WO2022259719A1 - 梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定 - Google Patents

梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定 Download PDF

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宗近 長谷川
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Definitions

  • the present invention relates to means for measuring body fluid antibodies using raw materials obtained from genetically modified organisms. More specifically, the present invention relates to means for measuring body fluid antibodies to syphilis using a mixture of T. syphilis surface antigens derived from genetically modified silkworms.
  • Syphilis is a typical sexually transmitted disease that has been around for a long time, and has been increasing rapidly in recent years. About 600 to 800 cases were reported annually from around 1999 to 2012, and with the exception of a few medical professionals, it was a disease that received little attention in daily clinical practice. However, after exceeding 1,000 cases at 1,228 in 2013, the number continued to increase, and in 2018, the number exceeded 7,000. According to the preliminary figures up to the 46th week of 2019, there were 5,817 cases, and it cannot be said that there has been a downward trend yet.
  • Syphilis is a chronic infectious disease caused by Treponema pallidum (hereinafter referred to as Treponema pallidum: hereinafter referred to as Treponema pallidum or TP) that spreads from local to the whole body. occurs. Both 1st and 2nd stage eruptions disappear spontaneously and become asymptomatic (asymptomatic syphilis) even without treatment, and the symptoms progress while repeating remission and exacerbation. Late symptoms (late syphilis) are said to appear several years after infection. Even if infected with syphilis, not all patients will develop symptomatic syphilis, and those who develop clinical symptoms and who have not been treated may develop asymptomatic syphilis at some point. At present, although it is sufficiently treatable with antibiotics, since such an asymptomatic condition coexists, serological testing is becoming mainstream rather than specimen acquisition from the affected area.
  • One such method for diagnosing syphilis is to detect antibodies produced in the patient's bodily fluids (bodily fluid antibodies).
  • Embodily fluid antibodies Antigen produced in the patient's bodily fluids
  • Treponema pallidum is cultured in domestic testicles, solubilized and extracted with surfactants, etc., and the antigen is obtained by removing insoluble matter and purifying necessary components using various methods.
  • it is a method of producing antigens using rabbits, it is difficult to stably obtain a large amount of products of the same quality.
  • Patent Document 1 a method using a Treponema pallidum surface antigen (TP antigen) produced in Escherichia coli by genetic recombination technology has also been performed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • TP antigen Treponema pallidum surface antigen
  • Non-Patent Documents 2, 3, 4, 5 a technology has been established that uses genetic recombination technology to produce useful proteins in silkworms (recombinant silkworms) (Non-Patent Documents 2, 3, 4, 5).
  • the inventor conducted a study to solve the above problems. Then, using a mixture of the TpN47 antigen derived from the cocoon thread or silk gland of a genetically modified silkworm, which is an artificial surface antigen of TP, and the same genetically modified TpN15-TpN17 fusion antigen, the anti-TP antibody in the body fluid specimen was detected. It was found that measurement by an immunoassay method clearly improves the measurement sensitivity to a practical level, even exceeding that of the native TP antigen.
  • the present invention provides cocoon filaments of transgenic silkworms (hereinafter also referred to as 47 recombinant silkworms) transformed with the TpN47 gene, which is an artificial surface antigen of Treponema pallidum (TP), or Genetically modified TpN47 antigen derived from the silk gland (hereinafter also referred to as 47 antigen), and genetically modified silkworms transformed with a fusion gene of the same TpN15 gene and TpN17 gene (hereinafter also referred to as 15-17 recombinant silkworms (hereinafter also referred to as the TP antigen mixture of the present invention or the TP antigen mixture), a recombinant TpN15-TpN17 fusion antigen (hereinafter also referred to as the 15-17 antigen) derived from the cocoon thread or silk gland of is brought into contact with a body fluid specimen, and the anti-Treponemal syphilis antibody in the body fluid specimen is measured by an
  • Silkworms transformed with the TP gene can be produced using the technology already provided.
  • an order was placed with a specialized company to purchase cocoons derived from 47 recombinant silkworms and cocoons derived from 15-17 recombinant silkworms, respectively, and the cocoon threads of the cocoons were combined with 47 antigens and 15-17 It is used as a raw material for antigens.
  • the recombinant TpN47 antigen and the TpN15-TpN17 antigen obtained from the cocoon thread are unknown.
  • TP Treponema pallidum
  • TP antigen proteins The Journal of Immunology, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol.129, p.1287 -1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122, 1992
  • TP surface antigen protein with a molecular weight of 47 kd.
  • TpN47; 15 kd TpN15; 17 kd TpN17 are known as typical TP surface antigen proteins, and the base and amino acid sequences of their genes have also been determined (Microbiological. Reviews, Vol.57, p.750- 779; Infection and Immunity, Vol.61, p.1202-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol.162, p.1227-1237, 1992; Infection and Immunity, Vol.57, p.3708-3714, 1989) .
  • the cloning of the above genes is preferably carried out by gene amplification methods such as PCR and recombinant PCR, regardless of the host into which the gene is to be introduced, such as Escherichia coli and silkworm (described later).
  • gene amplification methods such as PCR and recombinant PCR, regardless of the host into which the gene is to be introduced, such as Escherichia coli and silkworm (described later).
  • a chemical gene synthesis method can be used as necessary.
  • the desired gene amplification product is obtained by specifically amplifying the TP antigen region using forward and reverse primers flanking both ends of the coding region of the TpN47 gene in the native TP antigen gene. It is possible to obtain a TP antigen gene fragment that The native TP antigen gene can be obtained by extracting genomic DNA from Treponema pallidum (Nicols strain) cultured in rabbit testicles.
  • the recombinant PCR method can be suitably used when obtaining the TpN15-TpN17 fusion gene. That is, the TpN15 gene and the TpN17 gene are separately obtained by a gene amplification method such as the PCR method described above, and one DNA fragment is ligated to the end to which the other is to be ligated. Synthesize a sequence complementary to the vicinity of the end of the intended fusion gene by mixing one gene fragment to which the end addition was performed and the other gene fragment to be bound to it.
  • a desired TpN15-TpN17 fusion gene fragment can be obtained by performing gene amplification by the PCR method using primers complementary to .
  • gene amplification primers used when cloning the TpN47 gene using PCR and when cloning the TpN15-TpN17 fusion gene using recombinant PCR are exemplified. These exemplifications are matters that can be easily derived by applying each sequence of the TP antigen to the knowledge of the known PCR method or recombinant PCR method.
  • the base sequence underlined parts are each terminal sequence of the gene. As shown in each example, it is preferable that a termination codon is added to the additional sequence at the 3' end.
  • the 5'-terminal sequence and the 3'-terminal sequence are provided with predetermined restriction enzyme recognition sites.
  • predetermined restriction enzyme recognition sites include, but are not limited to, addition of a BamHI recognition sequence to the 5' end and addition of a NotI recognition sequence to the 3' end sequence. It can be freely selected depending on the vector to be incorporated, for example, the restriction enzyme site in the binary expression system described later.
  • TpN15 As a primer for TpN15, for example; 15K Primer 1: 5' end GATCC GGATCC TGTTCATTTAGTTCTATC (SEQ ID NO: 5) 15K Primer 2: 3' end TAGCC GCGGCCGCCTA CCTGCTAATAATGGCTT (SEQ ID NO: 6) are exemplified. These can be used to clone the TpN15 gene.
  • the TpN15-TpN17 fusion gene can be cloned using the TpN17 gene and the TpN15 gene obtained as described above.
  • the desired TpN15-TpN17 fusion gene can be cloned by carrying out a PCR reaction in which these gene fragments and primers used for fragment fusion amplification coexist appropriately.
  • a primer for 15K fragment a pair of amplification primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 below: 15K primer 1 at the 5' end of SEQ ID NO : 5;
  • 17K-5' end + 15K-3' end primer TGTGCACGAGACACACCTGCTAATAATGGCTTCCT (SEQ ID NO: 7) to perform a PCR reaction using the TpN15 gene obtained above as a template to clone the 15K connecting fragment
  • Second, as a primer for 17K fragment 2 a pair of amplification primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 4 below: the 5' end TGTGTCTCGTGCACAACCGT (SEQ ID NO: 8); 17K primer 2 at the 3' end of SEQ ID NO:4
  • the resulting TP antigen gene fragment can be incorporated into a plasmid vector using conventional methods such as ligation and linker ligation.
  • a transgenic silkworm can be obtained by transforming a silkworm with a TP antigen gene.
  • Silkworms (Bombyx mori) are domesticated from the wild species of mulberry (Bombys mandarina) in the history of sericulture, which is said to be about 5,000 years old, and are domesticated insects that have undergone selective breeding.
  • transformation methods have already been provided, and whole genome information has also been clarified (Goldsmith, MR et al., Annu. Rev. Entomol., 50:71-100, 2005).
  • transformation method examples include a method using a vector using a transposon, a binary (binary) expression system, and the like. Transformation can also be achieved by knock-in.
  • a plasmid vector using the transposon piggyBac is well known.
  • the plasmid vector contains two inverted repeat sequences present at both ends of the transposon piggyBac, and the TP antigen gene to be integrated into the silkworm chromosome is inserted between the repeat sequences.
  • the TP antigen gene region is transposed between the above-mentioned repetitive sequences by the action of the transposase, so silkworms in which the TP antigen gene is integrated into the chromosome can be obtained.
  • piggyBac when piggyBac is used, the TP antigen gene is almost randomly inserted into the base sequence TTAA in the silkworm genome, and the size of the DNA fragment that can be inserted is limited to approximately 20 kb or less.
  • Binary expression systems include GAL4/UAS system, IE1/hr3 system, Tet-On/Off system, and the like.
  • GAL4/UAS system has already been used in silkworms (M.Imamura et al., Genetics 165:1329-1340, 2003: Non-Patent Document 5).
  • constructs with the GAL4 gene placed under a basal promoter are created and integrated into various genomic regions.
  • a basal promoter such as the sericin 1 promoter traps the enhancer, resulting in the expression of the yeast-derived transcriptional activator GAL4. If the enhancer is active only in a particular silkworm cell population, GAL4 is expressed only in that cell population.
  • the sericin 1 promoter described above functions in the expression of sericin 1 in the middle silk gland of silkworms. Sericin 1 is the sericin 1 that is secreted in the highest amount among the three types of sericin, ie, sericin 1-3.
  • the TP antigen gene which is the subject of the present invention, is expressed in the middle silk gland of the silkworm and the TP antigen is secreted into the sericin layer of the cocoon filament, sericin is water-soluble. It can be dissolved in a solvent, the TP antigen can be easily extracted, and the activity is not easily impaired.
  • the above-mentioned sericin 1 promoter is the basal promoter that is most preferably used when applying the GAL4/UAS system to the present invention.
  • the target gene, the TP antigen gene is directly ligated to the sericin 1 promoter, the expression level is insufficient, so it is preferable to use a binary expression system that enhances the expression.
  • TP antigen gene is arranged downstream of a GAL4 recognition sequence UAS (upstream activator sequence)
  • UAS upstream activator sequence
  • Such gene ectopic expression using the GAL4/UAS system is obtained by mating a transgenic silkworm that is a GAL4 transgenic individual (driver) and a transgenic silkworm that is a UAS transgenic individual (effector). , can be performed in silkworms as double transgenic individuals.
  • the IE1/hr3 system utilizes the properties of the IE1 transactivator and hr3 enhancer of the baculovirus that infects insects to control gene expression in host insects to control the expression level of the target gene, the TP antigen gene.
  • the E. coli tetracycline regulatory activator activates the expression of the TP antigen gene, which is a transgene linked downstream of the transcriptional regulatory response element sequence, and is activated by the addition of tetracycline or doxycycline. Because they bind to and inhibit factors, administration of these agents can turn on or off the expression of the TA antigen gene.
  • a target gene such as a GAL4 gene or a TP antigen gene, is introduced into a silkworm, and whether or not it is expressed can be confirmed by introducing a marker gene downstream of the target gene, such as the GAL4 gene or the TP antigen gene. It can be done by A fluorescent protein gene is preferably used as the marker gene. Fluorescent protein genes of two or more colors can be used as necessary. For example, when a red fluorescent protein gene is used as one marker (for example, a driver silkworm) and a green fluorescent protein gene is used as the other marker (effector silkworm), red and green are produced from silkworms into which both have been introduced by mating. Since combined yellow fluorescence can be observed, silkworms into which both the driver gene and the effector gene have been introduced can be selected using this yellow fluorescence as an index.
  • the TP antigen mixture of the present invention is a mixture of 47-antigen and 15-17 antigen.
  • the mixing ratio of 47-antigen and 15-17 antigen is preferably 47-antigen:15-17 antigen (mass ratio) of 4:6-6:4.
  • the TP mixture of the present invention may be in the form of an aqueous composition dissolved in an aqueous solvent, a lyophilized product, or the like, or may be in a state immobilized on a solid phase. good.
  • the concentration of the TP-antigen mixture of the present invention in the aqueous composition can be freely set according to the intended use of the mixture.
  • Body fluid sample The body fluid sample to be subjected to the measurement method of the present invention is not limited as long as it is a sample of body fluid that can contain anti-TP antibody due to syphilis.
  • Examples include blood samples, saliva samples, urine samples, and the like. Among these, blood samples are particularly suitable. Blood specimens include whole blood specimens, serum specimens, plasma specimens, etc., and serum specimens or plasma specimens are more preferable. If necessary, serum obtained by adding an anticoagulant or the like, or by subjecting the heated supernatant of the TP Reiter strain culture medium to absorption of non-specific antibodies is also acceptable. Dilution with physiological saline or buffer solution is also performed as appropriate.
  • the antigen-antibody reaction between the anti-TP antibody in the body fluid sample and the TP antigen mixture of the present invention causes is not limited as long as it can measure the anti-TP antibody of To that extent, enzyme immunoassay, immunoturbidimetry, radioimmunoassay, latex agglutination or nephelometry (hereinafter referred to as latex agglutination/turbidimetry), blood cell or particle agglutination (hereafter blood cell - described as a particle agglutination method), an immunochromatography method, or the like can be used.
  • enzyme immunoassay, immunoturbidimetry, radioimmunoassay, latex agglutination or nephelometry hereinafter referred to as latex agglutination/turbidimetry
  • blood cell or particle agglutination hereafter blood cell - described as a particle agglutination method
  • an immunochromatography method or the like
  • Enzyme immunoassay methods include, for example, EIA (Enzyme Immunoassay), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), FEIA (Fluorescence Enzyme Immunoassay), CLEIA (CLIA ) (chemiluminescent enzyme immunoassay), CLIA (chemiluminescent immunoassay), and the like.
  • EIA Enzyme Immunoassay
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • FEIA Fluorescence Enzyme Immunoassay
  • CLEIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • immunoturbidimetric methods include Nephelometry and IA (Turbidimetric Immunoassay).
  • radioimmunoassay methods include RIA (Radio Immunoassay) and CPBA (Competitive Protein Binding Assay).
  • latex agglutination/turbidimetry examples include LA (latex agglutination), LA (latex agglutination turbidimetric immunoassay), and LPIA (latex photometric immunoassay). , KIMS (Kinetic Interaction of Microparticles), Colloidal Gold Immunoassay, and the like.
  • Examples of blood cell/particle agglutination methods include PA (Particle Agglutination) and PHA (Passive Hemagglutination).
  • the TP antigen mixture of the present invention is applied as the TP antigen for capturing the anti-TP antibody in the body fluid sample in each immunological measurement method described above.
  • a specific form of the application can be freely selected according to the measurement method to be applied.
  • a TP antigen mixture is fixed in the wells of a 96-well plate used as a solid phase, and a body fluid sample is brought into contact with the TP antigen mixture to A step of binding the anti-TP antibody in the sample to the TP antigen mixture fixed in the well is performed, and then the anti-human antibody to which a predetermined enzyme label has been added is applied to the anti-human antibody in the body fluid sample on the well.
  • the anti-TP antibody in the body fluid sample can be measured by contacting the TP antibody-bound TP antigen mixture and using the coloring signal obtained from the enzyme labeling.
  • the TP antigen mixture of the present invention is immobilized on a solid phase suitable for each assay method, for example, predetermined particles or the like, and the anti-TP antibody in the body fluid sample is brought into contact with the solid phase.
  • the anti-human antibody labeled according to the type of measurement method is bound to the TP antigen mixture bound to the anti-TP antibody immobilized on the solid phase, and the predetermined label, such as a fluorescent substrate (FEIA), chemiluminescent substrates (CLEIA or CLIA), etc., can be used to measure anti-TP antibodies in bodily fluid samples.
  • FEIA fluorescent substrate
  • CLIA or CLIA chemiluminescent substrates
  • a body fluid sample is brought into contact with the TP antigen mixture of the present invention in a liquid phase, and light scattering intensity (nephelometric) and transmittance (IA) are measured with respect to the liquid phase.
  • light scattering intensity nephelometric
  • transmittance IA
  • a radioimmunoassay method for example, in RIA
  • a competitive antigen-antibody reaction between a RI-labeled antibody and an anti-TP antibody in a body fluid sample is performed on a certain amount of the TP antigen mixture of the present invention.
  • the labeled antibody bound to the antigen (bound type: Bound) and the labeled antibody that does not bind to the antigen (free type: Free) are separated, and the ratio can be measured as the concentration of the anti-TP antibody from the radioactivity.
  • the antigen-antibody complex is precipitated with a second antibody
  • an ammonium sulfate salting-out method in which it is precipitated with ammonium sulfate (ammonium sulfate)
  • a method of PEG precipitation in the CPBA method, the anti-TP antibody in the RI-unlabeled body fluid specimen is subjected to a competitive reaction against the reaction between the RI-labeled antibody and the TP antigen mixture of the present invention immobilized on the solid phase, and then binding. Antibody and free antibody can be separated and their radioactivity measured.
  • the latex agglutination reaction is performed by sensitizing the TP antigen mixture of the present invention to latex particles, which are a solid phase, and separating the sensitized latex particles from the body fluid sample.
  • an antigen-antibody reaction is performed with an anti-TP antibody, and the presence of the anti-TP antibody in the body fluid specimen is determined based on the presence or absence of agglutination due to the antigen-antibody reaction. Mainly react on a slide glass and observe the cloudy state.
  • the latex agglutination turbidimetric method is an automated method for measuring the anti-TP antigen in a body fluid sample based on the change in turbidity of the reaction solution accompanying the agglutination of the sensitized latex in the latex agglutination reaction described above. .
  • the latex near-infrared turbidimetric method measures the turbidity of the reaction solution accompanying the agglutination of the sensitized latex in the above-mentioned latex agglutination reaction by irradiating near-infrared light, and based on the transmittance, anti-antibody in the body fluid sample.
  • a method for measuring TP antigen is an automated method for measuring the anti-TP antigen in a body fluid sample based on the change in turbidity of the reaction solution accompanying the agglutination of the sensitized latex in the latex agglutination reaction described above.
  • microparticles to which the TP-antigen mixture of the present invention is bound are used as a solid phase, antigen-antibody reaction with anti-TP antibody in a body fluid sample is performed, and the turbidity of agglutination due to the antigen-antibody reaction is measured. is measured from the transmittance to measure the anti-TP antigen in the body fluid sample.
  • the colloidal gold immunoassay method the anti-TP antibody in the body fluid sample captured by the antigen-antibody reaction with the TP antigen mixture of the present invention is further reacted with the colloidal gold-labeled TP antigen, and the coloration of the colloidal gold in the body fluid sample is performed. is a method for determining the presence of an anti-TP antigen in . This principle may also be used in immunochromatography.
  • the particle agglutination reaction is performed by using gelatin particles or the like to which the TP antigen mixture of the present invention is adsorbed (bound) as a solid phase, and anti-TP antigen in the body fluid sample and the sensitization.
  • antigen-antibody reaction is performed with particles, and the presence or absence of agglutination due to the reaction is used to determine the presence of anti-TP antibody in a body fluid specimen.
  • sensitized erythrocytes having the TP antigen mixture of the present invention immobilized on the surface of the erythrocytes are reacted with the anti-TP antibody in the body fluid sample, and the presence or absence of agglutination due to the antigen-antibody reaction determines the body fluid sample.
  • the immunochromatographic method is an immunological measurement method that utilizes the property that when a liquid is dropped onto a nitrocellulose membrane or the like, it moves on the membrane due to capillary action.
  • the labeled TP-antigen mixture of the present invention was brought into contact with a body fluid sample to form a labeled antigen-antibody complex, and the antigen-antibody complex was immobilized downstream in the process of moving through the membrane.
  • the antigen-antibody complex is captured by the TP antigen, and the presence or absence of the label makes it possible to determine the presence or absence of the anti-TP antigen in the body fluid sample. It is also used as a point-of-care test (POCT) tool. Details will be described later.
  • POCT point-of-care test
  • the present invention provides the above-described measurement method in which a TP-antigen mixture fixed on a solid phase is used.
  • Fixtures in the solid phase include tubes, columns, etc., on which the above-described TP antigen mixture is fixed; multiwell plates such as 96-well plates; particles such as latex particles, gelatin particles, microparticles, and the like;
  • the present invention also provides these fixings (hereinafter also referred to as the solid phase of the present invention).
  • a region for immobilizing a TP antigen mixture is provided, A region for detecting a complex of the mixture of antigens and the anti-TP antibody in the body fluid sample, which is formed by contact between the immobilized region and the body fluid sample and migrates in the continuous phase by capillary action mediated by the aqueous phase. is provided downstream of the immobilization region, Provided is an immunochromatographic device for measuring Treponema pallidum (hereinafter also referred to as the device of the present invention).
  • the TP antigen mixture of the present invention is brought into contact with a body fluid sample, and the anti-TP antibody in the body fluid sample signals binding to the TP antigen mixture. It can also be expressed as a data acquisition method of measuring as , and acquiring the signal as data on the syphilis prevalence of the specimen provider.
  • the present invention also provides a kit for performing the measurement method of the present invention (hereinafter also referred to as the kit of the present invention), which contains the solid phase of the present invention as an element.
  • the kit of the present invention can freely include diluents, labeled second antibodies, labeled eliciting reagents, etc. used in the measurement, as kit elements, according to the specific immunological measurement method. is.
  • the present invention provides means for measuring anti-TP antibodies in body fluid specimens, which clearly improves measurement sensitivity at a practical level compared to conventional products.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is drawing which showed an example of the device in the case of performing the measuring method of this invention by immunochromatography.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is drawing which showed an example of the measurement principle in the case of performing the measurement method of this invention by immunochromatography.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is drawing which showed the measurement principle when performing the measurement method of this invention by enzyme immunoassay methods, such as ELISA method.
  • FIG. 1 is a drawing showing an example of a device for performing the measurement method of the present invention by immunochromatography.
  • the immunochromatographic device 10 (hereinafter referred to as the device 10) is configured by fixing a water absorption phase 1, a mobile phase 2, and a specimen drop/reaction phase 3 on a packing sheet 5.
  • the water absorption phase 1, the mobile phase 2 and the specimen dropping/reaction phase 3 are in contact with each other in such a manner that water can flow therethrough.
  • the mobile phase 2 is provided with a coloring area 21 .
  • the anti-TP antibody in the sample reacts with the TP antigen mixture contained in the sample dropping/reaction phase 3, resulting in an anti-TP antibody-TP antigen complex conjugate.
  • This bound substance migrates in the direction of 3 ⁇ 2 ⁇ 1 by capillary action, is captured in the coloring area 21 provided with capturing means for the anti-TP antibody-TP antigen complex and signal coloring means, and causes predetermined coloring. be done.
  • a separate developing solution may be added directly to the specimen dropping/reaction phase 3 or from its upstream side. Free TP antigens and developing solutions are trapped in the water absorption phase 1 .
  • the water absorbing phase 1 also has a function of rectifying the capillary phenomenon, and is preferably made of a material having a strong water absorbing power such as cotton or filter paper.
  • the predetermined color development described above serves as a signal that the anti-TP antibody is present in the body fluid sample. If color develops, the presence of anti-TP antibody in the body fluid sample (positive), and if no color develops, the anti-TP antibody does not exist (negative).
  • FIG. 2 is a drawing showing an example of the measurement principle using the device 10.
  • the basic reaction principle in the device 10 is the antigen-antibody reaction between the anti-TP antibody in the body fluid specimen and the TP-antigen mixture of the present invention.
  • sensitized particles 41 obtained by sensitizing particles 61 with "TP antigen mixture 50, which is a mixture of 15-17 antigen 52 and 47 antigen 53".
  • TP antigen mixture 50 which is a mixture of 15-17 antigen 52 and 47 antigen 53.
  • the particles 61 include colored latex particles, fluorescent particles, colloidal metal particles such as colloidal gold, and the like.
  • a TP-antigen mixture 50 directly carrying a label such as a chromogenic enzyme may be used.
  • a label such as a chromogenic enzyme
  • the metal colloid in addition to gold colloid, colloid of different metals such as colloid of silver and colloid of selenium can be used.
  • a label such as a chromogenic enzyme generates a predetermined signal by reacting a label eliciting reagent such as a substrate for the chromogenic enzyme in the chromogenic area 21 .
  • the label-revealing reagent can be dropped separately toward the coloring area 21, for example, the label-revealing reagent is attached to the coloring area 21 in advance, and the moisture moved by capillary action intervenes to automatically It is preferable to provide the coloring area 21 with a mechanism that specifically induces the generation of a signal.
  • a blood sample is suitable as a body fluid sample that may contain the anti-TP antibody 51, as described above.
  • Blood specimens include whole blood specimens, serum specimens, plasma specimens, etc., and serum specimens or plasma specimens are preferred. Since the anti-TP antibody 51 in the body fluid specimen is an antibody generated as a humoral immune reaction by the subject being infected with TP, the presence of the anti-TP antibody 51 in the body fluid specimen is a signal regarding the subject's syphilis. ie, signals that the subject has, or at least had, syphilis.
  • the material of the specimen dropping/reaction phase 3 is capable of adhering the sensitizing antigen 41 and the like when dried, and in the liquid phase such as the body fluid specimen and developing solution, the TP antigen in the TP antigen mixture, or , as long as it dissociates the anti-TP antibody-TP antigen complex.
  • the liquid phase such as the body fluid specimen and developing solution, the TP antigen in the TP antigen mixture, or , as long as it dissociates the anti-TP antibody-TP antigen complex.
  • examples include glass fiber, cotton, filter paper, and the like.
  • a specimen dropping phase (not shown) and a reaction phase may be provided separately. In this case, the sample dropping phase is arranged upstream of the reaction phase to which the sensitizing particles 41 and the like are attached.
  • the developing solution that may be added is not limited as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction and allows capillary action in the device 10 to proceed 3 ⁇ 2 ⁇ 1.
  • the TP antigen mixture 50 (composed of a large number of 15-17 antigens 52 and a large number of 47 antigens 53) sensitized on the surface of the sensitizing particles 41 adhering to the specimen dropping/reaction phase 3 anti-TP antibody 51 in the body fluid sample (Fig. 2 (1)), and the antigen-antibody reaction causes particles 42 carrying anti-TP antibody-TP antigen complexes (complex-carrying particles 42). is formed (FIG. 2(2)).
  • the mobile phase 2 is a material in which the TP antigen in the TP antigen mixture or the complex-supported particles 42 can move due to capillary action mediated by moisture, and the material can provide the coloring area 21.
  • the material can provide the coloring area 21. Examples include nitrocellulose membrane, cellulose nanofiber, glass fiber, silica gel and the like.
  • Composite-supported particles 42 reaching coloring area 21 are captured in coloring area 21 by capillary action.
  • the capturing means is integrated with the coloring means.
  • the TP antigen is immobilized in a line on the coloring area 21 .
  • the immobilization must be a firm immobilization that does not move or diffuse due to moisture.
  • the TP antigen immobilized in the coloring area 21 is preferably the TP antigen mixture 50, other TP antigens, such as native TP antigens, may be transformed into TPs in different hosts. It may be an antigen. In addition, any shape other than a line shape, for example, a point shape, a circle shape, or any other design may be used, and is not limited at all.
  • the composite-supported particles 42 that have migrated by capillary action are captured by antigen-antibody reaction binding between the TP antigen immobilized in the coloring area 21 and the anti-TP antigen 51 on the composite-supported particles 42, resulting in " A sandwich complex combination 43 of "immobilized TP antigen-anti-TP antibody-TP antigen" is formed (Fig. 2 (3)).
  • Such a sandwich complex 43 develops color in the coloring area 21 due to its intended action, thereby making the presence of the anti-TP antibody in the body fluid sample to be measured.
  • the sandwich composite 43 is formed in the coloring area 21, thereby visually revealing the coloring of the latex and the red color of the colloidal gold.
  • chromogenic enzymes such as alkaline phosphatase (ALP) and peroxidase, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate disodium salt, DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride), etc. Visually revealed by contact with a chromogenic substrate.
  • the specimen provider is likely to have or was suffering from syphilis, and if negative, syphilis is not infected or is in a wait-and-see state. Since syphilis requires long-term follow-up, data for definitive diagnosis of syphilis can be obtained with reliability by monitoring over time using the highly sensitive and easy-to-use device 10. It is possible to obtain
  • FIG. 3 is a drawing showing the measurement principle when the measurement method of the present invention is performed by an enzyme immunoassay method such as the ELISA method.
  • the solid phase 62 has a structure in which the antigen-antibody reaction related to the measuring method of the present invention is performed on its inner wall.
  • the wells of a multi-well plate such as a 96-well plate are typical, but not limited to, and are merely illustrative, and other aspects such as column surfaces, particles, tubes, etc. good.
  • the first step is to bring the anti-TP antibody 51 in the body fluid specimen into contact with the TP-antigen mixture 50 fixed on the solid phase 62 to carry out antigen-antibody reaction (FIG. 3 (1 )).
  • the anti-human antibody against the anti-TP antibody 51 is further loaded with a labeling substance such as a chromogenic enzyme.
  • the second step is to contact the antibody 54 (FIG. 3(2)).
  • a sandwich complex 502 consisting of the solid-phase fixed TP mixture 50-anti-TP antibody 51 complex 501-second antibody formed in the second step is allowed to react with a labeling revealing reagent 55 such as a reaction substrate.
  • the third step is the color development step in which the color is developed by pressing ((3) in FIG. 3).
  • the anti-TP antibody 51 in the body fluid sample can be measured. As shown in FIG. 3(4), it is possible to perform not only qualitative determination but also quantitative determination by using a calibration curve that associates signal intensity with the amount of anti-TP antibody.
  • the extract was concentrated with a centrifugal concentrator (Sartorius Vivaspin 20) and subjected to gel filtration with Sephacryl S-200HR XK50/60 (GE) column and Tris-HCl buffer.
  • the antigen fraction was concentrated with a centrifugal concentrator to obtain a purified recombinant antigen. Table 1 shows the purification results.
  • Example 1 Test using an immunochromatographic method test device (1) Production of test device An immunochromatographic device shown in Fig. 1 was produced.
  • a mixed antigen stock solution was prepared by mixing equal volumes of the recombinant silkworm TpN47 antigen and the recombinant silkworm TpN15-17 antigen as 1 mg/ml phosphate buffer solutions. The concentration of each antigen in the mixed antigen mixed stock solution is 0.5 mg/ml. One volume of this mixed antigen mixture stock solution was added to 9 volumes of a latex suspension in which red latex particles (Bangs Laboratory) were similarly suspended in a phosphate buffer, and mixed by inversion at 4° C. for 5 hours. A blocking treatment was performed with a phosphate buffer containing 1% BSA to obtain a mixed antigen-sensitized latex particle-containing liquid.
  • the above antigen-sensitized latex particle suspension is evenly applied to a glass fiber sheet (Millipor) cut into small pieces, placed in a vacuum drying apparatus and dried under reduced pressure for 20 hours.
  • a conjugate pad corresponding to reaction phase 3 was prepared (hereinafter referred to as conjugate pad).
  • the above recombinant antigen mixture solution was applied onto a nitrocellulose membrane for immunochromatography (IMMUNOPORE) corresponding to mobile phase 2 in FIG. was provided (hereinafter referred to as a line-coated membrane).
  • Filter paper manufactured by Whatman
  • a test device for measurement was produced by combining the conjugate pad, the coated membrane, and the filter paper cut into appropriate widths and lengths as shown in FIG. 1 (hereinafter referred to as the product).
  • the anti-TP antibody in the bodily fluid specimen reacts with the TP antigen-sensitized red latex beads contained in the conjugate pad to form a complex of anti-TP antibody-TP antigen-sensitized latex beads. to form This complex migrates on the line-coated membrane, which is the mobile phase, and binds to the immobilized TP antigen as a linear colored line immobilized on the downstream side, resulting in immobilized TP antigen-antigen.
  • a sandwich-type complex of TP antibody-TP antigen-sensitized red latex beads is formed. It should be noted that the developer may or may not be present during the movement on the membrane. Based on the presence or absence of the red line of the latex beads revealed by this, it is possible to determine whether or not the sample provider has a positive signal related to syphilis. If a red line appears, the syphilis signal is positive.
  • Therodia TPPA which is a standard method for measuring anti-TP antibodies, uses native antigens, but the TP antigen mixture derived from recombinant silkworms was nevertheless superior.
  • Espline TPAb Flujirebio
  • Espline TPAb is a reagent that uses an E. coli recombinant antigen and includes a measuring device capable of individually determining TpN15-17 and TpN47, and was performed according to the package insert.
  • This product was processed in the same manner as in (2) above. The results are shown in Table 4. The meanings of “+”, “ ⁇ ” and “ ⁇ ” in Table 4 are the same as in Table 3.
  • Espline TPAb Tp15-17 was withheld on day 45, positive on day 48, and TpN47 positive on day 52. Therodia TPPA became positive on the 45th day.
  • this product gave a positive determination on the 31st day, and was able to capture the anti-TP antibody clearly earlier than the other two methods. It is generally said that IgM appears in the blood about 30 days after infection, and IgG appears about 45 days after infection, but this product is thought to have reacted with IgM as well. Although it is said that the capture of IgM is difficult, the use of the recombinant silkworm antigen in anti-TP antibody measurement was shown to be possible with the present product using the TP antigen mixture of the present invention.
  • Example 2 Test by ELISA
  • a native antigen Tokiwa Chemical
  • a silkworm-derived recombinant antigen TpN47, TpN15-17 mixture (TP antigen mixture) stock solution
  • TP antigen mixture silkworm-derived recombinant antigen mixture
  • 10 mM phosphate buffer sensitized by distributing 100 ⁇ L/well at a concentration of 5 ⁇ g/mL and leaving overnight at 4°C. made.
  • the plate was blocked with 10 mM phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin at 37°C for 2 hours, washed and dried to prepare a sensitized ELISA plate for each antigen.

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Abstract

本発明は、より高い感度をもって、梅毒トレポネーマ菌による感染を検出する手段を提供することことを課題とし、本発明者は、梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺由来のＴｐＮ４７抗原、及び、同遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原、の混合物を用いて、体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫学的測定方法によって測定することにより、測定感度が実用レベルで、ネイティブの梅毒トレポネーマ菌抗原をも超えて明らかに向上することを見出した。

Description

梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定
　本発明は、遺伝子組換え生物から得られる原料を用いる体液抗体の測定手段に関する発明である。より具体的には、本発明は、遺伝子組換えカイコ由来の梅毒トレポネーマ菌表面抗原の混合物を用いる、梅毒の体液抗体の測定手段に関する発明である。
　梅毒は古くからある性感染症の代表的な疾患であり、近年特に急増している。１９９９－２０１２年頃までは年間約６００－８００例程度の報告となっており、ごく一部の医療関係者を除いて、日常診療ではあまり注目されない疾患となっていた。しかし、２０１３年に１２２８例と１０００例を超えたあとは右肩上がりに増加を続け、２０１８年では７０００例を超えた。２０１９年第４６週までの速報値では５８１７例となっており、未だ減少傾向に転じたとは言えない。
　梅毒はＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ（トレポネーマ・パリダム：以下、梅毒トレポネーマ又はＴＰ、という）による局所から全身へ拡大する慢性の感染症で、感染部位に生じる第１期梅毒疹、その後全身性に第２期梅毒疹が生じる。１期疹、２期疹ともに無治療でも自然に消褪し無症状（無症候梅毒）となり、症状の寛解と増悪を繰り返しながら進行していく。感染から数年の経過で晩期症状（晩期梅毒）を呈するようになるとされる。梅毒に感染したとしても、すべての患者が顕症梅毒となるわけではなく、また臨床症状が出現した者で、特に治療をなされなかった者も無症候梅毒となる時期がある。現在、抗生物質により十分に治療可能になっている反面で、このような無症状状態が併存するため、患部からの検体取得よりも、血清学的な検査が主流となりつつある。
　このような梅毒診断法の一つに、患者体液中に産生される抗体（体液抗体）を検出する方法がある。この抗体検出法では、梅毒トレポネーマ菌を家兔睾丸で培養し、界面活性剤等で可溶化・抽出し、さらに種々の方法を用いて不溶物の除去・必要成分の精製を行ったものが抗原として用いられてきた。しかし、家兔を用いた抗原の製造方法であるため、大量に安定的に且つ同一品質の物を取得するには難しい面があった。また、動物愛護の観点からも問題視されつつあった。その様な点を解消するため、近年、遺伝子組換え技術により大腸菌で産生した梅毒トレポネーマ菌表面抗原（ＴＰ抗原）を用いる方法も行われている（特許文献１，非特許文献１）。
　一方、最近になり、遺伝子組み換え技術を用いてカイコ（組換えカイコ）に有用タンパク質を産生させる技術が確立されている（非特許文献２，３，４，５）。
特開平１１－１９２０８９号公報
V.Sambri,et al.,Western Immunoblotting with Five Treponema pallidum Recombinant Antigens for Serologic Diagnosis of Syphilis Clin.Diagno.Labo.Immuno.,8(3) p.534-539(2001) 分子昆虫学，pp.36-45, 共立出版 Dev. Growth Differ., 56, 14-25, 2011 J. Biotechnol. Biomater, S9, 004, 2012 Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori Morikazu Imamura,etal. Genetics, 165, 1329- 1340 (2003)
　上記のように、現在、梅毒は抗生物質によって十分治療可能である反面、無症状状態が併存する。従って、その感染を、可能な限り正確に診断し、早期に治療を行う判断を行う必要性は依然として高く、より高い感度をもって、梅毒トレポネーマ菌による感染を検出する手段の提供が求められている。その点で、現在提供されている遺伝子組換えＴＰ抗原を用いた体液検体中の抗ＴＰ抗体の測定における感度性能をさらに向上させる必要がある。
　本発明者は、上記の課題の解決に向けて検討を行った。そして、ＴＰの人工表面抗原である、遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺由来のＴｐＮ４７抗原、及び、同遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原、の混合物を用いて、体液検体中の抗ＴＰ抗体を免疫学的測定方法によって測定することにより、測定感度が実用レベルで、ネイティブのＴＰ抗原をも超えて明らかに向上することを見出した。
（１）本発明の概要
　すなわち本発明は、梅毒トレポネーマ菌（ＴＰ）の人工表面抗原である、ＴｐＮ４７遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコ（以下、４７組換えカイコともいう）の繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原（以下、４７抗原ともいう）、及び、同ＴｐＮ１５遺伝子とＴｐＮ１７遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコ（以下、１５－１７組換えカイコともいう）の繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原（以下、１５－１７抗原ともいう）、の混合物（以下、本発明のＴＰ抗原混合物、又は、ＴＰ抗原混合物、ともいう）を、体液検体と接触させて、該体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を、上記抗原の混合物との結合シグナルとして免疫学的測定方法により測定する、体液抗体の測定方法（以下、本発明の測定方法ともいう）を提供する発明である。
　ＴＰ遺伝子で形質転換されたカイコは、既に提供されている技術を用いて生産することが可能である。本実施例では、専門企業に注文をして、４７組換えカイコ由来の繭と、１５－１７組換えカイコ由来の繭を、それぞれ購入して、該繭の繭糸を、４７抗原と１５－１７抗原の原料として用いている。しかしながら、本発明者が知る限り、該繭糸から取得された遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原と、同ＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７抗原は、非公知である。
（２）梅毒トレポネーマ菌（ＴＰ）
　ＴＰは、スピロヘータの一種で、ＴＰ抗原タンパク質として複数のタンパク質が報告されており（The Journal of Immunology, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122, 1992)、ＴＰ表面抗原タンパク質として、分子量が４７ｋｄのＴｐＮ４７；１５ｋｄのＴｐＮ１５；１７ｋｄのＴｐＮ１７が、代表的なＴＰ表面抗原タンパク質として知られており、その遺伝子の塩基配列ならびにアミノ酸配列も決定されている（Microbiological. Reviews, Vol.57,p.750-779; Infection and Immunity, Vol.61, p.1202-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol.162, p.1227-1237, 1992; Infection and Immunity, Vol.57, p.3708-3714, 1989）。
（３）遺伝子組換えＴＰ抗原
　＜遺伝子のクローニング＞
　遺伝子組換え大腸菌を用いて得られた、遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原、及び、遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原は既に知られており（特許文献１等）、その生産は遺伝子工学における常法によって行うことができる。すなわち、目的とするＴｐＮ４７遺伝子ないしＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子をクローニングし、得られたＴｐ抗原をコードするＤＮＡ配列をベクターに組み込んだ後、該ベクターを宿主である大腸菌に導入する。そして、該ベクターが導入されて形質転換がなされた大腸菌を培養して、該ベクターのＴｐ抗原をコードするＤＮＡ配列の発現を行うことにより、所望する上記２種類のＴＰ抗原を大量に得ることが可能である。さらに、これらの大腸菌由来の遺伝子組換えＴＰ抗原は、市販もなされている。しかしながら、上記したように、カイコ由来の遺伝子組換えＴＰ抗原については、本発明者の知る限り、非公知である。
　上記遺伝子のクローニングについては、大腸菌、カイコ（後述）等の遺伝子導入が予定されている宿主を問わずに、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法によって好適に行われる。また、必要に応じて遺伝子化学合成法を用いることができる。
　ＰＣＲ法を用いる場合は、ネイティブのＴＰ抗原遺伝子に、ＴｐＮ４７遺伝子のコーディング領域の両端を挟んだフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、該ＴＰ抗原領域を特異的に増幅させた遺伝子増幅産物として、所望するＴＰ抗原遺伝子断片を得ることができる。ネイティブのＴＰ抗原遺伝子は、ウサギ睾丸で培養した梅毒菌（Treponema pallidum, Nicols strain ）からジェノミックＤＮＡを抽出することにより得ることができる。
　リコンビナントＰＣＲ法は、ＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子、を得る場合に好適に用いることができる。すなわち、ＴｐＮ１５遺伝子と、ＴｐＮ１７遺伝子を、上記したＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法により、それぞれ別々に得て、一方のＤＮＡ断片のうち他方を結合させたい末端に、該他方のＤＮＡ断片の結合させたい側の末端近傍に対して相補的な配列を付加合成し、該末端付加を行った一方の遺伝子断片と、それに結合させたい他方の遺伝子断片、の両者を混合して、企図する融合遺伝子の両端に対して相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法による遺伝子増幅を行うことにより、所望するＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子断片を得ることができる。
　ここで、少なくともカイコに関して、ＰＣＲ法を用いてＴｐＮ４７遺伝子をクローニングする場合、及び、リコンビナントＰＣＲを用いてＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子をクローニングする場合に用いられる遺伝子増幅用プライマーの例示を行う。これらの例示は、公知のＰＣＲ法ないしリコンビナントＰＣＲ法の知見に、ＴＰ抗原の各配列を当て嵌めることにより容易に導かれる事項である。ここで例示する遺伝子増幅用プライマーに関して、塩基配列下線部分は、遺伝子の各末端配列である。各例示のように、３’末端の付加配列には、終止コドンが付加されていることが好適である。また、５’末端配列及び３’末端配列には、所定の制限酵素認識部位が設けられていることが好適である。例えば、５’末端にはＢａｍＨＩ認識配列の付加、３’末端配列にはＮｏｔＩ認識配列の付加が例示されるが、これらに限定されるものではない。組み込まれるベクター、例えば後述するバイナリ発現系における制限酵素部位等に応じて自由に選択することができる。
（ａ）ＰＣＲ法を用いて、ＴｐＮ４７遺伝子をクローニングする場合には、上記ＴＰジェノミックＤＮＡに対して、ＴｐＮ４７用プライマーとして、例えば；
４７Ｋプライマー１：
５’末端　 GATCC GGATCC GGCTCGTCTCATCATGAG（配列番号１）、
４７Ｋプライマー２：
３’末端　 TAGCC GCGGCCGC CTA AGACACACGGGATAGGAC（配列番号２）、
　が例示される。これらを用いて、ＴｐＮ４７遺伝子のクローニングを行うことができる。
（ｂ）リコンビナントＰＣＲ法を用いて、ＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子をクローニングする場合には、上記ＴＰジェノミックＤＮＡに対して、先ずＴｐＮ１７用プライマーとして、例えば；
１７Ｋプライマー１：
５’末端　GATCC GGATCC TGTGTCTCGTGCACAACC（配列番号３）、
１７Ｋプライマー２：
３’末端　TAGCCGCGGCCGCCTATTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC（配列番号４）、
　が例示される。これらを用いて、ＴｐＮ１７遺伝子のクローニングを行うことができる。
　次に、ＴｐＮ１５用プライマーとして、例えば；
１５Ｋプライマー１：
５’末端　GATCC GGATCCTGTTCATTTAGTTCTATC（配列番号５）
１５Ｋプライマー２：
３’末端　TAGCC GCGGCCGCCTACCTGCTAATAATGGCTT（配列番号６）
　が例示される。これらを用いて、ＴｐＮ１５遺伝子のクローニングを行うことができる。
　そして、上記のようにして得られた、ＴｐＮ１７遺伝子とＴｐＮ１５遺伝子を用いて、ＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子のクローニングを行うことができる。
　すなわち、これらの遺伝子断片と、フラグメント融合増幅に用いるプライマーを適宜共存させて、ＰＣＲ反応を行うことにより、所望のＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子のクローニングを行うことができる。具体例を示せば、例えば；
　第１に、１５Ｋフラグメント１用プライマーとして、配列番号５と下記配列番号７の増幅用プライマーのペア：
　配列番号５の５’末端の１５Ｋプライマー１と、
 １７Ｋ－５’末端＋１５Ｋ－３’末端プライマーとして、
　TGTGCACGAGACACACCTGCTAATAATGGCTTCCT（配列番号７）
を準備し、上記で得たＴｐＮ１５遺伝子を鋳型にしたＰＣＲ反応を行って、１５Ｋ接続フラグメントのクローニングを行い；
　第２に、１７Ｋフラグメント２用プライマーとして、下記配列番号８と配列番号４の増幅用プライマーのペア：
　５’末端　TGTGTCTCGTGCACAACCGT（配列番号８）と、
　配列番号４の３’末端の１７Ｋプライマー２
を準備し、上記で得たＴｐＮ１７遺伝子を鋳型にしたＰＣＲ反応を行って、１７Ｋ接続フラグメントのクローニングを行い；
　第３に、１５Ｋ－１７Ｋ増幅用プライマーとして、上記配列番号４と配列番号５の増幅用プライマーのペアを準備して、上記第１、第２で得た１５Ｋ接続フラグメントと１７Ｋ接続フラグメントを鋳型としたＰＣＲ反応を行う；
　ことにより、所望のＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合遺伝子のクローニングを行うことができる。
　得られたＴＰ抗原遺伝子断片の、プラスミドベクターへの組込は、ライゲーション法、リンカーライゲーション法等の常法を用いて行うことができる。
　＜遺伝子組換えカイコ＞
　遺伝子組換えカイコは、カイコをＴＰ抗原遺伝子で形質転換することにより得ることができる。カイコ(Bombyx mori)は、約５千年ともいわれる養蚕の歴史の中で、野生種のクワコ(Bombys mandarina)から飼い慣らされた種であり、品種改良が続けられた家畜昆虫である。カイコでは、形質転換法が既に提供されており、さらに全ゲノム情報も明らかにされている(Goldsmith,M.R. et al.,Annu.Rev.Entomol.,50:71-100,2005)。
　上記形質転換法としては、例えば、トランスポゾンを利用したベクター、バイナリ（二元）発現系等を用いる方法が代表的であるが、他に、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９等を用いて、ＴＰ抗原遺伝子のノックインを行うことで、形質転換を行うことも可能である。
　トランスポゾンを利用したベクターを用いる方法としては、トランスポゾンであるｐｉｇｇｙ　Ｂａｃを用いたプラスミドベクターが良く知られている。該プラスミドベクターは、上記トランスポゾンｐｉｇｇｙ　Ｂａｃの両末端に存在する２つの逆向きの反復配列を含んでおり、カイコの染色体中に組み込むべきＴＰ抗原遺伝子を該反復配列間に挿入する。これをトランスポゼース発現ヘルパープラスミドと共に、カイコの卵に微量注入すると、トランスポゼースの働きで上記反復配列間のＴＰ抗原遺伝子領域が転移するので、染色体中にＴＰ抗原遺伝子が組み込まれたカイコを得ることができる。ただし、ｐｉｇｇｙ　Ｂａｃを用いた場合は、カイコゲノム中の塩基配列ＴＴＡＡにほぼランダムにＴＰ抗原遺伝子が挿入されることと、挿入し得るＤＮＡ断片のサイズが、ほぼ２０ｋｂ以下に限定されること等の限界がある。
　バイナリ発現系としては、ＧＡＬ４／ＵＡＳ系、ＩＥ１／ｈｒ３系、Ｔｅｔ－Ｏｎ／Ｏｆｆ系等が挙げられる。これらのうち、ＧＡＬ４／ＵＡＳ系は、既にカイコにおいて用いられている(M.Imamura et al.,Genetics 165:1329-1340,2003：非特許文献５)。
　ＧＡＬ４／ＵＡＳ系では、基本プロモーター下にＧＡＬ４遺伝子を配置させたコンストラクト（トラップコンストラクト）を作成し、さまざまなゲノム領域に組込む。組込まれたトラップコンストラクトがあるエンハンサーの支配下にある場合、セリシン１プロモーター等の基本プロモーターが、そのエンハンサーをトラップして、酵母由来の転写活性因子であるＧＡＬ４が発現する。エンハンサーが、特定のカイコの細胞群でのみ活性を示す場合、ＧＡＬ４はその細胞群のみで発現する。上記のセリシン１プロモーターは、カイコの中部絹糸腺におけるセリシン１の発現において働く。セリシン１は、セリシン１－３の３種のセリシンのうち、最も分泌量の多いセリシン１である。そして、本発明の対象であるＴＰ抗原遺伝子がカイコの中部絹糸腺で発現し、ＴＰ抗原が繭糸のセリシン層に分泌されれば、セリシンは水溶性であることから、リン酸緩衝液等の水性溶媒で溶解可能であり、上記ＴＰ抗原の抽出が容易で、活性も損なわれにくい。このような理由から、上記のセリシン１プロモーターは、本発明にＧＡＬ４／ＵＡＳ系を適用させる場合において、最も好適に用いられる基本プロモーターである。ただし、セリシン１プロモーターに、目的遺伝子であるＴＰ抗原遺伝子を直接つないだ場合には、発現量が不十分なため、その発現を増強させるバイナリ発現系を用いることが好適となる。例えば、ＧＡＬ４の認識配列であるＵＡＳ（ｕｐｓｔｒｅａｍ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の下流に、ＴＰ抗原遺伝子を配置させたコンストラクトをゲノムに組込むと、発現したＧＡＬ４をＵＡＳが認識することにより活性化し、該ＴＰ抗原遺伝子が効率的に発現する。
　このようなＧＡＬ４／ＵＡＳ系を利用した遺伝子異所発現は、ＧＡＬ４トランスジェニック個体（ドライバー）である遺伝子組換えカイコと、ＵＡＳトランスジェニック個体（エフェクター）である遺伝子組換えカイコを交配させて得られる、二重トランスジェニック個体としてのカイコにおいて行うことができる。
　ＩＥ１／ｈｒ３系は、昆虫に感染するバキュロウイルスが持つＩＥ１トランスアクチベーターと、ｈｒ３エンハンサーが、宿主の昆虫の遺伝子の発現をコントロールする性質を利用して、目的遺伝子であるＴＰ抗原遺伝子の発現量を上昇させる系である。セリシン１プロモーターで発現させたＩＥ１が、ｈｒ３を活性化することにより、目的タンパク質であるＴＰ抗原タンパク質の発現量が増強される。
　Ｔｅｔ－Ｏｎ／Ｏｆｆ系では、大腸菌のテトラサイクリン制御活性化因子が、転写調節応答エレメント配列の下流につないだ導入遺伝子であるＴＰ抗原遺伝子の発現を活性化するが、テトラサイクリンやドキシサイクリンを与えると活性化因子に結合して阻害するため、これらの薬剤投与によりＴＡ抗原遺伝子の発現をオンオフできる。
　目的とする遺伝子、例えば、ＧＡＬ４遺伝子やＴＰ抗原遺伝子がカイコに導入され、発現されているか否かの確認は、ＧＡＬ４遺伝子やＴＰ抗原遺伝子等の導入を目的とする遺伝子の下流にマーカー遺伝子を導入することにより行うことができる。該マーカー遺伝子としては、蛍光タンパク質の遺伝子を用いることが好適である。蛍光タンパク質の遺伝子は、必要に応じて２種類以上の色彩の蛍光タンパク質の遺伝子を用いることができる。例えば、赤色蛍光タンパク質の遺伝子を一方（例えば、ドライバーカイコ）のマーカーとし、緑色蛍光タンパク質の遺伝子を他方（エフェクターカイコ）のマーカーとして用いると、交配により両者が導入されたカイコからは赤色と緑色が合わさった黄色蛍光が観察できるので、この黄色蛍光を指標として、ドライバー遺伝子とエフェクター遺伝子の両者が導入されたカイコを選抜することができる。
（４）本発明のＴＰ抗原混合物
　上記の通り、本発明のＴＰ抗原混合物は、４７－抗原と１５－１７抗原の混合物である。４７－抗原と１５－１７抗原の混合比は、４７－抗原：１５－１７抗原（質量比）が、４：６－６：４であることが好適である。本発明のＴＰ混合物は、水性溶媒中に溶解した状態の水性組成物の形態であってもよいし、凍結乾燥品等であってもよいし、固相に固定化された状態であってもよい。水性組成物における、本発明のＴＰ抗原混合物の濃度は、該混合物の使用目的に応じて自由に設定可能である。
（５）体液検体
　本発明の測定方法に供される体液検体は、梅毒罹患により、抗ＴＰ抗体が含まれ得る体液の検体であれば限定されない。例えば、血液検体、唾液検体、尿検体等が例示される。これらの中でも、特に血液検体が好適である。血液検体としては、全血検体、血清検体、血漿検体等が挙げられ、血清検体又は血漿検体がさらに好適である。必要に応じて抗凝固剤等の添加や、ＴＰ　Ｒｅｉｔｅｒ株の培養液加熱上清で非特異抗体の吸収処理を行って得られる血清も許容される。また、適宜生理食塩水や緩衝液による希釈も行われる。
（６）免疫学的測定方法
　本発明の測定方法において行われる免疫学的測定方法は、体液検体中の抗ＴＰ抗体と、本発明のＴＰ抗原混合物の間の抗原抗体反応によって、該体液検体中の抗ＴＰ抗体を測定できる手段であれば限定されない。その限りにおいて、酵素免疫測定法、免疫比濁法、放射性免疫測定法、ラテックス凝集法若しくは比濁法（以下、ラテックス凝集法・比濁法と記載する）、血球若しくは粒子凝集法（以下、血球・粒子凝集法と記載する）、イムノクロマトグラフィー法等を用いることができる。
　酵素免疫測定法としては、例えば、ＥＩＡ（酵素免疫測定法：Enzyme Immunoassay）、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＦＥＩＡ（蛍光酵素免疫測定法：Fluorescence Enzyme Immunoassay）、ＣＬＥＩＡ（ＣＬＩＡ）（化学発光・酵素免疫測定法：Chemiluminescent Enzyme Immunoassay）、ＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法：Chemiluminescent Immunoassay）等が挙げられる。なお、略語ＣＬＩＡは、ＣＬＥＩＡの意味で用いられる場合が多い。
　免疫比濁法としては、例えば、ネフェロメトリー（Nephelometry）、ＩＡ（免疫比濁法：Turbidimetric Immunoassay）等が挙げられる。
　放射性免疫測定法としては、例えば、ＲＩＡ（放射性免疫測定法：Radio Immunoassay）、ＣＰＢＡ（競合性蛋白結合分析法：Competitive Protein Binding Assay）等が挙げられる。
　ラテックス凝集法・比濁法としては、例えば、ＬＡ（ラテックス凝集反応：Latex Agglutination）、ＬＡ（ラテックス凝集比濁法：Latex Agglutination Turbidimetric Immunoassay）、ＬＰＩＡ（ラテックス近赤外比濁法：Latex Photometric Immunoassay）、ＫＩＭＳ（マイクロパーティクル比濁法：Kinetic Interaction of Microparticles）、金コロイド免疫測定法（Colloidal Gold Immunoassay）等が挙げられる。
　血球・粒子凝集法としては、例えば、ＰＡ（粒子凝集反応：Particle Agglutination）、ＰＨＡ（受身赤血球凝集反応：Passive Hemagglutination）等が挙げられる。
　本発明の測定方法においては、具体的には、上記の各免疫学的測定方法における、体液検体中の抗ＴＰ抗体を捕捉するためのＴＰ抗原として、本発明のＴＰ抗原混合物を適用する。該適用の具体的な形態は、適用する測定方法に応じて自由に選択が可能である。
　本発明の測定方法において、酵素免疫測定法を行う場合、例えば、ＥＬＩＳＡでは、固相として用いられる９６ウェルプレートのウェルに、ＴＰ抗原混合物を定着させて、これに体液検体を接触させて、体液検体中の抗ＴＰ抗体を、ウェルに定着されているＴＰ抗原混合物に該抗体を結合させる工程を行い、その後、所定の酵素標識が付加された抗ヒト抗体を、ウェル上の体液検体中の抗ＴＰ抗体が結合したＴＰ抗原混合物に接触させて、上記酵素標識から得られる発色シグナルによって、体液検体中の抗ＴＰ抗体を測定することができる。他の酵素免疫測定法においても、それぞれの測定法に応じた固相、例えば、所定の粒子等を固相として、本発明のＴＰ抗原混合物を定着させ、体液検体中の抗ＴＰ抗体を接触させ、測定方法の種類に応じた標識を行った抗ヒト抗体を、上記固相に定着している抗ＴＰ抗体が結合したＴＰ抗原混合物、に結合させて、上記所定の標識、例えば、蛍光基質（ＦＥＩＡ）、化学発光基質（ＣＬＥＩＡ又はＣＬＩＡ）等によるシグナルによって、体液検体中の抗ＴＰ抗体を測定することができる。
　免疫比濁法を用いる場合には、液相において、体液検体と本発明のＴＰ抗原混合物を接触させて、該液相に対して、光の錯乱強度（ネフェロメトリー）や透過率（ＩＡ）を測定することで、体液検体中の抗ＴＰ抗原を測定することができる。
　放射性免疫測定法を用いる場合には、例えば、ＲＩＡにおいては、一定量の本発明のＴＰ抗原混合物に対して、ＲＩ標識した抗体と体液検体中の抗ＴＰ抗体との競合的抗原抗体反応を行い、抗原と結合した標識抗体（結合型：Bound）と抗原と結合していない標識抗体（遊離型：Free）を分離し、その割合を放射活性から抗ＴＰ抗体の濃度として測定することができる。抗原抗体複合体を第２抗体で沈澱させる２抗体法、硫酸アンモニウム（硫安）で沈澱させる硫安塩析法、ＰＥＧ沈澱させる方法がある。ＣＰＢＡ法では、ＲＩ標識した抗体と、固相に定着された本発明のＴＰ抗原混合物との反応に対して、ＲＩを標識していない体液検体中の抗ＴＰ抗体を競合反応させた後、結合抗体と遊離抗体を分離してその放射能を測定することができる。
　ラテックス凝集法・比濁法を用いる場合には、例えば、ラテックス凝集反応は、本発明のＴＰ抗原混合物を、固相であるラテックス粒子に感作させて、該感作ラテックス粒子と体液検体中の抗ＴＰ抗体と抗原抗体反応を行い、抗原抗体反応による凝集の有無により体液検体中の抗ＴＰ抗体の存在を判定する方法である。主にスライドガラス上で反応させて、その白濁状態を観測する。ラテックス凝集比濁法は、上記のラテックス凝集反応における、感作ラテックスの凝集に伴う反応液の濁度変化に基づいて、体液検体中の抗ＴＰ抗原を測定する方法であり、自動化がなされている。ラテックス近赤外比濁法は、上記のラテックス凝集反応における、感作ラテックスの凝集に伴う反応液の濁度を、近赤外光を照射して、透過率に基づいて、体液検体中の抗ＴＰ抗原を測定する方法である。マイクロパーティクル比濁法は、本発明のＴＰ抗原混合物を結合させたマイクロパーティクルを固相として用いて、体液検体中の抗ＴＰ抗体との抗原抗体反応を行ない、該抗原抗体反応による凝集の濁度を透過率から測定して、体液検体中の抗ＴＰ抗原を測定する方法である。金コロイド免疫測定法は、本発明のＴＰ抗原混合物との抗原抗体反応により捕捉した体液検体中の抗ＴＰ抗体に、さらに金コロイド標識したＴＰ抗原を反応させ、金コロイドの呈色により体液検体中の抗ＴＰ抗原の存在を判定する方法である。イムノクロマト法においてもこの原理が用いられることがある。
　血球・粒子凝集法を用いる場合には、例えば、粒子凝集反応は、本発明のＴＰ抗原混合物を吸着（結合）させたゼラチン粒子等を固相として、体液検体中の抗ＴＰ抗原と該感作粒子との抗原抗体反応を行ない、該反応による凝集の有無により、体液検体中の抗ＴＰ抗体の存在を判定する方法である。受身赤血球凝集反応は、赤血球の表面に、本発明のＴＰ抗原混合物を固定させた感作赤血球を用いて、体液検体中の抗ＴＰ抗体を反応させ、抗原抗体反応による凝集の有無により、体液検体中の抗ＴＰ抗体の存在を判定する方法である。
　イムノクロマトグラフィー法は、液体をニトロセルロース膜等に滴下すると毛細管現象により膜上を移動する性質を利用した免疫学的測定法である。まず体液検体と標識を行った、本発明のＴＰ抗原混合物を接触させて、標識付きの抗原抗体複合体を形成させ、該抗原抗体複合体が膜を移動する過程で、下流に固相化したＴＰ抗原によって該抗原抗体複合体を捕捉し、標識の有無で、体液検体中の抗ＴＰ抗原の有無を判断することができる。臨床現場即時検査（ＰＯＣＴ）のツールとしても用いられている。詳しくは、後述する。
　本発明は、ＴＰ抗原混合物の、固相における定着物が用いられる態様の上記測定方法を提供する。固相における定着物とは、上述したＴＰ抗原混合物が定着しているチューブ、カラム等；９６ウェルプレート等の多穴プレート；ラテックス粒子、ゼラチン粒子、マイクロパーティクル等の粒子；等である。本発明は、これらの定着物（以下、本発明の固相ともいう）も提供する。
　さらに本発明は、ＴＰ抗原混合物の固相化領域が設けられており、
　該固相化領域と体液検体との接触により形成され、水相により媒介される毛細管現象により連続相中を移動する、上記抗原の混合物と体液検体中の抗ＴＰ抗体の複合体を検出する領域が、上記固相化領域の下流に設けられている、
　梅毒トレポネーマ測定用イムノクロマトデバイス（以下、本発明のデバイスともいう）を提供する。
（７）データの提供方法など
　本発明の測定方法は、例えば、本発明のＴＰ抗原混合物、と体液検体を接触させ、該体液検体中の抗ＴＰ抗体を、上記ＴＰ抗原混合物との結合をシグナルとして測定し、該シグナルを検体提供者の梅毒罹患のデータとして取得するデータの取得方法、とも表現され得るものである。
　また、本発明は、本発明の固相を要素として含む、本発明の測定方法を行うためのキット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。本発明のキットには、その他、具体的な免疫学的測定方法に応じた、測定に際して用いられる希釈液、標識第２抗体、標識顕在化試薬等を、自由にキット要素として含ませることが可能である。
　本発明により、測定感度が実用レベルで明らかに従来品よりも向上した、体液検体中の抗ＴＰ抗体の測定手段が提供される。
本発明の測定方法を、イムノクロマト法により行う場合のデバイスの一例を示した図面である。 本発明の測定方法を、イムノクロマト法により行う場合の測定原理の一例を示した図面である。 本発明の測定方法を、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法により行う場合の測定原理を示した図面である。
　本発明の実施の形態を、図面を用いて説明する。
　図１は、本発明の測定方法を、イムノクロマト法により行う場合のデバイスの一例を示した図面である。イムノクロマトデバイス１０（以下、デバイス１０）は、パッキングシート５の上に、水分吸収相１、移動相２、検体滴下・反応相３が固定されて構成されており、水分吸収相１、移動相２及び検体滴下・反応相３は、互いに水分が流通可能な形態で接触している。移動相２には、発色エリア２１が設けられている。体液検体を検体滴下・反応相３に滴下すると、検体中の抗ＴＰ抗体は、検体滴下・反応相３に含まれているＴＰ抗原混合物と反応し、抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原複合体の結合物を形成する。この結合物は、３→２→１の方向で毛細管現象により移動し、抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原複合体の捕捉手段とシグナル発色手段が設けられた発色エリア２１において捕捉され、所定の発色が惹起される。上記毛細管現象による移動を促進するために、別途展開液が、検体滴下・反応相３に直接、又は、その上流から添加されてもよい。フリーのＴＰ抗原や展開液は、水分吸収相１においてトラップされる。水分吸収相１は、該トラップ機能の他、毛細管現象の整流作用も担っており、コットンや濾紙等の吸水力の強い素材が好適である。上記の所定の発色が、体液検体中に抗ＴＰ抗体が存在するシグナルとなる。発色すれば、体液検体中に抗ＴＰ抗体が存在し（陽性）、発色しなければ該抗ＴＰ抗体は存在しない（陰性）が判明する。
　図２は、デバイス１０を用いる測定原理の一例を示した図面である。デバイス１０における基本的な反応原理は、体液検体中の抗ＴＰ抗体と、本発明のＴＰ抗原混合物との抗原抗体反応である。図２に示した検体滴下・反応相３には、粒子６１に対して「１５－１７抗原５２と４７抗原５３との混合物であるＴＰ抗原混合物５０」が感作された感作粒子４１、が、水分で媒介される毛細管現象により移動可能な状態で付着している。粒子６１としては、例えば、色付きラテックス粒子、蛍光粒子、金コロイド等の金属コロイド粒子等が挙げられる。また、粒子６１を用いずに、例えば、ＴＰ抗原混合物５０に直接、発色酵素等の標識を担持させたものを用いることも可能である。上記金属コロイドとしては、金コロイド以外に、銀コロイド、セレニウムコロイド等の異なる金属のコロイドを用いることも可能である。また、発色酵素等の標識は、発色エリア２１において該発色酵素に対する基質等の標識顕在化試薬を反応させることにより、所定のシグナルを発生させる。該標識顕在化試薬は、別途発色エリア２１に向けて滴下することも可能であるが、例えば、予め該顕在化試薬を発色エリア２１に付着させて、毛細管現象により移動した水分の介在により、自動的にシグナルの発生が惹起される機構を、発色エリア２１において設けることが好適である。
　抗ＴＰ抗体５１が含有され得る体液検体としては、上述した通り、血液検体が好適である。血液検体としては、全血検体、血清検体、血漿検体等が挙げられ、血清検体又は血漿検体が好適である。体液検体中の抗ＴＰ抗体５１は、被験者がＴＰに感染することによる、液性免疫反応として生成される抗体であるから、体液検体中の抗ＴＰ抗体５１の存在は、被験者の梅毒罹患に関するシグナル、すなわち、被験者が梅毒に罹患している、又は、少なくとも罹患していたことのシグナルとなる。
　検体滴下・反応相３の素材は、感作抗原４１等を、乾燥時に付着させることが可能であり、かつ、体液検体、展開液等による液相中では、ＴＰ抗原混合物中のＴＰ抗原、又は、抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原複合体が解離する素材であれば限定されない。例えば、グラスファイバー、コットン、濾紙等が例示される。また、検体滴下相（図示せず）と反応相が別途設けられていても良い。この場合、検体滴下相は、感作粒子４１等が付着している反応相の上流に配置される。上記のように、添加されることがある展開液は、抗原抗体反応を阻害せず、デバイス１０における毛細管現象で３→２→１の進行が可能である限り限定されず、各種の水性溶媒、例えば、水、緩衝液、生理食塩液等が例示される。
　デバイス１０においては、先ず、検体滴下・反応相３に付着している感作粒子４１表面に感作されているＴＰ抗原混合物５０（多数の１５－１７抗原５２と多数の４７抗原５３で構成されている）に、体液検体中の抗ＴＰ抗体５１が接触して（図２（１））、抗原抗体反応により、抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原複合体を担持した粒子４２（複合体担持粒子４２）が形成される（図２（２））。
　移動相２は、水分で媒介される毛細管現象により、ＴＰ抗原混合物中のＴＰ抗原、又は、複合体担持粒子４２、が移動し得る素材であり、発色エリア２１を設けることが可能な素材であれば特に限定されず、例えば、ニトロセルロースメンブレン、セルロースナノファイバー、グラスファイバー、シリカゲル等が挙げられる。毛細管現象により、発色エリア２１に到達した複合体担持粒子４２は、発色エリア２１において捕捉される。捕捉手段は、発色手段と一体となっている。具体的には、発色エリア２１は、ライン状にＴＰ抗原が固定化されている。該固定化は、水分によって移動・拡散しない強固な固定化である必要がある。また、発色エリア２１において固定化されたＴＰ抗原は、ＴＰ抗原混合物５０であることが好適であるが、他のＴＰ抗原、例えばネイティブのＴＰ抗原であっても、異なる宿主において形質転換されたＴＰ抗原であってもよい。また、ライン状以外の形状、例えば、点状、円状等の任意のデザインであってもよく、全く限定されない。毛細管現象によって移動してきた複合体担持粒子４２は、かかる発色エリア２１において固定化されたＴＰ抗原と、該複合体担持粒子４２上の抗ＴＰ抗原５１との抗原抗体反応による結合により捕捉され、「固定化ＴＰ抗原－抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原」というサンドイッチ複合体の結合物４３を形成する（図２（３））。
　かかるサンドイッチ複合体４３が、企図された作用で発色エリア２１において発色することにより顕在化し、これにより、体液検体中の抗ＴＰ抗体の存在の測定が行われる。例えば、着色ラテックス等の着色粒子や金コロイドであれば、発色エリア２１において上記サンドイッチ複合体４３が形成されることにより、ラテックスの着色や金コロイドの赤色が視覚的に顕在化する。また、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ等の発色酵素であれば、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸二ナトリウム塩、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩）等の発色基質との接触によって、視覚的に顕在化する。上記のように、このデバイス１０の方式により、抗ＴＰ抗体が陽性であれば、検体提供者は梅毒に罹患している、又は、罹患していた可能性が高くなり、陰性であれば、梅毒には感染していないか、又は、様子見状態であることを示している。梅毒は、長期間における経過観察が必要であるため、高感度で手軽に用いることができるデバイス１０を用いて経時的にモニタリングすることにより、梅毒の確定診断のためのデータを、信頼性を伴って得ることが可能である。
　図３は、本発明の測定方法を、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法により行う場合の測定原理を示した図面である。図３において、固相６２は、その内壁において、本発明の測定方法に係わる抗原抗体反応を行う構造になっている。例えば、９６ウェルプレート等の多穴プレートのウェルが典型的であるが、これに限定されるものではなく、あくまでも例示であり、他の態様、例えば、カラム表面、粒子、チューブ等であってもよい。いずれにしても、固相６２において定着されているＴＰ抗原混合物５０に対して、体液検体中の抗ＴＰ抗体５１を接触させて抗原抗体反応を行うのが第１ステップである（図３（１））。
　この第１ステップにより形成された、固相定着ＴＰ混合物５０－抗ＴＰ抗体５１の複合体５０１に対して、さらに、抗ＴＰ抗体５１に対する抗ヒト抗体に発色酵素等の標識物質を担持した第２抗体５４を接触させるのが、第２ステップである（図３（２））。
　この第２ステップにより形成された、固相定着ＴＰ混合物５０－抗ＴＰ抗体５１の複合体５０１－第２抗体からなるサンドイッチ複合体５０２に対して、反応基質等の標識顕在化試薬５５を作用させて発色させる発色工程が、第３ステップである（図３（３））。
　この第３ステップによる発色等のシグナル５６を測定することにより、体液検体中の抗ＴＰ抗体５１の測定を行うことができる。図３（４）に示すように、シグナル強度と抗ＴＰ抗体量を関連付けた検量線を用いることにより、定性のみならず定量を行うことが可能である。
　以下、本発明にかかわる試験例ないし実施例を開示する。
［製造例１］　組換えＴＰ抗原の精製
　リムコ株式会社（沖縄県うるま市）からオンデマンド注文を行って購入した、４７組換えカイコと、１５－１７組換えカイコが、それぞれ産生した１００個ほどの繭を用いて、カイコ遺伝子組換えＴＰ抗原の抽出と精製を行った。これらの繭は、ハサミで５ｍｍほどの大きさに切断し、ＰＢＳ－１％Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００に浸潤し、一昼夜４℃下でスターラー攪拌した。次に、ろ紙（ワットマン社）で不溶物を濾別し、抽出液を得た。抽出液は遠心濃縮器（サルトリウス社　ビバスピン２０）にて濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００ＨＲ　ＸＫ５０／６０（ＧＥ社）カラム、トリス塩酸緩衝液にてゲルろ過した。抗原分画は遠心濃縮器で濃縮し、精製組換え抗原とした。表１に精製結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［参考例１］　ＥＬＩＳＡによる反応性比較
　９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）の各ウェルに、ネイティブ抗原、及び、組換えカイコ抗原（ＴｐＮ４７，ＴｐＮ１５－１７）それぞれを、１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、５μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ウェルで分注し、一晩４℃に放置することにより各ウェル壁を感作した。感作後、１％ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で３７℃２時間ブロッキング後、洗浄、乾燥し、各抗原の感作ＥＬＩＳＡプレートとした。
　各ウェルに、種々の濃度の抗ＴＰ抗体標準液（積水メディカル）を５０μＬ分注し、室温で６０分インキュベートした。０．０５％トリトンＸ１００－１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ加え、室温で１．５時間インキュベートした。０．０５％トリトンＸ１００－１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、過酸化水素水とＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）の混合溶液を５０μＬ加えて３分間発色させた。反応を停止した後、分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１］　イムノクロマト法テストデバイスによる試験
（１）テストデバイスの作製
　図１に示すイムノクロマトデバイスを作製した。
　組換えカイコＴｐＮ４７抗原および組換えカイコＴｐＮ１５－１７抗原を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝液溶液として、等容量混合して、混合抗原原液を調製した。混合抗原混合原液中の各抗原濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌである。この混合抗原混合原液１容を、赤色ラテックス粒子（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、同じくリン酸緩衝液に懸濁したラテックス懸濁液９容に加えて、４℃で５時間転倒混和した。１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキング処理し、混合抗原感作ラテックス粒子含有液を得た。
　小片に裁断されたグラスファイバーシート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ）に、上記の抗原感作ラテックス粒子懸濁液を均一に塗布し、減圧乾燥装置に入れ２０時間減圧乾燥して、図１のデバイス１０における検体滴下・反応相３に相当するコンジュゲートパッドを作製した（以下、コンジュゲートパッドという）。図１の移動相２該当する、イムノクロマト用ニトロセルロースメンブレン（ＩＭＭＵＮＯＰＯＲＥ）の上に、上記の組換え抗原混合物溶液を点着機（ＢＩＯＤＯＴ　ＸＹＺ３０５０）を用いて塗布し、発色エリア２１に相当する線状の発色ラインを設けた（以下、ライン塗布メンブレンという）。図１の水分吸収相としては、濾紙（ワットマン製）を用いた。適切な幅、長さに切断したコンジュゲートパッド、塗布メンブレン、濾紙を、図１の如く組み合わせて測定用のテストデバイスを作製した（以下、本品と称する）。
　体液検体を、コンジュゲートパッドに滴下すると、体液検体中の抗ＴＰ抗体は、コンジュゲートパッドに含まれるＴＰ抗原感作赤色ラテックスビーズと反応し、抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原感作ラテックスビーズの複合体を形成する。この複合体は、移動相であるライン塗布メンブレン上を移動して、下流側に固相化された線状の発色ラインとして固相化されたＴＰ抗原と結合し、固相化ＴＰ抗原－抗ＴＰ抗体－ＴＰ抗原感作赤色ラテックスビーズのサンドイッチタイプの複合体を形成する。なお、上記メンブレン上の移動に際して、展開液はあっても無くてもよい。これにより顕在化するラテックスビーズの赤色のラインの有無により、検体提供者の梅毒罹患に関するシグナルが陽性か否かを判定することができる。赤色ラインが現れた場合は、梅毒シグナル陽性である。
（２）組換えカイコ抗原を用いたテストデバイスの市販検査試薬との比較
　本試験は、ヒト血清を体液検体として用いた。また、上記複合体のメンブレン移動用の展開液は用いていない。抗ＴＰ抗体の濃度が１８．７５ｍＩＵ／ｍＬの血清を、抗ＴＰ抗体陰性の健常人血清で２倍希釈系列を作製した。この希釈血清をセロディアＴＰＰＡ（富士レビオ）と、上記のように赤色ラテックスビーズに感作させた組換えカイコ抗原を用いた、上記のテストデバイス（本品）で測定した。セロディアＴＰＰＡは添付文書の処方に従い、また、本品は血清１００μＬを、コンジュゲートパッドに滴下し、メンブレンに展開し、１５分後に赤色ラインの出現の有無で陰陽を判定した。結果を表３に示す。表３において、「＋」は陽性、「－」は陰性、「±」は判定保留を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　セロディアＴＰＰＡは３２倍希釈（９．３８ｍＩＵ／ｍＬ）で保留判定となったが、本品では１２８倍希釈（２．３４ｍＩＵ／ｍＬ）まで陽性判定であった。このように、明らかに本品の感度が高いことが示された。抗ＴＰ抗体測定の標準法であるセロディアＴＰＰＡはネイティブ抗原を使用しているが、それにもかかわらず組換えカイコ由来のＴＰ抗原混合物の優位性が認められた。
（３）梅毒セロコンバージョンパネル測定による市販検査試薬との比較
　上述したように、梅毒は潜伏性を伴うので、検査試薬の性能を実用レベルで確かめるためには経時的な効果の検討が必要であり、セロコンバージョンパネルによる試験が適合する。ＴＰ感染後、体液抗体の産生は一度に起こるのではなく、少量から徐々に増加する。従って、感度の高い試薬は、より少量の体液抗体から測定できるので、ＴＰ感染後、より早い段階から、ＴＰ感染の診断に寄与することが可能となる。かかる観点からの試薬の性能を、セロコンバージョンパネルを用いることにより検討することが可能である。これは言い換えれば、実用レベルの試薬性能の検討と位置付けられる。
　市販されているセロコンバージョンパネル（ＰＳＳ９０１／ＳｅｒａＣａｒｅ）を、イムノクロマトデバイスを含む試薬であるエスプラインＴＰＡｂ（富士レビオ）と、上記のセロディアＴＰＰＡおよび本品で測定した。エスプラインＴＰＡｂは大腸菌組換え抗原を使用し、ＴｐＮ１５－１７およびＴｐＮ４７それぞれに個別に判定する事ができる測定デバイスを含む試薬であり、添付文書の処方に従い実施した。本品は、上記（２）と同様の操作で行った。結果は、表４に示した。表４における「＋」「－」「±」の意義は、表３と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　エスプラインＴＰＡｂのＴｐ１５－１７は４５日目で保留判定、４８日目で陽性、ＴｐＮ４７は５２日目で陽性と判定された。また、セロディアＴＰＰＡでは４５日目に陽性となった。一方、本品は３１日目に陽性判定となり、他の２法に比べ明らかに早期に抗ＴＰ抗体を捕捉できた。一般的に感染後３０日ほど経過すると血中にＩｇＭが出現し、４５日ほど過ぎるとＩｇＧが出現すると言われているが、本品はＩｇＭとも反応したと考えられる。抗ＴＰ抗体測定における組換えカイコ抗原の使用は、ＩｇＭの捕捉が難しいと言われているにもかかわらず、本発明のＴＰ抗原混合物を用いた本品においては可能であることが示された。
［実施例２］　ＥＬＩＳＡ法による試験
　９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）の各ウェルに、ネイティブ抗原（常盤化学）、及び、上記実施例１（１）にて調製したカイコ由来の組換抗原（ＴｐＮ４７，ＴｐＮ１５－１７）の混合物（ＴＰ抗原混合物）原液、それぞれを１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、５μｇ／ｍＬの濃度で、１００μＬ／ウェルで分注し一晩４℃に放置することにより感作した。感作後１％ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で、３７℃２時間ブロッキング後、洗浄、乾燥し、各抗原の感作ＥＬＩＳＡプレートとした。
　各ウェルに種々の濃度の抗ＴＰ抗体標準液（積水メディカル）を５０μＬ分注し、室温で６０分インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ加え、室温１．５時間インキュベートした。洗浄後、過酸化水素水とＴＭＢ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）の混合溶液を５０μＬ加えて、３分間発色させた。硫酸溶液で反応を停止させた後、分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　この結果より、本発明のＴＰ抗原混合物を用いた場合、ＥＬＩＳＡにおいても、ネイティブ抗原と比べて、極めて高感度に体液検体中の抗ＴＰ抗体を測定できることが明らかになった。
　そして実施例１と実施例２の結果より、イムノクロマトグラフィー法やＥＬＩＳＡ法をはじめとする免疫学的測定方法を用いた、体液検体における抗ＴＰ抗体の測定に用いることにより、梅毒のより早期の診断への寄与が可能となることが明らかになった。
１：水分吸収相
２：移動相
２１：発色エリア
３：検体滴下・反応相
１０：イムノクロマトデバイス
４１：感作粒子
４２：複合体担持粒子
４３，５０２：サンドイッチ複合体
５０：ＴＰ抗原混合物
５０１：固相定着ＴＰ混合物－抗ＴＰ抗体の複合体
５１：抗ＴＰ抗体
５２：１５－１７抗原
５３：４７抗原
５４：第２抗体
５５：標識顕在化試薬
５６：シグナル
６１：粒子
６２：固相

Claims (6)

  1. 　梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、ＴｐＮ４７遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原、及び、同ＴｐＮ１５遺伝子とＴｐＮ１７遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原、の混合物を、体液検体と接触させて、該体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を、上記抗原の混合物との結合シグナルとして免疫学的測定方法により測定する、体液抗体の測定方法。
  2. 　体液検体は、血液検体である、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　免疫学的測定方法は、酵素免疫測定法、免疫比濁法、放射性免疫測定法、ラテックス凝集若しくは比濁法、血球若しくは粒子凝集法、又は、イムノクロマトグラフィー法である、請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 　前記遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原、及び、遺伝子組換えＴＰＮ１５－ＴＰＮ１７融合抗原の混合物の、固相における定着物が用いられる、請求項１－３のいずれか１項に記載の測定方法。
  5. 　梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、ＴｐＮ４７遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原、及び、同ＴｐＮ１５遺伝子とＴｐＮ１７遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原、の混合物が固相において定着している、体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる、抗原が定着した固相。
  6. 　梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、ＴｐＮ４７遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ４７抗原、及び、同ＴｐＮ１５遺伝子とＴｐＮ１７遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えＴｐＮ１５－ＴｐＮ１７融合抗原、の混合物、の固相化領域が設けられており、
    　該固相化領域と体液検体との接触により形成され、水相により媒介される毛細管現象により連続相中を移動する、上記抗原の混合物と体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の複合体を検出する領域が、上記固相化領域の下流に設けられている、
    　梅毒トレポネーマ測定用イムノクロマトデバイス。
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