JP6867529B1 - ヘリコバクター・ピロリ検出用抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列:RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号2)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号3)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片を用いる、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法。
(2)免疫学的測定方法が免疫凝集法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射性免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法及びイムノブロット法から成る群より選択される、(1)記載の方法。
(3)免疫学的測定方法がサンドイッチ法である、(1)記載の方法。
(4)サンドイッチ法が酵素免疫測定法である、(3)記載の方法。
(5)酵素免疫測定法が、ルシフェラーゼを標識酵素として使用する、(4)記載の方法。
(6)ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、(5)記載の方法。
(7)生体試料が糞便である、(1)〜(6)のいずれか1記載の方法。
(8)ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列:RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号2)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号3)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片。
(9)(8)記載の抗体又はその断片を固定化した不溶性担体。
(10)(8)記載の抗体もしくはその断片、又は(9)記載の不溶性担体を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬。
(11)(10)記載の試薬を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬キット。
(12)(10)記載の試薬を用いる生体試料中のヘリコバクター・ピロリの検査方法。
本発明に係る抗体としては、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、それらの混合物が挙げられる。
不溶性担体の粒子径としては、0.01〜50μm、0.1〜10μmが好ましく、より好ましくは0.5〜5μmであるが、特にこの範囲に限定されない。
また、標識としては、酵素と反応して蛍光、発光若しくは発色を生じる酵素と特異的に結合できる分子であってもよい。
基質と反応して蛍光、発光又は発色を生じる酵素が、ストレプトアビジンと結合した酵素の場合、標識はビオチンであってもよい。
ヘリコバクター・ピロリを微好気環境下で5日間培養した後、遠心分離により集菌してからリン酸緩衝液に再懸濁する操作を繰り返してヘリコバクター・ピロリを洗浄した。洗浄したヘリコバクター・ピロリをリン酸緩衝液で懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて破砕した。破砕したヘリコバクター・ピロリを遠心分離し、その遠心上清を抽出物として得て免疫原とした。
[精製リコンビナントヘリコバクター・ピロリ カタラーゼとの反応性]
30%過酸化水素水10μLに0.02mg/mL精製リコンビナントヘリコバクター・ピロリ カタラーゼ(59.4kDa)(Seramun Diagnostica GmbH社製, AGX-5-000-0648)を2μL添加し、カタラーゼ活性を確認した。
ピロリ菌のカタラーゼと高い相同性を示す菌としてBacteroides fragilis、Bacillus subtilis、Campylobacter jejuni、ヘリコバクター属として、培養が成功したHelicobacter felis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter mustelae、及びその他の細菌について交差反応性を確認した。
上記CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003について、ペプチドマッピングにより抗体が反応するアミノ酸配列の解析を行った。ペプチドマッピングによるアミノ酸配列解析は、次のiv.糞便検体中ヘリコバクター・ピロリの検出におけるBLEIA法において、試料としてビオチン化ペプチドを用いた点を除き、同様の方法で行った。参考例として、ヘリコバクター・ピロリのリコンビナントカタラーゼと各抗体の反応性についても、同様の方法で確認した。
1) 各種抗体を磁性粒子に固相化又は抗体無添加磁性粒子を調製した。
2) 各種抗体固相化磁性粒子又は抗体無添加磁性粒子溶液、各種ビオチン化ペプチド60pmolをそれぞれ混合し、37℃で15分間反応させた。
3) 磁性粒子を洗浄液で洗浄し、洗浄液を除去した後、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを添加し、37℃で15分間反応させた。
4) 磁性粒子を洗浄液で洗浄し、洗浄液を除去した後、ルシフェラーゼに対する基質液(ルシフェリン溶液)を添加し、発光強度を測定した。
5) それぞれの試料について、[各種抗体固相化磁性粒子の発光強度]/[抗体無添加磁性粒子の発光強度]を算出した。
6)[各種抗体固相化磁性粒子の発光強度]/[抗体無添加磁性粒子の発光強度]の値が他の配列の算出値と比べて明らかに高いペプチド配列を、抗体が反応するアミノ酸配列と判定した。
*2)〜4)は全自動生物化学発光免疫測定装置BLEIA-1200(栄研化学社製)にて測定した。
結果を以下の表2に示す。
反応するアミノ酸配列を解析した下記実施例1、2及び比較例1、2の抗体により試薬を調製し、生物発光酵素免疫測定法(BLEIA法、特開平10−239314公報に記載の方法に準じた方法)で、試料(ヒト糞便)中のヘリコバクター・ピロリの測定を行った。
試料は、糞便検体約35mgをBL採便容器(栄研化学)の緩衝液2mLに懸濁後、フィルター濾過して得られた糞便抽出液を試料として用いた。
実施例1及び2、並びに比較例1〜3の試薬は、以下の通りであった:
〔実施例1〕試薬2:ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼ及び変性カタラーゼに対するモノクローナル抗体2種(固相用抗体:CHP002, 標識用抗体:CHP003);
〔実施例2〕試薬3:試薬2と異なるヘリコバクター・ピロリのネイティブなカタラーゼ及び変性カタラーゼに対するモノクローナル抗体1種(固相及び標識用抗体:CHP006);
〔比較例1〕試薬1:ネイティブカタラーゼ特異的抗体1種(固相及び標識用抗体:CHP001);
〔比較例2〕試薬4:ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナル抗体1種(固相及び標識用抗体:PHP003);
〔比較例3〕市販のELISAヘリコバクター・ピロリ検出キットA。
内視鏡検査、血清抗体価、及び尿素呼気試験により以下の基準で陽性又は陰性と臨床において診断された糞便検体133例をそれぞれ用いた。
陽性:「現感染」:《既往》除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤あり、木村・竹本分類C-2以上の萎縮、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が10U/ml以上(陰性高値(3〜9U/ml)は尿素呼気試験(UBT)で2.5‰以上)。
陰性:「未感染」及び「既感染」
「未感染」:《既往》除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤なし、萎縮なし、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が3U/ml未満。
「既感染」:《既往歴》除菌歴あり(除菌成功)又は除菌歴なし、《内視鏡検査》びまん発赤なし、C-2以上の萎縮、《H.pylori 感染検査》血清抗体価が3U/ml未満(陰性高値(3〜9U/ml)は尿素呼気試験(UBT)で2.5‰未満)。
特開平10-239314号公報(抗体と酵素の双方にビオチンを結合)に記載の方法で行い、固相担体として磁性粒子、検出用の酵素にビオチン化ルシフェラーゼ、基質にルシフェリンを使用し、抗体として、試薬1〜4の各抗体を用いた。
1) 各種固相用抗体を磁性粒子に固相化し、各種抗体固相化磁性粒子を作製した。
具体的には、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中で、市販の磁性粒子1mgに対して5μgの各種抗体を反応させ、希釈液(0.1%BSA、0.09%アジ化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0))で希釈して1.5mg/mLの抗体固相化磁性粒子を作製した。
2) 各種標識用抗体とビオチン化試薬を混合し、各種ビオチン標識抗体を作製した。
具体的には、50mMリン酸緩衝液(pH8.0)中で、各種抗体溶液とSulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohexanoate(同仁化学)溶液をモル比1:20で混合し、30℃で2時間反応させ、抗体にビオチンを結合させた。次に50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いてゲルろ過し、未反応のSulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohexanoateを除去し、ビオチン標識抗体溶液を得た。
3) ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼの作製
具体的には、緩衝液(100mM塩化ナトリウム、4mM EDTA-2Na、0.09%アジ化ナトリウム、0.2% BSAを含む0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0))中で、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で溶解したストレプトアビジン(ロシュ・ダイアグノスティックス)とビオチン化ルシフェラーゼ(キッコーマンバイオケミファ)をモル比1:4で混合し、30℃で2時間反応させて、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを作製した。
4) 試薬1〜4の組合せにおいて、それぞれ、ビオチン標識抗体溶液80μLと、試料50μLと、抗体固相化磁性粒子(1.5mg/mL)20μLを混合し、37℃で15分間反応させた。
5) 磁性粒子を含む反応溶液に、BL洗浄液(栄研化学)500μLを加え、BL洗浄液を除去し、この操作を5回繰り返した。続いて、ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼを80μL加えて、37℃で15分間反応させた。
6) 磁性粒子を含む反応溶液にBL洗浄液(栄研化学)500μLを加え、洗浄液を除去し、この操作を5回繰り返した。続いて、BL発光試薬セット(栄研化学)のBL発光試薬1 50μLとルシフェラーゼに対する基質液(ルシフェリン溶液)であるBL発光基質液 50μLを加え、発光強度を測定した。
7) それぞれの試料及びBLEIA‘栄研’H.ピロリ抗原のキャリブレータ1、キャリブレータ2の発光強度から、COI=(試料の発光強度−キャリブレータ1の発光強度)/((キャリブレータ2の発光強度−キャリブレータ1の発光強度)/補正係数)を算出した。
8) 1 COI未満を陰性、1 COI以上を陽性と判定した。
*4)〜8)は全自動生物化学発光免疫測定装置BLEIA-1200にて測定。
臨床診断の結果と併せて、測定結果を以下の表3に示す。
Claims (12)
- ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列:RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号2)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号3)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片を用いる、生体試料中のヘリコバクター・ピロリを検出する免疫学的測定方法。
- 免疫学的測定方法が免疫凝集法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射性免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロット法及びイムノブロット法から成る群より選択される、請求項1記載の方法。
- 免疫学的測定方法がサンドイッチ法である、請求項1記載の方法。
- サンドイッチ法が酵素免疫測定法である、請求項3記載の方法。
- 酵素免疫測定法が、ルシフェラーゼを標識酵素として使用する、請求項4記載の方法。
- ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項5記載の方法。
- 生体試料が糞便である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼにおけるアミノ酸配列:RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(配列番号2)若しくはKNPENYFAEVEQAAFSPANV(配列番号3)又はそれらの一部と反応する抗体又はその断片。
- 請求項8記載の抗体又はその断片を固定化した不溶性担体。
- 請求項8記載の抗体もしくはその断片、又は請求項9記載の不溶性担体を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬。
- 請求項10記載の試薬を含む、生体試料中のヘリコバクター・ピロリ検出用免疫学的測定試薬キット。
- 請求項10記載の試薬を用いる生体試料中のヘリコバクター・ピロリの検査方法。
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