WO2023145788A1 - 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 - Google Patents

菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023145788A1
WO2023145788A1 PCT/JP2023/002329 JP2023002329W WO2023145788A1 WO 2023145788 A1 WO2023145788 A1 WO 2023145788A1 JP 2023002329 W JP2023002329 W JP 2023002329W WO 2023145788 A1 WO2023145788 A1 WO 2023145788A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
outer membrane
membrane fraction
pylori
swiss
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/002329
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英則 松井
絵美子 林原
仁人 鈴木
崇道 高橋
明 石井
Original Assignee
学校法人北里研究所
国立感染症研究所長が代表する日本国
デンカ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人北里研究所, 国立感染症研究所長が代表する日本国, デンカ株式会社 filed Critical 学校法人北里研究所
Publication of WO2023145788A1 publication Critical patent/WO2023145788A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring Helicobacter suis antibodies using an outer membrane fraction of H. suis.
  • H. pylori a microscopic pathogen that parasitizes the human stomach. It is known that infection with temperamental Gram-negative Helix, hereinafter referred to as "H. pylori" is involved.
  • H. pylori infection test methods include the isolation culture method, urea breath test (UBT), and H. pylori in serum and urine.
  • pylori antibody titer ELISA and latex agglutination
  • H. pylori in stool pylori antigen measurement (immunochromatographic method) and gastric biopsy rapid urease test (RUT) are mainly employed.
  • H.I. H. pylori due to the spread of diagnosis and eradication of H. pylori.
  • H. NHPH Non-Helicobacter pylori hericobacters; Helicobacter other than H. pylori
  • H. NHPH includes Helicobacter suisse (hereinafter H. Switzerland), H. bizzozeronnii, H. felis, H. salmonis, H. ailurogastricus, H. cynogasticus, H. baculiformis, H. mustelae, H. acinonychls, H.; cetorum and H. heilmannii, of which the majority found in the human stomach are H. Switzerland.
  • H. pylori infects only primates, and infection from close relatives is assumed only in infancy, but H. pylori infects only primates. In Switzerland, people of all ages are infected by animals such as pigs and monkeys.
  • Non-Patent Document 1 Multi Locus Sequencing Typing
  • JP 2016-10331 A International publication WO2019/225639
  • the present invention is based on H.I.
  • the object of the present invention is to provide a method and a reagent for measuring antibodies against Helicobacter suis using Swiss outer membrane fractions.
  • Patent Document 1 H. It discloses immobilizing the Swiss F2R2 protein on a plate and measuring antibodies in the serum.
  • Patent Document 2 discloses that HsvA protein, which is said to have a higher antibody titer than F2R2 protein, is immobilized on a plate to measure antibodies in serum.
  • a method with higher sensitivity and specificity than conventional methods there is a need for a method with higher sensitivity and specificity than conventional methods.
  • the present invention relates to the following inventions: [1] At least H. H. spp. of a subject-derived specimen containing the Swiss outer membrane fraction, or proteins and anti-Ig antibodies contained in the outer membrane fraction. A reagent that detects antibodies that bind to the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction. [2] The reagent of [1], wherein the subject is a mammal. [3] The reagent of [1] or [2], wherein the specimen is derived from blood. [4] Furthermore, H. pylori cell component or H. pylori. H. pylori in a subject-derived specimen containing antibodies against H. pylori body components antibodies that bind to H.
  • anti-H A method characterized by detecting an antibody that binds to the Swiss outer membrane fraction or a protein contained in the outer membrane fraction: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. (b) contacting with the Swiss outer membrane fraction or a protein contained in the outer membrane fraction; Detecting antibodies in said sample bound to the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction.
  • [7] The method of [6], wherein the subject is a mammal.
  • [8] The method of [6] or [7], wherein the sample is derived from blood.
  • the H.I. The method according to any one of [6] to [8], which also detects an antibody that binds to H. pylori: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. and (b) H. pylori body components. A step of detecting antibodies in the specimen bound to H. pylori body components. [10] Furthermore, the H.I. The method according to any one of [6] to [8], characterized in that antigens of H.
  • pylori body components are also detected: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. (b) contacting with antibodies against H. pylori body components; H. pylori in the sample bound to antibodies against H. pylori body components. A step of detecting an antigen of a H. pylori body component.
  • a subject whose antibody was detected by the measurement using the reagent of any one of [1] to [5] and/or by the method of any one of [6] to [10] is treated with H.I. determine infected with Switzerland, H. Swiss infection detection method.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-009302, which is the basis of priority of this application.
  • H By using the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction, anti-H. Swiss antibodies can be measured with high sensitivity.
  • the Swiss outer membrane fraction, or the proteins contained in the outer membrane fraction, are described in H. anti-H. It can be used to measure the presence or absence of Swiss antibodies or titers.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a specimen and H. suis whole cell or H. suis outer membrane fraction as an antigen.
  • FIG. 2 graphically shows the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as the specimen and H. suis whole cells (FIG. 2A) or H. suis outer membrane fraction (FIG. 2B) as the antigen.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ELISA using mouse serum (3600-fold dilution) as a sample and H. suis whole cell or H. suis outer membrane fraction as an antigen.
  • FIG. 4 graphically illustrates the results of ELISA using mouse serum (3600-fold dilution) as specimen and H. suis whole cells (FIG.
  • FIG. 4A is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a sample and H. pylori outer membrane fraction or H. suis outer membrane fraction as an antigen.
  • FIG. 6 graphically shows the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as the specimen and H. pylori outer membrane fraction (FIG. 6A) or H. suis outer membrane fraction (FIG. 6B) as the antigen.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a sample and H. suis outer membrane fractions or H.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a specimen and using H. suis outer membrane fractions or H. suis HsVA partial peptides (SEQ ID NOs: 6 to 11) as antigens, in terms of measured values. be.
  • the present invention provides a method for detecting H.
  • a method for detecting an antibody against the outer membrane fraction of Swiss fungal cells or a protein contained in the outer membrane fraction and a reagent for detecting the antibody.
  • the present invention provides a method for detecting H. pneumoniae in a subject.
  • a method for determining the presence of H.S.H. It is also the method of detecting infection in Switzerland.
  • the subject's H A method of obtaining ancillary data for diagnosing Swiss infections.
  • H. swiss means NHPH (Non-Helicobacter pylori helicobacters; Helicobacter other than H. pylori) or Helicobacter heilmannii sensu lato (in a broad sense) among the Helicobacter genus bacteria reported more than 50 kinds of Helicobacter hirmanii). It means the Swiss strain (Non-Patent Document 3). H. Switzerland is known to infect the stomachs of pigs, monkeys, wild boars, cats and dogs in addition to humans. H.I. The infected mammal from which Switzerland was isolated is not particularly limited and may be, for example, humans, monkeys, wild boars, or pigs.
  • H. swiss adventitial fraction refers to the H. Fraction prepared by collecting H. suis outer membrane fragments after sonication of H. suis. Sonication is performed according to H.I. It can be carried out by suspending the Swiss cells in a buffer solution and using an ultrasonicator. Examples of the ultrasonic crusher include a sample closed type ultrasonic disruption device Bioruptor (BM equipment) and a sample closed type ultrasonic disruption device Bioruptor (BM equipment). By sonication, H.I. Swiss cells are destroyed, leaving extracellular membrane fragments. Extracellular membrane fragments can be recovered by centrifugation or filtration. "Protein contained in H. Swiss outer membrane fraction” A protein derived from H. suis present in a fraction prepared by collecting H. suis outer membrane fragments after sonicating H. suis.
  • H. Antibodies to the Swiss outer membrane fraction were obtained from H. It refers to antibodies against antigens such as proteins and sugars contained in the Swiss outer membrane fraction, and may include multiple antibodies against various substances.
  • H. Antibodies against at least one of antigens such as proteins and sugars contained in the Swiss outer membrane fraction are isolated from H. It is called an antibody against the Swiss outer membrane fraction.
  • H.I. Antibodies against proteins contained in the Swiss outer membrane fraction were published by H. An antibody against a protein among the antigens contained in the Swiss outer membrane fraction.
  • the Swiss outer membrane fraction contains multiple proteins; Antibodies to proteins contained in the Swiss outer membrane fraction may contain multiple antibodies to different proteins.
  • H An antibody against at least one of the proteins contained in the Swiss outer membrane fraction was isolated from H. It is called an antibody against a protein contained in the Swiss outer membrane fraction.
  • H In swiss infected subjects, H .
  • H Antibodies to the Swiss outer membrane fraction or to proteins contained in the outer membrane fraction are produced.
  • the antibody is H.I.
  • An antibody is said to bind to the Swiss outer membrane fraction when it binds to an antigen contained in the Swiss outer membrane fraction.
  • a reagent for detecting the Swiss outer membrane fraction or an antibody against a protein contained in the outer membrane fraction can be prepared as a reagent applicable to known methods.
  • Known methods include, for example, an enzyme immunoassay method (EIA method), a simple EIA method, an enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), a radioimmunoassay method (RIA method), a fluorescence immunoassay method (FIA method), and the like.
  • turbidimetric method TIA method
  • NIA method nephelometric method
  • LIA method latex agglutination method
  • LIA method particle counting method
  • chemiluminescence measurement method CLIA method, CLEIA method
  • sedimentation reaction method surface plasmon resonance method (SPR method); resonant mirror detector method (RMD method); Whether or not the reagent of the present invention can be applied to the desired measurement method is described in H. et al.
  • H. Antibodies to the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction, can be used as markers for H. suis infection.
  • H.I. A subject's own immune system-generated H. It can be determined by confirming the presence of antibodies against the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction. The presence of these antibodies has been documented by H. It can be detected and confirmed by an antigen-antibody reaction using the protein contained in the Swiss outer membrane fraction or the outer membrane fraction. H. H. elegans using the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction as assay reagents.
  • Detection of antibodies against proteins contained in the Swiss outer membrane fraction or the outer membrane fraction can be performed by enzyme immunoassay (EIA method), simple EIA method, enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), radioimmunoassay method (RIA method), fluorescent immunoassay method (FIA method) and other labeled immunoassay methods; immunoblotting methods such as Western blotting; immunochromatographic methods such as gold colloid agglutination methods; ion-exchange chromatography methods, affinity chromatography methods and other chromatographic methods; Nephelometric method (TIA method); nephelometric method (NIA method); colorimetric method; latex agglutination method (LIA method); particle counting method (CIA method); method; surface plasmon resonance method (SPR method); resonant mirror detector method (RMD method);
  • EIA method enzyme immunoassay
  • simple EIA method enzyme-linked immunosorbent assay method
  • RIA method radioimmuno
  • the present invention provides a method for producing H. Concerning the method of determining Swiss infection: (a) A sample derived from a subject is treated with the H.364 of the present invention. contacting with the Swiss outer membrane fraction or a protein contained in the outer membrane fraction; (b) H.I. (c) detecting antibodies in said sample bound to the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction; Subjects in whom the Swiss outer membrane fraction or antibodies bound to proteins contained in the outer membrane fraction were detected were treated with H. determined to be infected with Switzerland, while H. Subjects in whom no antibodies bound to the Swiss outer membrane fraction or to proteins contained in the outer membrane fraction were detected were tested by H. The process of determining that Switzerland is not infected.
  • the present invention provides a method for producing an H.I. Concerning the method of determining Swiss infection: (a) A sample from a subject is treated with H.I. contacting with the Swiss outer membrane fraction or a protein contained in the outer membrane fraction; (b) H.I. measuring the level of antibodies in said specimen bound to the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction; If higher than the level of antibody measured, the subject is treated with H.I. If determined to be infected with H. switzerland and the level of antibody measured is equal to or lower than the level of antibody measured for the negative control by a similar method, the subject is tested for H. pneumoniae. The process of determining that Switzerland is not infected.
  • a negative subject refers to a specimen from a subject not infected with H. suis.
  • the level of antibody refers to the quantitative value of antibody, ie, antibody titer, and is expressed, for example, as the concentration in the sample. Also included in the detection of antibodies is the measurement of levels of antibodies.
  • H Whether or not the Swiss outer membrane fraction or the protein contained in the outer membrane fraction binds to the antibody in the specimen derived from the subject can be confirmed by the methods exemplified below.
  • H The Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction are bound to an immobilized carrier, and a specimen derived from a subject is treated with H. After contact with the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction, the reaction system is washed to remove unbound antibodies.
  • H.I There is a Swiss outer membrane fraction, or a complex in which a protein contained in the outer membrane fraction binds to an antibody in a subject-derived specimen. After that, contact with a labeled anti-Ig antibody, the H.
  • the reaction system After binding the subject-derived antibody bound to the protein contained in the Swiss outer membrane fraction or the outer membrane fraction with the labeled anti-Ig antibody, the reaction system is washed to remove the unbound labeled anti-Ig antibody. removing and detecting the label of the remaining labeled anti-Ig antibody; It can be determined that the protein contained in the Swiss outer membrane fraction or the outer membrane fraction bound to the antibody in the specimen derived from the subject. By measuring the level of the labeled anti-Ig antibody, H. The level of binding between the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction, and antibodies in a specimen derived from a subject can also be measured.
  • the anti-Ig antibody may be an anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody, or the like, but is preferably an anti-IgG antibody.
  • anti-IgG antibodies are preferably monoclonal antibodies.
  • Fab, Fab', F (ab') 2 single chain antibody (scFv), VHH single domain antibody (nanobody) dsFv, dibody, fragment having specific antigen binding such as minibody (antigen-binding fragment ) can also be used. Representative examples of such methods include ELISA and immunochromatography.
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as gold colloids, silica particles, cellulose particles, magnetic particles, fluorescent particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, and the like are used for labeling anti-Ig antibodies.
  • metal colloids such as gold colloids, silica particles, cellulose particles, magnetic particles, fluorescent particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, and the like are used for labeling anti-Ig antibodies.
  • colored particles such as metal colloid particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, etc.
  • the amount of antibody can be calculated from the measured values by creating a standard curve using a standard solution whose abundance is known in advance.
  • a surface plasmon resonance sensor H. Binding of the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction, to antibodies in a specimen derived from a subject can also be detected or measured.
  • the sandwich method is preferred.
  • the sandwich method itself is well known in the field of immunoassay, and can be performed, for example, by an immunochromatography method or an ELISA method in which lateral flow immunoassay is performed.
  • sandwich methods per se are all well-known, and the method of the present invention can be carried out by the well-known sandwich method.
  • the ELISA method will be described below.
  • the Swiss outer membrane fraction or a protein (antigen) contained in the outer membrane fraction is immobilized, and H. elegans is added to the immobilized carrier.
  • a Swiss outer membrane fraction or a specimen that may contain an antibody against a protein contained in the outer membrane fraction is added and contacted to form a complex of the antigen and the antibody on the immobilized carrier.
  • an enzyme-labeled antibody that is specific to a human antibody is added and brought into contact, and the anti-Ig antibody is bound to the antigen-antibody complex on the immobilized carrier.
  • a substrate for the enzyme is added, an enzymatic reaction is allowed to occur, color development is measured by absorbance measurement, and a sandwich complex of the antigen and antibody on the plate can be detected.
  • the antigen-antibody reaction can be carried out at 4° C. to 45° C., preferably 20° C. to 40° C., more preferably 25° C. to 38° C., and the reaction time for each binding reaction is 10 minutes to 18 hours. It is preferably 10 minutes to 3 hours, more preferably 30 minutes to 2 hours.
  • H. Binding of the Swiss outer membrane fraction or proteins (antigens) contained in the outer membrane fraction to the carrier can be performed by known methods such as physical adsorption and covalent bonding using functional groups.
  • the immobilized amount is not particularly limited, but when the carrier is a 96-well microtiter plate, it is preferably several ng to several tens of ⁇ g per well.
  • the solid-phased H.I. It can be carried out by contacting the Swiss outer membrane fraction or the protein (antigen) solution contained in the outer membrane fraction with the carrier. For example, H.
  • a Swiss outer membrane fraction or a solution of proteins (antigens) contained in the outer membrane fraction can be dispensed into wells of a microtiter plate and allowed to stand for a certain period of time to solidify.
  • H After immobilizing the Swiss outer membrane fraction or proteins (antigens) contained in the outer membrane fraction, use bovine serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin to prevent non-specific binding during the assay. Blocking is preferably performed using a blocking solution containing such as.
  • the subject in the method of determining Swiss infection can be mammals such as humans, monkeys, pigs, cats, wild boars, dogs, rabbits, mice and sheep, and is preferably a human. More preferably, gastritis, chronic gastritis, goose bump gastritis, type A gastritis, gastric MALT lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, gastric cancer, gastric/duodenal ulcer, idiopathic thrombocytopenic purpura, functional dyspepsia, or a human patient suffering from Parkinson's disease.
  • the method of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively (Non-Patent Document 4).
  • a tissue sample taken from a subject as a biopsy or a liquid sample taken from a subject can be used as a specimen for the method of the present invention.
  • the specimen is not particularly limited as long as it can be used as a target for the method of the present invention. Fluid, saliva, or fractions or processed products thereof can be mentioned.
  • the H.I. Preferred specimens are blood, plasma, serum, lymph, and urine when antibodies are to be detected in the method for determining the presence of Swiss.
  • kits for measuring antibodies against the Swiss outer membrane fraction or a protein contained in the outer membrane fraction comprising at least H. It contains a Swiss outer membrane fraction or a carrier on which a protein contained in the outer membrane fraction is immobilized, and further contains a labeled anti-Ig antibody.
  • the Swiss outer membrane fraction or proteins contained in the outer membrane fraction can be appropriately prepared by methods well known to those skilled in the art with reference to the disclosure of the present specification. Moreover, the reagent of the present invention can be produced as appropriate by a method well known in the art.
  • the present invention provides a method for detecting H. H . It relates to a method for determining the presence of Switzerland.
  • the present invention relates to H.I. detection of H . It relates to a method for determining Swiss infection.
  • H. Subjects who collected the Swiss outer membrane fraction or samples in which antibodies against proteins contained in the outer membrane fraction were detected were tested for H. pneumoniae, respectively. Switzerland exists, or H. Determined to be infected with Switzerland.
  • the method of the present invention is performed by measuring the binding between the antibody in the specimen and the test reagent, whether or not it is "detected” in the determination does not necessarily mean the presence or absence of absolute detection. Instead, it may be determined in comparison with other specimens. That is, the presence/absence of detection may be determined based on the measured value instead of based on the ⁇ detection result. That is, in the method of the present invention, the step of "detecting" can be replaced with "measuring” as necessary, and whether or not it is “detected” is determined based on the measured value of the target substance and the negative target. It may be determined in comparison. For example, negative subjects, ie, H. Specimens not containing Switzerland or H.
  • the target substance When the target substance is detected in a specimen derived from a subject who is clearly not infected with Switzerland, if the measured value of the subject is equivalent to that of the negative subject, it is detected in a small amount.
  • H.I. Switzerland does not exist or H. Determined not to have infected Switzerland.
  • the subject's measurement is high compared to the negative subject's measurement, it will be labeled as "detected.” Switzerland exists, or H. Determined to be infected with Switzerland. Therefore, it is within the pre-accepted range of the present invention that the method of the present invention accepts a small measured value for subjects that are negative.
  • H. Swiss infected and H. It is possible to measure antibody titers in specimens from uninfected Swiss subjects and set a cut-off value. If it is equal to or greater than the cutoff value, the H.I. Switzerland exists, or H. It is possible to determine that Switzerland is infected.
  • the cutoff value can be determined, for example, by ROC (receiver operating characteristic curve) analysis.
  • the diagnostic accuracy (sensitivity and specificity) of the method of the present invention can be determined by ROC analysis.
  • ROC analysis was carried out according to H. Specimens collected from Swiss infected persons and H. Anti-H. The Swiss antibody is measured, the sensitivity and false positive rate (1-specificity) at each cutoff value are calculated, and plotted on a coordinate system with (1-specificity) on the horizontal axis and sensitivity on the vertical axis.
  • the diagnostic accuracy is analyzed by ROC analysis, the sensitivity is 80% or higher, preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, and the specificity is 75% or higher, preferably 80% or higher.
  • H.I. Antibodies to H. pylori are available from H. pylori.
  • Helicobacter pylori refers to an antibody against any of the constituents of the whole cell of H. pylori, ie, the cell component. For example, H.I. If the test for H. pylori is negative but shows symptoms of gastric disease, H.
  • the detection of antibodies against H. pylori may be performed simultaneously using the same specimen, or may be performed separately using different specimens collected at different times. H. Detection of antibodies to H. pylori is described in H. pylori. Detection of antibodies against proteins contained in the Swiss outer membrane fraction or the outer membrane fraction may be performed in the same manner.
  • H. Whether or not H. pylori is "detected” does not have to be the absolute presence or absence of detection, and may be determined in comparison with other specimens. That is, the presence/absence of detection may be determined based on the measured value instead of based on the ⁇ detection result. That is, in the method of the present invention, the step of "detecting" can be replaced with “measuring” as necessary, and whether or not it is “detected” is determined based on the measured value of the target substance and the negative target. It may be determined in comparison. For example, negative subjects, ie, H. pylori-free specimen or H.
  • the target substance is detected in a specimen derived from a subject who is clearly not infected with Helicobacter pylori, if the measured value of the subject is equivalent to that of the negative subject, it is detected in a small amount.
  • H.I. pylori is absent or H. pylori infection is determined.
  • the subject's measurement is high compared to the negative subject's measurement, it will be labeled as "detected.”
  • pylori is present, or H. pylori infection is determined. Therefore, it is within the pre-accepted range of the present invention that the method of the present invention accepts a small measured value for subjects that are negative.
  • H. antibodies to the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction In the present invention, H. antibodies to the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction; A kit for measuring antibodies to H. pylori is included, the kit comprising at least H. pylori. Swiss outer membrane fraction or a carrier on which proteins contained in the outer membrane fraction are immobilized, and H. It contains a carrier on which any constituent component of the whole H. pylori cell is immobilized, and further contains a labeled anti-human Ig antibody.
  • H. pylori antigen may be detected.
  • H. Detection of H. pylori antigen also results in detection of H. pylori infection can be detected.
  • H. A preferred sample for detecting H. pylori antigens is stool.
  • the present invention is a method for detecting H. antibodies to the Swiss outer membrane fraction, or proteins contained in the outer membrane fraction;
  • a kit for measuring H. pylori antigen is included, the kit comprising at least H. pylori antigen.
  • Example 1 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay).
  • Swiss medium composition Brucella Broth (BD BBL) 2.8 g Agar powder (BD BBL) 1.5 g Pyruvic acid (Sigma) 0.1 g added when preparing agar medium Skirrow Supplement (2 mL/vial, Oxoid) 0.4 mL Vitox Supplement (10 mL/vial, Oxoid) 2 mL Amphotericin B (0.25 mg/mL) 2 mL Adjust pH to 5 with 0.135 mL of concentrated hydrochloric acid 20 mL of inactivated fetal bovine serum (FBS) Distilled water was added to bring the total volume to 100 mL.
  • BD BBL Swiss medium composition Brucella Broth
  • BD BBL 2.8 g
  • Non-Patent Document 2 9 mL of agar medium was added to a 75 cm 2 flask to prepare a slant medium, and H. spp. Swiss SNTW101c strain (Non-Patent Document 2) was inoculated, 12 mL of liquid medium was added, temperature was 37°C, humidity was 100%, and microaerobic conditions (5% O 2 , 12% CO 2 , 83% N 2 ) were used. Shaking culture was performed for 1 week. After that, the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells.
  • the cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruption). 30 seconds of sonication and 5 repetitions of 30 seconds rest on the device (setting High)).
  • the disruption solution was "H. swiss whole cell suspension", the sediment was taken as "H. swiss cell outer membrane fraction" by centrifugation (30,190 G x 10 minutes), and suspended in distilled water.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • H. pylori-infected persons determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.), and H. pylori Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • Figures 1 and 2 show the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution).
  • the H. suis positive subject had an absorbance against both the H. suis whole cell and the H. suis solubilized fraction antigens. Higher absorbance was obtained with the Swiss solubilized fraction.
  • H.I. H . pylori-infected and non-infected individuals had low absorbance for all antigens. For this reason, H. In human blood infected with Swiss H. that antibodies have been produced against the Swiss solubilized fraction; It was shown for the first time that antibodies can be captured with high sensitivity by using the Swiss solubilized fraction as an antigen. This suggests that H. suis solubilized fractions may be used in humans.
  • H. pylori infection as distinct from H. pylori infection. It became clear that highly sensitive diagnosis of Swiss infection was possible.
  • Example 2 Measurement of mammalian specimen
  • the cultured H. suisse SNTW101c strain was centrifuged to collect cells. The cells were suspended in PBS, and 4-week-old female C57BL/6 mice were orally infected with 1 ⁇ 10 8 colony forming units (CFU) once.
  • the H.C. pylori strain SS1 was inoculated on a Nissui plate Helicobacter agar medium and cultured for 3 days under microaerobic conditions (5% O 2 , 12% CO 2 , 83% N 2 ) at a temperature of 37° C. and a humidity of 100%.
  • Colonies were grown in 100 mL of brucella broth (containing 10 mL of inactivated FBS and 0.4 mL of SR0147 Helicobacter pylori Selective Supplement (Dent)) at 37° C., 100% humidity, microaerophilic conditions (5% O 2 , 12%). After culturing with shaking for 3 days in CO 2 , 83% N 2 ), the cells were collected by centrifugation. The cells were suspended in PBS, and 2 ⁇ 10 8 CFU was orally administered to 4-week-old female C57BL/6 mice three times every other day. H. DNA was extracted from the gastric mucosa of Swiss-infected mice, and infection was confirmed by PCR. Also, H.I.
  • H. pylori-infected mouse gastric mucosa suspended in a buffer solution was spread on a Nissui Helicobacter agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and cultured to confirm infection.
  • Sera from H. pylori-infected mice and H. suis-infected mice 4 weeks after the last infection day were collected, respectively.
  • sera were collected from healthy mice that were not infected with any of these (non-infected).
  • H. suis whole cell suspension (4 ⁇ g/mL) or H. suis solubilized fraction (4 ⁇ g/mL) 100 ⁇ L/well dissolved in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.4) was added to 96- Dropped onto a well NUNC ImmunoPlate #439454 and left at 4° C. overnight. The next day, the cell solution was discarded, and the cells were washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times. 200 ⁇ L/well of a blocking solution (1% BSA, PBS system pH 7.4) prepared from Blocker BSA 10X in PBS (Thermo Scientific) was dropped and left at 37° C. for 1 hour.
  • a blocking solution 1% BSA, PBS system pH 7.4
  • Blocker BSA 10X in PBS (Thermo Scientific) was dropped and left at 37° C. for 1 hour.
  • the blocking solution was discarded, and the cells were washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • 50 ⁇ L/well of mouse serum diluted with a blocking solution was dropped and left at 37° C. for 1 hour.
  • the serum solution was discarded and washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • Horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat Anti-Mouse Ig, Human ads-HRP, SouthernBiotech, Inc.) diluted 100,000-fold with blocking solution was added dropwise at 50 ⁇ L/well and left at 37° C. for 1 hour.
  • the secondary antibody solution was discarded, and washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • FIGS 3 and 4 show the results of ELISA using mouse serum (3600-fold dilution).
  • the H. suis positive subject had absorbance for both the H. suis whole cell and H. suis outer membrane fraction antigens. Higher absorbance was obtained with the Swiss outer membrane fraction.
  • H.I. H . H. pylori-infected mice and non-infected mice had low absorbance for both antigens. For this reason, H. H . that antibodies against the Swiss outer membrane fraction have been produced; It was shown for the first time that antibodies can be captured with high sensitivity by using the Swiss outer membrane fraction as an antigen. This demonstrated that H. suis outer membrane fractions could be used to generate H. suis in mice. H. pylori infection as distinct from H. pylori infection. It became clear that highly sensitive diagnosis of Swiss infection was possible.
  • Example 3 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. pylori antibody titer and anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay) (1) H for ELISA . Preparation of H. pylori antigen (H. pylori extracorporeal membrane fraction) H.
  • ELISA EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay
  • Non-Patent Document 2 pylori TN2GF4 strain was prepared in brucella broth containing 10% (V/V) fetal calf serum (FCS) at a temperature of 37°C, humidity of 100%, microaerobic conditions (5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 ) for 48 hours, and then the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells. The cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor).
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor). (setting High), sonication for 30 seconds, rest for 30 seconds, repeated 5 times).
  • the disruption solution was "H. swiss whole cell suspension", the sediment was taken as "H. swiss cell outer membrane fraction" by centrifugation (30,190 G x 10 minutes), and suspended in distilled water.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • H. H. pylori extracellular membrane fraction and H. suis extracellular membrane fraction (4 ⁇ g/mL) (100 ⁇ L/well) were dropped onto a 96-well NUNC ImmunoPlate #468667 and left at 4° C. overnight. The next day, the cell solution was discarded, and the cells were washed three times with 250 ⁇ L/well of PBS-T (PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20). 200 ⁇ L/well of a blocking solution (1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0) was added dropwise and left at 37° C. for 1 hour. The blocking solution was discarded, and the cells were washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times. H.
  • PBS-T PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20
  • 200 ⁇ L/well of a blocking solution 1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0
  • H. pylori-infected persons with symptoms of gastric disease determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.) and H. pylori patients with symptoms of gastric disease.
  • Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • serum was collected from a healthy subject who had not been infected with any bacteria (non-infected).
  • 50 ⁇ L/well of human serum diluted with a specimen diluent (0.5% (V/V) BSA, PBS system pH 7.0) was added dropwise and left at 37° C. for 1 hour.
  • the serum solution was discarded and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • Horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat anti-Human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch, Inc.) was added dropwise at 50 ⁇ L/well and left at 37° C. for 1 hour. The secondary antibody solution was discarded, and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • 50 ⁇ L/well of TMB One Component HRP Microwell Substrate, (Surmodics, Inc.) was dropped to develop a blue color, and then 50 ⁇ L/well of 0.17 M sulfuric acid was dropped to change the color to yellow.
  • Absorbance at 450 nm reference wavelength: 620 nm to 630 nm
  • FIGS 5 and 6 show the results of ELISA using human serum (3,600-fold dilution).
  • H.I. In the Swiss outer membrane fraction, H. The absorbance of the swiss infected group (gastric disease - E, F, G, H) was H.C. Significantly higher results than the H. pylori infected group (stomach disease-A, B, C, D) or the non-infected group (healthy subjects-A, B, C, D) were obtained (H. Swiss infected group vs. H pylori-infected group or non-infected group: P 0.0209). This suggests that anti-H. pylori antibody and anti-H. By testing for both Swiss antibodies, H. pylori infection. H. pylori-negative and missed subjects were also tested. It became clear that a diagnosis of Swiss infection could be made.
  • Example 4 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay).
  • Swiss medium composition Brucella Broth (BD BBL) 2.8 g Agar powder (BD BBL) 1.5 g Pyruvic acid (Sigma) 0.1 g added when preparing agar medium Skirrow Supplement (2 mL/vial, Oxoid) 0.4 mL Vitox Supplement (10 mL/vial, Oxoid) 2 mL Amphotericin B (0.25 mg/mL) 2 mL Adjust pH to 5 with 0.135 mL of concentrated hydrochloric acid 20 mL of inactivated fetal bovine serum (FBS) Distilled water was added to bring the total volume to 100 mL.
  • BD BBL Swiss medium composition Brucella Broth
  • BD BBL 2.8 g Agar powder (BD BBL) 1.5
  • Non-Patent Document 2 9 mL of agar medium was added to a 75 cm 2 flask to prepare a slant medium, and H. spp. Swiss SNTW101c strain (Non-Patent Document 2) was inoculated, 12 mL of liquid medium was added, temperature was 37°C, humidity was 100%, and microaerobic conditions (5% O 2 , 12% CO 2 , 83% N 2 ) were used. Shaking culture shaking was performed for one week. After that, the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells.
  • the cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor). (setting High), sonication for 30 seconds, rest for 30 seconds, repeated 5 times).
  • the disruption liquid was used as "H. suis whole cell suspension", and the sediment was obtained by centrifugation (30, 190 G x 10 minutes) to obtain "H. suis cell outer membrane fraction", which was suspended in distilled water.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • HsvA antigenic peptides are a part of HsvA (an outer membrane protein specifically present only in H. Switzerland, composed of about 3000 amino acid residues) disclosed in International Publication WO2019/225639. 14 amino acid residues are shown.
  • EKKAVQQMENSNPD Peptide No. 11: SEQ ID NO: 1
  • EKKAVEQMENSNPD Peptide No. 11 (TKY): SEQ ID NO: 2)
  • EKDAVTSLKNSNSG Peptide No. 11 (SH8): SEQ ID NO: 3
  • EKDAVTSLENSNSG Peptide No. 11 (SH10): SEQ ID NO: 4
  • NQGTLEFLSNDVST Peptide No.
  • TNGQEVSASIDYNK Peptide No. 16: SEQ ID NO: 6
  • AKLSNFASNDALPD Peptide No. 23: SEQ ID NO: 7
  • PTTSSGASPDSSNP Peptide No. 10: SEQ ID NO: 8
  • NVDNILNMPSTTSG Peptide No. 20: SEQ ID NO: 9
  • TLTLEGTETFAQNS Peptide No. 81: SEQ ID NO: 10
  • ADIQSSQTTFANSV Peptide No. 61: SEQ ID NO: 11).
  • H. H. pylori extracorporeal membrane fraction and HsvA antigen peptide were added dropwise to 96-well NUNC ImmunoPlate #468667 and left at 4° C. overnight. The next day, the cell solution was discarded, and the cells were washed three times with 250 ⁇ L/well of PBS-T (PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20). 200 ⁇ L/well of a blocking solution (1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0) was added dropwise and left at 37° C. for 1 hour.
  • PBS-T PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20
  • 200 ⁇ L/well of a blocking solution 1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0
  • H. pylori-infected persons determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.), and H. pylori Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy). As a control, serum was collected from a healthy subject who had not been infected with any bacteria (non-infected).
  • H. H. pylori infection as distinct from H. pylori infection. Sensitive diagnosis of Swiss infection becomes possible. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Ｈ．スイスの外膜画分を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法および測定試薬の提供。　少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体を検出する試薬。

Description

菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法
　本発明は、Ｈ.スイスの外膜画分を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法に関する。
　現在、慢性胃炎、胃潰瘍や十二指腸潰瘍、胃癌、胃Ｍｕｃｏｓａ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＬＴ）リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫などに、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ヒトの胃に寄生する微好気性のグラム陰性螺旋菌、以下、「Ｈ．ピロリ」という）による感染が関与することが知られている。Ｈ．ピロリの感染検査方法として、分離培養法や尿素呼気試験（ＵＢＴ）、血清や尿中のＨ．ピロリ抗体価の測定（ＥＬＩＳＡとラッテクス凝集法）、便中のＨ．ピロリ抗原測定（イムノクロマト法）、胃生検体の迅速ウレアーゼ試験（ＲＵＴ）が主に採用されている。
　しかし、近年、Ｈ．ピロリの診断や除菌の普及によるＨ．ピロリの感染率の低下に伴い、Ｈ．ピロリ以外のヒトに重篤な胃疾患を誘発するヘリコバクターとして、ＮＨＰＨ(Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒｓ; Ｈ．ピロリ以外のヘリコバクター)が問題となってきた。ＮＨＰＨには、ヘリコバクター・スイス（以下、Ｈ．スイス）、Ｈ．ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｎｉｉ、Ｈ．ｆｅｌｉｓ、Ｈ．ｓａｌｍｏｎｉｓ、Ｈ．ａｉｌｕｒｏｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｈ．ｃｙｎｏｇａｓｔｉｃｕｓ、Ｈ．ｂａｃｕｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｌｓ、Ｈ．ｃｅｔｏｒｕｍおよびＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉが含まれ、このうちヒトの胃から見つかる大部分は、Ｈ．スイスである。
　Ｈ．ピロリは霊長類にしか感染せず、乳幼児期においてのみ近親者からの感染が想定されるが、Ｈ．スイスは年齢に関係なく、豚、猿などの動物から感染する。
　Ｈ.スイスは約１０万年前には、サルの胃に寄生していた。その後１．５万年前にブタにも感染するようになった。ブタの家畜化に伴い感染が爆発的に広まり、ヒトにも感染するようになった（非特許文献１）。世界各地から分離された１８１株のＨ.スイス遺伝子のＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｙｐｉｎｇ）解析を行ったところ、感染宿主動物により独立のクラスターを形成したが、ヒトから分離した株は、独立のクラスターを形成せず、ブタのクラスターに含まれることから、ヒトへの感染源はブタと判定された(非特許文献２)。そこで、ブタとヒトにおいて感染診断と除菌剤が必要となる。
　Ｈ．スイスの感染検査方法として、血清中のＨ．スイス抗体価の測定（ＥＬＩＳＡとラッテクス凝集法）が報告されている（特許文献１、２）。
特開２０１６－１０３３１号公報 国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号
Ｆｌａｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＳＭ　Ｊ．，Ｊａｎ；１２（１）：７７－８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｓｍｅｊ．２０１７．１４５ Ｅ．Ｒｉｍｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２０２１　Ｖｏｌ．１１８　Ｉｓｓｕｅ　１３　ｅ２０２６３３７１１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２０２６３３７１１８． Ｈａｅｓｅｂｒｏｕｃｋ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，１６（４），３３９－３４０，２０１１，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５２３－５３７８．２０１１．００８４９．ｘ Ａ．Ｄ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．，２０１９，６，１８８，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｅｄ．２０１９．００１８８（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／３１５５５６４８）
　本発明は、Ｈ．スイスの外膜画分を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法および測定試薬の提供を目的とする。
　特許文献１にはＨ．スイスのＦ２Ｒ２蛋白をプレートに固相して血清中の抗体を測定することが開示されている。そして、特許文献２にはＦ２Ｒ２蛋白質より抗体価が高いとさされるＨｓｖＡ蛋白をプレートに固相して血清中の抗体を測定することが開示されている。
　しかしながら、従来の方法より感度と特異性の高い方法が求められていた。
　今回、本発明者らは、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を用いることで、感染者の体内の抗Ｈ．スイス抗体の測定感度と特異性を高めることを新規に発見し、新しい測定法を見出した。
　より具体的には、本発明は、以下の発明に関する：
[１]　少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体を検出する試薬。
[２]　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、[１]の試薬。
[３]　検体が血液由来であることを特徴とする、[１]または[２]の試薬。
[４]　さらに、Ｈ．ピロリの菌体成分またはＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体またはＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、[１]～[３]のいずれかの試薬。
[５]　ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマト用試薬である、[１]～[４]のいずれかの試薬。
[６]　以下の工程を含む、被験体由来の検体の抗Ｈ．スイス外膜画分または外膜画分に含まれる蛋白と結合する抗体を検出することを特徴とする方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
[７]　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、[６]の方法。
[８]　検体が血液由来であることを特徴とする、[６]または[７]の方法。
[９]　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体も検出することを特徴とする、[６]～[８]のいずれかの方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
[１０]　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、[６]～[８]のいずれかの方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分に対する抗体と結合した、前記検体中のＨ．ピロリ菌体成分の抗原を検出する工程。
[１１]　[１]～[５]のいずれかの試薬を用いた測定および／または[６]～[１０]のいずれかの方法により抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定する、Ｈ．スイスの感染の検出方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-009302号の開示内容を包含する。
　Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を用いることで、感染者の体内の抗Ｈ．スイス抗体を高感度に測定することができる。Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質は、Ｈ．スイス感染診断対象体由来血液中の抗Ｈ．スイス抗体の有無または抗体価を測定するために使用することができる。
検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体またはＨ.スイス外膜画分を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体（図２Ａ）またはＨ.スイス外膜画分（図２Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す図である。 検体としてマウス血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体またはＨ.スイス外膜画分を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてマウス血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体（図４Ａ）またはＨ.スイス外膜画分（図４Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.ピロリ外膜画分またはＨ.スイス外膜画分を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.ピロリ外膜画分（図６Ａ）またはＨ.スイス外膜画分（図６Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス外膜画分またはＨ.スイスのＨｓＶＡの部分ペプチド（配列番号１～５）を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス外膜画分またはＨ.スイスのＨｓＶＡの部分ペプチド（配列番号６～１１）を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。
　以下、本発明の方法について説明する。
　本発明は、被験体の生体試料中のＨ．スイスの菌体の外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を検出する方法、および該抗体を検出する試薬である。本発明は、被験体におけるＨ．スイスの存在を判定する方法、または被験体のＨ．スイスの感染の検出方法でもある。あるいは、被験体のＨ．スイス感染症を診断するための補助的データを取得する方法である。
（Ｈ．スイス：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ）
　本明細書において、「Ｈ．スイス」とは、５０種類以上報告されているヘリコバクター属細菌の中で、ＮＨＰＨ（Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｓ; Ｈ．ピロリ以外のヘリコバクター)あるいは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ（広義のヘリコバクター・ハイルマニイ)に含まれるＨ．スイスの菌種を意味する（非特許文献３）。Ｈ．スイスは、ヒト以外にブタ、サル、イノシシ、ネコ、イヌなどの胃に感染することが知られている。本明細書におけるＨ．スイスが単離された感染哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、イノシシ、またはブタであってよい。
（Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質）
　本明細書において、「Ｈ．スイス外膜画分」とは、Ｈ．スイスを超音波破砕後のＨ. スイス菌体外膜断片を集めることで調製した画分である。超音波破砕は、Ｈ．スイス菌体を緩衝液に懸濁させ超音波破砕機を用いて行うことができる。超音波破砕機としてサンプル密閉型超音波破壊装置 Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（ビーエム機器）サンプル密閉型超音波破壊装置 Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（ビーエム機器）が挙げられる。超音波破砕により、Ｈ．スイス菌体は破壊され、菌体外膜断片が残る。菌体外膜断片は、遠心分離やろ過により回収することができる。「Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質」とは、Ｈ．スイスを超音波破砕後のＨ.スイス菌体外膜断片を集めることで調製した画分に存在するＨ. スイス由来の蛋白質をいう。
（Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を検出する方法および試薬）
　Ｈ．スイス外膜画分に対する抗体は、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質、糖等の抗原に対する抗体をいい、種々の物質に対する複数の抗体が含まれ得る。本発明において、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質、糖等の抗原のうち少なくともいずれかの抗原に対する抗体をＨ．スイス外膜画分に対する抗体という。また、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体は、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる抗原のうち蛋白質に対する抗体をいう。Ｈ．スイス外膜画分には複数の蛋白質が含まれており、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体は、種々の蛋白質に対する複数の抗体が含まれ得る。本発明において、Ｈ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質のいずれかの蛋白質のうち少なくともいずれかの蛋白質に対する抗体をＨ．スイス外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体という。実際には、Ｈ．スイスが感染した被験体において、体内でＨ．スイス菌体が分解された結果、被験体中でＨ．スイス外膜画分に対する抗体、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体が産生される。
　なお、抗体がＨ．スイス外膜画分に含まれる抗原と結合することを、抗体がスイス外膜画分と結合するという。
　Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を検出する試薬は、公知の方法に適用し得る試薬として作製することができる。公知の方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；イムノブロッティング法；イムノクロマト法；クロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。本発明の試薬が、所望の測定法に適用することが可能であるか否かは、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を含む検体または該検体と同じ濃度のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を含むサンプルを用いて、各測定法を実施することにより、検出可能であるか否かを測定することで確認することができる。
　Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体をＨ.スイス感染のマーカーとして用いることができる。
　すなわち、被験体がＨ．スイスに感染しているか否かは、被験体自身の免疫系が生み出したＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体の存在を確認することにより決定することができる。これらの抗体の存在は、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を利用した抗原抗体反応により検出し確認することができる。Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を測定試薬として利用したＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体の検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等の免疫学的測定法により行うことができる。
　一態様において、本発明は、以下の工程を含むＨ．スイス感染の判定方法に関する：
（ａ）被験者由来の検体を本発明のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と接触させること、
（ｂ）Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程、および
（ｃ）Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定し、一方、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した抗体が検出されなかった被験体を、Ｈ．スイスに感染していないと判定する工程。
　他の態様において、本発明は、以下工程を含むＨ．スイス感染の判定方法に関する：
（ａ）被験体由来の検体を、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と接触させる工程、
（ｂ）Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した、前記検体中の抗体のレベルを測定する工程、および
（ｃ）測定された抗体のレベルが、同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルよりも高い場合、該被験体をＨ．スイスに感染していると判定し、一方、測定された抗体のレベルが、同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルと同等か低い場合、該被験体を、Ｈ．スイスに感染していないと判定する工程。ここで、陰性対象とは、Ｈ.スイスに感染していない被験体由来の検体をいう。抗体のレベルとは、抗体の定量値、すなわち抗体価をいい、例えば、検体中の濃度で表される。また、抗体のレベルの測定は、抗体の検出に含まれる。
　Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と被験体由来の検体中の抗体が結合したか否かは、以下に例示される方法で確認すればよい。例えば、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を固相化担体に結合させ、被験体由来の検体を、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と接触させた後に、反応系を洗浄して非結合の抗体を除去する。この結果、反応系には、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と被験体由来の検体中の抗体が結合した複合体が存在する。その後、標識化した抗Ｉｇ抗体と接触させて、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した被験体由来の抗体と該標識抗Ｉｇ抗体とを結合させた後に、反応系を洗浄して非結合の標識抗Ｉｇ抗体を除去して、残った標識抗Ｉｇ抗体の標識を検出し、該標識抗Ｉｇ抗体の標識が検出された場合にＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と被験体由来の検体中の抗体が結合したと判断することができる。該標識抗Ｉｇ抗体のレベルを測定することで、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と被験体由来の検体中の抗体との結合レベルを測定することもできる。抗Ｉｇ抗体は、抗ＩｇＧ抗体でも、抗ＩｇＭ抗体等でもよいが、好ましくは抗ＩｇＧ抗体である。また、抗ＩｇＧ抗体は好ましくはモノクローナル抗体を用いる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨシングルドメイン抗体（ナノボディ）ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いることもできる。このような方法の代表例として、ＥＬＩＳＡ等やイムノクロマト法を挙げることができる。抗Ｉｇ抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、磁性粒子、蛍光粒子、着色ポリスチレン粒子および着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。結合レベルを指標として利用する場合、予め存在量が判明している標準溶液を用いて標準曲線を作成することにより、測定値から抗体量を計算することができる。あるいは、表面プラズモン共鳴センサーを用いて、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と被験体由来の検体中の抗体の結合を検出または測定することもできる。
　上記の免疫測定法の中でも、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばラテラルフロー式に免疫測定を行うイムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は周知のサンドイッチ法により行うことができる。以下、ＥＬＩＳＡ法について説明する。
　ＥＬＩＳＡ用プレートに、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質(抗原）を固相化し、該固相化担体にＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を含む可能性がある検体を添加して接触させ、固相化担体上で抗原と抗体の複合体を形成させる。さらに、ヒト抗体に対する特異的抗体（抗Ｉｇ抗体）であって酵素で標識した抗体を添加して接触させ、固相化担体上の抗原と抗体の複合体に抗Ｉｇ抗体を結合させる。次いで、酵素に対する基質を添加し、酵素反応を行わせ、発色を吸光度の測定により測定しプレート上の抗原と抗体のサンドイッチ複合体を検出すればよい。
　抗原抗体反応は４℃～４５℃、好ましくは２０℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３８℃で行うことができ、また、それぞれの結合反応の反応時間は、１０分～１８時間、より好ましくは１０分～３時間、さらに好ましくは３０分～２時間程度である。
　Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質(抗原）の担体への結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。固相化量は、特に限定されないが担体が96ウェルマイクロタイタープレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべきＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質(抗原）の溶液を担体と接触させることにより行うことができる。例えば、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質(抗原）の溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質(抗原）を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うことが好ましい。
　Ｈ．スイスは広く哺乳動物に感染することから、本発明のＨ．スイスの存在を判定する方法及びＨ．スイスへの感染を判定する方法における被験体は、ヒト、サル、ブタ、ネコ、イノシシ、イヌ、ウサギ、ネズミ及びヒツジ等の哺乳動物とすることができ、好ましくは、ヒトである。また、より好ましくは、胃炎、慢性胃炎、鳥肌胃炎、Ａ型胃炎、胃ＭＡＬＴリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胃癌、胃・十二指腸潰瘍、特発性血小板減少紫斑病、機能性ディスペプシア、またはパーキンソン病に罹患しているヒト患者である。また、本発明の方法は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる（非特許文献４）。
　本発明のＨ．スイスの存在を判定する方法において用いる検体としては、例えば、生検として被験体から採取した組織試料または被験体から採取した液体試料を使用することができる。検体は、本発明の方法の対象として用い得るものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、便、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のＨ．スイスの存在を判定する方法において抗体を検出対象とする場合には、好ましい検体は、血液、血漿、血清、リンパ液、及び尿である。
　本発明は、検体中のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗Ｉｇ抗体を含む。
　本発明のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質は、本明細書の開示を参照して当業者周知の方法により適宜調製することができる。また、本発明の試薬は、当該技術分野周知の方法により、適宜製造することができる。
　一態様において、本発明は、検体中の、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を検出する方法を含む、当該検体を採取して被験体におけるＨ．スイスの存在を判定する方法に関する。特に、本発明は、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体を検出することを含む、被験体におけるＨ．スイスの感染を判定する方法に関する。本方法において、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体が検出された検体を採取した被験体は、それぞれＨ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定される。
　本発明の方法が、前記検体中の抗体と、被検試薬との結合を測定することにより行われる場合、判定において「検出された」か否かは、絶対的な検出の有無である必要はなく、他の検体との比較において決定してもよい。すなわち、±の検出結果に基づくものではなく、測定値から検出の有無を決定してもよい。すなわち、本発明の方法において、「検出する」工程は、必要に応じて「測定する」と置き換えることができ、「検出された」か否かは、対象物質の測定値に基づき陰性対象との比較において決定してもよい。例えば、陰性対象、即ち、Ｈ．スイスを含まない検体またはＨ．スイスに感染していないことが明らかな被験体由来の検体等において目的の物質が検出される場合、検被体の測定値が当該陰性対象の測定値と同等であれば、微量ながら検出されていても、本発明の方法においては「検出されなかった」としてＨ．スイスが存在しない、またはＨ．スイスに感染していないと判定される。一方で、陰性対象の測定値と比較して、被験体の測定値が高い場合には、「検出された」としてＨ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定される。よって、本発明の方法において、陰性である対象についてわずかな測定値が認められることは、本発明が予め許容する範囲内である。
　本発明の方法においては、Ｈ．スイス感染者とＨ．スイス非感染者の検体中の抗体の抗体価を測定し、カットオフ値を設定することができる。カットオフ値以上であれば、Ｈ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定することが可能である。
　カットオフ値は、例えば、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ：受信者動作特性曲線）解析により定めることができる。また、ＲＯＣ解析により本発明の方法による診断精度（感度及び特異度）を決定することができる。ＲＯＣ解析は、Ｈ．スイス感染者から採取した検体とＨ．スイス非感染者から採取した検体について抗Ｈ．スイス抗体を測定し、各カットオフ値での感度及び偽陽性率（１－特異度）を算出し、横軸を（１－特異度）とし、縦軸を感度とした座標上にプロットする。ＲＯＣ解析により診断精度を解析した場合の感度は８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上であり、特異度は７５％以上、好ましくは８０％以上であることが良い。
（Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗体またはＨ．ピロリ抗原の検出）
　本発明は同一の被験体においてＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体とＨ．ピロリに対する抗体を検出する方法および該方法に用いる試薬も包含する。ここで、Ｈ．ピロリに対する抗体は、Ｈ．ピロリの全菌体のいずれかの構成成分、すなわち菌体成分に対する抗体をいう。例えばＨ．ピロリの検査で陰性だが胃疾患の症状が示される場合は、Ｈ．スイスの感染が原因の可能性が考えられる。同一の被検体からＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体とＨ．ピロリに対する抗体を検出することで、Ｈ．ピロリの感染の有無だけではなく、これまでＨ.ピロリ陰性で見逃されていた被検体に対してもＨ.スイス感染の確認をすることができる。早期に感染を確認することで、適切な治療方針を定めることができる。同一の被験体由来の検体はＨ．ピロリとＨ．スイスで同じであっても、異なってもよい。すなわち、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体の検出とＨ．ピロリに対する抗体の検出は、同じ検体を用いて同時に行ってもよいし、別の時に採取された異なる検体を用いて別途行ってもよい。Ｈ．ピロリに対する抗体の検出は、Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体の検出と同様の方法で行えばよい。
　Ｈ．ピロリの判定においても「検出された」か否かは、絶対的な検出の有無である必要はなく、他の検体との比較において決定してもよい。すなわち、±の検出結果に基づくものではなく、測定値から検出の有無を決定してもよい。すなわち、本発明の方法において、「検出する」工程は、必要に応じて「測定する」と置き換えることができ、「検出された」か否かは、対象物質の測定値に基づき陰性対象との比較において決定してもよい。例えば、陰性対象、即ち、Ｈ．ピロリを含まない検体またはＨ．ピロリに感染していないことが明らかな被験体由来の検体等において目的の物質が検出される場合、検被体の測定値が当該陰性対象の測定値と同等であれば、微量ながら検出されていても、本発明の方法においては「検出されなかった」としてＨ．ピロリが存在しない、またはＨ．ピロリに感染していないと判定される。一方で、陰性対象の測定値と比較して、被験体の測定値が高い場合には、「検出された」としてＨ．ピロリが存在する、またはＨ．ピロリに感染していると判定される。よって、本発明の方法において、陰性である対象についてわずかな測定値が認められることは、本発明が予め許容する範囲内である。
　本発明は、検体中のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体、およびＨ．ピロリに対する抗体を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を固相化した担体およびＨ．ピロリ全菌体のいずれかの構成成分を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗ヒトＩｇ抗体を含む。
　さらに、被験体由来の試料中のＨ．ピロリ抗原を検出してもよい。Ｈ．ピロリ抗原の検出によってもＨ．ピロリの感染を検出することができる。Ｈ．ピロリ抗原を検出するための試料は糞便が好ましい。本発明は、検体中のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質に対する抗体、およびＨ．ピロリ抗原を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質を固相化した担体およびＨ．ピロリに対する抗体を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗ヒトＩｇ抗体を含む。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）ヒト検体の測定
ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.スイス抗体価の測定
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２．８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１．５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　 ０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial,Oxoid)　　　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial,Oxoid)　　　　　　　　　　　　 ２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　　　　　　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（非特許文献２）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とし、遠心分離（３０，１９０ Ｇ ｘ １０分間）により沈渣を「Ｈ．スイス菌体外膜画分」とし、蒸留水に懸濁した。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　０．１Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解したＨ．スイス全菌体懸濁液またはＨ.スイス菌体外膜画分（４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４３９４５４へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１０Ｘ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より調製したブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．４）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｈ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、およびＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。ブロッキング溶液を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液を用いて１００,０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｕｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）,Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.（ＫＰＬ）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、１Ｎ塩酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清（３６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図１および図２に示す。Ｈ.スイス陽性の対象はＨ.スイス全菌体およびＨ.スイス可溶化画分のいずれの抗原に対しても吸光度が得られたが、Ｈ．スイス可溶化画分でより高い吸光度が得られた。また、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染者および非感染者はいずれの抗原に対する吸光度も低かった。このことから、Ｈ．スイスに感染したヒト血液中にＨ．スイス可溶化画分に対する抗体が産生されていること、および、Ｈ．スイス可溶化画分を抗原として用いることで、高感度に抗体を捉えられることが初めて示された。これにより、Ｈ.スイス可溶化画分を用いることにより、ヒトにおいてＨ．ピロリ感染と区別してＨ．スイス感染の高感度な診断ができることが明らかとなった。
（実施例２）哺乳動物検体の測定
　培養したＨ.スイス　ＳＮＴＷ１０１ｃ株を遠心分離により菌体を集めた。菌体はＰＢＳに懸濁し、4週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスへ１ｘ１０８Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ＣＦＵ）を１回経口感染投与した。一方、－８０℃保存のＨ．ピロリＳＳ１株をニッスイプレートヘリコバクター寒天培地に植菌し、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で３日培養し、生じたコロニーを１００ ｍＬのブルセラブロス（１０ｍLの非働化ＦＢＳと０．４ｍLのＳＲ０１４７ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｄｅｎｔ）を含む）で温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で３日間振とう培養を行った後に、遠心分離により菌体を集めた。菌体はＰＢＳに懸濁し、４週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスへ２ｘ１０８ＣＦＵを１日置きに３回経口投与した。Ｈ．スイスを感染させたマウス胃粘膜からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲで感染を確認した。また、Ｈ．ピロリを感染させたマウス胃粘膜を緩衝液に懸濁した液をニッスイヘリコバクター寒天培地（日水製薬）に塗布し、培養して感染を確認した。最終感染日から４週間後のＨ.ピロリ感染マウス、およびＨ.スイス感染マウスからの血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれにも感染していない健常なマウスからの血清を採取した（非感染）。
　０．１Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解したＨ.スイス全菌体懸濁液（４μｇ/ｍＬ）またはＨ.スイス可溶化画分（４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４３９４５４へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ １０Ｘ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より調製したブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．４）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液を用いて希釈したマウス血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液を用いて１００,０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ, Ｈｕｍａｎ ａｄｓ－ＨＲＰ，ＳｏｕｔｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｕｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、１Ｎ塩酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長: ６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　マウス血清（３６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図３および図４に示す。Ｈ.スイス陽性の対象はＨ.スイス全菌体及びＨ.スイス外膜画分のいずれの抗原に対しても吸光度が得られたが、Ｈ．スイス外膜画分でより高い吸光度が得られた。また、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染マウス及び非感染マウスはいずれの抗原に対する吸光度も低かった。このことから、Ｈ．スイスに感染したマウス血液中にＨ．スイス外膜画分に対する抗体が産生されていること、及び、Ｈ．スイス外膜画分を抗原として用いることで、高感度に抗体を捉えられることが初めて示された。これにより、Ｈ.スイス外膜画分を用いることにより、マウスにおいてＨ．ピロリ感染と区別してＨ．スイス感染の高感度な診断ができることが明らかとなった。
（実施例３）ヒト検体の測定
　ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.ピロリ抗体価および抗Ｈ.スイス抗体価の測定
（１）ＥＬＩＳＡ用Ｈ．ピロリ抗原（Ｈ．ピロリ菌体外膜画分）の調製
　Ｈ．ピロリ　ＴＮ２ＧＦ４株（非特許文献２）は、１０％（Ｖ/Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むブルセラブロスで温度３７℃、湿度１００％、微好気条件（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２）で４８時間振とう培養を行った後で、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．ピロリ全菌体懸濁液」とし、遠心分離（３０，１９０ Ｇ ｘ １０分間）により沈渣を「Ｈ．ピロリ菌体外膜画分」とし、蒸留水に懸濁した。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
（２）ＥＬＩＳＡ用Ｈ．スイス抗原（Ｈ．スイス菌体外膜画分）の調製
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２.８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１.５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　　 ０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　　 ２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　　　　　　 　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養振を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とし、遠心分離（３０，１９０ Ｇ ｘ １０分間）により沈渣を「Ｈ．スイス菌体外膜画分」とし、蒸留水に懸濁した。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したＨ．ピロリ菌体外膜画分およびＨ.スイス菌体外膜画分（４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４６８６６７へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。胃疾患の症状を有するＨ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、および胃疾患の症状を有するＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。検体希釈液（０．５％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。二次抗体希釈液（１．０％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて２０，０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ,（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、０．１７Ｍ硫酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清（３，６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図５および図６に示す。Ｈ．ピロリ菌体外膜画分では、Ｈ．ピロリ感染群（胃疾患‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の吸光度がＨ．スイス感染群（胃疾患‐Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）または非感染群（健常人‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）よりも優位に高い結果が得られた（Ｈ．ピロリ感染群 ｖｓ．Ｈ．スイス感染群：Ｐ＝０．０２０９、Ｈ．ピロリ感染群 ｖｓ．非感染群：Ｐ＝０．０２０２）。また、Ｈ．スイス菌体外膜画分では、Ｈ．スイス感染群（胃疾患‐Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の吸光度がＨ．ピロリ感染群（胃疾患‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または非感染群（健常人‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）よりも優位に高い結果が得られた（Ｈ．スイス感染群 ｖｓ．Ｈ．ピロリ感染群 ｏｒ 非感染群：Ｐ＝０．０２０９）。このことより、同一の被検体に対し抗Ｈ．ピロリ抗体と抗Ｈ．スイス抗体の両方の検査をすることで、Ｈ．ピロリ感染の有無だけではなく、今までＨ．ピロリ陰性で見逃されていた対象についても、Ｈ．スイス感染と診断できることが明らかとなった。
（実施例４）ヒト検体の測定
　ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.スイス抗体価の測定
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２.８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１.５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　　　０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　 ２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　 　　　　　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（非特許文献２）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養振を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ G ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とし、遠心分離（３０，１９０ G ｘ １０分間）により沈渣を「Ｈ．スイス菌体外膜画分」とし、蒸留水に懸濁した。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　ＨｓｖＡ抗原ペプチド（１１種）は、国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号で開示されているＨｓｖＡ（Ｈ．スイスにのみ特異的に存在する外膜蛋白質で、約３０００アミノ酸残基で構成される）の一部である１４アミノ酸残基を示す。
ＥＫＫＡＶＱＱＭＥＮＳＮＰＤ（ペプチドＮｏ．１１：配列番号１）、
ＥＫＫＡＶＥＱＭＥＮＳＮＰＤ（ペプチドＮｏ．１１（ＴＫＹ）：配列番号２）、
ＥＫＤＡＶＴＳＬＫＮＳＮＳＧ（ペプチドＮｏ．１１（ＳＨ８）：配列番号３）、
ＥＫＤＡＶＴＳＬＥＮＳＮＳＧ（ペプチドＮｏ．１１（ＳＨ１０）：配列番号４）、
ＮＱＧＴＬＥＦＬＳＮＤＶＳＴ（ペプチドＮｏ．１９（ＴＫＹ）：配列番号５）、
ＴＮＧＱＥＶＳＡＳＩＤＹＮＫ（ペプチドＮｏ．１６：配列番号６）、
ＡＫＬＳＮＦＡＳＮＤＡＬＰＤ（ペプチドＮｏ．２３：配列番号７）、
ＰＴＴＳＳＧＡＳＰＤＳＳＮＰ（ペプチドＮｏ．１０：配列番号８）、
ＮＶＤＮＩＬＮＭＰＳＴＴＳＧ（ペプチドＮｏ．２０：配列番号９）、
ＴＬＴＬＥＧＴＥＴＦＡＱＮＳ（ペプチドＮｏ．８１：配列番号１０）、及び
ＡＤＩＱＳＳＱＴＴＦＡＮＳＶ（ペプチドＮｏ．６１：配列番号１１）。
　０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したＨ．ピロリ菌体外膜画分およびＨｓｖＡ抗原ペプチド（各４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４６８６６７へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｈ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、およびＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。検体希釈液（０．５％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。二次抗体希釈液（１．０％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて２０，０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ,（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、０．１７Ｍ硫酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清（３，６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図７－１および７－２に示す。Ｈ．スイス菌体外膜画分ではＨ．スイス感染者に対して吸光度が最小であった検体でも０．６５８（Ａｂｓ．４５０ｎｍ～６３０ｎｍ）と高い吸光度が得られ、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染者および非感染者に対しては吸光度が最大であった検体でも０．４６１（Ａｂｓ．４５０ｎｍ～６３０ｎｍ）に止まり、Ｈ．スイス感染者と非感染者とを明確に区別することができた。一方ＨｓｖＡ抗原ペプチドではいずれの配列ペプチドにおいてもＨ．スイス感染者に対して高い吸光度が得られず、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染者や非感染者に対する吸光度と明確に区別することができなかった。このことから、Ｈ．スイス菌体外膜画分を用いることにより、ＨｓｖＡ抗原ペプチドを用いた検出系よりも、感度・特異度ともに優れたＨ．スイスの診断ができることが明らかとなった。
　本発明の方法により、Ｈ．ピロリ感染と区別してＨ．スイス感染の高感度な診断が可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
配列番号１～１１：合成

Claims (11)

  1. 　少なくともＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体を検出する試薬。
  2. 　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、請求項１記載の試薬。
  3. 　検体が血液由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の試薬。
  4. 　さらに、Ｈ．ピロリの菌体成分またはＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体またはＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の試薬。
  5. 　ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマト用試薬である、請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬。
  6. 　以下の工程を含む、被験体由来の検体の抗Ｈ．スイス外膜画分または外膜画分に含まれる蛋白質と結合する抗体を検出することを特徴とする方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．スイス外膜画分、または外膜画分に含まれる蛋白質と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
  7. 　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
  8. 　検体が血液由来であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体も検出することを特徴とする、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
  10. 　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分に対する抗体と結合した、前記検体中のＨ．ピロリ菌体成分の抗原を検出する工程。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の試薬を用いた測定および／または請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法により抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定する、Ｈ．スイスの感染の検出方法。
PCT/JP2023/002329 2022-01-25 2023-01-25 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 WO2023145788A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-009302 2022-01-25
JP2022009302 2022-01-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023145788A1 true WO2023145788A1 (ja) 2023-08-03

Family

ID=87471513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/002329 WO2023145788A1 (ja) 2022-01-25 2023-01-25 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023145788A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10307142A (ja) * 1997-05-06 1998-11-17 Fujirebio Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測定試薬及び該試薬を用いる測定方法
US20090285856A1 (en) * 2006-11-14 2009-11-19 Universiteit Gent Helicobacter species and cultivation thereof
WO2019225639A1 (ja) * 2018-05-23 2019-11-28 学校法人北里研究所 ヘリコバクター・スイス感染の診断法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10307142A (ja) * 1997-05-06 1998-11-17 Fujirebio Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測定試薬及び該試薬を用いる測定方法
US20090285856A1 (en) * 2006-11-14 2009-11-19 Universiteit Gent Helicobacter species and cultivation thereof
WO2019225639A1 (ja) * 2018-05-23 2019-11-28 学校法人北里研究所 ヘリコバクター・スイス感染の診断法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUI, HIDENORI ET AL.: "Development of the rapid diagnostic methods of Helicobacter suis infection", JAPANESE JOURNAL OF HELICOBACTER RESEARCH, vol. 21, no. 2, 2020, pages 121 - 127, XP009547849 *
MORIMOTO, NORIHITO ET AL.: "Development of testing method using H. pylori membrane protein for Helicobacter pylori-related extra-gastrointestinal diseases", JOURNAL OF JAPANESE SOCIETY OF LABORATORY MEDICINE, NIPPON RINSHO BYORI GAKKAI, TOKYO., JP, vol. 64, no. Suppl., 1 January 2016 (2016-01-01) - 4 September 2016 (2016-09-04), JP , pages 32, XP009548386, ISSN: 0047-1860 *
RIMBARA EMIKO, SUZUKI MASATO, MATSUI HIDENORI, NAKAMURA MASAHIKO, MORIMOTO MISAKO, SASAKAWA CHIHIRO, MASUDA HIROKI, NOMURA SACHIYO: "Isolation and characterization of Helicobacter suis from human stomach", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 118, no. 13, 30 March 2021 (2021-03-30), XP093082235, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.2026337118 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112679605B (zh) 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
US20150192583A1 (en) Hbv immunocomplexes for response prediction and therapy monitoring of chronic hbv patients
JP7178224B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法及びキット
CN110850100A (zh) 一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒
US20220120737A1 (en) Method for detecting sars-cov-2-specific serum human immunoglobulins
EP2673646A1 (en) Diagnostic method for urinary tract infection
US20230333097A1 (en) KIT FOR DETECTING ANTI-VINCULIN-IMMUNOGLOBULIN G (IgG) ANTIBODY
JP2024056971A (ja) ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
KR101678428B1 (ko) 폐렴구군 검출방법
JPWO2019225639A1 (ja) ヘリコバクター・スイス感染の診断法
WO2020158858A1 (ja) 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法
US20170205407A1 (en) Proteins used for the diagnosis of lyme borreliosis
WO2023145788A1 (ja) 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法
WO2023145787A1 (ja) 菌体可溶化画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法
JP5204036B2 (ja) 肺炎球菌の検出方法
WO2022265065A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット、並びにモノクローナル抗体又はその抗体断片
WO2023145789A1 (ja) 全菌体を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法
JP6867529B1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ検出用抗体
CZ20023063A3 (cs) Způsob detekce Helicobacter pylori a heilmanii ve vzorcích stolice, slin a bioptickém materiálu
WO2007139099A1 (ja) 新規な酸化ｌｄｌ複合体及びその検知方法
WO2022265066A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫測定方法及び免疫測定キット
WO2020158811A1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット
WO2022054754A1 (ja) 敗血症原因細菌の免疫学的分析方法及び該方法に用いるモノクローナル抗体
JP7315966B2 (ja) 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法
EP4033247A1 (en) Multi-species immunoassays for detecting antibodies anti-sars-cov-2 using protein a for detection of captured antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23746998

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1