WO2007139099A1

WO2007139099A1 - 新規な酸化ｌｄｌ複合体及びその検知方法

Info

Publication number: WO2007139099A1
Application number: PCT/JP2007/060887
Authority: WO
Inventors: Eiji Matsuura
Original assignee: Okayama Prefecture Industrial Promotion Foundation
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2007-12-06
Also published as: US20100081149A1

Abstract

　血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２－グリコプロテインＩの三者は複合体を形成し、この複合体を抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体および抗β２－グリコプロテインＩ抗体のいずれかを用いて検出することにより、高脂血症や動脈硬化などの疾患を判定することができる。

Description

明細書

新規な酸化 LDL複合体及びその検知方法

技術分野

[0001] 本発明は、血清アミロイド Pコンポーネント、酸化 LDL及び β 2—グリコプロテイン I 力なる複合体、その検知方法及びこれに用いるキット等に関する。

背景技術

[0002] 本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。

β - GPI : j8 2—グリコプロテイン I

2

BSA：ゥシ血清アルブミン

CRP： C 反応性タンパク質

EDTA:エチレンジァミン四酢酸

ELISA:酵素結合免疫吸着アツセィ

HRP：ホースラディッシュ（西洋ヮサビ）のペルォキシダーゼ

LDL：低密度リポタンパク質 (酸化されて!、な、ネイティブなもの）

OD :吸光度

oxLDL:酸化 LDL

oxLDL/ β - GPI複合体： oxLDL及び j8 - GPIからなる複合体

2 2

PBS：リン酸緩衝生理食塩水

SAP :血清アミロイド Pコンポーネント (serum amyloid P component;ペントラキシンタンパク質の 1つ）

SAP/oxLDL/ β - GPI複合体： SAP、 oxLDL及び j8 -GPIからなる複合体

2 2

SAP/oxLDL複合体： SAP及び oxLDLからなる複合体

TBS：トリス緩衝生理食塩水

[0003] SAPはマウスの炎症にぉ、て誘導される急性期タンパク質の一種である（非特許文献 1)。一方、 oxLDLは j8 -GPIと複合体を形成し、ヒトにおいてこの oxLDLと j8 -GPIと

2 2 の複合体はさらに CRPとの複合体を形成することが知られている（特許文献 1)。し力し、 SAP力 oxLDL及び j8 -GPIと複合体を形成することは知られていない。ましてこの複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られていない。また SAP が oxLDLと複合体を形成することも知られておらず、この複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られてヽな、。

[0004] 特許文献 1：特開 2004— 271502号公報

非特干文献 2： Carlanda C, Bottazzi B, Bastone A, and Mantovani A. Pentraxins at t he crossroads between innate Immunity, inflammation, matrix deposition, and female fertility. Annu Rev Immunol 23: 337—66, 2005

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、 SAP/oxLDL/ β - GPI複合体、 SAP/oxLDL複合体、これらの検知方法

2

及びこれらに用いるキット等を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者は、 SAP, oxLDL及び β -GPIの三者の関係を調べた結果、驚くべきこと

2

にこれら三者が複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。

[0007] すなわち本発明は、 SAP/oxLDL/ β -GPI複合体 (以下、「本発明複合体」 t 、う。）

2

を提供する。

また本発明は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 ι8 — GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体の

2

検知方法 (以下、「本発明複合体検知方法」という。）を提供する。本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 ι8 — GPI抗体を接触させて、「抗 SAP抗体一本発明複合体抗 -GPI

2 2 抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗 SAP抗体及び抗 j8 — GPI抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好

2

ましい。 [0008] また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；

ステップ（1)：抗体 Aが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体 A—本発明複合体」で示される第 1複合体を形成させるステップ、

ステップ（2)：ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Bを接触させ、「固相に固着された抗体 A—本発明複合体抗体 B」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び

ステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体 Aは抗 SAP抗体及び抗 β GPI抗体の!/、ずれか一方の抗体を、抗体 Β

2

は他方の抗体をそれぞれ示す。 ) ο

以上にいう「本発明複合体を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。

[0009] また本発明は、以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法」という。）を提供する；

ステップ（1)：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップ、及び

ステップ（2)：ステップ（1)における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化力選択されるものであることが好ましい。

[0010] また本発明は、抗 SAP抗体及び抗 |8 — GPI抗体を構成成分として少なくとも含む

2

、本発明複合体の検知キット (以下、「本発明複合体検知キット」という。）を提供する。この抗 SAP抗体及び抗 |8 — GPI抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されてい

2

るものが好ましい。

[0011] また本発明は、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好まし、。同時に本発明者は、 SAP及び oxLDLが複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。

すなわち本発明は、 SAP/oxLDL複合体 (以下、「本発明複合体 2」という。）をさらに提供する。

[0012] また本発明は、本発明複合体 2を含有している可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体 2 の検知方法 (以下、「本発明複合体検知方法 2」という。）を提供する。本発明複合体検知方法 2の一例として、本発明複合体 2を含有している可能性がある試料に、抗 S AP抗体及び抗 oxLDL抗体を接触させて、「抗 SAP抗体-本発明複合体 2—抗 ox LDL抗体」力なるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体 2の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法 2における抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体は、その、ずれか一方が固相に固着されて、るものであることが好ましい。

[0013] また本発明複合体検知方法 2の一例として、以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、本発明複合体 2の検知方法も挙げることができる；

ステップ（1)：抗体 Cが固着された固相に、本発明複合体 2を含有している可能性力 Sある試料を接触させて「固相に固着された抗体 C一本発明複合体 2」で示される第 1複合体を形成させるステップ、

ステップ（2)：ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Dを接触させ、「固相に固着された抗体 C一本発明複合体 2—抗体 D」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び

ステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体 Cは抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体のいずれか一方の抗体を、抗体 Dは他方の抗体をそれぞれ示す。 ) o

以上にいう「本発明複合体 2を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。

[0014] また本発明は、以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法 2」という。）を提供する；

ステップ（1)：本発明複合体検知方法 2を用いて、体液中に存在する本発明複合体

2を検知するステップ、及び

[0015] また本発明は、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体 2の検知キット（以下、「本発明複合体検知キット 2」という。）を提供する。この抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。

[0016] また本発明は、本発明複合体検知キット 2からなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット 2」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好まし、。

発明の効果

[0017] 本発明複合体は、例えば本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットのスタンダード等として利用することができ、極めて有用である。また本発明複合体検知方法によれば、試料中に存在する本発明複合体を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、これに基づいて本発明複合体検知キットが提供されることから極めて有用である。本発明疾患検知方法は、体液中の SAP/oxLDL/ iS -GPI複合体の検知を通じて、高

2

脂血症や動脈硬化などの疾患を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、さらにこれに基づいて本発明疾患検知キットが提供されることから極めて有用である。また本発明複合体検知キットや本発明疾患検知キットは、これを用いることによって本発明複合体検知方法や本発明疾患検知方法をさらに簡便、迅速、かつ容易に実施することができ、極めて有用である。そしてこれらの本発明は、疾患 (例えば高脂血症や動脈硬化など）のモデル動物を用いてその疾患に対する医薬の候補物質を探索したり、その物質の有効性を評価するような医薬開発の場面においても利用することができる。

[0018] また本発明複合体 2、本発明複合体検知方法 2、本発明疾患検知方法 2、本発明複合体検知キット 2及び本発明疾患検知キット 2についても、上記の本発明複合体、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットと同様に極めて有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 以下に、本発明の実施の形態を説明する。

< 1 >本発明複合体

本発明複合体は、 SAP/oxLDL/ β -GPI複合体である。本発明複合体は、 SAP, ox

2

LDL及び 13 -GPIの三者により構成されることを特徴とする。

2

本発明複合体は、 SAP, oxLDL及び |8 -GPIの三者を生理的条件下で接触させるこ

2

とにより製造することができる。 SAP、 oxLDL及び j8 - GPIは、それぞれ公知の方法で

2

製造することができる。また市販のものを用いることもできる。

ここにいう「生理的条件」も、マウス生体内（特に血液）における塩濃度、 pH、温度等と同等の条件である限りにおいて特に限定されないが、例えば、緩衝作用を有する生理的塩類溶液中、 pH6〜8 (好ましくは pH6. 5〜7. 5)、温度 35°C〜40°C (好ましくは 36°C〜38°C)の条件が例示される。

また、本出願書類における「接触」の方法は、接触対象となる分子同士が互いに接触する状態となる限りにお、て特に限定されな、。

[0020] また、 SAP、 oxLDL及び β -GPIを接触させる順序も特に限定されな、。例えば、こ

2

れら三者を同時に接触させてもよぐいずれか二者をまず接触させた後これに残りの一者を接触させてもよい。例えば、まず oxLDLと |8 - GPIを接触させ、次いでこれに SA

2

Pを接触させる方法が例示される。

接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、まず oxLDLと |8 - GPIを接触させ、次いでこれに SAPを接触させ

2

る方法を採用する場合には、 oxLDLと |8 - GPIの質量比として、 oxLDL: - GPI = 1 :

2 2

5〜5 : 1 (好ましくは 1 :4〜4 : 1、より好ましくは 1 : 3〜3 : 1、より好ましくは 1： 2〜2： 1) を例示することができる。次いで SAPを接触させる際には、 oxLDL/ iS -GPI複合体と S

2

APの質量比として、 oxLDL/ jS - GPI複合体： SAP= 20 : 1〜1 : 10 (好ましくは 15 : 1〜1

2

: 5、より好ましくは 12 : 1〜1： 2)を例示することができる。この場合において、 SAPは、終濃度 0.1mM〜10mM程度（好ましくは 0.5mM〜5mM程度）のカルシウムイオン存在下で接触させることが好まし、。

[0021] また、これらの接触時間も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。一般に、反応は時間依存的で接触時間が長いほど十分に複合体が形成されることから、例えば 10時間〜 48時間（好ましくは 12時間〜 24時間）程度を例示することができる。本発明複合体のより具体的な製造方法の一例は、後述の実施例を参照されたい

[0022] また本発明複合体は、高脂肪食を摂取させた (高脂肪食を負荷した)高脂血症モデルマウスの血液力精製することによつても製造することができる。具体的には、高脂血症モデルマウス（例えば、後述の LDLR- /-マウスや、 apoE- /-マウスなど）に高脂肪食を摂取させ、その後採血して、その血液中から本発明複合体を精製することによつて製造することができる。

ここにいう「精製」は、いわゆる完全精製のみならず、部分精製を含む概念である。精製の方法も特に限定されないが、例えば、抗 SAP抗体又は抗 |8 -GPI

2 抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィー等の手法を採用することができる。これに用いる抗 SAP抗体又は抗 |8 - GPI抗体は、いずれも公知のものを用いることができる。もちろん

2

、市販のものを用いてもよい。例えば、後述の実施例に示す通り、抗 SAP抗体は巿販されており、これを用いることができる。また抗 j8 - GPI抗体は、例えば「WB- CAL- 1」 (

2

J. Immunol, 149, pl063- 1068(1992))を用いることができる。

[0023] 本発明複合体は、例えば、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キット等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体と ELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体を定量することもできる。もちろん、本発明複合体を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。

[0024] < 2>本発明複合体検知方法

本発明複合体検知方法は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 |8 -GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明

2

複合体の検知方法である。

ここで、「本発明複合体を含有している可能性がある試料」とは、本発明複合体の検知が意図されている試料を意味する。このような意図がある限りにおいて、現実にその試料に本発明複合体が含有されて、るか否かは関係な!/、。

また「試料」の種類も特に限定されず、人工的に製造された試料であっても、天然物に由来する試料であってもよい。例えば、人工的に製造した本発明複合体の水溶液や、生体に由来する試料等は、当然にここにいう「試料」に包含される。なかでも、生体に由来する試料が好ましぐ生体に由来する液体 (体液）が好ましい。体液の種類も特に限定されないが、例えば、血液を例示することができる。ここにいう「血液」は、血清や血漿等を包含する概念である。

本発明複合体検知方法は、このような試料に、抗 SAP抗体及び抗 |8 -GPI

2 抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。

[0025] したがって、このような試料に抗 SAP抗体のみを接触させてもよぐ抗 β - GPI抗体

2 のみを接触させてもよぐ両者を接触させてもよい。また、両者を接触させる場合、両者を同時に接触させてもよぐまず一方を接触させた後に他方を接触させても良いことは、前記と同様である。両者を接触させる方法を採用すれば、試料中に SAP、 β -

2

GPU oxLDL/ β -GPI複合体等の夾雑物が存在していても、本発明複合体のみを特

2

異的に検知することができる。ここで用いる抗 SAP抗体ゃ抗 |8 -GPI抗体は、それぞ

2

れ SAPや |8 -GPIに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、検知精

2

度を高めるためには、これらの抗原に特異的に結合するものであることが好ましい。なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、大量生産や均質性を考慮した場合には、モノクローナル抗体であることが好ましい。

[0026] これらの抗体は、これらの抗原を用いて、抗体の通常の作製方法に従って作製することができる。また、巿販されているものをそのまま用いても良い。例えば、抗 SAP抗体は市販のものをそのまま用いることができる。また、抗 j8 -GPI

2 抗体として具体的には、 WB- CAL- 1 (J. Immunol, 149, pl063- 1068(1992))、 Cof- 22及び Cof- 23 (Blood, 87, p3262- 3270(1996))、 EY2C9 (Arthritis Rheum., 37, pl453- 1461(1994))等が例示される。

また「接触」の条件は、これらの抗体と本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。

本発明複合体検知方法は、このようなステップを含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、試料を調製するステップや、洗浄するステップ、本発明複合体を検出するための反応を行うステップ、検量線や関係式を作成するステップ、本発明複合体の検知結果を解析するステップ等をさらに含んでいてもよい。

[0027] なお、本出願書類にお!/、て「検知」とは、定性的な検知（存否や有無の検知)及び定量的な検知（存在量や程度の検知）の両方を含む概念である。したがって、例えば本発明複合体の量 (濃度)等を測定することもここに、う「検知」の語に包含される。

[0028] また本発明複合体検知方法は、前記のステップを含む限りにお、て、その具体的な方法も限定されない。具体的な方法の一例としては、例えば抗体を用いた免疫学的な測定手法 (ELISA法 (サンドイッチ法、競合法、阻害法等）、ィムノブロッテイング、凝集法等)が例示される。

本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有して!/、る可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 - GPI抗体を接触させて、「抗 SAP抗体—本発明複合

2

体—抗 j8 -GPI抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本

2

発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗 S AP抗体及び抗 |8 — GPI抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているもの

2

であることが好ましい。

[0029] また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；

ステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。 (ただし、抗体 Aは抗 SAP抗体及び抗 β GPI抗体のヽずれか一方の抗体を、抗

2

体 Βは他方の抗体をそれぞれ示す。 )₀

以下、ステップごとに説明する。

ステップ（1)は、抗体 Αが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性力 Sある試料を接触させて「固相に固着された抗体 A—本発明複合体」で示される第 1 複合体を形成させるステップである。

ここにいう「抗体 Aが固着された固相」は、抗体 Aを固相に固着させることにより製造することができる。

[0030] この抗体 Aを固着するために用いる固相は、抗体 Aを固着させることができ、かつ、水、体液、測定反応液等に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのゥエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好まし!/、。

これらの固相に抗体 Aを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、タンパク質や脂質の一般的な固着方法を利用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。物理的吸着法として具体的には、例えば、抗体 Aを緩衝液等に溶解し、この溶液を固相（例えばマイク口プレート）に接触させることによって、抗体 Aを固相に吸着させる方法を挙げることができる。

[0031] また、抗体 Aを固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに試料中の本発明複合体ゃ夾雑分子などが固着すると検知の結果に影響を及ぼすおそれがある。よって、試料を固相と接触させる前にプロッキング物質を添加して抗体 Aが固着してヽな、部分を被覆しておくことが好ま、。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、その他ブロッキング物質として巿販されてヽるものを使用することもできる。

[0032] このようにして得られる「抗体 Aが固着された固相」に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させることにより、「固相に固着された抗体 A—本発明複合体」で示される第 1複合体が形成される。ここにいう「接触」は、試料中の本発明複合体分子と、固相に固着された抗体 A分子が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体 Aと本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することがでさる。

ステップ（2)は、ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Bを接触させ、「固相に固着された抗体 A—本発明複合体抗体 B」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップである。

ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Bを接触させることにより、「固相に固着された抗体 A—本発明複合体抗体 B」で示されるサンドイッチ状複合体が形成されるここにいう「接触」も、抗体 B分子と、第 1複合体分子（固相に固着されている）が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体 Bと第 1複合体分子（固相に固着されている）とが抗原抗体反応する条件である限りにお、て特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。

[0033] なお、抗体 Aは抗 SAP抗体及び抗 β -GPI抗体の!/、ずれか一方の抗体を、抗体 Β

2

は他方の抗体をそれぞれ意味する。したがって、抗体 Αとして抗 SAP抗体を採用した場合には、抗体 Bは抗 |8 -GPI抗体である。逆に、抗体 Aとして抗 |8 - GPI抗体を採用

2 2

した場合には、抗体 Bは抗 SAP抗体である。

ステップ（3)は、ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップである。

この「ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体の検知」の方法も、「固相に固着された抗体 A—本発明複合体抗体 B」カゝらなるサンドイッチ状複合体を検知しうる限りにお、て特に限定されな、が、当該サンドイッチ状複合体の開放端 (固相に直接固着されていない側）に存在する「抗体 B」を検知することによって行うことが好ましい。

そのために、ステップ 2において接触させる「抗体 B」自体を標識物質で標識しておいてもよい。また「抗体 B」として標識されていないものを用いる場合には、「『抗体 B』に結合する物質」であって標識物質で標識されたものを用いてもよい。「『抗体 B』に結合する物質」としては、例えば「抗体 B」（免疫グロブリン）が由来する動物又はクラス等に応じた、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば「抗体 B」がヒッジ由来の IgGである場合には、「『抗体 B』に結合する物質」として抗ヒッジ IgG抗体を用いることができる。

[0034] この標識物質を検出することによって、ステップ 2で形成された「固相に固着された抗体 A—本発明複合体抗体 B」からなるサンドイッチ状複合体中に存在する「抗体 B」を検知することができる。すなわち、当該サンドイッチ状複合体が検知されることとなる。

このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 j8 ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルォレセインイソチオシァネート (FITC)など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ピオチン、アビジン (ストレプトアビジンを含む)等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、ダルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルポジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、 1987年発行参照〕等力も適宜選択することができる。例えば標識物質としてピオチンを使用する場合は、ピオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法 (Avidi n-Biotin Chemistry: A Handbook, 57—63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）、またフルォレセインイソチオシァネートを使用する場合は特公昭 63— 17 843号公報記載の方法等から適宜選択できる。

[0035] 標識物質の検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルォキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン、 0-フエ-レンジァミン等の発色基質および過酸ィ匕水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合、を吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。

[0036] < 3 >本発明疾患検知方法

本発明疾患検知方法は、以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。

ステップ（2)：ステップ（1)における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。以下、ステップごとに説明する。

ステップ（1)：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップである。

本発明疾患検知方法は、本発明複合体検知方法を疾患の検知方法に応用したものである。ステップ（1)における「本発明複合体検知方法」については、前記の「く 2 >本発明複合体検知方法」を参照されたい。ただし、ここでは「本発明複合体を含有して、る可能性がある試料」として「体液」を用いることとなる。ここで用いる「体液」は、疾患の検知対象となる動物由来のものである限りにおいて特に限定されない。疾患の検知対象となる動物も特に限定されないが、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、家兎等を例示することができる。

また「体液」の種類については、含有される本発明複合体の量が疾患によって変動する体液である限りにお、て特に限定されな、が、血液 (血清や血漿を包含する概念である。）であることが好ましい。

[0037] ステップ（2)は、ステップ（1)における検知結果と、疾患とを関連づけるステップである。これにより、疾患の検知を行うことができる。

前記の通り、本出願書類における「検知」の語は、定性的な検知のみならず、定量的な検知をも含む概念である。したがって、ここにいう「ステップ（1)における検知結果」は、体液中の本発明複合体の「存否や有無」（定性的な検知結果)であっても、「存在量や程度」（定量的な検知結果)であってもよい。また「存在量」や「程度」については、濃度既知のスタンダードを用いて作成した検量線や関係式等力求めた量（実測値)であっても良ぐ健常動物 (疾患に罹患していない動物）に対する比 (相対値 )であっても良い。

そして、体液中における本発明複合体の量は疾患によって増加しうる。この場合において、体液中の当該複合体量が健常動物のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患して!/、る」もしくは「疾患に罹患して、る可能性が高、」と関連づけることができる。体液中の当該複合体量が健常動物のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患して、る可能性は低、」と関連づけることができる。

[0038] また本発明疾患検知方法は、疾患への罹患の有無のみでなぐ罹患の程度の検知も含まれる。例えば、ある動物の体液中の当該複合体量を定期的に測定し、当該複合体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行して、る」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された当該複合体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された当該複合体量に変化がない場合には、「疾患の程度 (または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度 (または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。したがって、本発明疾患検知方法は、医薬品の候補物質の探索やその物質の有効性評価等の用途にも使用しうる。

[0039] 本発明疾患検知方法によって検知される「疾患」は、疾患により体液中の本発明複合体の量が変動する性質のものである限りにおいて特に限定されないが、高脂血症及び動脈硬化力も選択されるものであることが好ましい。

以上のように、本発明複合体検知方法を用いて体液中に存在する本発明複合体を検知し、その検知結果と疾患とを関連づけることによって、疾患を検知することができる。

[0040] < 4 >本発明複合体検知キット

本発明複合体検知キットは、抗 SAP抗体及び抗 -GPI抗体を構成成分として少な

2

くとも含む、本発明複合体の検知キットである。ここで用いることができる抗 SAP抗体及び抗 |8 - GPI抗体は、前記の「く 2>本発明

2

複合体検知方法」と同様である。この抗 SAP抗体及び抗 |8 -GPI抗体は、そのいずれ

2

か一方が固相に固着されて、るものが好まし、。ここで用、ることができる固相及び抗体の固着の方法は、前記の「く 2 >本発明複合体検知方法」と同様である。

本発明複合体検知キットは、抗 SAP抗体及び抗 -GPI抗体を構成成分として含ん

2

で、る限りにお、て、さらに他の構成成分を含んで、てもよ、。

本発明複合体検知キットに加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「抗 SAP抗体又は抗 |8 -GPI抗体に結合し、かつ標識物質で標識された抗体（二次

2

抗体)」等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、試料希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。

これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明複合体検知方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。本発明複合体検知キットを用いた本発明複合体の検知は、本発明複合体検知方法に従って行うことができる。なかでも、サンドイッチ状複合体を形成させてこれを検知する方法 (いわゆるサンドイッチ法；前記の「く 2 >本発明複合体検知方法」参照）にお、て用いられることが好ましい。

[0041] < 5 >本発明疾患検知キット

本発明疾患検知キットは、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キットについては、前記を参照されたい。

ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化力選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キットを用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法に従って行うことができる。

[0042] < 6 >本発明複合体 2

本発明複合体 2は、 SAP/oxLDL複合体である。本発明複合体 2は、 SAP及び oxLD Lの二者により構成されることを特徴とする。

本発明複合体 2は、 SAP及び oxLDLの両者を生理的条件下で接触させることにより製造することができる。 SAP及び oxLDLは、それぞれ公知の方法で製造することができる。また市販のものを用いることもできる。ここにいう「生理的条件」については、前記 < 1 >と同様である。

また両者を接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、 oxLDLと SAPの質量比として、 oxLDL : SAP=20 : l〜 1： 10 (好ましくは 15： 1〜1： 5、より好ましくは 12： 1〜1： 2)を例示することができる。この場合において、 SAPは、終濃度 0.1mM〜10mM程度（好ましくは 0.5mM〜5mM程度 )のカルシウムイオン存在下で接触させることが好ま、。

これらの接触時間、その他の点については前記 < 1 >と同様である。

本発明複合体 2は、例えば、本発明複合体検知方法 2、本発明疾患検知方法 2、本発明複合体検知キット 2及び本発明疾患検知キット 2等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体 2を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体 2の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体 2と ELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体 2を定量することもできる。もちろん、本発明複合体 2を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。

< 7>本発明複合体検知方法 2

本発明複合体検知方法 2は、本発明複合体 2を含有してヽる可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体 2の検知方法である。

「本発明複合体 2を含有している可能性がある試料」、「試料」等についての説明は、前記く 2 >と同様である。

本発明複合体検知方法 2は、このような試料に、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。

なお、抗 oxLDL抗体は、 oxLDLに結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。 oxLDLを抗原として、抗体の通常の作製方法に従ってモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作製することができる。なかでも、マウスモノクローナル抗 oxLDL抗体を用いることが好ましい。

他の説明は、前記 < 2 >と同様である。 [0044] 本発明複合体検知方法 2の一例として、本発明複合体 2を含有して、る可能性がある試料に、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体を接触させて、「抗 SAP抗体一本発明複合体 2—抗 oxLDL抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体 2の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法 2における抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体は、その、ずれか一方が固相に固着されて、るものであることが好ましい。

[0045] また本発明複合体検知方法 2の一例として、以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、本発明複合体 2の検知方法も挙げることができる；

ステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。 (ただし、抗体 Cは抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体のいずれか一方の抗体を、抗体 Dは他方の抗体をそれぞれ示す。 )₀

これらの説明は、前記 < 2 >と同様である。前記 < 2 >における「抗体 A」及び「抗体 B」を、それぞれ「抗体 C」及び「抗体 D」と読み替えて理解されたい。また前記 < 2> における「抗 β - GPI抗体」は「抗 oxLDL抗体」と読み替えて理解された!ヽ。

2

[0046] < 8 >本発明疾患検知方法 2

本発明疾患検知方法 2は、以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。

ステップ（1)：本発明複合体検知方法 2を用いて、体液中に存在する本発明複合体 2を検知するステップ、及び

ステップ（2)：ステップ（1)における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。本発明疾患検知方法 2についての説明は、前記く 3 >と同様である。

[0047] < 9 >本発明複合体検知キット 2 本発明複合体検知キット 2は、抗 SAP抗体及び抗 oxLDL抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体 2の検知キットである。

本発明複合体検知キット 2についての説明は、前記く 4>と同様である。なお前記 < 4 >における「抗 β - GPI抗体」は「抗 oxLDL抗体」と読み替えて理解された!、。

2

[0048] く 10 >本発明疾患検知キット 2

本発明疾患検知キット 2は、本発明複合体検知キット 2からなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キット 2については、前記を参照されたい。

ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化力選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キット 2を用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法 2に従つて行うことができる。

[0049] 以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。

実施例 1

[0050] SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の調製と測定系の確立

2

<材料及び方法 >

(1)高脂血症モデルマウス（LDLR-/-、 apoE-/")

本実施例では、動脈硬化好発 '高脂血症モデルマウスとして、 LDLR-/-マウス及び apoE- /-マウス（C57BL/6マウスバックグラウンド；米国 Jackson社より購入）を用いた。これらはそれぞれ、 LDL代謝に関わる受容体 (LDLR)やリガンド (apoE)を欠損させたマウスである。マウスの血中には LDLがほとんど存在しないため、本来動脈硬化と無縁の動物である力これらの高脂血症モデルマウスは、 LDLの前駆体であるカイ口ミクロンレムナントや IDL (intermediate (low)- density lipoprotein)が肝臓や組織に取り込まれなくなり、 LDLを血中に滞留させることが可能となる。よって、これらの LDLR- /-マウス及び apoE-/-マウスに高脂肪食を負荷し、血中コレステロールを上昇させることによって、高脂血症および動脈硬化を容易に発症させることができる（Pro Nat 1. Acad. Sci. U.S.A., 98, p7946- 51 (2001)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, p4431 -5 (1994) )。

[0051] (2)マウスおよびヒト oxLDLの調製

高脂肪食 (オリエンタル酵母 (株)）を 2週間負荷した LDLR-/-又は apoE-/-高脂血症モデルマウス血漿、あるいはヒト新鮮血漿に終濃度 0.25 mMとなるように 200 mM EDTAを添カ卩し、 EDTA含有血漿とした。 3ml用の超遠心管（3.5 PC, Beckman, fiiller ton, CA)にその EDTA含有血漿 750 μ 1を添カ卩し、 PBS (0.25 mM EDTA含有） 250 μ 1 を重層し、 100,000 rpm、 10°Cで 7分間遠心分離を行った（TL-100ローター； TLA100. 3, Beckman)。その後、上清 250 μ 1を除去し、 PBS (0.25 mM EDTA含有）を 250 μ 1重層して、さらに同条件で 2.5時間遠心を行った。その後、上清 250 /z lを除去し、 KBrを含有する PBS 150 1を添加して混和した。その後、同条件で 5時間遠心分離し、上清 200 μ 1を回収して LDL画分とした。得られた LDL画分を、 PBS (lmM EDTA含有）に対して一晩透析した後、酸化させた。

[0052] LDLの酸ィ匕は、終濃度 100 μ g/mlの LDLを、 5 M硫酸銅の存在下で 37°Cでインキュベーシヨンすることにより行った。インキュベーションを開始して 12時間後に、 EDTA を終濃度 ImMとなるように添加して、酸化反応を停止させた。酸化後の画分を、 PBS ( ImM EDTA含有）に対して透析し、その後濃縮して、 thiobarbituric acid reactive subs tance (TBARS)で酸化度を確認した (J. Lipid Res., 28, p495- 509 (1987) )。

[0053] (3)抗体 (抗 |8 -GPI抗体）

2

抗 j8 - GPI抗体として、「WB- CAL- l」（IgG2a, κ )を用いた。この抗体は j8 - GPI反

2 2 応性のモノクローナル自己抗体である。抗リン脂質抗体症候群モデルマウス (NZW X BXSBマウス）由来の抗体であり、遊離の β -GPIには反応せず、 oxLDLと複合体を

2

形成した j8 -GPIに反応性を示す抗体である。本抗体は複合体型のヒトおよびマウス

2

β -GPIを認識する（Immunol., 149, pl063- 1068(1992))。

2

[0054] (4) ELISA (マウスおよびヒト SAP/oxLDL/ β -GPI複合体のアツセィ方法）

2

まず、 Immulon 2HBプレート（Thermo Labsystems)に、 8 μ g/mlの WB- CAL- 1を 50 μ 1/ゥエルで添カ卩し、 4°Cでー晚インキュベートすることによって WB-CAL-1をプレートに固相化した。固相化後、 0.05% Tween20を含有する TBS (1.25mM Ca²⁺含有）を 20 0 1/ゥエル添加し、プレートを洗浄した。洗浄は 3回行った。

次いで、 0.5% BSAを含有する TBS (1.25 mM Ca²⁺含有）でプレートをブロッキングした。プレートを上記と同様に洗浄後、適当な倍率に希釈したサンプルを各ゥエルに添カロして、 27°Cで一晩インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。 [0055] 次いで、 10000倍に希釈したヒッジ抗マウス SAP抗体 (あるいは家兎抗ヒト SAP抗体）溶液を 100 1/ゥエル添カ卩して、室温で 1時間インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。

次、で、 4000倍に希釈した HRP標識抗ヒッジ IgG抗体 (あるいは抗家兎 IgG抗体)溶液を 100 1/ゥエル添カ卩し、室温で 1時間インキュベートした。その後、同様に洗浄した。

次いで、 0— PD試薬溶液（0— phenylenediamine dihydrochloride 4mg/10ml 0.1 Mクェン酸緩衝液 (PH5.0)及び 10 /z l 30% H O )を各ゥエルに 100 1ずつ添カ卩し、室温

2 2

で 20分間インキュベートした。その後、 1M H SO を 100 μ 1/ゥエル添カ卩して反応を停

2 4

止させ、 490nmで吸光度を測定した。

[0056] (5)マウスおよびヒト SAP/oxLDL/ iS -GPI複合体の調製と、当該複合体の標準曲線

2

作成

まず、 SAP/oxLDL/ iS -GPI複合体の標準品を調製した。調製は次の通り行った。

2

まず PBS中でマウスある!/、はヒト由来の oxLDLと β -GPIを質量比 1： 1となるように混

2

合し、 37°Cで一晩インキュベートした。その後、その複合体溶液に終濃度 ImMとなるようにカルシウムイオンを添加し、これにマウスあるいはヒト由来の SAPを、 oxLDL/ jS

2

-GPI複合体: SAPの質量比 10 : 1となるように混合し、 37°Cでー晚インキュベートした。なお、複合体の最終濃度は、 oxLDLとして 0.1 mg/mlとなるように調製した。

これにより得られたマウスあるいはヒト SAP/oxLDL/ β -GPI複合体を段階的に希釈

2

して、前記の ELISAにより 490nmの吸光度を測定した。対照として、 oxLDL/ jS -GPI複

2 合体及び SAPを同様に段階的に希釈して、上記複合体と同時に測定した。マウスあるいはヒト SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体の濃度とその測定結果との関係について、標

2

準曲線を作成した。

[0057] (6)マウス SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体形成の経時変化

2

マウス oxLDL/ jS -GPI複合体（質量比 4 : 1で混合し、 37。Cでー晚インキュベートし

2

たもの）に、 SAPをカルシウムイオン存在下で混合（oxLDL/ jS -GPI複合体： SAPの質

2

量比 = 20 : 1)し、 37°Cで反応を開始させた。反応開始後、 1時間目、 2時間目、 4時間目及び 8時間目にサンプルを一定量ずつ採取し、 80°Cで凍結保存することによつて反応を停止させた。残りのサンプルはそのまま反応を続行し、反応開始後 24時間目に反応を停止させた。

マウス SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体形成の経時変化を調べるために、このサンプル

2

を ELISA及び電気泳動で確認した。 ELISAの方法は前記の通りである。

また電気泳動は、サンプルをァガロースゲルフィルム（ヘレナ研究所）〖こ 6〜7 μ gスポットし、 0.05 Mバルピタール緩衝液（pH8.6)中で 90V、 40分間で泳動を行った。染色は脂質染色とタンパク質染色の二通り行った。脂質染色には Fat Red 7B (Sigma-Al drich)を、タンパク質染色には Amido Black 10B (ナカライテスタ）を用いた。

[0058] (7)高脂肪食負荷マウス血清中からの複合体検出

LDLR-/-高脂血症モデルマウス 27匹に高脂肪食を 2週間与え、その後全採血した。採取した血液をへパリンを添カ卩したチューブに回収し、 10,000rpm、 4°Cで 10分間の遠心分離することにより血漿を分離し、これをサンプルとして前記の ELISAにより SAP/ oxLDL/ β -GPI複合体を定量した。また、コントロールとしては、 BALB/cマウス及び

2

C57BL/6マウスの血清を用いた。

[0059] (8)測定系の信頼性確認試験

(希釈直線性試験）

高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス (Apoe-/-マウス及び LDLR-/-マウス）力採取した血漿サンプルのうち、 SAP/oxLDL/ jS -GPI複合体がポジティブである

2

サンプルを段階的に希釈して、前記の ELISAで SAP/oxLDL/ 18 - GPI複合体を測定し

2

た。希釈倍率と測定値との相関関係を調べ、濃度依存的かつ正確に定量できている力どう力を言周べた。

[0060] (添加回収試験）

SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の標準品（濃度既知）を、 SAP/oxLDL/ β -GPI複合体

2 2

がネガティブである血清 (BALB/cマウス由来）を用!、て段階的に希釈した。このサンプル中の SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体を前記の ELISAで測定し、期待された量が検

2

出される力否かを確かめるため、回収率を算出した。

[0061] (同時再現性試験）

高脂肪食負荷高脂血症モデルマウスにおける SAP/oxLDL/ β -GPI複合体がポジティブである血漿サンプルを用いて、同一サンプルを同時に 10ゥエル分、前記の ELIS Aに付することによって SAP/oxLDL/ |8 - GPI複合体を測定した。それぞれの測定値

2

の CV (変動係数)を算出することにより、それぞれの各測定値における平均値力のばらつきを調べた。

[0062] <結果 >

(1)マウス SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の標準曲線

2

マウス SAP/oxLDL/ β -GPI複合体、マウス oxLDL/ β -GPI複合体、マウス SAP単独

2 2

の三種類を段階希釈していき、測定した。結果を図 1に示す。なお図 1中の黒四角印は SAP/oxLDL/ |8 -GPI複合体の測定値 (対数値）を、白四角印は oxLDL/ -GPI

2 2 複合体の測定値を、三角印は SAP単独の測定値をそれぞれ示す。なお、 SAP/oxLD L/ β -GPI複合体濃度は LDLタンパク質相当濃度として表した。

2

図 1から明かな通り、 SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体の濃度と測定値は、両対数グラフ

2

において良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。また、本測定系において oxLDL/ |8 -GPI複合体と SAP単独との交差反応性は見られな力つた。よって、

2

本測定系において、 SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体を特異的に検出できることが示され

2

た。

[0063] (2) SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体形成の経時変化

2

SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体形成の経時変化を観察するために、複合体形成の反

2

応時間を変化させて調製したサンプルについて、 SAP/oxLDL/ j8 -GPI

2 複合体を ELI

SA及び電気泳動で確認した。 ELISAの結果を図 2に、電気泳動の結果を図 3にそれぞれ示す。なお図 3中の（a)は Fat Red 7Bによる染色結果を、（b)は Amide Blackによる染色結果をそれぞれ示す。また図 3では、比較のため、 oxLDLと oxLDL/ |8 - GPIに

2 ついても同時に泳動した。

図 2から、反応時間の経過とともに SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体の濃度が上昇 (複

2

合体形成が進行)して、ることがわかる。

[0064] 図 3に関し、電気泳動では、 oxLDLに β -GPIが結合すると陰性荷電が消失し、 oxL

2

DL単独のものと比べて移動度が減少することが知られている。この oxLDL/ jS -GPI

2 複合体にさらに SAPが結合することによる移動度の変化によって、複合体形成の経時的変化を調べた。その結果、脂質を染色する Fat Red 7B染色、タンパク質を染色する Amide Black染色の両染色において、反応時間の経過とともに陽極方向への泳動距離が次第に減少することが示された（図 3の右側が陽極である)。したがって、複合体の形成に伴って oxLDLの陰性荷電が消失していくことが示された。また、 Amide B1 ack染色においては、中央付近に太いバンドが二本確認された力これはもともと SAP (試薬）中に補体成分 C3が存在しており、それが検出されたものと考えられる。

[0065] (3)高脂肪食負荷（High fat fed)マウス（16周齢〜 24週齢）における SAP/oxLDL/ β

-GPI複合体の検出

2

高脂肪食を 2週間負荷した LDLR-/-マウス（high fat fed LDLR- /-マウス）から採取した血漿並びに同週齢の BALB/cマウス及び C57BL/6マウスの血清（いずれもコントロール）をサンプルとして、 SAP/oxLDL/ j8 - GPI複合体を ELISAで測定した。尚、当

2

該週齢の高脂血症モデルマウスで、動脈硬化巣 (プラーク）の増加が観察でき始めている。結果を図 4に示す。

図 4より、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス (high fat fed LDLR-/-マウス）のサンプルにおいて、数値の高いものがいくつか観察された。このサンプルにおける SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の濃度の平均値もコントロール群より高いため、高脂肪

2

食を負荷した高脂血症モデルマウスに SAP/oxLDL/ β -GPI複合体が存在している

2

可能性が示唆された。

[0066] (4)測定系の信頼性試験

ELISA測定系の信頼性を確認するため、以下の試験を行ったところ、いずれも良好な結果が得られ、本測定系の信頼性が確認された。

[0067] (希釈直線性試験）

結果を図 5に示す。希釈率と測定値との間の相関性を調べた結果、全てのサンプルにおいて相関係数 (R²値）が 1に近い結果を示し、良好な直線関係が認められた。

[0068] (添加回収試験）

結果を表 1に示す。なお回収率 (Recovery)は、以下に示す 2通りの計算方法で算出し、それぞれ「Recovery 1」及び「Recovery 2」とした。なお以下の「A」〜「E」は、それぞれ表 1中に「A」〜「E」として示した部分の数値を意味する。 Recovery 1 (D) = ( (A- B) /C) X 100

Recovery 2 (E) = (A/ (B + C) ) X 100

その結果、回収率がほぼ 100%に近い値を示していたことから、本 ELISA測定系によって、期待された量を測定できてレ、ることが示された。

[0069] (同時再現試験）

結果を表 2に示す。 CV (変動係数）は、個々の測定値の平均値からのばらつきを示すものであり、一般に CV値が 10%以内に収まれば良好な結果とされる。表 2より、いずれのサンプルについても CV値は 10%以内に収まっており、良好な結果が得られた。

[0070] [表 1]

[0071] [表 2] AVG _{S D} CV (¾

(OD 490nm)

Apoe 0.39 0,026 6 J

Ldlrl 0.0 Π 4.4

Ldlr2 0.31 0.015 4,8

Ldlr3 0.25 0.01 6 6.4

Ldlr4 0.18 0.01 2 6.7

LdlrS 0.15 0.015 10

実施例 2

[0072] SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の動脈硬化マーカーとしての可能性評価

2

<材料及び方法 >

(1)マウスにおける血中動態

C57BL/6マウスの静脈に、既知量 (LDLタンパク質相当濃度として 0.8 g/ml)の SA P/oxLDL/ β -GPI複合体 200 mlを投与し、時間経過とともに眼底より採血して遠心に

2

より血漿を回収し、 ELISAにより SAP/oxLDL/ jS -GPI複合体を測定した。

2

[0073] (2)経時変化

10週齢のォス LDLR-/-マウス 3匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、 12週齢目、 14週齢目及び 16週齢目に採血し、 SAP/oxLDL/ β - GPI複合体を ELISAにより測定した。

2

また別途、 5週齢のォス LDLR-/-マウス 6匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、 10週齢目、 15週齢目及び 20週齢目に採血し、 SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体を ELISAにより測定した。

2

その他の材料及び方法は、実施例 1と同様である。

[0074] <結果 > (1)マウスにおける SAP/oxLDL/ β - GPI複合体の血中動態

2

結果を図 6及び図 7に示す。なお図 6及び図 7は、別個独立に試験した結果である図 6及び図 7より、 SAP/oxLDL/ β -GPI複合体は、投与力数分のうちに血中から

2

消失することが示された。したがって、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（血中力複合体が検出される）においては、 SAP/oxLDL/ 18 - GPI複合体が炎症部

2

位 (動脈硬化巣)から連続的に血中に供給されて！ヽることが示唆された (但し、絶対血中濃度は、投与の手技によって異なる）。

[0075] (2) LDLR-/-マウスにおける SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体の経時変化

2

10週齢のマウスを用いた結果 (平均値)を図 8に、 5週齢のマウスを用いた結果 (平均値）を図 9にそれぞれ示す。図 8及び図 9より、血中の SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体

2

の量は経時的に増加した。このこと力、 SAP/oxLDL/ j8 -GPI複合体の増加には、

2

加齢に伴うプラーク形成が関係することが示唆された。

実施例 3

[0076] マウス SAP/oxLDL複合体の検知と標準曲線作成

実施例 1で調製した SAP/oxLDL/ 18 -GPI複合体を段階的に希釈して、実施例 1〖こ

2

記載の ELISA (ただし、 WB- CAL- 1に代えて、マウスモノクローナル抗 oxLDL抗体（10 μ g/mlの溶液)を、 50 1/ゥエルで固相に添加することにより固相化したものを使用）により測定した。測定される SAP/oxLDL複合体 (SAP/oxLDL/ β 2-GPI複合体における「SAPと oxLDLとが複合体を形成している部分」）の濃度とその測定結果との関係について、標準曲線を作成した。

結果を図 10に示す。図 10から明かな通り、 SAP/oxLDL複合体の濃度と測定値は、良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、 SAP/oxLDL複合体を特異的に検出できることが示された。

実施例 4

[0077] ヒト SAP/oxLDL/ β -GPI複合体の検知、標準曲線の作成、および患者血清中の複

2

合体の測定

前述のマウス SAP/oxLDL/ β -GPI複合体と同様に ELISAによりヒト SAP/oxLDL/ β - GPI複合体を測定した。図 11には得られた標準曲線を示す。さらに 250倍希釈した健常人および急性冠症候群患者 (動脈硬化性疾患患者として)血清中の本複合体を測定した。結果を表 3に示す。

図 11から明かな通り、ヒト SAP/oxLDL/ iS -GPI複合体の濃度と測定値は、良好な

2

直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、ヒト SA P/oxLDL/ β -GPI複合体を特異的に検出できることが示された。

2

また、表 3の結果から、このように少数例ではあるが、健常人血清に対し疾患群ではヒト SAP/oxLDL/ β -GPI複合体濃度が高値を示した。従って、ヒト SAP/oxLDL/ β -

2 2

GPI複合体の測定により動脈硬化などが検知できることが明らかとなった。

[0078] [表 3] 表 3

複合体濃度

血清 (吸光度）

健常人 1 0. 194

健常人 2 0. 103

急性冠症候群患者 1 0. 489

急性冠症候群患者 2 — 0. 305 実施例 5

[0079] 本発明キットの作成

(1)下記の構成力もなる本発明キット (ELISAキット)を作成した。

1. 96ゥエルのィムノプレート 1枚

2.抗 j8 - GPI抗体 (WB- CAL- 1 ;ィムノプレートへの固相化用） 1本

2

3.ヒッジ抗 SAP抗体（一次抗体） 1本

4. HRP標識抗ヒッジ IgG抗体（二次抗体） 1本

5. 0- PD試薬溶液 1本

6. SAP/oxLDL/ β 2- GPI複合体 (スタンダード）

(2)下記の構成力もなる本発明キット (ELISAキット)を作成した。

1.抗 j8 -GPI抗体 (WB-CAL-1)が固着された 96ゥエルのィムノプレート 1枚 2.抗 SAP抗体 (一次抗体） 1本

3. HRP標識抗ィムノグロブリン抗体（二次抗体） 1本

4. 0 - PD試薬溶液 1本

5. SAPん xLDL/ β 2-GPI複合体 (スタンダード）

(3)下記の構成力もなる本発明キット (ELISAキット)を作成した。

1.抗 ]3 - GPI抗体 (WB- CAL- 1)が固着された 96ゥエルのィムノプレート 1枚

2

2. HRP標識抗 SAP抗体 1本

3. DAB溶液 1本

4. SAP/oxLDL/ β 2- GPI複合体 (スタンダード）

[0080] (4)下記の構成力もなる本発明キット 2 (ELISAキット）を作成した。

1. 96ゥエルのィムノプレート 1枚

2.抗 oxLDL抗体 (ィムノプレートへの固相化用） 1本

3.ヒッジ抗 SAP抗体 (一次抗体） 1本

4. HRP標識抗ヒッジ IgG抗体（二次抗体） 1本

5. 0- PD試薬溶液 1本

6. SAPん xLDL複合体（スタンダード）

[0081] (5)下記の構成力もなる本発明キット 2 (ELISAキット）を作成した。

1.抗 oxLDL抗体が固着された 96ゥエルのィムノプレート 1枚

2.抗 SAP抗体 (一次抗体） 1本

3. HRP標識抗ィムノグロブリン抗体（二次抗体） 1本

4. 0- PD試薬溶液 1本

5. SAP/oxLDL複合体（スタンダード）

[0082] (6)下記の構成力もなる本発明キット 2 (ELISAキット）を作成した。

1.抗 oxLDL抗体が固着された 96ゥエルのィムノプレート 1枚

2. HRP標識抗 SAP抗体 1本

3. DAB溶液 1本

4. SAP/oxLDL複合体（スタンダード）図面の簡単な説明

[図 1]本発明複合体の標準曲線を示す図である。

[図 2]本発明複合体の形成の経時変化 (ELISAにより検出）を示す図である。

[図 3]本発明複合体の形成の経時変化 (電気泳動により検出）を示す図である。

[図 4]高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウスの血中における、本発明複合体の検知結果を示す図である。

[図 5]本発明複合体の検知に用いた ELISAの信頼性試験 (希釈直線性試験)の結果を示す図である。

[図 6]本発明複合体の血中動態を示す図である。

[図 7]本発明複合体の血中動態を示す図である。

[図 8]血中における本発明複合体の経時変化を示す図である。

[図 9]血中における本発明複合体の経時変化を示す図である。

[図 10]本発明複合体 2 (SAP/oxLDL/ β 2-GPI複合体における、「SAPと oxLDLとが複合体を形成して、る部分」 )の標準曲線を示す図である。

[図 11]本発明複合体 (ヒト SAP/oxLDL/ -GPI複合体)の標準曲線を示す図である。

Claims

請求の範囲

[1] 血清アミロイド Pコンポーネント、酸ィ匕 LDL及び |8 —グリコプロテイン I力もなる複合

2

体。

[2] 請求項 1に記載の複合体を含有してヽる可能性がある試料に、抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗 β —グリコプロテイン I抗体の少なくとも一方を接触させるス

2

テツプを含む、請求項 1に記載の複合体の検知方法。

[3] 請求項 1に記載の複合体を含有してヽる可能性がある試料に、抗血清アミロイド Ρコンポーネント抗体及び抗 —グリコプロテイン I抗体を接触させて、「抗血清アミロイド

2

Ρコンポーネント抗体請求項 1に記載の複合体ー抗 j3 ーグリコプロテイン I抗体」か

2

らなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、請求項 1に記載の複合体の検知方法。

[4] 抗血清アミロイド Ρコンポーネント抗体及び抗 j8 —グリコプロテイン I抗体のいずれ

2

か一方が固相に固着されているものである、請求項 2又は 3に記載の検知方法。

[5] 以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、請求項 4に記載の検知方法；

ステップ（1)：抗体 Aが固着された固相に、請求項 1に記載の複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体 A 請求項 1に記載の複合体」で示される第 1複合体を形成させるステップ、

ステップ（2)：ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Bを接触させ、「固相に固着された抗体 A 請求項 1に記載の複合体抗体 B」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び

ステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。ただし、抗体 Aは抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗 |8 —グリコプロティ

2

ン I抗体の!/ヽずれか一方の抗体を、抗体 Bは他方の抗体をそれぞれ示す。

[6] 請求項 1に記載の複合体を含有している可能性がある試料が、生体に由来する試料である、請求項 2〜5の、ずれか 1項に記載の検知方法。

[7] 生体に由来する試料が、体液である、請求項 6に記載の検知方法。

[8] 以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法；

ステップ（1)：請求項 6又は 7のいずれ力 1項に記載の方法を用いて、体液中に存在する請求項 1に記載の複合体を検知するステップ、及び

ステップ（2)：ステップ（1)における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。

[9] 疾患が、高脂血症及び動脈硬化力選択されるものである、請求項 8に記載の検知方法。

[10] 抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗 j8 —グリコプロテイン I抗体を構成成

2

分として少なくとも含む、請求項 1に記載の複合体の検知キット。

[11] 抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗 j8 —グリコプロテイン I抗体のいずれ

2

か一方が固相に固着されているものである、請求項 10に記載の検知キット。

[12] 請求項 10又は 11に記載のキットからなる、疾患の検知キット。

[13] 疾患が、高脂血症及び動脈硬化力も選択されるものである、請求項 12に記載の検知キット。

[14] 血清アミロイド Pコンポーネント及び酸化 LDL力もなる複合体。

[15] 請求項 14に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイド P コンポーネント抗体及び抗酸化 LDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、請求項 14に記載の複合体の検知方法。

[16] 請求項 14に記載の複合体を含有している可能性がある試料に、抗血清アミロイド P コンポーネント抗体及び抗酸ィ匕 LDL抗体を接触させて、「抗血清アミロイド Pコンポ一ネント抗体—請求項 14に記載の複合体—抗酸化 LDL抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、請求項 14に記載の複合体の検知方法。

[17] 抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗酸化 LDL抗体の!/、ずれか一方が固相に固着されているものである、請求項 15又は 16に記載の検知方法。

[18] 以下の（1)〜（3)のステップを少なくとも含む、請求項 17に記載の検知方法；ステップ（1)：抗体 Cが固着された固相に、請求項 14に記載の複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体 C 請求項 14に記載の複合体」で示される第 1複合体を形成させるステップ、

ステップ（2)：ステップ 1で形成された第 1複合体に抗体 Dを接触させ、「固相に固着された抗体 C 請求項 14に記載の複合体抗体 D」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及びステップ（3)：ステップ 2で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。ただし、抗体 Cは抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗酸ィ匕 LDL抗体のヽずれか一方の抗体を、抗体 Dは他方の抗体をそれぞれ示す。

[19] 請求項 14に記載の複合体を含有している可能性がある試料が、生体に由来する試料である、請求項 15〜18のいずれか 1項に記載の検知方法。

[20] 生体に由来する試料力体液である、請求項 19に記載の検知方法。

[21] 以下の（1)及び（2)のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法；

ステップ（1)：請求項 19又は 20のいずれか 1項に記載の方法を用いて、体液中に存在する請求項 14に記載の複合体を検知するステップ、及び

[22] 疾患が、高脂血症及び動脈硬化力も選択されるものである、請求項 21に記載の検知方法。

[23] 抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗酸化 LDL抗体を構成成分として少なくとも含む、請求項 14に記載の複合体の検知キット。

[24] 抗血清アミロイド Pコンポーネント抗体及び抗酸化 LDL抗体の!/、ずれか一方が固相に固着されているものである、請求項 23に記載の検知キット。

[25] 請求項 23又は 24に記載のキットからなる、疾患の検知キット。

[26] 疾患が、高脂血症及び動脈硬化力も選択されるものである、請求項 25に記載の検知キット。