WO2022195797A1 - 末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法 - Google Patents

末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法 Download PDF

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力 大山
徹 米山
和幸 濱田
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国立大学法人弘前大学
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    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to a sugar chain having a terminal sialic acid residue linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond, and a sugar chain having a terminal sialic acid residue linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond. Regarding the measurement method.
  • the sugar chain of PSA (Prostate Specific Antigen), which is known as a marker for prostate cancer, is a two-chain N-type sugar chain in which sialic acid at the end is linked to galactose with an ⁇ 2,6 bond, and a sialic acid at the end It is known that there are N-type sugar chains that are linked to galactose via ⁇ 2,3 bonds, and that the number of sugar chains that are linked to galactose via ⁇ 2,3 bonds increases with carcinogenesis. (Non-Patent Document 1).
  • Sambucus nigra lectin is known as a probe capable of detecting sugar chains with terminal sialic acid residues bound to galactose via ⁇ 2,6 bonds, and is used as a probe for detecting sugar chains containing sialic acid.
  • Patent Document 1 In addition, using a glycolipid having a sugar chain with a terminal sialic acid residue linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond as an immunogen, a mouse monoclonal that recognizes a sugar chain with a terminal sialic acid residue linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond was used. An antibody has been reported (Patent Document 2).
  • Sambucus nigra lectin is a plant-derived natural product that serves as a raw material, and its binding property varies depending on product lots. Recombinant lectins are being developed, but have yet to be put to practical use. In addition, detection of cancerous transformation of PSA requires antibodies with higher sensitivity that recognize sugar chains in which terminal sialic acid residues are linked to galactose via ⁇ 2,6 linkages.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having a high binding property to a sugar chain in which a terminal sialic acid residue is linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond, and a monoclonal antibody having a terminal sialic acid residue.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring a sugar chain in which an acid residue is linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond.
  • the present inventors immunized a rabbit with Sia ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4GlcNAc-BSA as an immunogen, isolated the resulting positive rabbit B cells, obtained antibody genes by single-cell PCR, and transferred the antibody genes to the host.
  • the inventors have found that a monoclonal antibody obtained by introduction into cells binds with high affinity to sugar chains whose terminal sialic acid residues are bound to galactose via ⁇ 2,6 linkages, thereby completing the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the binding property to a sugar chain in which a terminal sialic acid residue is linked to galactose via an ⁇ 2,6 bond is 20% higher than that to a sugar chain in which a terminal sialic acid residue is linked to galactose via an ⁇ 2,3 bond.
  • the amino acid sequence of complementarity determining region (hereinafter also referred to as CDR) 1 of the heavy chain variable region (hereinafter also referred to as VH) of the antibody or antibody fragment thereof is represented by SEQ ID NO: 1.
  • VH CDR2 amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • VH CDR3 amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the light chain variable region The amino acid sequence of CDR1 of VL includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • the monoclonal antibody or antibody fragment thereof according to any one of [1] to [3], wherein the sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6.
  • VH amino acid sequence of the antibody or antibody fragment thereof comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • VL amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A monoclonal antibody or antibody fragment thereof as described.
  • the VH CDR1 amino acid sequence of the antibody or antibody fragment thereof comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and the VH CDR2 amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • the amino acid sequence of CDR1 of VL comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the amino acid sequence of CDR2 of VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • the monoclonal antibody according to any one of [1] to [3], which comprises the amino acid sequence represented by 11, and the amino acid sequence of VL CDR3 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, or the antibody thereof piece.
  • VH amino acid sequence of the antibody or antibody fragment thereof comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • VL amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16
  • a monoclonal antibody having a high binding property to a sugar chain in which a terminal sialic acid residue is bound to galactose via an ⁇ 2,6 bond (hereinafter also referred to as an ⁇ 2,6 sugar chain), and an ⁇ 2,6 sugar chain can provide a method for measuring
  • Example 2 shows the results of a sensorgram of 8A2 antibody against a biosensor on which ⁇ 2,6 sugar chains are immobilized in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of a sensorgram of 8A2 antibody against a biosensor on which ⁇ 2,3 sugar chains are immobilized in Example 2.
  • FIG. 2 shows sensorgram results of the 8A2 antibody against a biosensor on which a sugar chain bound with galactose with no sialic acid bound at its end (hereinafter also referred to as a galactose-bound sugar chain) was immobilized in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of a sensorgram of 8B9 antibody against a biosensor on which ⁇ 2,6 sugar chains are immobilized in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of a sensorgram of 8B9 antibody against a biosensor on which ⁇ 2,3 sugar chains are immobilized in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of a sensorgram of 8B9 antibody against a biosensor on which galactose-linked sugar chains are immobilized in Example 2.
  • antibody refers to a full-length immunoglobulin molecule, either naturally occurring or produced by genetic recombination techniques
  • antibody fragment refers to an antigen-binding fragment of such an immunoglobulin molecule.
  • Antibody fragments include F(ab') 2 , F(ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv, variants thereof, fusion proteins or fusion peptides containing antibody portions, and ⁇ 2,3 carbohydrate chains. Modified structures other than immunoglobulin molecules, including moieties, can be included.
  • the term “antibody specifically binds” means that the terminal sialic acid residue does not substantially bind to other sugar chains different from the sugar chain bound to galactose via an ⁇ 2,6 bond. It means binding to ⁇ 2,6 sugar chains.
  • ⁇ 2,6 sugar chain is also referred to as "Sia ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4GlcNAc”.
  • the term "monoclonal antibody” means an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, wherein the individual antibodies contained in the population are naturally occurring random antibodies that may exist in some number. Identical except for the variants.
  • a monoclonal antibody is an antibody that displays one binding specificity and affinity for a particular epitope on an antigen.
  • the modifier "monoclonal” indicates the properties of antibodies obtained from a substantially homogeneous antibody population and is not to be interpreted restrictively as requiring production of the antibody by a particular method.
  • the "heavy chain” of an antibody refers to the larger of the two types of polypeptide chains present in all antibody molecules in their naturally occurring conformation.
  • an antibody “light chain” refers to the smaller of the two types of polypeptide chains present in all antibody molecules in their naturally occurring conformation.
  • the complementarity determining region is composed of a heavy chain complementarity determining region and a light chain complementarity determining region.
  • the heavy and light chain variable regions each consist of three CDRs and four framework regions (FR) joined by the CDRs.
  • the CDRs on each chain are held in close proximity by the FRs and, together with the CDRs on the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody.
  • Techniques for determining CDRs include, but are not limited to, (1) approaches based on interspecies sequence variability (e.g., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD); and (2) approaches based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273, 927-948, 1997). can be done. These approaches and other approaches may be used in combination.
  • approaches based on interspecies sequence variability e.g., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD
  • approaches based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273, 927-948, 1997.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention is a monoclonal antibody or antibody fragment thereof that specifically binds to ⁇ 2,6 sugar chains and does not bind to sugar chains with galactose bound to which sialic acid is not bound at the terminal.
  • the monoclonal antibody of the present invention is also referred to as an anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody.
  • the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody of the present invention may be a human antibody or a non-human animal antibody.
  • non-human animals include mice, rats, hamsters, rabbits, goats, sheep, chickens, etc.
  • Rabbit monoclonal antibodies are preferred because of their high antigen-binding properties.
  • the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention is a monoclonal antibody or antibody fragment thereof that does not bind to galactose-linked sugar chains.
  • the binding property of the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention to the ⁇ 2,6 sugar chain is preferably higher than the binding property to the ⁇ 2,3 sugar chain.
  • Chain binding is 20 times or more, preferably 30 times or more, more preferably 40 times or more, still more preferably 50 times or more, particularly preferably 80 times or more, than ⁇ 2,3 sugar chain binding .
  • the binding property of the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention to antigens such as ⁇ 2,6 sugar chains can be expressed by the dissociation constant (KD value).
  • KD value dissociation constant
  • the KD value for the ⁇ 2,6 sugar chain of the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention is preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 or less, more preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less. is more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, particularly preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, for example, 8.5 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 8.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 7.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 6.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 4.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 3.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less, 2.0 ⁇ 10 ⁇ 9 or less , 9.0 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 8.0 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 7.0 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 6.0 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 4.0 ⁇ 10 ⁇ 10 or less, 3.0 ⁇ It may be 10 ⁇ 10 or less.
  • the above KD value can be calculated, for example, using a biosensor on which sugar chains serving as antigens are immobilized. Specifically, a sugar chain serving as an antigen is immobilized on a biosensor, and the biosensor is immersed in an antibody solution to allow the antibody to bind to the antigen immobilized on the biosensor. Then, it is immersed in a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS), and the number of antibodies bound to the biosensor or the change in the wavelength shift ⁇ caused by the change in the number of antibodies dissociated from the biosensor is measured.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the KD value can be calculated from the sensorgram when the concentration of is changed.
  • the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention can be produced using known methods. Specifically, first, a non-human animal is immunized with a conjugate of an ⁇ 2,6 sugar chain and a carrier protein as an immunogen, and the lymphocytes of the immunized non-human animal are confirmed to bind to the antigen by ELISA. Then, lymphocytes with high binding to ⁇ 2,6 sugar chains are selected.
  • Non-human animals to be immunized include mice, rats, hamsters, rabbits, goats, sheep, chickens and the like.
  • antibody genes are obtained from the selected lymphocytes by the single cell PCR method and amplified by the PCR method.
  • ELISA is used to confirm the antigen-binding properties of the PCR amplification products.
  • a PCR amplification product that has a high binding property to ⁇ 2,6 sugar chains is transfected into cells such as Human Embryonic Kidney cells 293, and the culture supernatant containing secretory antibodies is collected, and the collected sample is is confirmed by ELISA for binding to the antigen, and clones with high binding to the ⁇ 2,6 sugar chain are obtained.
  • Antibody genes are obtained from the obtained clones and inserted into a vector to obtain antibody-producing cells.
  • the obtained antibody-producing cells are cultured to produce and accumulate the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention, and the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention is isolated from the culture. can be manufactured.
  • the amino acid sequence of CDR1 of VH comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of CDR2 of VH is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of CDR3 of VH comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of CDR1 of VL comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • Anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody 8A2 hereinafter referred to as 8A2 antibody
  • 8A2 antibody an antibody fragment thereof.
  • the antibody 8A2 comprises a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the amino acid sequence of CDR1 of VH comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the amino acid sequence of CDR2 of VH comprises SEQ ID NO: 8
  • the VH CDR3 amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • the VL CDR1 amino acid sequence comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody 8B9 8B9 antibody hereinafter or an antibody fragment thereof.
  • the antibody 8B9 comprises a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • Table 1 shows the amino acid sequences represented by SEQ ID Nos: 1 to 12 above.
  • Table 2 shows the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 13 to 16 above.
  • the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention containing these VH CDR1 to CDR3 and VL CDR1 to CDR3 can be produced using known genetic recombination techniques. Specifically, the genes encoding VH CDR1 to CDR3 and VL CDR1 to CDR3, respectively, are incorporated into a vector containing genes encoding the FR of the antibody and the constant region of the antibody, respectively, and introduced into host cells. Cells expressing the antibody can be obtained by transforming the antibody, and the cells can be produced by culturing the cells. Cells, vector types, cell types, culture conditions, and the like used for this preparation are within the technical scope of those skilled in the art, and appropriate conditions can be set as appropriate.
  • Antibody fragments are also included in the monoclonal antibodies or antibody fragments thereof of the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and/or added is one or more, and the number is not particularly limited. Current Protocols molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)].
  • the number is preferably 1 to several tens, more preferably 1 to 20, still more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.
  • the method for measuring ⁇ 2,6 sugar chains of the present invention is a method for measuring ⁇ 2,6 sugar chains using the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention.
  • a method for measuring ⁇ 2,6 sugar chains using the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention ⁇ 2,6 sugar chains in a sample and the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody of the present invention are used.
  • a labeled antibody or labeled antibody fragment in which a label is bound to the anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof is added, and the ⁇ 2,6 sugar chain, the anti- ⁇ 2 ,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof, and the labeled antibody or the labeled antibody fragment immune complex is generated, and the amount of label in the generated immune complex is measured ⁇ 2,6 in the sample
  • An immunological measurement method for sugar chains and the like are included.
  • the specimen may be blood such as serum, plasma or whole blood of animals including humans, lymph, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, and body cavities. fluids, digestive fluids, nasal mucus, tears, sweat, urine, and the like.
  • the sample may be a sample itself collected from a subject, or may be a sample obtained by subjecting the collected sample to processing such as dilution and concentration that are normally performed.
  • the sample may be one collected or prepared during the execution of the measurement method, or one previously collected or prepared and stored.
  • the immunological measurement method includes enzyme immunoassay (EIA or ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA), depending on the labeling of the labeled detection antibody. ), electrochemiluminescence immunoassay, and the like, and any of these can be used in the measurement method of the present invention, but ELISA is preferable because it allows simple and rapid measurement of the target to be detected.
  • the ⁇ 2,6 sugar chain in the specimen can be measured by measuring the label in the immune complex.
  • an ⁇ 2,6 sugar chain in a specimen can be measured by reacting an enzyme as a label with a substrate of the enzyme and measuring the absorbance of the colored product (sandwich method). .
  • the unlabeled anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention immobilized on a solid support with the ⁇ 2,6 sugar chain in the sample
  • the unlabeled anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or adding the antibody fragment (primary antibody)
  • measuring the label of the secondary antibody It is also possible to measure the ⁇ 2,6 sugar chain in the specimen.
  • the secondary antibody is labeled with biotin, bound with enzyme-labeled avidin or streptavidin to biotin, the secondary antibody is labeled with an enzyme or the like, and the label of the secondary antibody is measured.
  • ⁇ 2,6 sugar chains in a sample can also be measured.
  • an unlabeled anti- ⁇ 2,6 sugar chain monoclonal antibody or antibody fragment thereof may be applied to the ⁇ 2,6 sugar chain immobilized on a solid support or to a conjugate of the ⁇ 2,6 sugar chain and a protein such as BSA. is added to the solid support to generate an immune complex consisting of ⁇ 2,6 sugar chain and primary antibody, then a sample is added, and an antibody (secondary antibody) against this unlabeled antibody is labeled.
  • the ⁇ 2,6 sugar chain in the sample can also be measured by adding a secondary antibody that has been modified and measuring the labeling of the standardized secondary antibody (competitive method).
  • the solid support is not particularly limited as long as it can stably hold the antibody or antibody fragment.
  • Preferred materials for the solid support include polymeric materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, and polyethylene terephthalate. , glass, ceramics, magnetic particles and metals.
  • Preferable shapes of the solid support include tubes, beads, plates, fine particles such as latex, and sticks.
  • the label examples include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase in ELISA, radioactive substances such as 125 I, 131 I, 35 S and 3 H in RIA, fluorescein isothiocyanate, rhodamine and dansyl chloride in FPIA, Fluorescent substances such as phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, and near-infrared fluorescent materials, in the CLIA method, enzymes such as luciferase and ⁇ -galactosidase and luminescent substrates that change into luminescent substances with each enzyme, and luciferin, aequorin, etc. Luminescent substances can be used. In addition, nanoparticles such as gold colloids and quantum dots can also be used as labels.
  • ELISA when the enzyme is peroxidase, 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), O-phenylenediamine (OPD), etc. are used as the labeling enzyme substrate.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • OPD O-phenylenediamine
  • pNPP p-nitropheny phosphate
  • Example 1 Using Sia ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4GlcNAc-BSA as an immunogen, rabbits (slc: JW/CSK, 13 weeks old) were immunized, and the obtained rabbit B cells were isolated from cells (single cells) that bind to Sia ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4GlcNAc. Twenty-seven positive clones were selected by testing by ELISA method. Antibody genes were obtained from the selected positive clones by single-cell PCR. Human Embryonic Kidney Cells 293 cells were transfected with the obtained antibody gene sequences, and the recombinant rabbit antibodies secreted into the culture supernatant were examined for ⁇ 2,6 sugar chains and ⁇ 2,3 sugar chains.
  • Example 2 After washing with PBST three times, the culture supernatant of each clone obtained in Example 1 was diluted 2-fold, 50 ⁇ l was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour. After washing with PBST three times, 50 ⁇ l of anti-Rabbit IgG HRP ( ⁇ 10000; ab97080, manufactured by abcam) was added and shaken at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBST, 100 ⁇ l/well of TMB substrate solution (composition: 3.3′,5.5′-tetramethylbenzidine, catalog number: N301, manufactured by ThermoFisher Scientific) was added and incubated for 5 minutes. Next, 100 ⁇ l/well of 0.1N HCl was added, and absorbance at 450 nm was measured.
  • TMB substrate solution composition: 3.3′,5.5′-tetramethylbenzidine, catalog number: N301, manufactured by ThermoFisher Scientific
  • Example 2 Among the monoclonal antibodies obtained in Example 1, the KD values of 8A2 antibody and 8B9 antibody were calculated as follows.
  • Amino reactive biosensor (AR2G; manufactured by FORTEBIO) was hydrophilized with ultrapure water, and 20 ⁇ g/mL BSA-MBS-sialic acid ⁇ (2,3) ⁇ 1,4GlcNAc antigen solution or BSA-MBS-sialic acid ⁇ (2,6) ⁇ 1,4GlcNAc antigen solution was immersed for 10 minutes to immobilize each antigen on the sensor.
  • AR2G Amino reactive biosensor
  • the sensor is immersed in an EDC-/sNHS solution (composition: a 1:1 mixture of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (manufactured by FORTEBIO) and sulfo-N-hydroxysuccinimide (manufactured by FORTEBIO)), blocked.
  • EDC-/sNHS solution composition: a 1:1 mixture of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (manufactured by FORTEBIO) and sulfo-N-hydroxysuccinimide (manufactured by FORTEBIO)
  • the BSA-MBS- ⁇ 1,4GlcNAc antigen-immobilized sensor was treated with a sialidase solution (composition: 3 ⁇ L ⁇ (2 ⁇ 3,6,8,9) Neuraminidase from Arthrobacter ureafaciens (N3786-1SET, manufactured by Sigma) + 47 ⁇
  • the biosensor was immersed in each antibody solution of 3.75 to 60 nM at 30° C. for 300 seconds to measure the binding state of the antibody to the antigen. After that, it was immersed in PBS for 300 seconds, and the state of dissociation of the antibody from the antigen was measured.
  • a change in wavelength shift ⁇ caused by a change in the number of antibodies bound to the biosensor or dissociated from the biosensor was measured in real time to generate a reaction profile on the Octet system (manufactured by FORTEBIO).
  • the KD value was calculated from the sensorgrams of binding and dissociation obtained in antibody solutions with concentrations ranging from 3.75 nM to 60 nM. Table 3 shows the calculated KD values. The results of the above sensorgrams for the 8A2 antibody and 8B9 antibody are shown in FIGS. 2A to 2C and 3A to 3C, respectively.
  • the KD value for the ⁇ 2,6 sugar chain of the 8B9 antibody is 8.5 ⁇ 10 -9 ⁇ 2.7 ⁇ 10 -24 , whereas ⁇ 2
  • the KD value for the ,3 sugar chain was 9.6 ⁇ 10 ⁇ 7 ⁇ 00. That is, the binding ability of the 8B9 antibody to ⁇ 2,6 sugar chains was 88.5 times higher than that to ⁇ 2,3 sugar chains.
  • FIG. 3C no binding to galactose-linked sugar chains was observed.
  • a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof with high binding ability to ⁇ 2,6 sugar chains and a method for measuring ⁇ 2,6 sugar chains are provided.

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Abstract

末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合し、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片。

Description

末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法
　本発明は、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法に関する。
　前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）の糖鎖は、２本鎖で末端にシアル酸がα２，６結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖と、末端のシアル酸が、α２，３結合でガラクトースに結合しているＮ型糖鎖が存在し、癌化に伴い、α２，６結合よりも、α２，３結合でガラクトースに結合する糖鎖が増加することが知られている（非特許文献１）。従って、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の検出と共に、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖を検出することは、ＰＳＡの癌化の検出に有用である。
　末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖を検出可能なプローブとして、セイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌｅｃｔｉｎ）が知られており、シアル酸を含む糖鎖の検出のプローブとして用いられている（特許文献１）。また、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖を有する糖脂質を免疫原として、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖を認識するマウスモノクローナル抗体が報告されている（特許文献２）。
特表２０１１－５２９１８４号公報 特許第６１７２６８７号公報
Ｔａｊｉｒｉ　Ｍ，Ｏｈｙａｍａ　Ｃ，Ｗａｄａ　Ｙ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８；１８：２－８
　しかしながら、セイヨウニワトコレクチンは、原料となる植物由来の天然物であり、製品のロットによってその結合性が変化するため、これをプローブとして使用した腫瘍バイオマーカーの臨床応用は困難である。組み換えレクチンの開発も進められているが、実用化には至っていない。
　また、ＰＳＡの癌化の検出には、より高感度で、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖を認識する抗体が必要である。
　本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に高い結合性を有するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法を提供することにある。
　本発明者らは、Ｓｉａα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ－ＢＳＡを免疫原として、ウサギに免疫し、得られた陽性ウサギＢ細胞を単離し、シングルセルＰＣＲにより、抗体遺伝子を取得し、該抗体遺伝子を宿主細胞に導入することにより得られた、モノクローナル抗体が、高い結合性で、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合し、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片。
［２］末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖との解離定数が、１．０×１０－８以下である、［１］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［３］末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖との結合性が、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖との結合性よりも２０倍以上高い、［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［４］前記抗体又はその抗体断片の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［５］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［６］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［７］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む、［６］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［８］［１］～［７］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法。
　本発明によれば、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖（以下、α２，６糖鎖とも称する）に高い結合性を有するモノクローナル抗体、及び、α２，６糖鎖の測定方法を提供することができる。
実施例１で得られた抗体の、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖（以下、α２，３糖鎖とも称する）、及び、α２，６糖鎖に対する結合性を、ＥＬＩＳＡで確認した結果を示す。 実施例２における、α２，６糖鎖を固定化したバイオセンサーに対する８Ａ２抗体のセンサーグラムの結果を示す。 実施例２における、α２，３糖鎖を固定化したバイオセンサーに対する８Ａ２抗体のセンサーグラムの結果を示す。 実施例２における、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖（以下、ガラクトース結合糖鎖とも称する）を固定化したバイオセンサーに対する８Ａ２抗体のセンサーグラムの結果を示す。 実施例２における、α２，６糖鎖を固定化したバイオセンサーに対する８Ｂ９抗体のセンサーグラムの結果を示す。 実施例２における、α２，３糖鎖を固定化したバイオセンサーに対する８Ｂ９抗体のセンサーグラムの結果を示す。 実施例２における、ガラクトース結合糖鎖を固定化したバイオセンサーに対する８Ｂ９抗体のセンサーグラムの結果を示す。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜モノクローナル抗体及びその抗体断片＞
　本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、遺伝子組換え技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子をいい、「抗体断片」とはかかる免疫グロブリン分子の抗原結合性の断片をいう。かかる抗体および抗体断片は、慣用技術を用いて作製することができる。抗体断片としては、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド、及び、α２，３糖鎖結合部位を含む、免疫グロブリン分子以外の修飾構造体等を挙げることができる。
　本明細書において、抗体が「特異的に結合する」とは、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖とは異なる他の糖鎖に実質的に結合することなく、α２，６糖鎖に結合することを意味する。また、本明細書において、「α２，６糖鎖」は、「Ｓｉａα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ」とも称する。
　本発明において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味し、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、抗原の特定のエピトープに対して1つの結合特異性及び親和性を示す抗体である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
　本明細書において使用する、抗体の「重鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より大きいほうを指す。本明細書において用いられる、抗体「軽鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より小さいほうを指す。
　ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、３つのＣＤＲと、ＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。
　ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　ｅｄ．，　１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤ）；及び（２）抗原－抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌｅｃ．　Ｂｉｏｌ．　２７３，９２７－９４８，１９９７）を挙げることができる。これらのアプローチや、他のアプローチを組み合わせて用いてもよい。
　本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、α２，６糖鎖に特異的に結合し、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片である。以下、本発明のモノクローナル抗体を、抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体とも称する。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体は、ヒト抗体であっても、非ヒト動物抗体であってもよい。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等が挙げられるが、ウサギモノクローナル抗体が抗原との結合性が高いため好ましい。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、ガラクトース結合糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片である。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片の、α２，６糖鎖との結合性は、α２，３糖鎖との結合性よりも高いことが好ましく、例えば、α２，６糖鎖との結合性が、α２，３糖鎖との結合性の２０倍以上、好ましくは、３０倍以上、より好ましくは４０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上、特に好ましくは８０倍以上である。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片の、α２，６糖鎖等の抗原との結合性は、解離定数（ＫＤ値）で表わすことができる。ＫＤの単位はＭであり、結合性が高いほどＫＤ値はより低くなる。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片のα２，６糖鎖とのＫＤ値は、１．０×１０－８以下であることが好ましく、５．０×１０－９以下であることがより好ましく、１．０×１０－９以下であることがさらに好ましく、５．０×１０－１０以下であることが特に好ましく、例えば、８．５×１０－９以下、８．０×１０－９以下、７．０×１０－９以下、６．０×１０－９以下、４．０×１０－９以下、３．０×１０－９以下、２．０×１０－９以下、９．０×１０－１０以下、８．０×１０－１０以下、７．０×１０－１０以下、６．０×１０－１０以下、４．０×１０－１０以下、３．０×１０－１０以下であってもよい。
　上記ＫＤ値は、例えば、抗原となる糖鎖を固定化したバイオセンサーを用いて算出することができる。具体的には、バイオセンサーに抗原となる糖鎖を固定させ、抗体溶液に浸漬して、抗体をバイオセンサーに固定化された抗原に結合させる。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液に浸漬し、バイオセンサーに結合する抗体数、又は、バイオセンサーから解離する抗体数の変化によって生じる波長シフトΔλの変化を計測し、抗体の濃度を変化させたときのセンサーグラムから、ＫＤ値を算出することができる。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、公知の方法を用いて製造することができる。具体的には、まず、α２，６糖鎖とキャリアータンパク質とのコンジュゲートを免疫原として非ヒト動物に免疫し、免疫された非ヒト動物のリンパ球について、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認し、α２，６糖鎖との結合性が高いリンパ球を選択する。免疫する非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等が挙げられる。次に、選択したリンパ球からからシングルセルＰＣＲ法で、抗体遺伝子を取得し、ＰＣＲ法により増幅する。ＰＣＲ増幅産物について、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認する。α２，６糖鎖との結合性が高いＰＣＲ増幅産物を、ヒト胎児腎細胞２９３（Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ　２９３）等の細胞にトランスフェクションし、分泌抗体が含まれる培養上清を回収し、回収サンプルについて、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認し、α２，６糖鎖との結合性が高いクローンを得る。得られたクローンから抗体遺伝子を取得し、ベクターに挿入し、抗体産生細胞を得る。得られた抗体産生細胞を培養し、本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を製造することができる。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片としては、ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体８Ａ２（以下、８Ａ２抗体とも称する）又はその抗体断片等が挙げられる。
　前記抗体８Ａ２は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　また、本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片としては、ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体８Ｂ９（以下、８Ｂ９抗体とも称する）又はその抗体断片等が挙げられる。
　前記抗体８Ｂ９は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
　上記配列番号１～１２で表されるアミノ酸配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記配列番号１３～１６で表されるアミノ酸配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらのＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３及びＶＬのＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。具体的には、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３及びＶＬのＣＤＲ１～ＣＤＲ３をそれぞれコードする遺伝子を、前記抗体のＦＲと前記抗体の定常領域をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、前記抗体を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
　前記ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と同様な特異性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。
　欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。
＜測定方法＞
　本発明のα２，６糖鎖の測定方法は、本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、α２，６糖鎖の測定方法である。本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、α２，６糖鎖の測定方法としては、検体中のα２，６糖鎖と、本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片とを反応させた後、前記抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片に標識が結合した標識化抗体又は標識化抗体断片を添加し、α２，６糖鎖、前記抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片、及び前記標識化抗体又は標識化抗体断片からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、検体中のα２，６糖鎖の免疫学的測定方法等が挙げられる。
　本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる測定方法において、検体としては、ヒトをはじめとする動物の血清、血漿又は全血等の血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗及び尿等が挙げられる。また、前記検体は、対象から採取した検体そのものであっても、採取した検体に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。また、検体は、前記測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
　前記免疫学的測定方法としては、前記標識化検出抗体の標識により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ) 、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ等に分類され、これらのいずれも本発明の測定方法に用いることができるが、ＥＬＩＳＡが、簡便且つ迅速に検出対象を測定することができ好ましい。
　上記免疫複合体を洗浄後、免疫複合体中の標識を測定することにより、検体中のα２，６糖鎖を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡの場合、標識である酵素と当該酵素の基質とを反応させ、発色した生成物の吸光度を測定することにより、検体中のα２，６糖鎖を測定することができる（サンドイッチ法）。また、固体支持体に固定した本発明の抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片と検体中のα２，６糖鎖とを反応させた後、非標識抗α２，６糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加し、この非標識抗体又はその抗体断片に対する抗体（二次抗体）に酵素標識した標識化二次抗体をさらに添加し、当該二次抗体の標識を測定することにより、検体中のα２，６糖鎖を測定することもできる。また、当該二次抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンと結合させて、当該二次抗体を酵素等で標識し、当該二次抗体の標識を測定することにより検体中のα２，６糖鎖を測定することもできる。
　また、固体支持体に固定したα２，６糖鎖叉はα２，６糖鎖とＢＳＡ等の蛋白質とのコンジュゲートに、非標識抗α２，６糖鎖モノクローナ抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加して、固体支持体に、α２，６糖鎖と一次抗体とからなる免疫複合体を生成させた後、検体を添加し、さらに、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を標識化した二次抗体を添加し、当該標二次抗体の標識を測定することにより、検体中のα２，６糖鎖を測定することもできる（競合法）。
　前記固体支持体としては、抗体又は抗体断片を安定に保持できるものであれば特に制限はない。固体支持体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。固体支持体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられる。
　前記標識としては、ＥＬＩＳＡでは、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ等の酵素と各酵素で発光物質に変化する発光基質、及びルシフェリン、エクオリン等の発光物質を用いることができる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子を標識として用いることもできる。
　ＥＬＩＳＡにおいて、標識となる酵素の基質は、酵素がパーオキシダーゼの場合３、３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＤＡＢ)、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＴＭＢ)、Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ(ＯＰＤ)等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ(ｐＮＰＰ)等を用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されない。
［実施例１］
　Ｓｉａα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ－ＢＳＡを免疫原として、ウサギ（ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫ、１３週齢）に免疫し、得られたウサギＢ細胞について、Ｓｉａα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃに結合する細胞（シングルセル）をＥＬＩＳＡ法により試験し、２７個の陽性クローンを選択した。選択された陽性クローンから、シングルセルＰＣＲにより、抗体遺伝子を取得した。得られた抗体遺伝子配列をヒト胎児腎細胞２９３（Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ　２９３）細胞にトランスフェクションし、培養上清に分泌された組み換えウサギ抗体について、α２，６糖鎖及びα２，３糖鎖との結合性を、以下のＥＬＩＳＡ法により確認し、α２，６糖鎖に結合性が高く、α２，３糖鎖に結合性が低い５個の抗体（８Ａ２、８Ａ４、８Ｂ５、８Ｂ９、８Ｂ１９）を得た。図１に、これら５個の抗体のＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。
［α２，６糖鎖への結合性］
　９６ｗｅｌｌプレートにＳｉａα２，６Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物（ＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，６）β１，４ＧｌｃＮＡｃ）を１μｌ／ｍｌ（×２５００）で５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートし、抗原をプレートにウェル上に固定化した。ＰＢＳＴ（０．05％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ添加し、４℃で一晩振とうし、ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、実施例１で得られた各クローンの培養上清を２倍希釈し、５０μｌ添加し、室温で１時間、振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　ＨＲＰ（×１００００；ａｂ９７０８０、ａｂｃａｍ社製）５０μｌを添加し、室温で１時間、振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（組成：３．３’，５．５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、カタログナンバー：Ｎ３０１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、５分間インキュベートした。次に、０．１Ｎ　ＨＣｌを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
［α２，３糖鎖への結合性］
　Ｓｉａα２，６Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物の代わりに、Ｓｉａα２，３Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物を用いる以外は上記と同様に行い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
［実施例２］
　実施例１で得られたモノクローナル抗体のうち、８Ａ２抗体及び８Ｂ９抗体のＫＤ値を以下のようにして算出した。
　Ａｍｉｎｏ　ｒｅａｃｔｉｖｅバイオセンサー（ＡＲ２Ｇ；ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）を超純水で親水化し、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，３）β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原溶液、又は、ＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，６）β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原溶液に１０分間浸漬し、各抗原をセンサーに固定化した。ＥＤＣ－／ｓＮＨＳ溶液（組成：１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）とｓｕｌｆｏ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）とを１：１で混合）にセンサーを浸漬し、ブロッキングした。ＢＳＡ－ＭＢＳ－β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原固定化センサーは、ブロッキング後にシアリダーゼ溶液（組成：３μＬ　α（２→３，６，８，９）Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（Ｎ３７８６－１ＳＥＴ、Ｓｉｇｍａ社製）＋４７μＬ　１００ｍＭ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５））に３７℃、３時間浸漬し、シアル酸を遊離させて作製した。ＰＢＳで洗浄後、３０℃条件下で、３．７５から６０ｎＭの各抗体溶液中にバイオセンサーを３００秒間浸漬し、抗原への抗体の結合状態を測定した。その後、ＰＢＳに３００秒間浸漬し、抗原からの抗体の解離状態を測定した。バイオセンサーに結合する抗体、またはバイオセンサーから解離する抗体数の変化によって生じる波長シフトΔλの変化を、リアルタイムに計測し、Ｏｃｔｅｔシステム上（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）で反応プロファイルを生成した。３．７５ｎＭから６０ｎＭの各濃度の抗体溶液中で得られた結合および解離のセンサーグラムから、ＫＤ値を算出した。算出されたＫＤ値を表３に示す。また、８Ａ２抗体、８Ｂ９抗体の上記センサーグラムの結果を、それぞれ図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３、図２Ａ、図２Ｂに示したように、８Ａ２抗体のα２，６糖鎖に対するＫＤ値は、２．９×１０－１０±１．７×１０－２４であるのに対し、α２，３糖鎖に対する解離定数ＫＤ値は、１．３×１０－９±１．６×１０－２４であった。すなわち、８Ａ２抗体のα２，６糖鎖への結合性は、α２，３糖鎖への結合性よりも２２．３倍高かった。また、図２Ｃに示すように、ガラクトース結合糖鎖への結合を認めなかった。これらの結果から、８Ａ２抗体は、α２，３糖鎖への結合性よりも、α２，６糖鎖への結合性が高く、ガラクトース結合糖鎖に結合しない抗体であることが明らかとなった。
　また、表３、図３Ａ、図３Ｂに示すように、８Ｂ９抗体のα２，６糖鎖に対するＫＤ値は、８．５×１０－９±２．７×１０－２４であるのに対し、α２，３糖鎖に対するＫＤ値は、９．６×１０－７±００であった。すなわち、８Ｂ９抗体のα２，６糖鎖への結合性は、α２，３糖鎖への結合性よりも８８．５倍高かった。また、図３Ｃに示すように、ガラクトース結合糖鎖への結合を認めなかった。これらの結果から、８Ｂ９抗体は、α２，３糖鎖への結合性よりも、α２，６糖鎖への結合性が高く、ガラクトース結合糖鎖に結合しない抗体であることが明らかとなった。
　本発明によれば、α２，６糖鎖に結合性の高いモノクローナル抗体又はその抗体断片、及びα２，６糖鎖の測定方法が提供される。

Claims (8)

  1. 　末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合し、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片。
  2. 　末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖との解離定数が、１．０×１０－８以下である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  3. 　末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖との結合性が、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖との結合性よりも２０倍以上高い、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  4. 　前記抗体又はその抗体断片の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  5. 　前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  6. 　前記抗体又はその抗体断片のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  7. 　前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法。
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