TW202141039A - 幽門桿菌檢出用抗體 - Google Patents

幽門桿菌檢出用抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202141039A
TW202141039A TW110109294A TW110109294A TW202141039A TW 202141039 A TW202141039 A TW 202141039A TW 110109294 A TW110109294 A TW 110109294A TW 110109294 A TW110109294 A TW 110109294A TW 202141039 A TW202141039 A TW 202141039A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
catalase
helicobacter
helicobacter pylori
antibodies
Prior art date
Application number
TW110109294A
Other languages
English (en)
Inventor
伊藤晋
Original Assignee
日商榮研化學股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商榮研化學股份有限公司 filed Critical 日商榮研化學股份有限公司
Publication of TW202141039A publication Critical patent/TW202141039A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明之目的在於藉由在生物試樣中感度良好地檢出幽門桿菌之觸酶，從而提供一種更加高感度之幽門桿菌感染之檢查方法，具體而言，本發明係關於一種檢出生物試樣中之幽門桿菌之免疫學測定方法，其以幽門桿菌之變性觸酶與天然觸酶雙方作為抗原，使用與該抗原之特定胺基酸序列反應的抗體或其片段。

Description

幽門桿菌檢出用抗體
本發明例如係關於一種檢查幽門桿菌之感染的方法，其藉由將生物試樣中之幽門桿菌之觸酶作為抗原，使用與該抗原之特定胺基酸序列反應的抗體檢出該抗原，從而檢查幽門桿菌之感染。
已知若感染幽門桿菌，則胃癌之風險升高。作為輔助診斷該幽門桿菌之感染的方法，已知有：快速脲酶試驗、鏡檢法、培養法、尿素呼氣試驗、抗體檢查、抗原檢查等。尤其是使用糞便檢體之幽門桿菌糞便抗原檢查係雖然檢體之採集、操作較繁雜，但不會受到糞便檢體之採集部位之影響，可非侵入性且直接地進行檢查的方法，較有用。
作為幽門桿菌之抗原，已知有：脲酶(專利文獻1及2)或作為幽門桿菌之表面抗原的LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)抗原(專利文獻3)、鞭毛蛋白等。認為尤其是藉由測定天然觸酶作為糞便檢體中之幽門桿菌之抗原，從而判定幽門桿菌之感染較有用(例如，專利文獻4～7)，例如，專利文獻5中揭示有一種檢查方法，其特徵在於：藉由檢出存在於消化道排泄物中之幽門桿菌之天然(保持立體結構，且具有活性)之觸酶，從而判定幽門桿菌之感染。市面上亦銷售有各種幽門桿菌之檢查套組。
然而，先前，由於提示存在觸酶結構基因發生變異或部分缺損之幽門桿菌感染者(非專利文獻1)，因此臨床現場期待一種相較於測定天然觸酶之方法而言進而高感度之幽門桿菌感染之檢查方法。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利第4219402號公報 專利文獻1：日本專利特開平11-318490號公報 專利文獻3：日本專利第4054681號公報 專利文獻4：日本專利第3393855號公報 專利文獻5：日本專利第3504633號公報 專利文獻6：日本專利第4763149號公報 專利文獻7：日本專利第4443117號公報 非專利文獻
非專利文獻1：神島雄一郎等人，Progress in Medicine，1999年，Vol. 19，No.5，pp. 1292-1296
[發明所欲解決之問題]
本發明鑒於上述實情，目的在於提供一種於生物試樣中能夠高感度地檢出幽門桿菌之觸酶的檢查幽門桿菌之感染之方法。 [解決問題之技術手段]
為了解決上述課題，進行了銳意研究，結果發現了以生物試樣中之幽門桿菌之變性觸酶與天然觸酶雙方作為抗原而與該抗原之特定胺基酸序列反應的抗體，從而完成本發明。
即，本發明包含以下內容。 (1)一種檢出生物試樣中之幽門桿菌之免疫學測定方法，其使用與幽門桿菌之觸酶中之胺基酸序列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)或KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)或者其等之一部分反應的抗體或其片段。 (2)如(1)中所記載之方法，其中免疫學測定方法選自由免疫凝集法、酶免疫測定法、化學發光免疫測定法、電化學發光免疫測定法、螢光免疫測定法、放射性免疫測定法、免疫層析法、西方墨點法及免疫墨點法所組成之群。 (3)如(1)中所記載之方法，其中免疫學測定方法為三明治法。 (4)如(3)中所記載之方法，其中三明治法為酶免疫測定法。 (5)如(4)中所記載之方法，其中酶免疫測定法使用螢光素酶作為標記酶。 (6)如(5)中所記載之方法，其中螢光素酶為螢火蟲螢光素酶。 (7)如(1)至(6)中任一項所記載之方法，其中生物試樣為糞便。 (8)一種抗體或其片段，其與幽門桿菌之觸酶中之胺基酸序列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)或KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)或者其等之一部分反應。 (9)一種不溶性載體，其固定有如(8)中所記載之抗體或其片段。 (10)一種生物試樣中之幽門桿菌檢出用免疫學測定試劑，其包含如(8)中所記載之抗體或其片段、或者如(9)中所記載之不溶性載體。 (11)一種生物試樣中之幽門桿菌檢出用免疫學測定試劑套組，其包含如(10)中所記載之試劑。 (12)一種生物試樣中之幽門桿菌之檢查方法，其使用如(10)中所記載之試劑。
本說明書包含成為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請案編號2020-044926號所揭示之內容。 [發明之效果]
根據本發明，於生物試樣中之幽門桿菌感染之檢查中，藉由使用與觸酶之特定胺基酸序列反應的抗體或其片段，從而不僅可與先前之天然觸酶反應亦可與變性觸酶反應，相較於先前之以天然觸酶作為抗原之測定法，能夠以高感度檢出幽門桿菌。
以下，對本發明詳細地進行說明。
本發明之方法(以下，稱為「本方法」)係一種免疫學測定方法，其使用與幽門桿菌之觸酶或其片段中之胺基酸序列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)或KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)或者其等之一部分反應的抗體或其片段(以下，稱為「本發明之抗體或其片段」)，檢出生物試樣中之幽門桿菌。本方法亦可稱為幽門桿菌感染之檢查方法、用於檢查幽門桿菌感染之體外資料收集方法等。
幽門桿菌之觸酶具有集合有4個分子量約50 kDa之次單元的四聚物結構。將幽門桿菌之觸酶之胺基酸序列示於序列編號1。以下，有時將「幽門桿菌之觸酶」簡稱為「觸酶」。
所謂「天然觸酶」，係指具有活性之幽門桿菌之觸酶。即，認為天然觸酶具有4個次單元，且保持立體結構。又，所謂「變性觸酶」，係指因SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸鈉)或還原劑等變性劑發生變性、背離，而使得立體結構分解之幽門桿菌之觸酶。例如，變性觸酶亦可為立體結構分解而成之次單元、觸酶之片段等。
本發明之抗體或其片段係與天然觸酶及變性觸酶雙方反應的抗體或其片段。換言之，本發明之抗體或其片段係對於幽門桿菌之觸酶不要求保持立體結構或有無活性的抗體或其片段，可藉由西方墨點等檢出發生變性之幽門桿菌之觸酶抗原。例如，可藉由在對確認了觸酶活性之幽門桿菌之重組觸酶(59.4 kDa)實施電泳(SDS-PAGE)之後，將其轉印至硝化纖維素膜上，並使用本發明之抗體或其片段作為一級抗體，使用HRP(Horseradish Peroxidase，辣根過氧化酶)標記抗小鼠抗體作為二級抗體而檢出(西方墨點法)。另一方面，對於天然觸酶具有特異性之抗體係僅與保持立體結構且具有活性之幽門桿菌之觸酶反應的抗體，不與變性之幽門桿菌之觸酶抗原反應，因此無法用於觸酶抗原會因SDS等發生變性之西方墨點法等。
根據本方法，藉由使用本發明之抗體或其片段，從而與天然觸酶及變性觸酶雙方反應，於幽門桿菌感染之檢查中，相較於先前之僅以天然觸酶作為抗原之測定法，能夠以高感度檢出幽門桿菌。
本發明之抗體係與觸酶之序列編號1所示之胺基酸序列中之相當於第49號～第68號胺基酸序列的序列編號2所示之胺基酸序列、或相當於第301號～第320號胺基酸序列的序列編號3所示之胺基酸序列、或其等之一部分反應的抗體。此處，所謂序列編號2或3所示之胺基酸序列之一部分，係指序列編號2或3所示之胺基酸序列中所含有的5個以上、較佳為6個以上、更佳為7個以上且20個以下、較佳為18個以下、更佳為16個以下連續之胺基酸殘基、或者序列編號2或3所示之胺基酸序列中所含有的3個以上、較佳為4個以上、更佳為5個以上且10個以下、較佳為8個以下、更佳為6個以下連續之胺基酸殘基之至少2個以上的組合。 作為本發明之抗體，例如可例舉：單株抗體、多株抗體、重組抗體、其等之混合物。
單株抗體可利用通常之單株抗體之製作方法進行製作。例如可例舉以下之使用小鼠之方法。具體而言，利用包含序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分(或由此所組成)的肽或者觸酶(序列編號1)或者包含觸酶(序列編號1)之溶菌液(萃取物)作為免疫原來免疫小鼠之後，摘除其脾臟，製備來自脾臟之B細胞，利用電融合法等與另行增生之小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合，並利用選擇培養基，對B細胞與骨髓瘤細胞融合而成之細胞(融合瘤)進行增生及選殖。藉由酶免疫測定法或西方墨點法等，確認結果生長之群落是否產生針對序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分的抗體。對確認產生了針對序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分的抗體之細胞進行選殖，獲得抗體產生細胞株。對所獲得之抗體產生細胞株進行培養，並於小鼠之腹腔內使其培養上清液或培養細胞增生而獲得腹水，自該腹水純化出抗體，從而可獲得與序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分反應的單株抗體。
又，多株抗體可利用通常之多株抗體之製作方法進行製作。例如，利用包含序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分(或由此所組成)的肽或者觸酶(序列編號1)作為免疫原來免疫兔之後，採集血液而獲得抗血清。由所獲得之抗血清純化出多株抗體，從而可獲得與序列編號2或3所示之胺基酸序列或者其等之一部分反應的多株抗體。
本發明之抗體可為任意免疫球蛋白(Ig)類(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM、IgY等)及亞型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)。又，免疫球蛋白之輕鏈可為κ鏈或λ鏈之任一種。
本發明之抗體片段(片段)例如包含：Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fd、Fabc等。此類抗體片段之製作方法係本技術領域所公知，例如可藉由木瓜酶、胃蛋白酶等蛋白酶來消化抗體分子而獲得。
又，本發明之抗體或其片段係不與由脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、貓胃螺桿菌(Helicobacter felis)、畢氏螺桿菌(Helicobacter bizzozeronii)、雪貂螺桿菌(Helicobacter mustelae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)及短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)所組成之群中之至少1種菌種進行交叉反應者。
本方法中，使用本發明之抗體或其片段，藉由免疫學測定方法檢出生物試樣中之幽門桿菌。具體而言，使生物試樣中之幽門桿菌之觸酶抗原與本發明之抗體或其片段接觸，產生抗原抗體反應，基於所形成之免疫複合體，檢出或測定該生物試樣中之幽門桿菌之觸酶抗原。
本方法中所使用之生物試樣只要可能存在幽門桿菌即可，無特別限制，可為固體及液體之任一者。例如使用：糞便、消化液(唾液、胃液、洗胃液等)等。由於本發明之抗體能夠檢出於各種消化道內受到變性作用之幽門桿菌之觸酶，因此本發明於使用糞便作為生物試樣時尤其有用。生物試樣亦可預先與保存用溶液或稀釋用溶液混合，例如，亦可使用便潛血檢查用之採便容器或BL採便容器(榮研化學)中之保存用溶液。再者，於使用糞便作為生物試樣之情形時，亦可使用利用便潛血檢查中所使用之採便容器所採集到的糞便。藉此，例如，當進行便潛血檢查時，亦可使用同一檢體進行幽門桿菌之感染檢查，無需再次採集糞便。
免疫學測定方法只要係使用抗體或其片段之測定法即可，藉由使用本發明之抗體或其片段，發揮所需之效果。作為免疫學測定方法，例如可例舉：使用經標記物質標記之抗原或抗體的標記免疫分析法，尤其是可例舉：藉由免疫散射比濁法、免疫比濁法等之乳膠凝集法或金膠體凝集法等免疫凝集法、酶免疫測定法、化學發光免疫測定法、電化學發光免疫測定法、螢光免疫測定法、放射性免疫測定法、及免疫層析法等三明治法、西方墨點法、免疫墨點法等，無特別限定。
作為檢出方法，例如可例舉：藉由光學方法測定反應液之吸光度或散射光、顯色、發光、螢光等的方法；測定經標記之放射性同位素之放射能的方法等。
作為上述酶免疫測定法，例如可例舉：ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酶聯免疫吸附分析)法、生物發光酶免疫測定法、化學發光酶免疫測定法。又，作為生物發光酶免疫測定法，可例舉：BLEIA(註冊商標)法。
BLEIA(註冊商標)法係如下測定方法：例如，以固相使抗體(或抗原)與磁性粒子結合，使該抗體(或抗原)與檢體中之抗原(或抗體)反應，使用經螢光素酶標記之抗體進行免疫反應，並使用螢光素作為受質，藉由生物發光檢出螢光素酶複合體之酶活性，從而測定或檢出生物試樣中之物質。
於標記免疫分析法之情形時，只要固相化抗體及標記抗體之中至少一者為本發明之抗體或其片段即可。又，固相化抗體及標記抗體可雙方為同一抗體，亦可為不同抗體。三明治法中，可藉由利用固相化之抗體、與經標記物質標記之抗體對試樣中之抗原(幽門桿菌之觸酶)進行夾心，使標記物質本身、或加上酶等針對標記物質之受質進行顯色等，從而檢出檢體中之幽門桿菌之觸酶。
作為固定抗體或其片段之固相載體，可使用：包含聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖凝膠、玻璃、金屬、陶瓷、或磁體等材質之粒子、微盤、試管、棒、或試片等形狀之不溶性載體。 作為不溶性載體之粒徑，較佳為0.01～50 μm、0.1～10 μm，更佳為0.5～5 μm，但並不特別限定於該範圍。
固相化抗體可藉由利用物理吸附法、化學結合法或其等之併用等公知之方法將固相載體與抗體或其片段結合而製備。
作為用於使抗體或其片段成為標記抗體之標記，可為其本身產生螢光、發光或顯色之物質，亦可為與受質反應而產生螢光、發光或顯色之酶。 又，作為標記，亦可為與酶反應而產生螢光、發光或顯色之可與酶特異性地結合之分子。
例如，可使用螢光素酶作為此類酶。於酶為螢火蟲螢光素酶之情形時，受質可為螢火蟲螢光素等。又，酶亦可為海螢螢光素酶(受質(螢光素)：咪唑并吡𠯤酮衍生物)、夜光蟲螢光素酶(受質：夜光蟲螢光素)、海青色多管水母之水母發光蛋白(受質：腔腸素)、海腎螢光素酶(受質：腔腸素)、細菌螢光素酶(受質：黃素單核苷酸)等。進而，亦可使用日本專利第3466765號公報中所記載之生物素化螢光素酶作為酶，使用日本專利第4379644號公報或日本專利第4503724號公報中所記載之螢光素作為受質。
又，亦可使用辣根過氧化酶(HRP)作為酶。於該情形時，受質亦可為鄰苯二胺(顯色)、四甲基聯苯胺(TMBZ)(顯色)、發光胺(化學發光)等。
進而，亦可使用鹼性磷酸酶(ALP)作為酶。於該情形時，其受質亦為對硝基苯基磷酸酯(顯色)、AMPPD(註冊商標)3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3''-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧環乙烷二鈉鹽(化學發光)等。 於與受質反應而產生螢光、發光或顯色之酶為與鏈黴抗生素蛋白結合之酶之情形時，標記亦可為生物素。
生物素係分子量約200之化合物，且與抗生物素蛋白或鏈黴抗生素蛋白等特異性地結合。別名為維生素H，由此可知其係生物必不可缺之微量成分之一。由於其與抗生物素蛋白或鏈黴抗生素蛋白之親和性極高而且穩定，因此用於對蛋白質或核酸經由抗生物素蛋白或鏈黴抗生素蛋白進行標記或固相化等。市面上銷售有為了與蛋白質或核酸結合而導入有各種官能基之生物素之衍生物。
另一方面，抗生物素蛋白係分子量約66000之鹼性蛋白質，鏈黴抗生素蛋白係分子量約52000之弱酸性～中性之蛋白質，且包含4個次單元。其等對於熱或蛋白質分解酶較穩定，具有4個生物素結合部位。代表性者有自蛋白純化出之抗生物素蛋白、或自鏈黴親生物素蛋白(Streptomyces avidinii)純化出之鏈黴抗生素蛋白。由於鏈黴抗生素蛋白之非特異結合較少，因此檢定系統經常使用鏈黴抗生素蛋白。抗生物素蛋白或鏈黴抗生素蛋白與生物素之結合反應僅使兩物質混合即可，無需特別之反應條件。
又，本發明之試劑係包含本發明之抗體或其片段的生物試樣中之幽門桿菌檢出用免疫學測定試劑，用於本方法。例如，根據免疫學測定方法之種類的不同，本發明之試劑能夠以固相化抗體(例如，被固定於不溶性載體之本發明之抗體或其片段)及/或標記抗體之形態包含本發明之抗體或其片段。
進而，本發明之試劑亦可套組化。本發明之套組除了包含本發明之試劑以外，例如可進而包含免疫學測定方法中所使用之試劑、容器、培養盤、使用說明書等。 實施例
以下，使用實施例，對本發明更加詳細地進行說明，但本發明之技術範圍並不受該等實施例所限定。
i.抗體之製作與試驗 於微好氧環境下對幽門桿菌進行5天培養之後，反覆進行藉由離心分離集菌後再次懸浮於磷酸緩衝液中之操作而對幽門桿菌進行洗淨。使經洗淨之幽門桿菌懸浮於磷酸緩衝液中，並使用超音波均質機破碎。對經破碎之幽門桿菌實施離心分離，以萃取物獲得其離心上清液，作為免疫原。
利用所獲得之免疫原50～100 μg，以2週為間隔，對小鼠(BALB/c)進行3～5次免疫。將免疫後之脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，利用有限稀釋法選殖經融合之細胞。選殖細胞之後，利用固相化有免疫原之ELISA法進行篩選，從而獲得產生與幽門桿菌抗原進行反應之抗體的細胞(CHP001～CHP006)。對確認了產生抗體之細胞進行培養，使用蛋白質A或蛋白質G對培養上清液中產生之抗體進行純化，從而獲得各抗體(以下，亦有時記為CHP001～CHP006)。
又，利用免疫原，以2週為間隔，對兔(PHP001～PHP003)進行3～5次免疫，採集血液而獲得抗血清。使用蛋白質A或蛋白質G自所獲得之抗血清純化出抗體，從而獲得各抗體(以下，亦有時記為PHP001～PHP003)。
組合所獲得之各抗體製成試劑，將上述之來自幽門桿菌之萃取物之稀釋系列作為試樣，利用BLEIA法進行測定(試劑及BLEIA法之詳情參照下述iv.糞便檢體中幽門桿菌之檢出中之BLEIA法)。當組合由CHP001、CHP002、CHP003、CHP004、CHP005、CHP006、PHP003所獲得之抗體時，能夠獲得與稀釋系列成比例之反應。
接著，使用將該等7種抗體如表1中所示般進行組合而製得13種試劑與幽門桿菌抗原檢出用EIA(Enzyme Immunoassay，酶免疫分析)套組之市售品A及B，將201例糞便檢體作為試樣進行測定。再者，對於所製得之13種試劑，將上述之來自幽門桿菌之萃取物1.5 ng/mL作為試樣，以利用BLEIA法所測得之測定值作為臨界值即1COI(COI(Cut Off Index，臨界值指數))，算出試樣之發光強度相對於該臨界值之發光強度的比作為測定值(COI)之後，將未達1COI判定為陰性，將1COI以上判定為陽性。其結果為，201例之中，172例對所有試劑均被判定為陰性，26例對所有試劑均被判定為陽性，各試劑及市售品A及B之測定結果一致，但3例中各試劑之判定相背離，判定不一致。將判定相背離之3例糞便檢體之結果示於表1。表1中記載有固定於固相之抗體、及用於標記之抗體。
最終，於判定相背離之3個檢體中，選擇3例中為陰性之CHP001、3例中為陽性之CHP002、CHP003、及CHP006作為能夠正確地檢出幽門桿菌之單株抗體的候選，並且對於作為多株抗體之PHP003，進行了該等抗體之解析。
[表1]
樣品 吸光度(Abs) BLEIA法(上：固相、下：標記)(COI)
市售品A 市售品B CHP001 CHP001 CHP001 CHP001 CHP002 CHP002 CHP003 CHP003 CHP003 CHP004 CHP005 CHP006 PHP003
CHP001 CHP002 CHP003 CHP004 CHP002 CHP003 CHP002 CHP003 CHP004 CHP004 CHP004 CHP006 PHP003
F9060 0.085 0.069 0.3 1.4 0.6 0.7 8.0 4.2 2.6 0.8 1.1 0.6 0.3 3.5 3.4
F9157 0.046 0.028 0.0 1.5 0.3 1.2 11.1 3.4 3.2 0.5 2.2 3.9 0.8 12.5 8.0
F9163 0.070 0.003 0.0 0.4 0.4 0.2 0.4 1.6 1.0 1.5 0.3 0.0 0.2 1.2 0.2
  
樣品 判定(上：固相、下：標記)
市售品A 市售品B CHP001 CHP001 CHP001 CHP001 CHP002 CHP002 CHP003 CHP003 CHP003 CHP004 CHP005 CHP006 PHP003
CHP001 CHP002 CHP003 CHP004 CHP002 CHP003 CHP002 CHP003 CHP004 CHP004 CHP004 CHP006 PHP003
F9060 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 陰性 陽性 陽性 陽性 陰性 陽性 陰性 陰性 陽性 陽性
F9157 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 陽性 陽性 陽性 陽性 陰性 陽性 陽性 陰性 陽性 陽性
F9163 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 陽性 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性
ii.抗體之特性評價 [與純化重組幽門桿菌觸酶之反應性] 於30%過氧化氫水10 μL中添加0.02 mg/mL純化重組幽門桿菌觸酶(59.4 kDa)(Seramun Diagnostica GmbH公司製造，AGX-5-000-0648)2 μL，確認觸酶活性。
將確認了觸酶活性之幽門桿菌之重組觸酶於約1%之十二烷基硫酸鈉及約10 mM之二硫蘇糖醇之存在下，花費15分鐘加熱至95℃以上使其變性，實施電泳(SDS-PAGE)之後，轉印至硝化纖維素膜上，並使用各抗體(CHP001、CHP002、CHP003、CHP006)作為一級抗體，使用HRP標記抗小鼠抗體作為二級抗體，藉由發光而檢出(西方墨點法)。其結果為，利用CHP002、CHP003、CHP006可檢出，但利用CHP001無法檢出。藉此，確認了CHP002、CHP003、CHP006可與變性觸酶反應。
又，除不使用固相化抗體，且不使用糞便檢體作為試樣，及使用不使確認了觸酶活性之幽門桿菌之重組觸酶變性地結合之磁性粒子以及經酶標記之各抗體(CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003)等方面以外，與後述之iv.糞便檢體中幽門桿菌之檢出中之BLEIA法同樣地，對與各抗體之反應性進行確認。其結果為，CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003之任一抗體中均確認出反應。藉此，確認了CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003可與天然觸酶反應。
[根據菌株之反應性之比較及與其他菌種之反應性] 針對作為與幽門桿菌之觸酶顯示較高同源性之菌的脆弱擬桿菌、枯草桿菌、空腸彎曲桿菌、作為螺桿菌屬成功地進行了培養之貓胃螺桿菌、畢氏螺桿菌、雪貂螺桿菌、及其他細菌，確認了交叉反應性。
對PHP003確認出了與畢氏螺桿菌、雪貂螺桿菌之較弱的交叉反應，對CHP001、CHP002與CHP003、CHP006未確認出與脆弱擬桿菌、枯草桿菌、空腸彎曲桿菌、貓胃螺桿菌、畢氏螺桿菌、雪貂螺桿菌、大腸桿菌、大腸彎曲桿菌、普通擬桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌之交叉反應。
iii.與抗體反應之胺基酸序列之解析 針對上述CHP001、CHP002、CHP003、CHP006、PHP003，藉由肽圖分析，對與抗體反應之胺基酸序列進行解析。藉由肽圖分析之胺基酸序列之解析係於以下之iv.糞便檢體中幽門桿菌之檢出中之BLEIA法中，使用生物素化肽作為試樣，除此以外利用同樣之方法進行。作為參考例，利用同樣之方法對各抗體與幽門桿菌之重組觸酶之反應性進行確認。
具體而言，胺基酸序列解析係藉由以下之步驟進行。 1)將各種抗體固相化於磁性粒子或製備未添加抗體之磁性粒子。 2)將各種固相化有抗體之磁性粒子或未添加抗體之磁性粒子溶液分別與各種生物素化肽60 pmol進行混合，並於37℃下反應15分鐘。 3)利用洗淨液對磁性粒子進行洗淨，去除洗淨液之後，添加鏈黴抗生素蛋白-生物素化螢光素酶，並於37℃下反應15分鐘。 4)利用洗淨液對磁性粒子進行洗淨，去除洗淨液之後，添加針對螢光素酶之受質液(螢光素溶液)，測定發光強度。 5)對於各試樣，算出[各種固相化有抗體之磁性粒子之發光強度]/[未添加抗體之磁性粒子之發光強度]。 6)將[各種固相化有抗體之磁性粒子之發光強度]/[未添加抗體之磁性粒子之發光強度]之值明顯高於其他序列之算出值的肽序列判定為與抗體反應之胺基酸序列。 *2)～4)係利用全自動生物化學發光免疫測定裝置BLEIA-1200(榮研化學公司製造)進行測定。 將結果示於以下之表2。
[表2]
Figure 02_image009
iv.糞便檢體中幽門桿菌之檢出 藉由對反應之胺基酸序列進行了解析的下述實施例1、2及比較例1、2之抗體製備試劑，並利用生物發光酶免疫測定法(BLEIA法，依據日本專利特開平10-239314公報中所記載之方法)進行試樣(人類糞便)中之幽門桿菌之測定。
試樣： 使糞便檢體約35 mg懸浮於BL採便容器(榮研化學)之緩衝液2 mL中之後，進行過濾器過濾而獲得糞便萃取液，使用該糞便萃取液作為試樣。
試劑： 實施例1及2、以及比較例1～3之試劑如下所示： [實施例1]試劑2：針對幽門桿菌之天然觸酶及變性觸酶的2種單株抗體(固相用抗體：CHP002，標記用抗體：CHP003)； [實施例2]試劑3：不同於試劑2之針對幽門桿菌之天然觸酶及變性觸酶的1種單株抗體(固相及標記用抗體：CHP006)； [比較例1]試劑1：1種天然觸酶特異性抗體(固相及標記用抗體：CHP001)； [比較例2]試劑4：1種針對幽門桿菌之多株抗體(固相及標記用抗體：PHP003)； [比較例3]市售之ELISA幽門桿菌檢出套組A。
檢體： 分別使用133例之藉由內視鏡檢查、血清抗體效價、及尿素呼氣試驗並根據以下之基準於臨床上診斷為陽性或陰性之糞便檢體。 陽性：「現感染」：《既往》無除菌史，《內視鏡檢查》有瀰漫性發紅，木村-竹本分類C-2以上之萎縮，《幽門桿菌感染檢查》血清抗體效價為10 U/ml以上(尿素呼氣試驗(UBT)中陰性高值(3～9 U/ml)為2.5‰以上)。 陰性：「未感染」及「曾感染」 「未感染」：《既往》無除菌史，《內視鏡檢查》無瀰漫性發紅，無萎縮，《幽門桿菌感染檢查》血清抗體效價未達3 U/ml。 「曾感染」：《既往史》有除菌史(除菌成功)或無除菌史，《內視鏡檢查》無瀰漫性發紅，C-2以上之萎縮，《幽門桿菌感染檢查》血清抗體效價未達3 U/ml(尿素呼氣試驗(UBT)中陰性高值(3～9 U/ml)未達2.5‰)。
測定方法(BLEIA法)： 利用日本專利特開平10-239314號公報(將生物素與抗體及酶雙方結合)中所記載之方法進行，使用磁性粒子作為固相載體，使用生物素化螢光素酶作為檢出用之酶，使用螢光素作為受質，且使用試劑1～4之各抗體作為抗體。 1)將各種固相用抗體固相化於磁性粒子，從而製得各種固相化有抗體之磁性粒子。 具體而言，於50 mM磷酸緩衝液(pH值7.0)中，使5 μg之各種抗體與市售之磁性粒子1 mg進行反應，並利用稀釋液(包含0.1%BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)、0.09%疊氮化鈉之50 mM磷酸緩衝液(pH值7.0))進行稀釋，從而製得1.5 mg/mL之固相化有抗體之磁性粒子。 2)將各種標記用抗體與生物素化試劑混合，從而製得各種生物素標記抗體。 具體而言，於50 mM磷酸緩衝液(pH值8.0)中，將各種抗體溶液與N-[N'-(D-生物素)-6-胺基己醯基]-6'-胺基己酸磺基琥珀醯亞胺酯(Sulfosuccinimidyl N-[N'-(D-biotinyl)-6-aminohexanoyl]-6'-aminohexanoate)(同仁化學)溶液以莫耳比1：20進行混合，並於30℃下反應2小時，使生物素與抗體結合。接著，使用50 mM磷酸緩衝液(pH值7.0)進行凝膠過濾，去除未反應之N-[N'-(D-生物素)-6-胺基己醯基]-6'-胺基己酸磺基琥珀醯亞胺酯，從而獲得生物素標記抗體溶液。 3)鏈黴抗生素蛋白-生物素化螢光素酶之製作 具體而言，於緩衝液(包含100 mM氯化鈉、4 mM之EDTA-2Na、0.09%疊氮化鈉、0.2%BSA之0.2 M磷酸緩衝液(pH值7.0))中，將溶解於50 mM磷酸緩衝液(pH值7.0)中之鏈黴抗生素蛋白(Roche Diagnostics)與生物素化螢光素酶(Kikkoman Biochemifa)以莫耳比1：4進行混合，並於30℃下反應2小時，從而製得鏈黴抗生素蛋白-生物素化螢光素酶。 4)試劑1～4之組合中，分別混合生物素標記抗體溶液80 μL、試樣50 μL、及固相化有抗體之磁性粒子(1.5 mg/mL)20 μL，並於37℃下反應15分鐘。 5)於包含磁性粒子之反應溶液中添加BL洗淨液(榮研化學)500 μL，去除BL洗淨液，反覆進行該操作5次。接著，添加鏈黴抗生素蛋白-生物素化螢光素酶80 μL，並於37℃下反應15分鐘。 6)於包含磁性粒子之反應溶液中添加BL洗淨液(榮研化學)500 μL，去除洗淨液，反覆進行該操作5次。接著，添加BL發光試劑盒(榮研化學)之BL發光試劑1 50 μL、及作為針對螢光素酶之受質液(螢光素溶液)的BL發光受質液50 μL，測定發光強度。 7)根據各試樣及BLEIA‘榮研’幽門桿菌抗原之校準物1、校準物2之發光強度，算出COI＝(試樣之發光強度－校準物1之發光強度)/((校準物2之發光強度－校準物1之發光強度)/修正係數)。 8)將未達1COI判定為陰性，將1COI以上判定為陽性。 *4)～8)係利用全自動生物化學發光免疫測定裝置BLEIA-1200進行測定。
關於比較例3之市售套組，將OD值0.1以上判定為陽性。
測定結果： 將測定結果與臨床診斷之結果一併示於以下之表3中。
[表3]
實施例1    實施例2
   試劑2 合計    試劑3 合計
陽性 陰性 陽性 陰性
診斷 陽性 108 1 109 診斷 陽性 108 1 109
陰性 0 24 24 陰性 0 24 24
合計 108 25 133 合計 108 25 133
感度99.1%，特異度100.0%， 一致率99.2%，n＝133 感度99.1%，特異度100.0%， 一致率99.2%，n＝133
比較例1 比較例2
   試劑1 合計    試劑4 合計
陽性 陰性 陽性 陰性
診斷 陽性 105 4 109 診斷 陽性 105 4 109
陰性 0 24 24 陰性 0 24 24
合計 105 28 133 合計 105 28 133
感度96.3%，特異度100.0%， 一致率97.0%，n＝133 感度96.3%，特異度100.0%， 一致率97.0%，n＝133
比較例3   
   對照品 合計
陽性 陰性
診斷 陽性 96 13 109
陰性 0 24 24
合計 96 37 133
感度88.1%，特異度100.0%， 一致率90.2%，n＝133
如表3中所示，當臨床診斷中陽性為109例、陰性為24例時，比較例3中，感度為88%、特異度為100%、一致率為90%，比較例1(CHP001，使用檢出天然觸酶之抗體的BLEIA法)中，感度為96%、特異度為100%、一致率為97%。另一方面，使用本案發明之實施例1及2之能夠與「RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)」或「KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)」中所含有之胺基酸序列結合之抗體(CHP002、CHP003、CHP006)檢出觸酶的BLEIA法中，感度為99%、特異度為100%、一致率為99%，表示根據本發明之抗體，能夠更加高感度地檢出幽門桿菌，且表示於臨床上有用。
本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案係直接藉由引用而引入至本說明書中。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016

Claims (12)

  1. 一種檢出生物試樣中之幽門桿菌之免疫學測定方法，其使用與幽門桿菌之觸酶中之胺基酸序列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)或KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)或者其等之一部分反應的抗體或其片段。
  2. 如請求項1之方法，其中免疫學測定方法選自由免疫凝集法、酶免疫測定法、化學發光免疫測定法、電化學發光免疫測定法、螢光免疫測定法、放射性免疫測定法、免疫層析法、西方墨點法及免疫墨點法所組成之群。
  3. 如請求項1之方法，其中免疫學測定方法為三明治法。
  4. 如請求項3之方法，其中三明治法為酶免疫測定法。
  5. 如請求項4之方法，其中酶免疫測定法使用螢光素酶作為標記酶。
  6. 如請求項5之方法，其中螢光素酶為螢火蟲螢光素酶。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中生物試樣為糞便。
  8. 一種抗體或其片段，其與幽門桿菌之觸酶中之胺基酸序列：RIPERVVHAKGSGAYGTFTV(序列編號2)或KNPENYFAEVEQAAFSPANV(序列編號3)或者其等之一部分反應。
  9. 一種不溶性載體，其固定有如請求項8之抗體或其片段。
  10. 一種生物試樣中之幽門桿菌檢出用免疫學測定試劑，其包含如請求項8之抗體或其片段、或者如請求項9之不溶性載體。
  11. 一種生物試樣中之幽門桿菌檢出用免疫學測定試劑套組，其包含如請求項10之試劑。
  12. 一種生物試樣中之幽門桿菌之檢查方法，其使用如請求項10之試劑。
TW110109294A 2020-03-16 2021-03-16 幽門桿菌檢出用抗體 TW202141039A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-044926 2020-03-16
JP2020044926A JP6867529B1 (ja) 2020-03-16 2020-03-16 ヘリコバクター・ピロリ検出用抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202141039A true TW202141039A (zh) 2021-11-01

Family

ID=75638930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110109294A TW202141039A (zh) 2020-03-16 2021-03-16 幽門桿菌檢出用抗體

Country Status (3)

Country Link
JP (2) JP6867529B1 (zh)
TW (1) TW202141039A (zh)
WO (1) WO2021187406A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4403603A1 (en) 2021-09-13 2024-07-24 Japan Elastomer Co., Ltd. Crosslinked rubber composition, method for producing crosslinked rubber composition

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3849080B2 (ja) * 1995-06-02 2006-11-22 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 ポリペプチド、その製造法及び用途
JP3504633B2 (ja) * 1999-10-29 2004-03-08 わかもと製薬株式会社 ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法及び検査試薬
ATE345354T1 (de) * 2000-04-27 2006-12-15 Max Planck Gesellschaft Methode zur identifizierung von helicobacter antigenen
JP4763149B2 (ja) * 2001-05-10 2011-08-31 わかもと製薬株式会社 ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法
WO2008143171A1 (ja) * 2007-05-17 2008-11-27 Meiji Dairies Corporation 糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原の定量的測定により胃粘膜の状態を判断する方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021148804A (ja) 2021-09-27
JP6867529B1 (ja) 2021-04-28
JP2021148431A (ja) 2021-09-27
WO2021187406A1 (ja) 2021-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6441407B2 (ja) 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬
EP0615129B1 (en) Methods for selectively detecting perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody of ulcerative colitis or primary sclerosing cholangitis
JP3958796B2 (ja) 抗原特異的ＩｇＧ検出
JP3958797B2 (ja) 抗原特異的ＩｇＭ検出
JP6713478B2 (ja) Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法、及びｐｉｖｋａ−ｉｉ免疫測定試薬又はキットの製造方法
JP2009085753A (ja) サンドイッチイムノアッセイ法
WO2022193980A1 (zh) 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
TW201812299A (zh) 腫瘤標記物之測定方法及測定試藥
JP7209498B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスコア抗体の免疫測定方法
US20030017619A1 (en) Test method for IgA nephropathy
TW202141039A (zh) 幽門桿菌檢出用抗體
WO2009084369A1 (ja) Ｈｉｖ－１抗原の検出用試薬及び検出方法
WO2023017817A1 (ja) 免疫測定方法、検体希釈液、及びイムノクロマトグラフィーキット
WO2022118947A1 (ja) 抗体を測定する方法およびキット
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
US4582699A (en) Assay of immunoglobulin A protease and the rapid diagnosis of gonorrhea
JPWO2004048975A1 (ja) 黄色ブドウ球菌の検査方法
TW202246774A (zh) 免疫學測定方法、免疫學測定用試劑及其套組、非特異性反應抑制方法以及非特異性反應抑制劑
WO2022259719A1 (ja) 梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定
WO2023068249A1 (ja) Ｉ型コラーゲン架橋ｎ－テロペプチドの測定試薬、その調製方法、及びそれを用いた免疫測定方法
WO2022195796A1 (ja) 末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法
EP3919509A1 (en) Method for immunological analysis of free aim in biological sample
CN114740194A (zh) 一种试剂盒、以及胃蛋白酶原ii的检测方法
CN114736274A (zh) 新冠病毒s蛋白总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
CN116380880A (zh) Pgⅰ的光激化学发光检测试剂及其应用