JPS62238462A - 高感度抗体測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原特異抗体の高感度測定方法に関する。

〔従来の技術〕

体液中の抗原特異抗体の測定は臨床検査上大変重要であ
る。すなわち、感染症の抗体検査、自己抗体の検査等に
広く用いられている。この分野の従来測定法は大きく２
つの技術に分けることができる。第１の技術はラジオア
イソトープで標識された抗原を抗原特異抗体を含む検体
と反応させ、生じた免疫複合体を沈殿剤を用いて沈殿さ
せ、この沈殿物中の放射能活性を測定する方法である。

また、第２の技術は、抗原を固相担体に固定化し、これ
に抗原特異抗体を含む検体を反応させ、更にラジオアイ
ソトープ又は酵素等で標識された抗イムノグロブリン抗
体を反応させ、抗原特異抗体を測定する方法である。第
１の技術の例としては、抗インスリン抗体の測定におけ
る、バルマー（ｐａｌｍａｒ　）　　とアスプリン（ム
θｐａｉｎ　）　　のラジオアイソトープ標識したイン
スリンを用いたポリ巴チレングリコール沈殿法がある［
サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　第２２２巻第１３３
７頁（１９８３）］。また、抗ＤＭＡ抗体の測定におけ
るＲ、　Ｂ、　７アー（Ｒ，Ｓ。

？ａｒｒ　）　　らのラジオアイソトープ標識したＤＩ
４Ａを用いた硫酸アンモニウム沈殿法がある〔サイエン
ス（５ｃｉｅｎｃｅ　）第１６１巻第８０６員（１９６
８）］。一方、第２の技術の例としては、抗インスリン
抗体の測定におけるり、　、ｌｒ、ネル（Ｉ、、　、Ｔ
、　Ｎ８１１）　　ら〔ダイアビーチス（Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ）第３４巻第６０頁（１９８５））のポリエチレン
製９６穴プレートにインスリンを固定化し、これに検体
を加え、結合したヒトイムノグロブリンを酵素標識した
抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いて、酵素免疫測定法
によシ定量する方法がある。また、抗ＤＭＡ抗体の測定
におけるＲ、ヨコハリ（Ｒ，Ｙｏｋｏｈａｒｉ　）　　
ら〔ジャーナルオプ　イムノロジカル　メソツズ（Ｊ、
工ｍｍｕｎｏ１゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　）第３８巻第１４９
頁（１９７９）］のＩ）ＭＡ固定化マイクロタイターブ
レートド酵素標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた
方法がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、第１の技術はラジオアイソトープを用い
る方法であシ、安全性、設備面、試薬の有効期間の面で
問題があった。また、第２の技術では、検体中に抗原非
特異抗体が多量に含まれており、これが面相に非特異的
に吸着するため、バックグランドが高くなり結果として
測定感度が悪くなるという欠点があった。

本発明の目的は、前記の事情にかんがみて、従来法に比
べて、簡便かつ高感度な抗原特異抗体の測定方法を提供
することにある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明は抗体の測定方法に関する
発明であって、下記の工程（４）、０３）、（Ｃ）及び
（９） （Ａ）　　抗体を含有する被検液に該抗体の抗原を添加
し抗原−抗体複合体を形成させる工程＠）＃被検液より
該抗原−抗体複合体を分離する工程 （（１）　　該抗原−抗体複合体よシ抗原を解離させる
工程 （ロ）解離させた該抗原を免疫測定法にて測定する工程 を包含することを特徴とする。

本発明者は、抗体を含む検体に抗原を反応させ、抗原−
抗体複合体を形成させた後、該抗原−抗体複合体を分離
し、この複合体中の抗原を解離剤により解離させ、この
抗原量を従来よく知られた免疫学的測定法、中でもサン
ドイッチ酵素免疫測定法により測定することにより検体
中の抗原特異抗体を従来法よシはるかに高感度に測定で
きることを見出し、本発明を完成した。

本発明方法によシ測定可能な被検液の例としては、血清
、血漿、髄液、唾液、尿等の体液が挙げられる。

本発明方法に用いる抗原としては、測定したい抗原特異
抗体に特異的に結合し、かつ本発明による工程中、解離
剤の処理により抗原性に変化を受けない抗原が使用され
る。その例としては、例えば抗インスリン抗体の測定に
おいては抗原としてヒト、豚、牛由来及び化学修飾され
たインスリン、更には遺伝子操作により作られたインス
リンが用いられる。

また、本発明方法における抗原−抗体複合体の分離方法
（工程Ｂ）としては、ポリエチレンクリコール、硫酸ア
ンモニウム等による沈殿方法が用いられるが、該沈殿方
法によシ遊離の抗原が分離できない場合は、分離方法と
して固相化した抗イムノグロブリン抗体又は抗イムノグ
ロブリン抗体そのものが使用でき、抗原性に変化を与え
ることなく抗原−抗体複合体を分離することが可能であ
る。

なお、上記抗原−抗体複合体の分離工程に先立ち被検液
中に存在する遊離の抗原を被検液よシ除去することが好
ましい。この際には例えばデキストラン−チャコール粒
子による吸着除去方法が用いられる。

本発明の抗原−抗体複合体よりの抗原の解離方法（工程
Ｏ）は公知の方法、例えば酸、ヨードカリ、塩化マグネ
シウム処理が用いられる。

本発明においてはこれらの方法のうち特に酸処理が好ま
しく、解離した抗体が失活するｐＨｆ前後の強い酸処理
が望ましい。すなわち一本発明方法の解離工程で解離し
た他方の抗体は、次の工程りにおいては失活していなけ
ればならないが、上記の解離処理によれば、同時に抗体
も失活するからである。したがって、本発明方法におい
ては、必要に応じて、解離と抗体の失活とを別工程で行
ってもよい。

本発明に用いる解離した抗原の測定法としては従来よく
知られた種々の免疫学的測定法が用いられるが、中でも
サンドイッチ酵素免疫測定法が適しており、例えばイン
スリンの測定法としてに−ｈルアン（Ｋ　−ｈ　Ｒｕａ
ｎ　）　　ら〔クリニカ　キミカ　アクタ（Ｃ１１ｎ、
　Ｃｈｉｎ、　Ａｃｔａ、　）　　第１４７巻第１６７
頁（１９８５）〕の方法が挙げられる。用いられる抗体
としては抗原を動物に常法により免疫して得られる抗血
清より精製されたＩｇＧ画分、又は一般によく知られた
方法により作製されたモノクローナル抗体が適している
。

本発明による高感度抗体測定方法を以下詳細に説明する
。

まず、被検液に過剰量の抗原を添加し、約６７℃で数時
間、好ましくは約３時間インキュベートする。この後、
遊離の抗原の吸着剤としてデキストラン−チャコールを
添加し、時々まぜながら約５分間インキュベートする。

この混合物１１５０（ＩＩＦで１５分間遠心分離し、上
清を取シ、再び同様の遠心分離操作を繰返す。この上清
を牛血清アルブミン（以下、Ｂ８Ａという）含有リン酸
緩衝生理食塩水と混合し、更に沈殿剤としてポリエチレ
ングリコール水溶液を加えよく混合し、１５００ｆで１
５分遠心分離する。沈殿を同上の沈殿剤とよくまぜ同様
の遠心分離を行う。この操作を２回繰返す。沈殿を冷ア
セトンで懸濁し１５００Ｆで１５分間遠心分離をする。

沈殿を室温で乾燥させ、蒸留水で懸濁し、解離剤として
塩酸を加える。この混合液を室温で１時間インキユペー
トシ、抗原の抗原−抗体複合体からの解離を行う。この
後、トリス−ＨＣ１緩衝液（ｐａａｏ）を添加し中和し
た後、Ｂ　Ｓ　Ａ　、　ＮａＮ３　含有リン酸緩衝生理
食塩水を加える。以上の操作によシ抗原特異抗体によっ
て捕捉された抗原が抽出される。この抗原の量を以下の
方法によって測定する。まず、抗体工ｇＧ又はそのＦ（
ａｂっ、をプラスチック製酵素免疫測定用マイクロプレ
ート、プラスチック製ボール、プラスチック裂チューブ
等の固相担体とリン酸緩衝生理食塩水等の溶媒中で４℃
で１２時間以上反応させることによって固相担体と抗体
を物理的に結合させる。

次いで、上記の方法によって抗原特異抗体から解離され
た抗原含有液を抗体の結合した固相体と４℃〜５７℃で
４時間〜２４時間、好ましくは３７℃で４時間、更に４
℃で１２時間反応させることによって抗原を捕捉した後
、洗浄後、これば酵素標識した抗体又はその’（ａｂ’
）ｓ、好ましくはそのＦａｂ’のリン酸緩衝生理食塩水
等の溶液を添加し、４℃〜５７℃で４時間〜１２時間好
ましくは５７℃で４時間反応させることによシ固相体に
捕捉された抗原と酵素標識した抗体を結合させる。標識
用酵素としてはアルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等があり、ペルオキシ
ダーゼが適している。固相体を洗浄後、発色試薬、蛍光
試薬又は発光試薬を加えて反応させ、その吸光度、蛍光
強度、発光強度等を測定する。この様な基質としては例
えばペルオキシダーゼの場合、基質のＨ鵞Ｏ鵞　と共に
５−アミンサリチル酸、〇−７二二レンジアミン等の発
色に薬、３−　（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン
酸等の蛍光試薬、ルミノール等の発光試薬等が用いられ
、中でも蛍光試薬が最も適している。

また、抗体を結合した固相担体、抗原、酵素標識抗体Ｆ
ａｂ’を同時に反応させて測定を行う一段法分行うこと
も可能である。

上記の方法において、被検液として血清分用いる場合、
血清の代りに患者血清より抗原結合−セファローズ（５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　４　Ｂ等のアフィニティーカラ
ムを用いて精製した濃度既知の抗原特異抗体を用いて反
応を行うことで検量線を作成することができ、被検血清
中の抗原特異抗重量は、検量線より求めることができる
。

〔実施例］ 以下、本発明を実施例によシ更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されないＯ 実施例１ 抗インスリン抗体陽性患者血清サンプルを正常ヒト血清
で種々の濃度に希釈した検体サンプル（Ｌ１１ｓ＋ＪＩ
Ｋ１６μＵのインスリン〔アクトラビド（Ａｃｔｒａｐ
ｌ　）　ＭＯ、ノボ　インダストリアルス（Ｍｏｖｏ　
Ｉｎ４ｕｓｔｒｉａ１ｇ　）　　社、コベンノーーゲン
］　ｆｔ１．０　ｔ／１ｆ）Ｂ　８ムと（ＬＩＭのゝＮ
ａＣＡを含有する１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液Ｐ
Ｈ７，０（バッフアーム）（Ｌ４４−に溶解した液α４
４−を加え、５ｙｃｓ時間インキエペートする。この後
、αＱ５５ｄのデキストラン−チャコール懸濁液を添加
し、５分間時々かくはんし反応させた。デキストラン−
チャコールはディクソン（Ｄｉｚｏｎ　）　Ｃクリニカ
ル　ケミストリー　（（！：Ｌｉｎ、　Ｃｈｕｍ、　）
第２０巻第１２７５頁（１９７４）〕の方法によって作
成した。ただし、Ｂ８Ａ［：フラクション（ｆｒａｃｔ
ｉｏｎ　）　Ｖ　、　　アーマ−ファーマシューチカル
　カンパニー（ムｒｍｏｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、　）、カンカキ−〕とノ！Ｊ　）　（Ｎｏ
ｒｉｔ　）ム（半井化学社、京都）をヒト血清アルブミ
ンとノリトＮＫ（又はノリト０ＳＸ）の代シに使った。

デキストラン−チャコールは乾燥重量でチャコールとし
て６０Ｍｇを１−中に含むように懸濁液として調製した
。

上記デキスト２ンーチヤコール処理した反応液を１５０
０２　１５分遠心分離し、この上清を更くもう一度１５
００２　１５分遠心分離した。この沈殿にポリエチレン
グリコール（す６０００半井化学社、京都）溶液（２５
０ｆ／２）１−を添加しよく混合し、１５００９１５分
遠心分離した。この操作を２回繰返した。この沈殿に冷
アセトン１−を加え懸濁し１５００２１５分遠心分離し
た。この沈殿を室温で乾燥させα０７−の蒸留水に懸濁
し、１１０１１Ｉ１のα８　Ｍ　Ｈｏｔを加えよく混合
した。室温に１時間放置した後、（ＬＯ２−のＩＭ）リ
スー’ａｃｔ緩衝液ｐＨａｏを加え中和し、更に（１０
５ｍの５ｆ／ｌのＢ　Ｂ　Ａ、Ｓ　ｔ　／　Ｌ　ＯＮａ
ｐｓ、　１．２　Ｍ　ＩＪａＯＡを含む３０　ｍＭ　リ
ン酸ナトリウム緩衝液を加えよく混合し九。このように
調製したサンプル（１１５−を抗インスリン抗体結合ポ
リスチレンボールとまぜ３７０４時間、続いて４℃で１
２時間反応させた。なお、抗インスリン抗体結合ポリス
チレンボールは以下のようにして作成した。抗インスリ
ン抗体はモルモット由来抗インスリン抗血清（医学生物
学研究所、名古屋）をＮａ！Ｊ１１０４　　で塩析しＤ
ＥｉＡＥ　−’セルロースカラムクロマトグラフィーに
よ）常法に従って精製し、ＩｇＧ画分を得た。この抗イ
ンスリン抗体１ｇＧ溶液（Ｅｌ　１　ｆ　／　Ｌ　）中
にボリスチレ／ボール〔直径五２■、グレシジョン　プ
ラスチック　ボール　カンパニー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
　Ｐｘａａｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　（！ｏ、）シカゴ〕を浸
し、石川ら〔スカンジナビアンジャーナル　オブ　イム
ノロジー（５ｃａｎｄ、　Ｊ。

工ｍｍｕｎｏ１．　）第８巻第４３頁（１９７８）］の
方法によって物理的に吸着させた。上記サンプルと反応
させた抗インスリ／抗体結合ポリスチレンボールを、１
　ｆ　／　Ｌ　Ｂ　８ム、１　ｆ　／　Ｌ　Ｍｈｏ＠、
１ｍＭ　ＭｇＯ６１、（Ｌ　１Ｍ　１１ａＯＡを含む１
０ｍＭ　　リン酸ナトリウム緩衝液Ｉ）３１７．Ｏ（バ
ッファーＢ）で２回洗い、次に５　ｎｇ　のペルオキシ
ダーゼ標識抗インスリン抗体ｔａｂ’液（１１５−と２
０℃４時間反応させた。

まお、ペルオキシダーゼ標識抗インスリン抗体ＩＰａｂ
’は以下のようＫして作成した。すなわち上記のごとく
作成されたモルモット由来抗インスリン抗体工ｇＧを常
法によシペプシン消化し１’（ａｂっ１両分を得、２−
メルカプトエチルアミンによってこれを還元しｔａｂ’
を得た。これを橋田ら【ジャーナル・オシ・アプライド
・バイオケミストリー（ｓ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　）　　第６巻第５６頁（１９Ｂ４）］の方法に
よって西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ〔グレード（ｇ
ｒａａｅ　）　１　ｓペーリンガー　マンハイム（Ｂｅ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ　−ｈｅｉｍ）社、マンハ
イムｌｃ、ｎ−スクシンイミソルー６−マレイミド　ヘ
キサノエート（同位化学研究所、熊本）を用いて結合さ
せた。

更に、この反応物を、既述のに−ｈルアンら〔クリニカ
　キミカ　アクタ　第１４７巻第１６７頁（１９８５）
）の方法によシ作成したメルカプトスクシニル化インス
リン１．６１９を活性化チオールセファローズ４Ｂ〔フ
ァーマシドファイン　ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉｄ
　Ｆｉｎｅ　Ｏｈｅ　−ｍｉｃａｌｓ　）ムク１ウプサ
ラコにカップリングさせたインスリン−セファローズ４
Ｂアフイニテイーカラムクロマトグラフイーによシ精製
し、更にウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ、ストックホ
ルム）により精製し、ペルオキシダーゼ標識抗インスリ
ン抗体Ｆ’ａｂ’を得た。上記のごとくインキュベート
したポリスチレンボールをバッファーＥで２回洗い、ポ
リスチレンボールに吸着シたペルオキシダーゼ活性を測
定した。ペルオキシダーゼ活性は基質としてＥ［、Ｏ，
と３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸〔アル
ドリッチ　ケミカル　カンパニー　インコーホレーテッ
ド（ム１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、工ｎｃ
、　）、ミルウオーキー〕を用い、今月ら〔アナリチカ
ル　レターズ（Ａｎａｌ　Ｌｅｔｔ　）第１６巻第１５
０９頁（１９８５）〕の方法によって３０℃−で測定“
した。蛍光強度は１Ｈｉキニンを１ｔの（１０５ＭＵ、
ＳＯ４に溶解した液に対する相対強度として表し、励起
波長３２０　ｎｍ　、蛍光波長４０５　ｎｍで島津スペ
クトロフルオロメーター（ＲＩＦ−５０島津製作所、京
都）を用いて測定した。５種のサンプルの測定結果を第
１図に実線で示す。

すなわち第１図は、本発明方法（実線）と従来法（点線
）の感度の比較を、血清の希釈率（横軸）と相対蛍光強
度（縦軸）との関係で示したグラフである。

比較例１ 従来法である既述のＩ、、　、Ｔ、ネルら〔ダイアビー
チス第３４巻第６０頁（１９８５）］の方法によって実
施例１と同一のサンプルを以下のように測定した。α１
艷の患者血清サンプルｔ（Ｌ１２５＋ｄの５２　ｍＭ　
ＨＣｊでｐＨｌ＆Ｑとし、これに１０５ｄの実施列１で
用いたデキストラン−チャコール液を添加し、混合液を
５分間時々かくはんし、Ｑ、１２Ｓ−の８　ｍＭ　Ｎａ
ＯＨを添加し中和する。この混合液を１５００２１０分
間遠心分離し、上清を更に１５００ｆ１０分間遠心分離
した。この上清を実施例１で用いたバッファーＡで７５
００倍に希釈し、このＱ、１５１ｍ１ｇをインスリンを
結合させたポリスチレンボールと３７℃４時間続いて４
℃１２時間反応させた。

なお、インスリン結合ポリスチレンボールはあらかじめ
正常ウサギエｇＧ　（２ｑ／ｄ　）を実施例１と同様に
ポリスチレンボールに物理吸着させ、これにインスリン
とグルタルアルデヒド処理することで作成した〔Ｔ、コ
ーン（Ｔ、Ｋｏｈｎｏ　）、ジャーナル　オブ　バイオ
ケミストリー（Ｊ。

Ｅｉｏｃｈｅｍ、　）第９８巻第３７９頁（１９８５）
）。

上記血清サンプルとインスリン結合ポリスチレンボール
の反応物を、実施例１のバッファーＢで２回洗い、次に
５　ｎｇのペルオキシダーゼ標識抗ヒトエｇＧ　Ｃγ−
チェーン（（！ｈａｉｎ　）　］抗体ＩＰａｂ’の１１
５−溶液中に上記ポリスチレンボールを浸し、２０℃４
時間反応させる。なお、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトエ
ｇＧ　（ｒ−チェーン）抗体Ｆａｂ’はウサギ由来抗ヒ
トＩｇＧ（γ−チェーン）抗血清（医学生物学研究所、
名古屋）を用い、実施例１と同様に、既述の橋田ら〔ジ
ャーナル　オプ　アプライド　バイオケミストリー第６
巻第５６頁（１９８４）］の方法によって作成した。上
記反応物を実施例１のバッファーＢで２回洗い、ポリス
チレンボールに吸着したペルオキシダーゼ活性を実施例
１と同様の方法で測定した。結果を第１図の点線で示す
。この結果よシ実施例１で行った本発明による測定法の
方が、従来法に比べ１０００〜３０００倍とはるかに高
感度であり、かつバックグランドが低いことが示され°
る。

実施例２ 本発明による測定法が血清サンプル中に共存する遊離の
インスリンによって影響されな込ことを以下の実施例に
よって確認した。正常ヒト血清に１．６μσ〜１６００
μＵのインスリン（既述のアクトラピドＭＯ，ノボ　イ
ンダストリアルス、コペンハーゲン）を添加し、実施９
１１で示した本発明による測定法を行った。なお、対象
として実施例１の測定法中デキストランーチャコールに
よる遊離のインスリ／の吸着除去操作を除いた測定法を
行った。結果を第２図に示す。すなわち第２図は、本発
明による測定法における遊離インスリンの影響を、添加
インスリン量（μＵ／チューブ、横軸）と相対蛍光強度
（縦軸）との関係で示すグラフである。白四角印は対象
実験であυ、白丸印は実施例１０本発明による測定法の
結果である。

第２図から、１６６μσ〜１６０μＵのインスリンの共
存下では測定値には全く影響を及ぼしておらず、血清サ
ンプル中の遊離のインスリン量によっては本発明による
測定法は何ら影響を受けないことが明らかである。

実施例３ 本発明によって抗インスリン抗体の定量を行うための検
量線を以下の実施例で示した。

実施例１における本発明による測定法を用い、患者血清
サンプルの代シに、濃度既知の患者血清由来抗インスリ
ン抗体工ｇＧを正常ヒト血清で種々に希釈したサンプル
を用いて検量線を求めた。また、対象として、正常ヒト
エｇＧを、患者血清由来抗インスリン抗体工ｇＧの代シ
に用い、同様の測定を行った。なお、患者血清由来抗イ
ンスリン抗体工ｇＧは以下の様にして作成した。

抗インスリン抗体を含む患者血清３−を２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０で２倍に希釈し、実施例１
で示したインスリン−結合セファローズ４Ｂ、カラムク
ロマトグラフィーを用い、Ｌ　５　ｍＭ　１１０１　ｐ
Ｈ１２，５によって溶出される画分を集め、直ちに１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０によって中和し患者
血清由来抗インスリン抗体Ｉｇ０１に得た。本実施例の
結果を第３図に示す。すなわち第３図は本発明による抗
イ／スリン抗体の定量のための検量線を、工ｇＧ　！ｔ
（モル／チューブ、横軸）と相対蛍光強度（縦軸）との
関係で示すグラフである。白丸印は、患者血清由来抗イ
ンスリン抗体工ｇＧの場合、白四角印は、正常ヒトエｇ
Ｇの場合である。

この結果から本発明による測定法は正常ヒト工ｇａには
反応せず、抗インスリン抗体の濃度に依存してペルオキ
シダーゼ活性が増加していることがわかり、抗インスリ
ン抗体の定量が可能であることが明らかである。更に、
本発明による測定感度は４５ｐｇ／チューブ又は４５０
ｎｇ／ｚであることが判明した。なお、測定感度はｔ−
検定（ｎ＝５、ｐ（ａ、ｏｏｔ）によって求めた。この
測定感度は、既述のり、　Ｊ、ネルらヴイアビーチス第
５４巻第６０頁（１９８５）］によって報告された測定
感度（４岬／１）Ｉｃ比べ約ＩＱ、０００倍という非常
に高感度な測定法であることが判明した。

〔発明の効果］ 以上詳細に説明した様に、本発明により、簡便かつ高感
度な抗体の測定が可能となシ、その結果、従来測定不可
能であった超微量抗体の測定が可能とｋつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗インスリン抗体含有血清サンプルを種々の濃
度に希釈し、本発明による方法（実線）と従来法（点線
）で測定したときの感度の比較を示したグラフ、第２図
は本発明による測定法ＰＣおける遊離インスリンの影響
を示したグラフ、第５図は本発明による抗インスリン抗
体の定量の丸めの検量線を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）（Ａ
   ）抗体を含有する被検液に該抗体の抗原を添加し抗原−
   抗体複合体を形成させる工程 （Ｂ）該被検液より該抗原−抗体複合体を分離する工程 （Ｃ）該抗原−抗体複合体より抗原を解離させる工程 （Ｄ）解離させた該抗原を免疫測定法により測定する工
   程 を包含することを特徴とする抗体の測定方法。