%甘油保存備用。
2.2 單域結合蛋白的螢光物標記
純化完成的每一個單域結合蛋白,利用Vivaspin 6離心濃縮管,在4℃下以1000g的離心機加以離心,濃縮至大於1mg/ml之濃度。以Cy3 mono-reactive Dye Pack(此為GE,Amersham Biosciences的產品)或類似的螢光標記套組加以標記。依照標記套組的說明標示階段完成後,可利用PD-10管柱(此為GE,Amersham Biosciences的產品)進行中產物的純化分離。
實施例3. 單域結合蛋白性能測試
經過純化並且標記過的單域結合蛋白,可以應用酶聯免疫法 或者是生物晶片法來進行實際的效能測試。測試的比對可以用既有的商業化單株抗體,同樣經過酵素或者螢光物的標記,作為對照組之用。本實施例以單域結合蛋白E03B1為例進行下列測試。
3.1 酶聯免疫法的進行
將人類IgE,IgA,IgM,IgG,IgD標準品以1.0ug/ml的濃度,以碳酸緩衝液(carbonate buffer,pH9.5)包被於酶聯免疫法ELISA平板中,再經過含1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffer saline,PBS)封閉。
將不同濃度的標記完成之單域結合蛋白-HRP產物,與對照用之單株抗體(此為Biocheck公司,Anti human IgE mAb #70188),分別稀釋1000,4000,16000,64000,256000倍,加入ELISA平板進行反應。從ELISA反應結果(參見圖1)可以發現,設計完成的單域結合蛋白與人類IgE有較強的反應,與對照組的單株抗體類似。對於IgA,IgM,IgG,IgD反應極弱,表示出針對IgE設計的單域結合蛋白可以應用於專一性的IgE檢測。但是從結果亦發現,在ELISA形式的反應中,經過標記的單域結合蛋白與單株抗體相比,顯然可能因為單域蛋白的分子較小(約12KD),其可能與酵素反應標記的胺基酸位置可能會影響到免疫反應的結合位置,故整體評估其訊號小於單株抗體。明顯的在ELISA反應系統,單域結合蛋白不特別佔有優勢。
3.2 蛋白質生物晶片法的進行
將人類IgE,標準品以2.5,5,10ug/ml(低[L]、中[M]、高[H])的濃度,IgA,IgM,IgG,IgD標準品以10ug/ml,以磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffer saline,PBS)稀釋,點在NEXTERION® Slide Glass B (Schott公司的系列產品)的玻片上。每個標準品點製三重複,每個點的大小約為350um。點製完完成後,以1%酪蛋白磷酸緩衝液(casein phosphate buffer,pH7.5)封閉。
將不同濃度的標記完成之單域結合蛋白-Cy3產物,與對照用之單株抗體,分別稀釋400,1000,2000,4000倍,加入準備完成的晶片表面進行反應。從蛋白質晶片的反應結果(參見圖2)可以發現,設計完成的單域結合蛋白與人類IgE有較強的反應,與對照組的單株抗體類似,對於IgA,IgM,IgG,IgD反應極弱,表示在蛋白質晶片上單域結合蛋白亦可達成檢測之目的。以信號定量分級結果加以判定,mAb*Cy3 2000倍稀釋的IgE高、中、低三個濃度反應比例線性為最佳,但最高信號強度僅為1625。SBP*Cy3按1000倍稀釋線性最佳,最高信號強度達2571。從結果可以發現,以Cy3標記之單域結合蛋白,其反應結果明顯優於在ELISA形式的免疫檢測反應結果。
從原理上來解釋,Cy3分子雖然跟HRP酵素與單域結合蛋白的反應胺基酸相同(都是離胺酸Lysine,K),但是由於HRP的分子量遠大於單域結合蛋白,而Cy3分子卻遠小於單域結合蛋白,因此造成了截然不同的效果。在蛋白質生物晶片的應用上,尤其是以玻片為基底的蛋白質生物晶片,使用的標記物都是高螢光效率的小分子標記物。單域結合蛋白在這種方法學上,顯然有較大的優勢。
實施例4. 單域結合蛋白熱穩定度測試
本實施例以單域結合蛋白E03B1為例,進行熱穩定度測試。將實施例3中的單域結合蛋白-Cy3標記產物,放置於攝氏37度、45度的條件下,進行熱穩定度測試。於7,14,28,56天進行蛋白質生物晶片的再測試。 對照組採用單株抗體-Cy3標記產物,以同為1000倍稀釋濃度,同條件下進行所有相關測試。在實驗結果(參見圖3)可以發現,明顯的單域結合蛋白標記物的訊號大於單株抗體標記物,且與前述實施例3的差異性不大,此處可證明單域結合蛋白應用於微量免疫檢測套組時,熱穩定性會優於傳統使用的抗體。
依照學理上,單域抗體多數熱穩定度優於一般的單株抗體或者多株抗體,在本發明中設計數個結構類似於單域抗體的單域結合蛋白,經過標記後,其性質還是傾向於單域抗體,可以有較佳的熱穩定性。對於臨床上使用的蛋白質晶片試劑套組,此試驗結果可以優化現有的試劑套組性能,並且避免在運輸或儲存的條件不佳時,所造成的性能變化,進而避免試劑套組性能偏差所造成的檢測結果失準,影響後續醫療判定。
實施例5. 單域結合蛋白性能穩定度測試
本實施例以單域結合蛋白E03B1為例,進行熱穩定度測試。將人類IgE,標準品以2.5,5,10ug/ml(低[L]、中[M]、高[H])的濃度,以磷酸緩衝生理鹽水(Phosphate buffer saline,PBS)稀釋,點在NEXTERION® Slide Glass B(Schott公司的系列產品)的玻片上。每個標準品點製三重複,每個點的大小約為350um。每一個濃度(L,M,H)重複點製20組,每一個單一反應中包含60*3個點。點製完完成後,以1%酪蛋白磷酸緩衝液(casein phosphate buffer,pH7.5)封閉。將實施例3中的單域結合蛋白-Cy3,以單株抗體-Cy3為對照組,皆已1000倍稀釋倍率,進行生物晶片的反應。反應完成後讀取訊號,計算每一組(L,M,H)的反應變異係數(CV%)。此試驗採用兩位不同實驗室人員進行試驗操作,兩位操作者的統計分析分開計算。
從試驗結果得知(參見圖4),在單於結合蛋白-Cy3的反應結果,優於使用單株抗體-Cy3。由於蛋白質晶片易受操作者操作手法、反應時間長短、反應溫度、反應震盪速率、背景值等外在因素干擾,所以在臨床上要發展一個性能合適的試劑套組常常會遇到變異係數(CV%)過大的問題。在試劑套組的開發者,必須在試劑開發前期,就已經評估到降低使用者外在因素干擾。單域結合蛋白在這個方面顯然是一個好的選擇。
雖然,本發明前述之實施方式及實施例揭露如上,然其並非用以限訂本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內所為之更動與潤飾,均屬於本發明專利範圍之主張。關於本發明所界定之專利範圍請參考所附之請求項。
Claims (5)
- 一種單域結合蛋白,可用於微量免疫檢測中的特異性過敏原IgE的檢測,其特徵在於:所述單域結合蛋白選自E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2,它們的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1-6所示,或SEQ ID NO:1-6所示序列C端去掉6個His胺基酸標籤形成的序列。
- 如請求項1所述之單域結合蛋白,其可單獨或組合應用於過敏原特異性IgE之檢測方式、檢驗試劑、試劑套組或者是蛋白質晶片。
- 如請求項2所述之單域結合蛋白,其中所述之檢測方式、檢驗試劑、試劑套組或者是蛋白質晶片,其特徵在於該單域結合蛋白經過酵素或螢光物質之標記。
- 請求項1所述之單域結合蛋白,其可單獨或組合使用於以下任一應用:1)特異性過敏原IgE的蛋白質晶片檢測中的應用;2)製備特異性過敏原IgE檢測試劑中的應用;3)特異性過敏原IgE ELISA免疫分析檢測中的應用;4)製備特異性過敏原IgE的側向流檢測試紙條中的應用。
- 如請求項4所述之單域結合蛋白,其特徵在於,所述蛋白質晶片檢測是指基於蛋白質晶片的微量免疫檢測。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW107112160A TW201943730A (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW107112160A TW201943730A (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201943730A true TW201943730A (zh) | 2019-11-16 |
Family
ID=69184525
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW107112160A TW201943730A (zh) | 2018-04-09 | 2018-04-09 | 應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TW201943730A (zh) |
-
2018
- 2018-04-09 TW TW107112160A patent/TW201943730A/zh unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20180238902A1 (en) | Methods for using antibodies and analogs thereof | |
JP2000505543A (ja) | 検定試薬および対照試薬として使用される試薬 | |
US10126312B2 (en) | Diagnostic method for urinary tract infection | |
US20110229908A1 (en) | Methods and products for measuring free immunoglobulin light chain molecules | |
CN108409841B (zh) | 用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用 | |
US20170370930A1 (en) | Detector and related, devices, methods and systems | |
Miller et al. | Beyond epitope binning: directed in vitro selection of complementary pairs of binding proteins | |
Ch’ng et al. | Phage display-derived antibodies: Application of recombinant antibodies for diagnostics | |
AU2013344322A1 (en) | Diagnostic, prognostic, therapeutic and screening protocols | |
WO2022110257A1 (zh) | 一种抗过敏性纳米抗体组合物、抗体测定方法及喷雾剂 | |
CN113045646B (zh) | 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体 | |
CN117110602A (zh) | 检测神经丝蛋白轻链的试剂盒与方法 | |
CN108535493B (zh) | 特异性过敏原IgE的检测方法 | |
WO2020134374A1 (zh) | 抗恶性疟原虫hrp-ii抗体 | |
TW201943730A (zh) | 應用於微量免疫反應檢測之單域結合蛋白及其應用方法 | |
SG183164A1 (en) | Allergen microarray | |
US20050048545A1 (en) | Universal detection of binding | |
CN113156134B (zh) | 用于检测人白介素23的elisa试剂盒及检测方法 | |
TW201943727A (zh) | 單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原IgE的檢測方法 | |
Dzantiev et al. | Antibody-based biosensors | |
CN117285624B (zh) | 抗犬NT-proBNP双特异性抗体及试剂盒 | |
Kaur et al. | Pull Down Assay-Based Protein Analysis | |
JP7416485B2 (ja) | スイッチング結合剤、その製造方法、及びそれを用いた薬学組成物、検査キット及び抗原と抗体との分析方法 | |
WO2022195797A1 (ja) | 末端シアル酸残基がα2,6結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα2,6結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法 | |
CN116514981B (zh) | 一种新的抗人il-23单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测方法 |