WO2022054754A1 - 敗血症原因細菌の免疫学的分析方法及び該方法に用いるモノクローナル抗体 - Google Patents

敗血症原因細菌の免疫学的分析方法及び該方法に用いるモノクローナル抗体 Download PDF

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lipopolysaccharide derived
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lipopolysaccharide
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勇輝 ▲高▼良
知啓 三浦
修 宮崎
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Definitions

  • the present invention relates to an immunological analysis method for sepsis-causing bacteria and a monoclonal antibody used in the method.
  • Sepsis means a condition in which an infectious disease causes serious organ damage.
  • the prognosis of sepsis varies depending on the pathogenic microorganism, background factors of the infected patient, and the quality of intervention. Although it cannot be said unconditionally, it is estimated that 100,000 people die in one year in Japan.
  • LPS lipopolysaccharide
  • a Limulus reagent using the blood coagulation reaction of horseshoe crab is used (Patent Document 1).
  • Limulus reagents have been used to diagnose or assist in the diagnosis of sepsis. In sepsis, it is necessary to identify the causative bacteria at an early stage in order to determine the treatment policy.
  • the Limulus reagent collectively analyzes LPS of many types of Gram-negative bacteria, there is a problem that it is necessary to identify the bacterial species by another protocol.
  • An object of the present invention is to provide an immunological analysis method for sepsis-causing bacteria, which can identify sepsis-causing bacteria by a simple operation.
  • the present inventors have diligently studied to solve the above problems. Then, a monoclonal antibody that specifically recognizes lipopolysaccharide derived from pneumoniae and a monoclonal antibody that specifically recognizes lipopolysaccharide derived from Escherichia coli were produced, and the present invention was completed. Specifically, the present invention is as follows. ⁇ 1> An immunological analysis method for sepsis-causing bacteria in biological samples.
  • An immunological analysis method comprising contacting at least one of the monoclonal antibodies with a biological sample, wherein the causative bacterium for sepsis is Klebsiella pneumoniae or Escherichia coli.
  • ⁇ 2> Crossover of a monoclonal antibody that reacts with the lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae but does not react with the lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae and the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli to the lipopolysaccharide derived from septicemia-causing bacteria other than Klebsiella pneumoniae.
  • the immunometric analysis method according to ⁇ 1> wherein the rate is less than 10%.
  • ⁇ 3> Crossover rate of monoclonal antibodies that react with the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but do not react with the lipopolysaccharide derived from Pyogenic bacillus and the lipopolysaccharide derived from pneumonia rod bacteria to the lipopolysaccharide derived from sepsis-causing bacteria other than Escherichia coli.
  • ⁇ 4> As the monoclonal antibody, a solid phase antibody immobilized on an insoluble carrier and a labeled antibody bound to a labeling substance are used, and the solid phase antibody and the labeled antibody are the same monoclonal antibody, ⁇ 1> to ⁇ 3. > The immunological measurement method according to any one of. ⁇ 5>
  • the monoclonal antibody that reacts with the lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa but does not react with the lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa and the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli is an IgM antibody, any of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • a monoclonal antibody that reacts with the lipopolysaccharide derived from Pneumococcus but does not react with the lipopolysaccharide derived from Pyogenic bacillus and the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli is a monoclonal antibody produced by the hybrid dome of accession number NITE BP-03241.
  • the monoclonal antibody that reacts with the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but does not react with the lipopolysaccharide derived from Pyogenic bacillus and the lipopolysaccharide derived from Pneumococcus is an IgM antibody.
  • a monoclonal antibody that reacts with the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but does not react with the lipopolysaccharide derived from Pyogenic bacillus and the lipopolysaccharide derived from Pneumococcus is a monoclonal antibody produced by the hybrid dome of accession number NITE BP-03242.
  • ⁇ 9> The immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the biological sample is blood, plasma, or serum.
  • ⁇ 13> A monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but does not react with lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa and lipopolysaccharide derived from pneumococcus.
  • ⁇ 14> The monoclonal antibody according to ⁇ 13>, wherein the crossover rate to lipopolysaccharide derived from a sepsis-causing bacterium other than Escherichia coli is 10% or less.
  • the monoclonal antibody according to ⁇ 13> which is produced from a hybridoma of accession number NITE BP-03242.
  • the immunological analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, further comprising a step of measuring a signal derived from the labeled substance and a step of comparing the measured value of the signal with the cutoff value.
  • the biological sample in the present invention includes solid tissues and body fluids derived from living organisms (organisms), and it is preferable to use body fluids.
  • the biological sample in the present invention is more preferably blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, tears, ear leak, or prostatic fluid, more preferably blood, serum or plasma, and even more preferably septicemia.
  • Living organisms or subjects include humans or animals (eg, monkeys, dogs, cats, mice, guinea pigs, rats, hamsters, etc.) and are preferably humans.
  • the biological sample may be in vivo or in vitro.
  • the term "sepsis-causing bacterium” means a bacterium that causes sepsis, such as pneumoniae, streptococcus, staphylococcus, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa. In the immunological analysis method of the present invention, it can be determined that the patient is suffering from sepsis and is caused by Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, or both of them.
  • the term "sepsis” herein includes both sepsis and septic shock. Sepsis refers to a condition in which an infection causes serious organ damage.
  • Septic shock refers to a condition in which acute circulatory insufficiency causes severe cell damage and metabolic disorders that can increase mortality.
  • pneumonia pneumoniae means Klebsiella pneumoniae, which is a gram-negative bacillus.
  • Escherichia coli means Escherichia coli, which is a gram-negative bacillus.
  • the present invention has the advantage of being able to identify not only the presence or absence of sepsis but also the causative bacteria of sepsis (Klebsiella pneumoniae or Escherichia coli) with sensitivity and reactivity equal to or higher than that of the Limulus reagent. That is, it has the advantage that it can replace the Limulus reagent actually used in the medical field at present and can identify the causative bacterium of sepsis.
  • lipopolysaccharide means a complex of a lipid and a polysaccharide linked by a covalent bond.
  • lipopolysaccharide may be simply referred to as LPS (lipopolysaccharide).
  • LPS lipopolysaccharide
  • Lipopolysaccharide is present on the outer membrane of Gram-negative bacteria.
  • a membrane structure is structurally formed so that lipid A, which is a lipid portion, is buried in the outer membrane, and the lipid A is mediated by oligosaccharide regions called cores (Outer Core and Inner Core).
  • the O antigen which is a polysaccharide chain
  • the present inventors conducted analysis experiments on lipopolysaccharide derived from various sepsis-causing bacteria with respect to the Limulus reagent. They then responded to all the sepsis-causing bacteria-derived lipopolysaccharides tested (Table 1).
  • lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae or lipopolysaccharide derived from Escherichia coli may be collectively referred to as "lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium”.
  • Klebsiella pneumoniae or Escherichia coli may be collectively referred to as "specific causative bacteria of sepsis".
  • the monoclonal antibody used in the present invention can recognize both lipopolysaccharide not detached from the cell wall of a specific sepsis-causing bacterium and lipopolysaccharide detached from the cell wall of a specific sepsis-causing bacterium.
  • Sandwich analysis often uses two types of antibodies that recognize different epitopes in the solid phase antibody and the labeled antibody.
  • the monoclonal antibody used in the present invention has the advantage that one type can form a sandwich system. Being able to form a sandwich system with one type facilitates the construction of an experimental system.
  • the term "one type” or “same type” with respect to a monoclonal antibody means a monoclonal antibody that recognizes the same epitope.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is preferably the same antibody, i.e., a monoclonal antibody produced from the same hybridoma.
  • the “sandwich system” means an experimental system in which an antigen is sandwiched between two types of antibodies, an antibody for capture (solid phase antibody) and an antibody for detection, to detect the antigen.
  • a labeling substance is bound to the antibody for detection, and the substance to be detected can be analyzed by measuring the intensity of the signal derived from the labeling substance.
  • the detection antibody may bind directly to the labeling substance or indirectly to the labeling substance via the secondary antibody.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is a monoclonal antibody and / or derived from Escherichia coli, which reacts with lipopolysaccharide derived from pneumococcus but does not react with lipopolysaccharide derived from Pyogenic bacillus and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli. It is a monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide but does not react with lipopolysaccharide derived from purpura and lipopolysaccharide derived from pneumonia.
  • a monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide derived from pneumonia rod but does not react with lipopolysaccharide derived from pyogenic bacterium and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli is specifically compared with lipopolysaccharide derived from pneumonia rod.
  • a reactive monoclonal antibody Sometimes referred to as a reactive monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but does not react with lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa and lipopolysaccharide derived from pneumococcus a monoclonal antibody that specifically reacts with lipopolysaccharide derived from Escherichia coli.
  • an antibody referred to as an antibody.
  • Examples of the monoclonal antibody that specifically reacts with the lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae include the S28201R antibody produced by the hybridoma of accession number NITE BP-03241.
  • Examples of the monoclonal antibody that specifically reacts with the lipopolysaccharide derived from Escherichia coli include the S28203R antibody produced by the hybridoma of accession number NITE BP-03242.
  • Does not react with the monoclonal antibody used in the present invention means that the monoclonal antibody used in the present invention does not substantially react with a compound.
  • Biacore® T100 or T200 is used based on the above SPR method to immobilize the monoclonal antibody used in the present invention. Can be measured. It can be confirmed that "substantially no reaction” can be confirmed by a method or means well known to those skilled in the art other than the above SPR method.
  • lipopolysaccharide derived from pneumonia rod but does not react with lipopolysaccharide derived from green pyorrhea and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli
  • lipopolysaccharide derived from pneumonia rod and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli it is preferable that lipopolysaccharide derived from pneumonia rod and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli.
  • lipopolysaccharide derived from Escherichia coli or lipopolysaccharide derived from Escherichia coli when the reactivity to lipopolysaccharide derived from pneumococcal bacterium is set to 1, the reactivity to lipopolysaccharide derived from green purulent bacterium and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli is determined. Both mean less than 0.1.
  • lipopolysaccharide derived from Escherichia coli does not react with lipopolysaccharide derived from green pus bacterium and lipopolysaccharide derived from pneumonia rod
  • lipopolysaccharide derived from pneumonia rod is preferably derived from E. coli-derived lipopolysaccharide and green pus bacterium.
  • lipopolysaccharide and lipopolysaccharide derived from pneumonia rod when the reactivity to lipopolysaccharide derived from pneumonia rod is set to 1, the reactivity to lipopolysaccharide derived from green pus and lipopolysaccharide derived from pneumonia rod is , Both mean less than 0.1.
  • the crossover rate is a system in which LPS derived from a cell with which an antibody specifically reacts is used as a solid phase, and a free antibody is reacted with this solid phase, and the free “antibody reacts specifically”.
  • LPS derived from bacterial cells When the decrease in reactivity when competing with "LPS derived from bacterial cells" is set to 100, the decrease in absorbance when competing with free "LPS derived from bacterial cells to which the antibody does not specifically react" is used in the same system. Means proportion.
  • the free LPS competes at a concentration equal to or higher than the concentration at which the reactivity between the antibody and the solid phase LPS decreases by 75% or more when the LPS derived from the bacterial cell with which the antibody specifically reacts is competed.
  • the monoclonal antibody used in the immunological analysis method of the present invention contains a fragment having the function of the monoclonal antibody as long as the effect of the present invention can be obtained.
  • a functional fragment containing the Fab portion of the monoclonal antibody obtained by enzymatic digestion of the monoclonal antibody a functional fragment containing the Fab portion of the monoclonal antibody produced by gene recombination, and a phage display method. Included are functional fragments containing scFv.
  • the monoclonal antibody used in the immunological analysis method of the present invention uses a heat-killed cell derived from pneumonia rod, purpura, and / or Escherichia coli as an antigen (immunogen) in a solvent such as phosphate buffered saline. It can be produced by dissolving and administering this solution to an animal for immunization. If necessary, an appropriate adjuvant may be added to the solution, and then the emulsion may be used for immunization.
  • a general-purpose adjuvant such as a water-in-oil emulsion, a water-in-oil-in-water emulsion, an oil-in-water emulsion, liposomes, and aluminum hydroxide gel can be used.
  • a protein derived from a biological component, a peptide substance, or the like may be used.
  • Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be preferably used.
  • the route of administration, dose, and timing of administration of the adjuvant are not particularly limited, but it is desirable to appropriately select the adjuvant so as to enhance the desired immune response in the animal immunized with the antigen.
  • the type of animal used for immunization is not particularly limited, but mammals are preferable, and for example, mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, alpaca and the like can be used, and more preferably mice or rats can be used.
  • Animal immunization may be performed according to a general method. Immunization can be performed, for example, by injecting a solution of the antigen, preferably a mixture with an adjuvant, subcutaneously, intradermally, intravenously or intraperitoneally in the animal. Since the immune response generally depends on the type and strain of the animal to be immunized, it is desirable to set the immune schedule appropriately according to the animal used. Antigen administration is preferably repeated several times after the first immunization.
  • the following operations can be continuously performed, but the procedure is not limited to this. Since the method for producing the monoclonal antibody itself is well known in the art and is widely used, those skilled in the art can easily produce the antibody used in the immunological analysis method of the present invention by using the above-mentioned antigen. (See, for example, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988), Chapter 6 and the like).
  • spleen cells or lymph node cells which are antibody-producing cells
  • a hybridoma can be produced by fusing these cells with a cell line derived from myeloma having high proliferative ability. It is preferable to use cells having a high antibody-producing ability (quality / quantity) for cell fusion, and it is preferable that the cell line derived from myeloma is compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
  • Cell fusion can be performed according to a method known in the art, and for example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using an electric current, or the like can be adopted.
  • the resulting hybridoma can be propagated according to conditions general in the art.
  • a desired hybridoma can be selected while confirming the properties of the antibody produced.
  • Cloning of hybridomas can be performed by well-known methods such as the limiting dilution method and the soft agar method.
  • Hybridoma selection can also be done efficiently at the selection stage, taking into account the conditions used for actual measurement of the antibody produced. For example, an antibody obtained by immunizing an animal is reacted with a lipopolysaccharide derived from a specific septic disease-causing bacterium immobilized on a solid phase in the presence of a compound whose cross-reactivity is desired to be confirmed. Then, by comparing with the reactivity in the absence of the compound for which cross-reactivity is desired to be confirmed, a hybridoma producing a desired antibody can be selected more efficiently.
  • the antibody obtained by immunizing an animal is reacted with lipopolysaccharide derived from a specific septic disease-causing bacterium immobilized on a solid phase in the presence of a component derived from a biological sample, and in the absence of the component derived from the biological sample.
  • Hybridomas that produce the desired antibody can also be selected more efficiently by comparison with the reactivity in.
  • the hybridoma selected is obtained by assaying the binding ability of the antibody produced to the lipopolysaccharide derived from a specific blood loss disease-causing bacterium using a method such as an ELISA method, an RIA method, or an immunofluorescence method. It can be confirmed whether or not a monoclonal antibody having a desired property is produced. By mass-culturing the hybridomas selected as described above, a monoclonal antibody having desired characteristics can be produced.
  • the method of mass culturing is not particularly limited, but for example, a method of appropriately culturing a hybridoma in a medium to produce a monoclonal antibody in the medium, or a method of injecting a hybridoma into the abdominal cavity of a mammal to proliferate the antibody in ascites.
  • a method for producing Purification of the monoclonal antibody shall be carried out by appropriately combining the above-mentioned methods for purifying the antibody from the antiserum, for example, DEAE anion exchange chromatography, affinity chromatography, sulfur fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method and the like. Can be done.
  • the antibody used in the immunological analysis method of the present invention it is also possible to use a fragment of an antibody having an antigen-antibody reaction activity in addition to the entire antibody molecule.
  • the antibody fragment is preferably a functional fragment, and examples thereof include F (ab') 2 , Fab', and scFv.
  • These fragments can be obtained by treating the antibody obtained as described above with a proteolytic enzyme (for example, pepsin or papain), or by cloning the DNA of the antibody and expressing it in a culture system using Escherichia coli or yeast.
  • a proteolytic enzyme for example, pepsin or papain
  • the monoclonal antibody can be used as a solid phase antibody immobilized on an insoluble carrier. Further, in the immunological analysis method of the present invention, the monoclonal antibody can be used as a labeled antibody labeled with a labeling substance well known to those skilled in the art described later.
  • a solid phase antibody by physically adsorbing a monoclonal antibody to an insoluble carrier, chemically binding (may be via an appropriate spacer), or binding via an antibody bound to an insoluble carrier. Can be manufactured.
  • an insoluble carrier made of a polymer base material such as polystyrene resin, an inorganic base material such as glass, or a polysaccharide base material such as cellulose or agarose can be used.
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and any shape such as a plate (for example, a microplate or a membrane), beads or particles (for example, latex particles or magnetic particles), or a tubular shape (for example, a test tube) can be selected. ..
  • labeling substance for producing a labeled antibody include enzymes, fluorescent substances, chemical luminescent substances, biotin, avidin, radioisotopes, colloidal gold particles, colored latex and the like.
  • a method for binding the labeling substance to the antibody a method such as a glutaraldehyde method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, or a periodic acid method, which can be used by those skilled in the art, can be used.
  • the types of the solid phase antibody and the labeled antibody, and the method for producing them are not limited to the above-mentioned examples of the binding method.
  • an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (ALP)
  • HRP horseradish peroxidase
  • OPD O-phenylenediamine
  • enzyme activity can be measured using 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), p-nitrophenyl phosphate in the case of ALP, etc.).
  • TMB 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • biotin it is common to react with avidin or enzyme-modified avidin.
  • biotin or HRP it is preferable to use biotin or HRP as a labeling substance, and it is more preferable to use biotin.
  • HRP-labeled streptavidin can be further used.
  • the term “insoluble carrier” refers to a substance on which an antibody or the like that specifically recognizes the substance to be detected is immobilized on the substance to be detected. Examples thereof include, but are not limited to, immunoplates, membranes, latex particles, magnetic particles and the like.
  • the "insoluble carrier” is “solid phase”, and the antibody is physically or chemically supported on the insoluble carrier, or the supported state is “fixed”, “immobilized”, or “solidified”. May be expressed.
  • the terms “analysis,” “detection,” or “measurement” include meanings such as proof and / or quantification of the presence of lipopolysaccharide from a particular septic disease-causing bacterium.
  • the immunological analysis method of the present invention includes electrochemiluminescence immunoassay (ECL method), enzyme immunoassay (ELISA method), latex aggregation immunoassay (LTIA method), chemiluminescence immunoassay, and immunofluorescence method. , And high performance liquid chromatography (HPLC), and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the immunological analysis method of the present invention is an electrochemical luminescence immunoassay (ELCL method), a high performance liquid chromatograph method (HPLC) or an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) in consideration of measurement sensitivity and ease of operation. Is preferable, and sandwich ELISA is more preferable.
  • the order of adding the monoclonal antibody and the lipopolysaccharide to the analytical system may be any first as long as the effect of the present invention can be obtained.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae and / or a monoclonal antibody that specifically reacts with lipopolysaccharide derived from Escherichia coli can be immobilized on the insoluble carrier.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with lipopolysaccharide derived from pneumococcal bacterium and lipo derived from Escherichia coli are used as antibodies for detection after adding a biological sample to the insoluble carrier.
  • Monoclonal antibodies that specifically react with polysaccharides can be further added to the insoluble carrier.
  • the label for detecting lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae it is preferable to use different labels for the label for detecting lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae and the label for detecting lipopolysaccharide derived from Escherichia coli.
  • both monoclonal antibodies are used, only lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae is present, only lipopolysaccharide derived from Escherichia coli is present, or lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae and lipopolysaccharide derived from Escherichia coli are both present. You can quickly determine which one it is.
  • the chemiluminescence immunoassay means a method of measuring the amount of a substance to be detected by causing a labeled substance to emit light by energization and detecting the amount of the light emitted.
  • ECL method electrochemical luminescence immunoassay
  • An electrode is placed on a solid phase (microplate, etc.) and radicals are generated on the electrode to make the ruthenium complex excited and emit light. Then, the amount of light emitted from this ruthenium complex can be detected.
  • an electrochemical luminescence immunoassay is performed using a first monoclonal antibody as a solid phase antibody and a second monoclonal antibody that recognizes an epitope different from the first monoclonal antibody as a labeled antibody.
  • ECL method electrochemical luminescence immunoassay
  • the measurement principle when the magnetic particles are used as the insoluble carrier particles and the ruthenium complex is used as the labeling substance is as follows.
  • the following shows the measurement principle in one embodiment of the present invention, and does not limit the scope of the present invention at all.
  • 1. When the magnetic particles on which the solid phase antibody is immobilized are brought into contact with the biological sample, lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium in the biological sample binds to the solid phase antibody. 2.
  • the labeled antibody When the labeled antibody is brought into contact with the magnetic particles after washing, the labeled antibody binds to the lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium bound to the magnetic particles. 3. 3. 3.
  • the magnetic particles When the magnetic particles are washed and then energized, they emit light according to the amount of labeled antibody bound to lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium. By measuring this amount of luminescence, it is possible to accurately measure the amount of lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium in a biological sample.
  • an enzyme-linked immunosorbent assay using an enzyme label is also preferable because the target can be measured easily and quickly.
  • ELISA means a method of capturing an antigen or an antibody, which is a substance to be detected, contained in a sample by using an antibody or an antigen against the substance to be detected, and then detecting the substance by using an enzymatic reaction. do.
  • sandwich ELISA is preferable.
  • the sandwich ELISA means an ELISA in which an antigen is sandwiched between two types of antibodies, an antibody for capture (solid phase antibody) and an antibody for detection, to detect and quantify the antigen.
  • an insoluble carrier on which a first monoclonal antibody (solid phase antibody) that recognizes a substance to be detected is immobilized and a second monoclonal antibody (labeled antibody) labeled with a labeling substance can be used.
  • the insoluble carrier is preferably a plate (immunoplate). HRP or ALP can be used as the label.
  • the enzyme-linked immunosorbent assay ELISA method
  • an antibody that recognizes the same epitope can be used for both the first antibody (solid phase antibody) and the second antibody (labeled antibody).
  • the measurement procedure and principle when sandwich ELISA is used as the immunological analysis method of the present invention are as follows. The following shows the measurement principle in one embodiment of the present invention, and does not limit the scope of the present invention at all. 1. 1. When a biological sample is added to a carrier on which a solid-phase antibody is immobilized and reacted, lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium in the biological sample binds to the solid-phase antibody, and the solid-phase antibody-lipopolysaccharide complex is formed on the carrier. Form. 2. 2. 2.
  • the labeled antibody When a labeled antibody that recognizes another labeled epitope is added to the carrier and reacted, the labeled antibody binds to the captured lipopolysaccharide and forms a sandwich with the above-mentioned solid phase antibody-lipopolysaccharide complex. 3. 3. After washing, it reacts with the enzyme substrate, develops color, and measures the absorbance. The amount of lipopolysaccharide in the biological sample can be measured according to the amount of the labeled substance measured. As a specific method such as a method for immobilizing an antibody on an insoluble carrier and a method for binding an antibody to a labeling substance, a method well known to those skilled in the art can be used without particular limitation. It is preferable to use biotin as the labeling substance, and when biotin is used, HRP-labeled streptavidin can be further used.
  • a secondary antibody can also be used in the sandwich ELISA method.
  • the reaction is amplified and the detection sensitivity can be increased.
  • a labeling substance HRP, ALP, etc.
  • the substrate of the labeling substance such as OPD, TMB, or p-nitrophenyl phosphate
  • the second monoclonal antibody is appropriately treated on the immobilized solid phase, a diluted biological sample is added, and then the biological sample is incubated, and the biological sample is removed and washed. Subsequently, the primary antibody is added for incubation and washing, and the enzyme-labeled secondary antibody is further added for incubation. Then, the substrate is added to develop the color. Then, by measuring the color development using a plate reader or the like, lipopolysaccharide derived from a specific sepsis-causing bacterium can be analyzed.
  • the analysis method of other sepsis-causing bacteria may be carried out to the patient and / or the administration of the sepsis therapeutic agent to the patient may be carried out.
  • the immunological analysis method of the present invention uses a monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae but does not react with lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa or Escherichia coli, the following step (A) And / or (B) can be included.
  • A Derived from 0.011 pg / mL or more, 0.011 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, or 0.011 pg / mL to 1 ⁇ g / mL of Klebsiella pneumoniae contained in a biological sample, preferably blood, serum or plasma.
  • the amount of lipopolysaccharide derived from Klebsiella pneumoniae in the biological sample, preferably blood, serum or plasma is 0.011 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, 0.023 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, It can be 0.1 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, 0.5 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, 1 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, or 5 pg / mL to 10 ⁇ g / mL.
  • the immunological analysis method of the present invention uses a monoclonal antibody that reacts with lipopolysaccharide derived from Escherichia coli but does not react with lipopolysaccharide derived from Pseudomonas aeruginosa or Klebsiella pneumoniae
  • the following step (A) And / or (B) can be included.
  • the cutoff value can be appropriately set according to the type of biological sample or the type of immunological analysis method.
  • the immunological analysis method of the present invention can include a step of comparing a measured value with a cutoff value. If the measured value is lower than the cutoff value, it can be determined that the subject does not have sepsis from a particular sepsis-causing bacterium. If the measured value is higher than the cutoff value, it can be determined that the subject has sepsis from a particular sepsis-causing bacterium.
  • the amount of E. coli-derived lipopolysaccharide in the biological sample, preferably blood, serum or plasma is 0.22 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, 0.49 pg / mL to 10 ⁇ g / mL, 1 pg. It can be from / mL to 10 ⁇ g / mL, or 5 pg / mL to 10 ⁇ g / mL.
  • Example 1 Method for producing a monoclonal antibody used in the present invention 1. Acquisition of antibody Heat-treated cells of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa diluted with PBS or heat-treated cells of Pneumonia bacillus, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa diluted with PBS were placed in the abdominal cavity of a rat (F344 / Jc1, ⁇ ). I was immunized every week. Test blood was collected 10 weeks after the initial immunization (after 10 immunizations), and the antibody titer in the blood was confirmed for each.
  • the antibody titer in the blood was evaluated by an antigen solid-phase ELISA using LPS derived from each of the main causative bacteria of sepsis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae.
  • the specific procedure of the antigen solid phase ELISA is as follows.
  • HRP-labeled goat anti-rat IgG (H + L) antibody diluted 17,000 times with an antibody diluted solution was dispensed (50 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the OPD color-developing solution was dispensed (50 ⁇ L / well) and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the stop solution was dispensed (50 ⁇ L / well) and the reaction was stopped. The absorbance at a wavelength of 492 nm was measured with a plate reader.
  • An anti-rat IgG or anti-rat IgM antibody solution diluted with PBS was dispensed into a 96-well plate for ELISA (5 ⁇ g / ml, 50 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 2 hours or 4 ° C overnight. -After washing 3 times (400 ⁇ L / well), the blocking solution was dispensed (100 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. overnight. -After removing the blocking solution, the antibody solution diluted to each concentration was dispensed (50 ⁇ l / well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • each LPS labeled with biotin with EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-Biotin was dispensed (1 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L / well), and 1 at room temperature. I left it for a while.
  • HRP-labeled streptavidin was dispensed (0.2 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the OPD color-developing solution was dispensed (50 ⁇ L / well) and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the stop solution was dispensed (50 ⁇ L / well) and the reaction was stopped.
  • the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured with a plate reader.
  • Tables 2 and 3 show the results of evaluation of the reactivity between the antibody obtained by screening and various LPSs by antigen solid phase ELISA.
  • One antibody (IgM type: S28201R) that reacts with LPS derived from pneumonia bacillus and one antibody that reacts with LPS derived from Escherichia coli (IgM type: S28201R), which was not included in the immunogen and had an insufficient increase in titer (IgM type: S28201R).
  • IgM type: S28203R was successfully established.
  • Example 2 Evaluation of sensitivity of the experimental system using the monoclonal antibody obtained in Example 1 Whether a sandwich system can be formed with the same antibody in each of S28201R and S2803R was evaluated by sandwich ELISA.
  • the specific procedure of the sandwich ELISA is as follows.
  • the S28201R or R28203R antibody solution diluted with PBS was dispensed into a 96-well plate for ELISA (5 ⁇ g / mL, 50 ⁇ l / well) and allowed to stand at room temperature for 2 hours or 4 ° C. overnight. The same operation was performed using a rat IgM monoclonal antibody as a control. -After washing 3 times (400 ⁇ L / well), the blocking solution was dispensed (100 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. overnight. -After removing the blocking solution, LPS diluted to each concentration (displayed value) was dispensed (50 ⁇ L / well) and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Example 3 Comparison of sensitivity with Limulus reagent
  • the sensitivity of Limulus reagent (product name "Endotoxin-Single Test Wako” manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was measured using LPS derived from Klebsiella pneumoniae and LPS derived from Escherichia coli. Then, it was compared with the sensitivity of the sandwich system constructed in Example 2. The experimental procedure for the Limulus reagent was performed according to the protocol described in the attached manual.
  • LPS derived from pneumonia rod (Sigma-Aldrich) and LPS derived from Escherichia coli (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were serially diluted, and each concentration was tested for detection using Limulus reagent.
  • Example 4 Calculation of sensitivity of the analysis method of the present invention 4-1 Pricing of a commercially available LPS solution using a Limulus reagent 4-1-1 Preparation of a calibration curve ⁇
  • Commercially available LPS (5 mg / mL (displayed value)) is used in PBS. It was diluted to each concentration (400, 300, 200 ng / mL). The diluted LPS was measured using Limulus HS-T Single Test Wako according to the instruction manual. An approximate expression of the quadratic function was created using the commercially available LPS concentration based on the displayed value and the measured value by Limulus HS-T Single Test Wako. The results are shown in Tables 8 and 9 and FIGS. 4 and 5.
  • S28201R can detect up to a concentration of 0.011 pg / mL
  • S28203R can detect up to a concentration of 0.22 pg / mL.
  • the crossing rate is set to 0%.
  • the crossover rate for E. coli-derived LPS was also calculated by the same method. ⁇ S2803R Competing with E. coli-derived LPS for changes in the absorbance of ELISA ((absorbance of LPS concentration of 0 pg / mL derived from pneumonia rod)-(absorbance of LPS concentration of 5000 pg / ml derived from pneumonia)) due to competition of LPS derived from pneumonia rod.
  • the average value and 2.6 SD (standard deviation ⁇ 2.6) were calculated from the results of the three measurements.
  • the minimum detection limit was calculated by the 2.6SD method. Specifically, when "0 pg / mL O.D. + 2.6 SD" ⁇ "O.D.-2.6 SD of each sample", it is judged that LPS at that concentration can be detected.
  • the minimum detection limit was set to the minimum LPS concentration in which all the samples having a certain concentration or higher satisfy the above conditions. The results are shown in Table 16.
  • the analysis method in this example can detect Klebsiella pneumoniae LPS with 2000 times or more higher sensitivity than the commercially available LPS detection ELISA kit. If the criteria described in the kit manual for positive judgment with a sensitivity of OD + 0.15 or higher of the Negative Control are adopted, the sample measured this time is negative judgment, that is, undetectable at any concentration. Is. Therefore, it was found that even when the determination method was changed, the analysis method in this example was able to detect Klebsiella pneumoniae LPS with higher sensitivity.
  • an immunological analysis method for sepsis-causing bacteria which has a sensitivity equal to or higher than that of the Limulus reagent and can identify sepsis-causing bacteria by a simple operation.
  • Hybridoma that produces antibody number S2803R Name and address of the depositary institution that deposited the biological material Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Organization 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (Postal code 292-0818) Date of deposit of biomaterials to Loi's depositary agency July 3, 2nd year Deposit number NITE BP-03242 assigned by Hai's depositary agency for deposits

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Abstract

簡便な操作で敗血症原因細菌を特定できる、敗血症原因細菌の免疫学的分析方法を提供することを課題とする。　生体試料中の敗血症原因細菌の免疫学的分析方法であって、 肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、並びに 大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、 のうち少なくとも1つのモノクローナル抗体と生体試料とを接触させる工程を含み、 前記敗血症原因細菌は、肺炎桿菌又は大腸菌である免疫学的分析方法により、前記課題を解決することができる。

Description

敗血症原因細菌の免疫学的分析方法及び該方法に用いるモノクローナル抗体
　本発明は、敗血症原因細菌の免疫学的分析方法及び該方法に用いるモノクローナル抗体に関する。
　敗血症は、感染症によって重篤な臓器障害が引き起こされる状態を意味する。敗血症の予後は病原微生物、感染した患者の背景因子、及び治療介入の質により様々である。一概にはいえないが、日本においては１年で１０万人が死亡していると推定されている。
　敗血症の原因菌となるグラム陰性菌の細胞外膜を構成するＬＰＳ（リポ多糖）を測定する方法として、カブトガニの血液凝固反応を利用したリムルス試薬が用いられている（特許文献１）。リムルス試薬は、敗血症の診断又は診断の補助に用いられている。敗血症においては、治療方針を決定するために原因となっている細菌を早期に同定する必要がある。しかしながら、リムルス試薬は、多くの種類のグラム陰性菌のＬＰＳをまとめて分析するため、菌種の特定を別のプロトコルで行う必要がある点が問題であった。敗血症の原因菌を同定する方法としては、各種培地で培養する方法が用いられているが、培養を含めた検査に数日間を要していた。また、リムルス試薬を使用する方法は、天然資源であるカブトガニの血液を必要としており、資源の枯渇が懸念されることに加え、一定の品質を保つことにコストがかかる。また、複数工程を必要とする用手法であるためバラつきが出やすいこともこの方法の欠点として挙げられる。
特開平０４－１３６７６３号公報
　本発明の課題は、簡便な操作で敗血症原因細菌を特定できる、敗血症原因細菌の免疫学的分析方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した。そして、肺炎桿菌由来のリポ多糖を特異的に認識するモノクローナル抗体及び大腸菌由来のリポ多糖を特異的に認識するモノクローナル抗体を作出して、本発明を完成するに至った。
　具体的に、本発明は以下の通りである。
＜１＞
　生体試料中の敗血症原因細菌の免疫学的分析方法であって、
肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、並びに
大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、
のうち少なくとも1つのモノクローナル抗体と生体試料とを接触させる工程を含み、前記敗血症原因細菌は、肺炎桿菌又は大腸菌である免疫学的分析方法。
＜２＞
　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体の、肺炎桿菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％未満である、＜１＞に記載の免疫測定学的分析方法。
＜３＞
　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体の、大腸菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％未満である、＜１＞又は＜２＞に記載の免疫測定学的分析方法。
＜４＞
　前記モノクローナル抗体として、不溶性担体に固定化した固相抗体と、標識物質を結合した標識抗体とを使用し、前記固相抗体と前記標識抗体が同一のモノクローナル抗体である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
＜５＞
　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、ＩｇＭ抗体である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜６＞
　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４１のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜７＞
　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、ＩｇＭ抗体である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜８＞
　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４２のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜９＞
　前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
＜１０＞
　肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体。
＜１１＞
　肺炎桿菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％以下である＜１０＞に記載のモノクローナル抗体。
＜１２＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４１のハイブリドーマより産生される、＜１０＞に記載のモノクローナル抗体。
＜１３＞
　大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体。
＜１４＞
　大腸菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％以下である＜１３＞に記載のモノクローナル抗体。
＜１５＞
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４２のハイブリドーマより産生される、＜１３＞に記載のモノクローナル抗体。
＜１６＞
　前記標識物質に由来するシグナルを測定する工程と
　前記シグナルの測定値とカットオフ値とを比較する工程と
をさらに含む、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法
　本発明によれば、簡便な操作で敗血症原因細菌を特定できる、敗血症原因細菌の免疫学的分析方法を提供することができる。
敗血症原因細菌におけるリポ多糖の構造の模式図である。 Ｓ２８２０１Ｒ抗体のみでサンドイッチ系を組むことができるか否かを試験したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 Ｓ２８２０３Ｒ抗体のみでサンドイッチ系を組むことができるか否かを試験したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 肺炎桿菌のＬＰＳの検量線を示すグラフである。 大腸菌のＬＰＳの検量線を示すグラフである。 肺炎桿菌のＬＰＳの最小検出限界を算出するためのグラフである。 大腸菌のＬＰＳの最小検出限界を算出するためのグラフである。
［１］生体試料中の敗血症原因細菌の免疫学的分析方法
（生体試料）
　本発明における「生体試料」としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液を挙げることができ、体液を用いることが好ましい。本発明における生体試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液であり、さらに好ましくは血液、血清又は血漿であり、さらに好ましくは敗血症を有する疑いのある対象の血液、血清又は血漿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ハムスターなど）を含み、好ましくはヒトである。生体試料は、インビボのものであってもよく、インビトロのものであってもよい。
（敗血症原因細菌）
　本明細書において、「敗血症原因細菌」は、肺炎桿菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、及び緑膿菌などの敗血症を引き起こす細菌を意味する。本発明の免疫学的分析方法では、敗血症に罹患していることとともに、肺炎桿菌、大腸菌、又はその両方の細菌が原因であることを判定できる。本明細書における用語「敗血症」は、敗血症及び敗血症性ショックの両方を含む。敗血症とは、感染症によって重篤な臓器障害が引き起こされる状態を意味する。敗血症性ショックとは、急性循環不全により細胞障害および代謝異常が重度となり、死亡率を増加させる可能性のある状態を意味する。
　本明細書において、「肺炎桿菌」は、グラム陰性の桿菌であるクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を意味する。
　本明細書において、「大腸菌」は、グラム陰性の桿菌であるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）を意味する。
　本発明では、リムルス試薬と同等以上の感度及び反応性で、敗血症の罹患の有無のみならず、敗血症原因細菌（クレブシエラ・ニューモニエ又はエシェリキア・コリ）を同定できるという利点を有する。すなわち、現在医療現場で実際に用いられているリムルス試薬と代替可能であり、且つ敗血症原因細菌を同定できるという利点を有する。
（リポ多糖）
　本明細書において「リポ多糖」とは、共有結合で結ばれた脂質と多糖の複合体を意味する。本明細書では、「リポ多糖」を単にＬＰＳ（lipopolysaccharide）と称することもある。リポ多糖は、グラム陰性菌の外膜に存在する。リポ多糖では、構造的には、脂質部分であるリピッドＡが外膜に埋もれるような形で膜構造が形成されており、リピッドＡからコア（Ｏｕｔｅｒ　Ｃｏｒｅ及びＩｎｎｅｒ　Ｃｏｒｅ）と呼ばれるオリゴ糖領域を介して、多糖鎖であるＯ抗原が伸長している（図１）。
　本発明者らは、リムルス試薬に関して、種々の敗血症原因細菌由来のリポ多糖の分析実験を行った。すると、試験した全ての敗血症原因細菌由来のリポ多糖に反応した（表１）。
　本明細書においては、肺炎桿菌由来のリポ多糖又は大腸菌由来のリポ多糖をまとめて、「特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖」と称することがある。同様に、本明細書においては、肺炎桿菌又は大腸菌をまとめて、「特定の敗血症原因細菌」と称することがある。本発明において使用されるモノクローナル抗体は、特定の敗血症原因細菌の細胞壁から脱離していないリポ多糖及び特定の敗血症原因細菌の細胞壁から脱離したリポ多糖の両方を認識することができる。
　サンドイッチ分析では、固相抗体と標識抗体で異なるエピトープを認識する２種類の抗体を使用することが多い。本発明において使用されるモノクローナル抗体は、一種類でサンドイッチ系を形成できるという利点を有する。一種類でサンドイッチ系を形成できることにより、実験系の構築が容易になる。本明細書において、モノクローナル抗体に関して「一種類」あるいは「同じ種類」とは、同じエピトープを認識するモノクローナル抗体を意味する。また、一種類でサンドイッチ系を形成できることにより、非特異反応が生じる可能性が減少する。本発明において使用されるモノクローナル抗体は、好ましくは、同一の抗体、すなわち同じハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体である。なお、本明細書において、「サンドイッチ系」とは、捕捉用の抗体（固相抗体）と検出用の抗体の二種類の抗体で、抗原をサンドイッチして抗原を検出する実験系を意味する。検出用の抗体には、標識物質が結合しており、その標識物質に由来するシグナルの強度を測定することで、被検出物質を分析できる。検出用の抗体は、標識物質に直接結合してもよく、二次抗体を介して標識物質と間接的に結合してもよい。
（モノクローナル抗体）
　本発明において使用されるモノクローナル抗体は、肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体及び/又は、大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体である。
　本明細書において、肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体を、肺炎桿菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体と称することがある。同様に、大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体を、大腸菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体と称することがある。
　肺炎桿菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体としては、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４１のハイブリドーマより産生されるＳ２８２０１Ｒ抗体が挙げられる。大腸菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体としては、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４２のハイブリドーマより産生されるＳ２８２０３Ｒ抗体が挙げられる。
　本明細書において、特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖と「反応する」、特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖を「認識する」、特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖と「結合する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。モノクローナル抗体がリポ多糖などの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固定化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができる。また、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うこともできる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
　本発明に使用されるモノクローナル抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明に使用されるモノクローナル抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいう。ある化合物と「実質的に反応しない」か否かを確認するために、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００やＴ２００を使用し、本発明に使用されるモノクローナル抗体を固定化して測定を行うことができる。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法又は手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できる。
　「肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しない」とは、好ましくは、肺炎桿菌由来のリポ多糖と緑膿菌由来のリポ多糖又は大腸菌由来のリポ多糖との共存下において、肺炎桿菌由来のリポ多糖に対する反応性を１とした場合に、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖への反応性が、いずれも０．１未満であることを意味する。
　「大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しない」とは、好ましくは、大腸菌由来のリポ多糖と緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖との共存下において、肺炎桿菌由来のリポ多糖に対する反応性を１とした場合に、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖への反応性が、いずれも０．1未満であることを意味する。
　本明細書において、交差率とは、抗体が特異的に反応する菌体由来のＬＰＳを固相として、この固相に遊離の抗体を反応させる系において、遊離の「抗体が特異的に反応する菌体由来のＬＰＳ」を競合させた場合の反応性低下を１００とした場合に、同系において、遊離の「抗体が特異的に反応しない菌体由来のＬＰＳ」を競合させた場合の吸光度低下の割合を意味する。この時、遊離のＬＰＳは、抗体が特異的に反応する菌体由来のＬＰＳを競合させた場合に、抗体と固相ＬＰＳとの反応性が７５％以上低下する濃度以上の濃度で競合させる。
　本発明の免疫学的分析方法において使用されるモノクローナル抗体は、本発明の効果が得られる限りにおいて、該モノクローナル抗体の機能を有する断片を含む。例えば、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される該モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片が挙げられる。
　本発明の免疫学的分析方法において使用されるモノクローナル抗体は、抗原（免疫原）として肺炎桿菌、緑膿菌、及び／又は大腸菌由来の加熱死菌体をリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することにより製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントを用いることができる。アジュバントとして、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
　免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカなどを用いることができ、より好ましくはマウス又はラットを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよい。例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体を得るために、引き続き以下の操作が行われることができるが、これに限定されることはない。モノクローナル抗体それ自体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されているので当業者は前記の抗原を用いることによって本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体を容易に製造することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８） 第６章などを参照のこと）。
　最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出する。そして、これらの細胞を高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、また骨髄腫由来の細胞株は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは当業界で汎用の条件に従って増殖させることができる。産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。
　ハイブリドーマの選択は、産生される抗体に関して実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うこともできる。例えば、動物に免疫して得られた抗体を、交差反応性を確認したい化合物の存在下、固相に固定化した特定の敗血病原因細菌由来のリポ多糖と反応させる。そして、交差反応性を確認したい化合物の非存在下での反応性と比較することにより、所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選抜することができる。また、動物に免疫して得られた抗体を、生体試料由来成分の存在下、固相に固定化した特定の敗血病原因細菌由来のリポ多糖と反応させ、生体試料由来成分の非存在下での反応性と比較することにより所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選択することもできる。
　クローニング工程後、産生される抗体と特定の敗血病原因細菌由来のリポ多糖との結合能をＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることにより、選択されたハイブリドーマが所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するか否かを確認することができる。
　前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、先述した抗血清からの抗体の精製法、例えばＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
　本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能である。前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるもの又はキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖなどが挙げられる。これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。
（固相抗体）
　本発明の免疫学的分析方法においてモノクローナル抗体は、不溶性担体上に固定化された固相抗体として使用することができる。また、本発明の免疫学的分析方法においてモノクローナル抗体は、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させること、化学的に結合させること（適当なスペーサーを介してよい）、又は不溶性担体に結合させた抗体を介して結合させることにより、固相抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができる。不溶性担体の形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは粒子状（例えば、ラテックス粒子、磁性粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
　（標識抗体）
　本発明の免疫学的分析方法において使用されるモノクローナル抗体と結合可能な標識を用いることにより、特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖に結合した抗体の量を測定することができる。それにより生体試料中の特定の敗血病原因細菌由来のリポ多糖を検出することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができる。固相抗体及び標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は前記の結合法の例に限定されることはない。例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素がＨＲＰの場合には、例えばＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３’，５，５’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＬＰの場合にはｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には、アビジン又は酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。本発明の免疫学的分析方法においては、標識物質としてビオチン又はＨＲＰを使用することが好ましく、ビオチンを使用することがより好ましい。ビオチンを使用する場合、ＨＲＰで標識したストレプトアビジンをさらに使用することができる。
　本明細書において、「不溶性担体」とは、被検出物質に対して、被検出物質を特異的に認識する抗体等を固定している物質をいう。例えば、イムノプレート、メンブレン、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗体を不溶性担体に物理的又は化学的に担持させること、又は担持させた状態を「固定」、「固定化」、又は「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、特定の敗血病原因細菌由来のリポ多糖の存在の証明及び／又は定量などの意味を含む。
（免疫学的分析方法）
　本発明の免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集免疫測定法（ＬＴＩＡ法）、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、及び高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫学的分析方法は、測定感度及び操作の簡便性を考慮して、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）であることが好ましく、サンドイッチＥＬＩＳＡであることがさらに好ましい。
　モノクローナル抗体と生体試料とを接触させる工程において、分析系へのモノクローナル抗体とリポ多糖の添加順序は、本発明の効果が得られる限りにおいて、いずれが先でもよい。
　不溶性担体に、肺炎桿菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体及び／又は大腸菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体を固定化することができる。
　両方のモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化した場合は、生体試料を不溶性担体に添加した後、検出するための抗体として、肺炎桿菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体及び大腸菌由来のリポ多糖と特異的に反応するモノクローナル抗体をさらに不溶性担体に添加することができる。この場合、肺炎桿菌由来のリポ多糖を検出するための標識と大腸菌由来のリポ多糖を検出するための標識では、異なる標識を使用することが好ましい。
　両方のモノクローナル抗体を使用する場合、肺炎桿菌由来のリポ多糖のみ存在する状態、大腸菌由来のリポ多糖のみ存在する状態、又は肺炎桿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖がいずれも存在する状態のいずれであるかを迅速に判断できる。
　電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）とは、通電により標識物質を発光させ、その発光量を検出することで被検出物質の量を測定する方法を意味する。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）では、標識物質として、ルテニウム錯体を用いることができる。固相（マイクロプレート等）に電極を設置してこの電極上でラジカルを発生させることによりルテニウム錯体を励起状態にして発光させる。そして、このルテニウム錯体の発光量を検出することができる。
　通常は、第一モノクローナル抗体を固相抗体として用い、第一モノクローナル抗体とは別のエピトープを認識する第二モノクローナル抗体を標識抗体として用いて、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことができる。一方で、本発明の免疫学的分析方法では、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体のいずれにも同じエピトープを認識するモノクローナル抗体又は、同じハイブリドーマから産生された同一のモノクローナル抗体を使用することができる。
　不溶性担体粒子として磁性粒子、標識物質としてルテニウム錯体を用いた際の測定原理は、以下の通りである。下記は本発明の一実施形態における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．固相抗体を固定化した磁性粒子と生体試料とを接触させると、生体試料中の特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖が固相抗体と結合する。
２．磁性粒子を洗浄後に標識抗体を接触させると、磁性粒子に結合した特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖に標識抗体が結合する。
３．磁性粒子を洗浄後、通電すると特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖に結合した標識抗体量に応じて発光する。この発光量を計測することにより、生体試料中の特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖の量を正確に測定することができる。
　免疫学的分析方法の中で、酵素標識を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）も、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。本明細書においてＥＬＩＳＡとは、試料中に含まれる被検出物質である抗原又は抗体を、前記被検出物質に対する抗体又は抗原を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。
　ＥＬＩＳＡとしてはサンドイッチＥＬＩＳＡが好ましい。本明細書において、サンドイッチＥＬＩＳＡとは、捕捉用の抗体（固相抗体）と検出用の抗体の二種類の抗体で、抗原をサンドイッチして抗原を検出し、定量するＥＬＩＳＡを意味する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、被検出物質を認識する第一モノクローナル抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体と、標識物質で標識された第二モノクローナル抗体（標識抗体）とを使用することができる。不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましい。標識としては、ＨＲＰ又はＡＬＰを使用することができる。
　通常は、第一抗体を固相抗体として用い、第一抗体とは別のエピトープを認識する第二抗体を標識抗体として用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を行うことができる。しかし、本発明の免疫学的分析方法では、第一抗体（固相抗体）及び第二抗体（標識抗体）のいずれにも同じエピトープを認識する抗体を使用することができる。
　本発明の免疫学的分析方法として、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する場合の測定手順及び原理は、以下の通りである。下記は本発明の一実施形態における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．固相抗体を固定した担体に生体試料を添加して反応させると、生体試料中の特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖が固相抗体と結合し、担体上で固相抗体－リポ多糖複合体を形成する。
２．標識した別のエピトープを認識する標識抗体を担体に添加して反応させると、標識抗体は前記捕捉されたリポ多糖に結合して前述の固相抗体－リポ多糖複合体とサンドイッチを形成する。
３．洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。測定した標識物質の量に応じて、生体試料中のリポ多糖の量を測定することができる。
　抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。標識物質としてビオチンを使用することが好ましく、ビオチンを使用する場合、ＨＲＰで標識したストレプトアビジンをさらに使用することができる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、二次抗体を用いることもできる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され、検出感度を高めることができる。二次抗体を用いる場合、一次抗体としての第一モノクローナル抗体、第二モノクローナル抗体を固定化した固相、標識物質（ＨＲＰ又はＡＬＰ等）で標識した、第一モノクローナル抗体に対する抗体（二次抗体）、及び標識物質の基質（ＯＰＤ、ＴＭＢ、又はｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど）を使用することができる。このような分析方法では、まず、第二モノクローナル抗体を固定化した固相に適宜処理し希釈した生体試料を添加した後インキュベートし、生体試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベートおよび洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。その後、基質を加えて発色させる。その後、プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより特定の敗血症原因細菌由来のリポ多糖を分析することができる。
（敗血症の診断、診断補助、及び治療）
　本発明の免疫学的分析方法の分析結果に基づき、対象が特定の敗血症原因細菌を原因とする敗血症に罹患しているか否かを診断することができ、又は診断の補助とすることができる。リムルス試薬を用いた分析方法では、菌種の特定を別のプロトコルで行う必要があった。しかしながら、本発明の免疫学的分析方法では、いずれの細菌由来の敗血症に罹患しているかどうかを判定することができ、したがって、敗血症原因細菌の早期特定を実現できる。
　また、本発明の免疫学的分析方法を行った後、他の敗血症原因細菌の分析方法の患者への実施、及び／又は敗血症治療薬の患者への投与を実施してもよい。
　本発明の免疫学的分析方法は、肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌若しくは大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体を使用する場合、以下の工程（Ａ）及び／又は（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）生体試料中、好ましくは血液、血清又は血漿中に含まれる０．０１１ｐｇ／ｍＬ以上、０．０１１ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、又は０．０１１ｐｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの肺炎桿菌由来のリポ多糖を検出する工程、及び／又は
（Ｂ）前記検出工程の結果に基づき生体試料を採取した対象が敗血症に罹患している若しくは罹患している疑いがあると診断する工程、又は診断を補助する工程。
　上記工程（Ａ）中、生体試料中、好ましくは血液、血清又は血漿中の肺炎桿菌由来のリポ多糖の量は、０．０１１ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、０．０２３ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、０．１ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、０．５ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、又は５ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであることができる。
　本発明の免疫学的分析方法は、大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌若しくは肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体を使用する場合、以下の工程（Ａ）及び／又は（Ｂ）を含むことができる。
（Ａ）生体試料中、好ましくは血液、血清又は血漿中に含まれる０．２２ｐｇ／ｍＬ以上、０．２２ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、又は０．２２ｐｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬの大腸菌由来のリポ多糖を検出する工程、及び／又は
（Ｂ）前記検出工程の結果に基づき生体試料を採取した対象が敗血症に罹患している若しくは罹患している疑いがあると診断する工程、又は診断を補助する工程を含むことができる。
　カットオフ値は生体試料の種類または免疫学的分析方法の種類に応じて適宜設定することができる。本発明の免疫学的分析方法は、測定値とカットオフ値とを比較する工程を含むことができる。測定値がカットオフ値より低い場合は、対象が特定の敗血症原因細菌由来の敗血症を罹患していないと判定することができる。測定値がカットオフ値より高い場合は、対象が特定の敗血症原因細菌由来の敗血症を罹患していると判定することができる。
　上記工程（Ａ）中、生体試料中、好ましくは血液、血清又は血漿中の大腸菌由来のリポ多糖の量は、０．２２ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、０．４９ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ、又は５ｐｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであることができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、特に説明のない限り、％は質量％を示す。
〔参考例１〕リムルス試薬による種々の敗血症原因細菌由来のリポ多糖の分析
　リムルス試薬（製品名　「エンドトキシン-シングルテストワコー　富士フイルム和光純薬社製）を用いて、種々の敗血症原因細菌由来のリポ多糖の分析を行った。リムルス試薬の実験手順は、添付の説明書に記載のプロトコルの通りに行った。肺炎桿菌由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、緑膿菌由来のＬＰＳ（富士フィルム和光純薬株式会社）、及び大腸菌由来のＬＰＳ（富士フィルム和光純薬株式会社）を１０００ｎｇ／ｍＬに調製し、リムルス試薬を用いて検出可能かどうかを試験した。
　結果を表１に示す。リムルス試薬では、肺炎桿菌、緑膿菌、大腸菌Ｏ１１１、大腸菌Ｏ２６の全ての細菌由来のＬＰＳに反応した。したがって、リムルス試薬を用いて敗血症の原因菌種を同定することは困難であることが
分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例１〕本発明に使用するモノクローナル抗体の製造方法
１．抗体の取得
　ＰＢＳで希釈した大腸菌と緑膿菌の加熱処理菌体、又は、ＰＢＳで希釈した肺炎桿菌、大腸菌、及び緑膿菌の加熱処理菌体をラット（Ｆ３４４／Ｊｃ１、♀）の腹腔に毎週免疫した。初回免疫から１０週後（１０回免疫後）に試験採血し、それぞれ血中抗体価を確認した。血中抗体価は主とした敗血症原因細菌の緑膿菌、大腸菌、肺炎桿菌のそれぞれ由来のＬＰＳを抗原とした抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した。抗原固相ＥＬＩＳＡの具体的な手順は以下の通りである。
・ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにＰＢＳで希釈した各種ＬＰＳを分注し（１μｇ／ｍｌ，５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間または４℃で一晩静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ブロッキング液を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間または４℃で一晩静置した。
・ブロッキング液を除去後、培養上清または血清を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、抗体希釈液で１７０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＯＰＤ発色液を分注（５０μＬ／ｗｅｌｌ）し、室温で１０分間反応させた。
・停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、反応を停止した。プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、免疫原である大腸菌由来のＬＰＳと緑膿菌由来のＬＰＳに対しての力価上昇が確認された。抗体価上昇を確認後、電気融合法により脾臓細胞、腸骨リンパ節細胞をミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏと融合した。融合に供さなかった細胞は凍結保存した。融合細胞は９６ｗｅｌｌプレートで培養し、融合から７日後に培養上清を回収してスクリーニングを行った。なお、スクリーニング前日に培地交換を行った。
２．スクリーニング
　敗血症の原因となる肺炎桿菌、大腸菌、緑膿菌由来のＬＰＳを抗原とした液相系ＥＬＩＳＡにより、特定の敗血病原因細菌由来のＬＰＳに反応する抗体のスクリーニングを試みた。液相系ＥＬＩＳＡの具体的な手順は以下の通りである。
・ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにＰＢＳで希釈した抗ラットＩｇＧもしくは抗ラットＩｇＭ抗体溶液を分注し（５μｇ／ｍｌ，５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間または４℃で一晩静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ブロッキング液を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間または４℃で一晩静置した。
・ブロッキング液を除去後、各濃度に希釈した抗体溶液を分注し（５０μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン標識した各ＬＰＳを分注し（１μｇ／ｍＬ，５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを分注し（０．２μｇ／ｍＬ，５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で３０分間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＯＰＤ発色液を分注（５０μＬ／ｗｅｌｌ）し、室温で１０分間反応させた。
・停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、反応を停止した。プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　スクリーニングにより獲得した抗体と各種ＬＰＳとの反応性を抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した結果を表２及び３に示す。免疫原には含まれておらず、力価上昇も不十分であった肺炎桿菌由来のＬＰＳに反応する１株の抗体（ＩｇＭ型：Ｓ２８２０１Ｒ）と大腸菌由来のＬＰＳに反応する１株の抗体（ＩｇＭ型：Ｓ２８２０３Ｒ）の樹立に成功した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例２〕実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いた実験系の感度の評価
　Ｓ２８２０１Ｒ、Ｓ２８２０３Ｒそれぞれにおいて同一抗体でサンドイッチ系を組むことができるか、サンドイッチＥＬＩＳＡによって評価した。サンドウィッチＥＬＩＳＡの具体的な手順は以下の通りである。
・ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにＰＢＳで希釈したＳ２８２０１ＲまたはＲ２８２０３Ｒ抗体溶液を分注し（５μｇ／ｍＬ，５０μｌ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間または４℃で一晩静置した。また、コントロールとしてラットＩｇＭモノクローナル抗体を用いて同様の操作を行った。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ブロッキング液を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間または４℃で一晩静置した。
・ブロッキング液を除去後、各濃度（表示値）に希釈したＬＰＳを分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でビオチン標識した各濃度のＬＰＳを分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを分注し（０．２μｇ／ｍＬ，５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で３０分間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＯＰＤ発色液を分注（５０μＬ／ｗｅｌｌ）し、室温で１０分間反応させた。
・停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、反応を停止した。プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　結果を表４及び５、並びに図２及び３に示す。その結果、サンドイッチ系を組むことは可能であることが示された（図２及び３）。また、Ｓ２８２０１ＲサンドウィッチＥＬＩＳＡ系は、約２ｎｇ／ｍＬ（表示値）の濃度まで抗原を検出可能であった。Ｓ２８２０３ＲサンドイッチＥＬＩＳＡ系は約３０ｎｇ／ｍＬ（表示値）の濃度まで抗原を検出可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔実施例３〕リムルス試薬との感度の比較
　肺炎桿菌由来のＬＰＳ及び大腸菌由来のＬＰＳを用いて、リムルス試薬（製品名「エンドトキシン-シングルテストワコー」富士フイルム和光純薬社製）の感度を測定し、実施例２において構築したサンドイッチ系の感度と比較した。リムルス試薬の実験手順は、添付の説明書に記載のプロトコルの通りに行った。肺炎桿菌由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び大腸菌由来のＬＰＳ（富士フィルム和光純薬株式会社）を段階希釈し、各濃度について、リムルス試薬を用いて検出可能かどうかを試験した。
　結果を表６及び７に示す。リムルス試薬では、肺炎桿菌のＬＰＳが１２５ｎｇ／ｍＬ（表示値）で検出不可能となった。したがって、実施例２において構築したサンドイッチ系は、肺炎桿菌のＬＰＳの分析において、リムルス試薬よりも６０倍以上感度が高いことが示された。
　また、リムルス試薬では、大腸菌のＬＰＳが１００ｎｇ／ｍＬ（表示値）で検出不可能となった。したがって、実施例２において構築したサンドイッチ系は、大腸菌のＬＰＳの分析において、リムルス試薬よりも３倍以上感度が高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
〔実施例４〕本発明の分析方法の感度の算出
４－１　リムルス試薬による市販ＬＰＳ溶液の値付け
４－１－１　検量線作成
・市販のＬＰＳ（５ｍｇ／ｍＬ（表示値））をＰＢＳで各濃度（４００，３００，２００ｎｇ／ｍＬ）に希釈した。
・希釈したＬＰＳをＬｉｍｕｌｕｓ　ＨＳ－Ｔ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｔｅｓｔ　Ｗａｋｏを用い、使用説明書に従い測定した。
・表示値ベースの市販ＬＰＳ濃度とＬｉｍｕｌｕｓ　ＨＳ－Ｔ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｔｅｓｔ　Ｗａｋｏによる測定値とを用い、二次関数の近似式を作成した。結果を表８及び９と図４及び５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　その結果、二次関数の近似式は以下の通りとなった。
・Ｓ２８２０１Ｒ：ｙ＝６×１０－５ｘ２＋０．００５７ｘ
・Ｓ２８２０３Ｒ：ｙ＝０．０００１ｘ２＋０．０１２６ｘ
４―１－２　市販のＬＰＳ溶液の濃度算出方法
　市販のＬＰＳの表示値濃度を上述の検量線式のｘに代入し、エンドトキシン濃度を算出した。
例）１００ｎｇ／ｍＬの肺炎桿菌ＬＰＳを濃度換算する場合、ｘ＝１００を適用すると、ｙ＝１．１７となる。したがって、１００ｎｇ／ｍＬの肺炎桿菌ＬＰＳ中のエンドトキシン量は１．１７ｐｇ／ｍＬとなる。
４－２　最小検出限界評価
　実施例３に記載の感度の評価の手順に従い、健常人血清に各濃度でＬＰＳを添加したサンプルに対しｎ＝８で測定を行った。８回の測定の結果から、平均値と２．６ＳＤ（標準偏差×２．６）を算出した。
　２．６ＳＤ法により最小検出限界を算出した。具体的には、「０ｐｇ／ｍＬの感度＋２．６ＳＤ」＜「各サンプルの感度－２．６ＳＤ」となった場合にＬＰＳを検出可能であると判断し、前記条件を満たす最低ＬＰＳ濃度を最小検出限界とした。結果を表１０及び１１と図６及び７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　その結果、Ｓ２８２０１Ｒは、０．０１１ｐｇ／ｍＬの濃度まで検出可能であり、Ｓ２８２０３Ｒは、０．２２ｐｇ／ｍＬの濃度まで検出可能であることが分かった。
〔実施例５〕交差率の測定
　Ｓ２８２０１Ｒ、Ｓ２８２０３Ｒが、それぞれ特異的に反応しない菌体由来のＬＰＳと交差反応するかを、競合ＥＬＩＳＡによって確認した。競合ＥＬＩＳＡの具体的な手順は以下の通りである。
・ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートにＰＢＳで希釈した各種ＬＰＳを分注し、室温で２時間または４℃で一晩静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ブロッキング液を分注し（１００μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間または４℃で一晩静置した。
・ブロッキング液を除去後、希釈液で希釈した抗体液と各濃度に希釈した各種ＬＰＳを分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、抗体希釈液で１７０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１時間静置した。
・３回洗浄後（４００μＬ／ｗｅｌｌ）、ＯＰＤ発色液を分注（５０μＬ／ｗｅｌｌ）し、室温で１０分間反応させた。
・停止液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、反応を停止した。プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　以下の方法により、各抗体が特異的に反応しない菌体由来のＬＰＳとの交差率を算出した。
　競合ＥＬＩＳＡの結果を表１２及び表１３に、競合ＥＬＩＳＡにより算出した交差率を表１４に示した。
・Ｓ２８２０１Ｒ
　緑膿菌由来ＬＰＳを競合させたことによるＥＬＩＳＡの吸光度変化（（緑膿菌由来ＬＰＳ濃度０ｐｇ／ｍＬの吸光度）－（緑膿菌由来ＬＰＳ濃度１５００ｐｇ／ｍＬの吸光度））を肺炎桿菌由来ＬＰＳを競合させたことによるＥＬＩＳＡの吸光度変化（（肺炎桿菌由来ＬＰＳ濃度０ｐｇ／ｍＬの吸光度）－（肺炎桿菌由来ＬＰＳ濃度１５００ｐｇ／ｍＬの吸光度））で除し、１００を乗じた数値を交差率（％）とした。ただし、算出した数値が負の値にであった場合は、交差率０％とした。大腸菌由来ＬＰＳに対する交差率についても同様の方法で算出した。
・Ｓ２８２０３Ｒ
　肺炎桿菌由来ＬＰＳを競合させたことによるＥＬＩＳＡの吸光度変化（（肺炎桿菌由来ＬＰＳ濃度０ｐｇ／ｍＬの吸光度）－（肺炎桿菌由来ＬＰＳ濃度５０００ｐｇ／ｍｌの吸光度））を大腸菌由来ＬＰＳを競合させたことによるＥＬＩＳＡの吸光度変化（（大腸菌由来ＬＰＳ濃度０ｐｇ／ｍＬの吸光度）－（大腸菌由来ＬＰＳ濃度５０００ｐｇ／ｍＬの吸光度））で除し、１００を乗じた数値を交差率（％）とした。ただし、算出した数値が負の値にであった場合は、交差率０％とした。緑膿菌に対する交差率についても同様の方法で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１２より、Ｓ２８２０１Ｒと肺炎桿菌ＬＰＳとの反応による吸光度は、反応系に共存させた遊離肺炎桿菌ＬＰＳの濃度依存的に低下したが、緑膿菌ＬＰＳ又は大腸菌ＬＰＳ共存下においては、共存するＬＰＳ濃度に応じた吸光度変動が見られなかった。また、表１４より、Ｓ２８２０１Ｒと緑膿菌ＬＰＳ又は大腸菌ＬＰＳとの交差率は１０％未満であることが分かった。表１３より、Ｓ２８２０３Ｒと大腸菌ＬＰＳとの反応による吸光度は、反応系に共存させた遊離大腸菌ＬＰＳの濃度依存的に低下したが、肺炎桿菌ＬＰＳ又は緑膿菌ＬＰＳ共存下においては、共存するＬＰＳ濃度に応じた吸光度変動が見られなかった。また表１４より、Ｓ２８２０３Ｒと肺炎桿菌ＬＰＳ又は緑膿菌ＬＰＳとの交差率は１０％未満であることが分かった。
〔参考例２〕市販抗ＬＰＳ抗体との感度比較
　実施例４におけるサンドイッチＥＬＩＳＡの抗体溶液及びビオチン標識抗体を、市販の抗ＬＰＳ抗体（Ａｎｔｉ-Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ, Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，　ｃｌｏｎｅ　ＷＮ１ ２２２－５；　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ社製）に変更して、実施例４と同様に健常人血清中の大腸菌ＬＰＳを検出する場合の最小検出限界を算出した。結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　表１５より、本実施例において実施した分析方法では、市販の抗ＬＰＳ抗体を使用したＥＬＩＳＡよりも５倍以上高感度で大腸菌ＬＰＳを検出可能であることが分かった。
〔参考例３〕市販ＬＰＳ検出ＥＬＩＳＡキットとの感度比較
　市販のＬＰＳ検出ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　（ＫＢＳＬ）　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ）を用い、マニュアルに従って、肺炎桿菌ＬＰＳを添加した健常人血清をサンプルとした場合の４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を測定した。各ＬＰＳ濃度のサンプルに対しｎ＝３で測定した。同時にキットに付属のＰｏｓｉｔｉｖｅ　ＣｏｎｔｒｏｌおよびＮｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌも同様に測定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ測定時のＯ.Ｄ.は１．１４であり、Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ測定時のＯ.Ｄ.は０．０４９であった。サンプルの測定結果について、３回の測定の結果から、平均値と２．６ＳＤ（標準偏差×２．６）を算出した。
　２．６ＳＤ法により最小検出限界を算出した。具体的には、「０ｐｇ／ｍＬのＯ.Ｄ.＋２．６ＳＤ」＜「各サンプルのＯ.Ｄ.－２．６ＳＤ」となった場合に、その濃度のＬＰＳを検出可能であると判断し、ある濃度以上のサンプルがすべて前記条件を満たす最低ＬＰＳ濃度を最小検出限界とした。結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６より、本実施例における分析方法では、市販のＬＰＳ検出ＥＬＩＳＡキットよりも２０００倍以上高感度に肺炎桿菌ＬＰＳを検出可能であることが分かった。なお、キットのマニュアルに記載のある、Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＣｏｎｔｒｏｌのＯ.Ｄ.＋０．１５以上の感度で陽性判定とする基準を採用する場合、今回測定したサンプルはいずれの濃度においても陰性判定、つまり検出不能である。したがって、判定方法を変更した場合においても、本実施例における分析方法の方が高感度に肺炎桿菌ＬＰＳを検出可能であることが分かった。
　本発明によれば、リムルス試薬と同等以上の感度を有し、簡便な操作で敗血症原因細菌を特定できる、敗血症原因細菌の免疫学的分析方法を提供することができる。
［寄託生物材料への言及］
（１）抗体番号Ｓ２８２０１Ｒを産生するハイブリドーマ
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構  
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月３日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  ＢＰ－０３２４１
（２）抗体番号Ｓ２８２０３Ｒを産生するハイブリドーマ
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構  
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
令和２年７月３日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ  ＢＰ－０３２４２

Claims (16)

  1. 　生体試料中の敗血症原因細菌の免疫学的分析方法であって、
    肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、並びに
    大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体、
    のうち少なくとも１つのモノクローナル抗体と生体試料とを接触させる工程を含み、
    前記敗血症原因細菌は、肺炎桿菌又は大腸菌である免疫学的分析方法。
  2. 　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体の、肺炎桿菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％未満である、請求項１に記載の免疫測定学的分析方法。
  3. 　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体の、大腸菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％未満である、請求項１又は２に記載の免疫測定学的分析方法。
  4. 　前記モノクローナル抗体として、不溶性担体に固定化した固相抗体と、標識物質を結合した標識抗体とを使用し、前記固相抗体と前記標識抗体が同一のモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫学的測定方法。
  5. 　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、ＩｇＭ抗体である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  6. 　前記肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４１のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である、請求項１～５のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  7. 　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、ＩｇＭ抗体である、請求項１～６のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  8. 　前記大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４２のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である、請求項１～７のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  9. 　前記生体試料が、血液、血漿、又は血清である、請求項１～８のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
  10. 　肺炎桿菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び大腸菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体。
  11. 　肺炎桿菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％以下である請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
  12. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４１のハイブリドーマより産生される、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
  13. 　大腸菌由来のリポ多糖とは反応するが、緑膿菌由来のリポ多糖及び肺炎桿菌由来のリポ多糖とはいずれも反応しないモノクローナル抗体。
  14. 　大腸菌以外の敗血症原因細菌由来のリポ多糖への交差率が、１０％以下である請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  15. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３２４２のハイブリドーマより産生される、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
  16. 　前記標識物質に由来するシグナルを測定する工程と
    　前記シグナルの測定値とカットオフ値とを比較する工程と
    をさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
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