KR20160146641A

KR20160146641A - 크레아틴키나아제 ｍｂ 아이소자임의 측정 방법 및 그것에 사용되는 키트

Info

Publication number: KR20160146641A
Application number: KR1020167015499A
Authority: KR
Inventors: 가즈마 하나이; 신이치 오다가키; 츠토무 마스다
Original assignee: 와꼬 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2016-12-21
Also published as: JP6515923B2; TW201621319A; EP3139168A1; US20170122943A1; ES2708781T3; EP3139168A4; KR102331684B1; CN106461662B; EP3139168B1; JPWO2015166790A1; CN106461662A; TWI679421B; WO2015166790A1

Abstract

CK-BB 의 영향을 회피하여, CK-MB 를 특이적으로 측정하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
즉 본 발명은,「하기 공정으로 이루어지는 시료 중의 CK-MB 의 측정 방법 ; 시료와, CK-MB 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, 크레아틴키나아제의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번째의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 반응시키는 공정 (공정 1), 그 반응에 의해 발생한 광학적 변화를 측정하는 공정 (공정 2), 공정 2 에서 얻어진 결과에 기초하여, 그 시료 중의 CK-MB 의 양을 구하는 공정 (공정 3), 및 이것에 사용되는 키트, 그리고 당해 항 CK-B 항체로 시료를 처리하는 것을 특징으로 하는 CK-MB 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향 회피 방법」에 관한 것이다.

Description

크레아틴키나아제 ＭＢ 아이소자임의 측정 방법 및 그것에 사용되는 키트 {METHOD FOR ASSAYING CREATINE KINASE MB ISOZYME AND KIT TO BE USED THEREIN}

본 발명은, 크레아틴키나아제 MB 아이소자임의 측정 방법 및 그것에 사용되는 키트에 관한 것이다.

크레아틴키나아제 (이하, CK 로 약기한다) 는 골격근, 심근, 평활근, 뇌 등에 함유되는 효소로서, 세포의 에너지 대사에 관련된 중요한 역할을 하고 있다.

CK 는 2 개의 서브유닛으로 구성되는 2 량체의 단백질로서, 그 서브유닛에는 M 형 (muscle type, M) 과 B 형 (brain type, B) 의 2 종류가 있다. 또, CK 에는, 서브유닛의 조합에 의해, 골격근에 많은 CK-MM, 심근에 많은 CK-MB, 뇌에 많은 CK-BB 의 3 종류의 아이소자임이 존재한다. 그 중에서도 CK-MB 는 심근 특이성이 높고, 심근 상해가 발생하면 심근 세포로부터 CK-MB 가 일탈하여 혈중에 유출된다. 그 때문에 CK-MB 는 심근 장해 (심근경색) 마커로서 임상 검사에 있어서 중요한 항목이 되고 있다.

CK-MB 의 정량 측정에는,「효소 활성」을 측정하는 면역 저해법이나「단백량」을 측정하는 라텍스 비탁법, 전기 화학 발광 면역 측정법 등이 있으며, 그 밖에 아이소자임 해석의 수법으로서「전기 영동법」이 알려져 있다.

그 중 면역 저해법은, 범용 자동 분석 장치를 사용하여 측정을 실시할 수 있기 때문에 일반적으로 사용되고 있지만, 검체 중에 CK-BB 등이 함유되면 그것들의 활성도 측정하기 때문에, CK-MB 측정에 대한 특이성이 낮아, 올바른 CK-MB 측정값이 얻어지지 않는다는 문제가 있다. 전기 화학 발광 면역 측정법은, CK-BB 의 영향을 받지 않고 CK-MB 를 특이적으로 측정할 수 있는 방법이지만, 특별한 측정 기기가 필요하거나, 사용하는 시약이 고가이거나 하는 문제가 있다. 또 전기 영동법은 신속성이 부족한 점, 정량성이 떨어지는 점 등에서, CK-MB 를 정량할 목적에는 이용되지 않는다.

한편, 단백질량을 측정하는 방법인 라텍스 비탁법은, CK-MB 에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 면역학적 수법으로 CK-MB 를 단백량으로서 정량하는 방법이다. 본 법은 범용 자동 분석 장치를 사용한 측정이 가능하며, 효소 활성을 측정하는 면역 저해법과 비교하여 정밀도가 높고, 또 CK-MB 의 특이성이 우수하고, CK-MB 의 일탈량을 정확하게 모니터할 수 있는 방법이라고 일컬어지고 있다.

그러나 실제로는, 종래의 라텍스 비탁법으로 CK-BB 가 공존하는 검체의 CK-MB 값을 측정하면, CK-BB 도 측정하여 (거짓 높은 값의 출현), 올바른 CK-MB 의 측정값이 얻어지지 않는다는 경우가 있었다. 그 원인으로는, 사용하는 항 CK-MB 항체의 일부가 시료 중의 CK-BB 와도 결합 (교차) 하는 것은 아닌지 생각되었다.

그래서 이 문제를 회피하기 위해, CK-MM 에도 CK-BB 에도 결합하지 않는 항 CK-MB 모노클로날 항체가 개발되고, 이것을 사용한 라텍스 비탁법이 제안되어 있다 (특허문헌 1). 이 방법은, 라텍스 입자 상에 고정화시킨 상기한 특이성을 갖는 제 1 항 CK-MB 항체와, 라텍스 입자 상에 고정화시킨 상기 제 1 항 CK-MB 항체와는 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 또한 상기한 특이성을 갖는 제 2 항 CK-MB 항체를 시료 중의 CK-MB 와 반응시켜, 항원 항체 반응의 결과 발생한 응집의 증가를 측정하는 방법이다. 그러나, 실제로는 이 방법으로 CK-MB 를 측정한 경우에도, 역시 거짓 높은 값이 얻어지는 경우가 있었다.

또 다른 라텍스 비탁법에 의한 측정 방법으로서, CK-MB 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 고정화시킨 라텍스 입자와 CK-BB 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 고정화시킨 라텍스 입자를 사용하는 방법 (특허문헌 2) 이 있다. 이 방법은, 라텍스 입자의 입경을 조정함으로써 CK-MB 의 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향을 회피하고자 하는 것이다. 그러나, 이 방법에서도 CK-MB 의 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향을 충분히 회피할 수 없었다.

일본 특허공보 제2774875호 일본 공개특허공보 2013-125005호

이상과 같이, 종래의 단백질량을 측정하는 것에 의한 CK-MB 측정법은, CK-BB 의 영향을 회피하여 CK-MB 를 특이적으로 측정하는 것이 곤란하였다. 그 원인으로는, 아마 항 CK-MB 항체의 특이성이 충분하지 않아, CK-MB 뿐만 아니라 CK-BB 와도 약간 교차하기 (거짓 높은 값의 출현) 때문인 것으로 생각된다.

따라서 본 발명의 과제는, 상기한 바와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로서, CK-BB 의 영향을 회피하여, CK-MB 를 특이적으로 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 상기 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것으로서, 이하의 구성으로 이루어진다.

(1) 하기 공정으로 이루어지는 시료 중의 CK-MB 의 측정 방법 ;

1) 시료와, CK-MB 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 반응시키는 공정 (공정 1),

2) 그 반응에 의해 발생한 광학적 변화를 측정하는 공정 (공정 2),

3) 공정 2 에서 얻어진 결과에 기초하여, 그 시료 중의 CK-MB 의 양을 구하는 공정 (공정 3).

(2) CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체로 시료를 처리하는 것을 특징으로 하는 CK-MB 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향 회피 방법.

(3) CK-MB 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 CK-MB 측정용 키트.

본 발명자들은, 종래의 단백질량을 측정하는 방법에 의한 CK-MB 의 측정계에 CK 의 B 서브유닛의 특정 영역을 인식하는 항체 (본 발명에 관련된 항 CK-B 항체) 를 공존시킨 결과, 시료 중의 CK-BB 의 영향을 회피하여 고정밀도 또한 고감도로 CK-MB 를 측정할 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 의하면, CK-MB 의 측정에 있어서의 시료 중에 공존하는 CK-BB 의 측정값에 대한 영향 (거짓 높은 값의 출현) 을 회피 (억제) 할 수 있어, 보다 고정밀도로, 고감도로 CK-MB 의 측정을 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 방법에 의하면, 범용 자동 분석 장치로 CK-MB 단백량을 측정할 수 있으므로, 특별한 기기를 사용할 필요가 없다.

또한, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, CK-MB 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향을 회피하는 것이다. 따라서 본 발명은, CK-MB 측정시의 CK-BB 의 영향 회피 방법을 제공한다.

도 1 은 실시예 2 에 있어서, 항 CK-B 항체로서 MAb to CK-BB (Meridian Life Science, Inc. 제조) 를 사용하여 얻어진 전기 영동도이다.
도 2 는 실시예 2 에 있어서, 항 CK-B 항체로서 CKBB Monoclonal Antibody (Roche Diagnostics K. K. 제조) 를 사용하여 얻어진 전기 영동도이다.

본 발명의 CK-MB 의 측정 방법은,

「하기 공정으로 이루어지는 시료 중의 CK-MB 의 측정 방법 ;

(1) 시료와, CK-MB 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 반응시키는 공정 (공정 1),

(2) 그 반응에 의해 발생한 광학적 변화를 측정하는 공정 (공정 2),

(3) 공정 2 에서 얻어진 결과에 기초하여, 그 시료 중의 CK-MB 의 양을 구하는 공정 (공정 3).」

이다.

즉, 본 발명의 방법은, 2 종의 항 CK-MB 항체를 사용한 CK-MB 의 측정 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 첨가함으로써, CK-BB 의 영향을 회피하고, 그 결과, CK-MB 를 특이적으로 측정할 수 있는 방법이다.

본 발명이 CK-BB 의 영향을 회피할 수 있는 측정 원리에 대해, 본 발명자들은 이하와 같다고 추찰한다.

CK-MB 는 M 서브유닛과 B 서브유닛의 헤테로 다이머이다. CK-BB 는 B 서브유닛의 호모 다이머이다.

시료 중에 CK-MB 와 CK-BB 가 공존재하는 경우, 그 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 접촉시키면, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, 그 시료 중의 CK-MB 의 B 서브유닛 및 CK-BB 의 B 서브유닛에 결합한다. 그리고, CK-BB 의 B 서브유닛에 결합한 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, 제 1 항체 또는 제 2 항체가 CK-BB 에 결합하는 것을 저해하는 것으로 생각된다. 그리고 그 결과, 본 발명의 CK-MB 의 측정 방법에서는, 시료 중에 존재하는 CK-BB 의 영향을 회피하여, CK-MB 를 특이적으로 또한 고정밀도로 측정할 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명에 관련된 CK-MB 에 대한 제 1 항체 (이하, 간단히「제 1 항체」로 약기하는 경우가 있다) 로는, CK-MB 의 M 서브유닛과 B 서브유닛의 양방을 인식하는 항체를 들 수 있다.

본 발명에 관련된 CK-MB 에 대한 제 2 항체 (이하, 간단히「제 2 항체」로 약기하는 경우가 있다) 로는, CK-MB 의 M 서브유닛과 B 서브유닛의 양방을 인식하지만, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 항체를 들 수 있다.

본 발명에 관련된 항 CK-B 항체로는, CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 (즉 N 말단 아미노산) ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다. 즉, CK 의 B 서브유닛을 인식하는 항 B 서브유닛 항체로서, 또한 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역 중의 특정 영역을 인식하는 항체만이, 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, Native 한 CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역의 삼차원 구조 (입체 구조) 를 인식하는 것이 더욱 바람직하다.

CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역의 아미노산 배열은, 구체적으로는, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열이다.

또한, CK 의 B 서브유닛의 전체 아미노산 배열은 공지이다 (NCBI Reference Sequence : NP_001814.2, 본 명세서의 배열 번호 2)

이하, 본 발명에 관련된 제 1 항체, 본 발명에 관련된 제 2 항체, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 합쳐서, 간단히「본 발명에 관련된 항체」로 기재하는 경우가 있다.

본 발명에 관련된 항체는, 각각 상기한 성질을 갖고 있는 것이면 되며, 시판품이어도 되고 통상적인 방법에 의해 적절히 조제된 것이어도 되고, 각각 모노클로날 항체여도 되고 폴리클로날 항체여도 된다.

본 발명에 관련된 항체가 모노클로날 항체인 경우, 그 유래는 특별히 한정되지 않고, 시판품, 혹은 세포 융합 기술이나 유전자 재조합 기술 등을 이용한 자체 공지된 방법 [Eur. J immunol, 6, 511 (1976)] 등에 의해 산생된, 상기한 바와 같은 성질을 갖는 것은 전부 사용 가능하다.

본 발명에 관련된 항체가 폴리클로날 항체인 경우, 그 유래는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 토끼, 래트, 마우스, 양, 염소, 말 등에서 유래하는, 상기한 성질을 갖는 것을 들 수 있다. 시판품, 혹은 예를 들어「면역학 실험 입문, 제2쇄, 마츠하시 타다시 등, (주) 학회 출판 센터, 1981」등에 기재된 방법으로 취득되는 것을 사용하면 된다.

또, 본 발명에 관련된 항체에는, 파파인 등으로 부분 분해시켜 얻어지는 Fab 프래그먼트, 펩신 등으로 부분 분해시켜 얻어지는 (Fab')₂ 프래그먼트, (Fab')₂ 프래그먼트를 환원 처리하여 얻어지는 Fab' 등의 이른바 항체 프래그먼트도 포함된다.

본 발명에 관련된 항체는 상기한 바와 같은 자체 공지된 방법으로 제조해도 얻어지지만, 시판품을 사용해도 된다.

제 1 항체 및 제 2 항체의 시판품으로는, 항 CK-MB 항체로서 시판되고 있는 것 중에서, 인식하는 에피토프가 서로 상이한 것을 선택하여 사용하면 되며, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에 관련된 항 CK-B 항체의 시판품으로는, 항 CK-B 항체나 항 CK-BB 항체로서 시판되고 있는 것 중에서, CK 의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 것을 선택하여 사용하면 된다. 이와 같은 시판품으로는, 예를 들어 Meridian Life Science, Inc. 제조의 MAb to CK-BB, Roche Diagnostics K. K. 제조의 CKBB Monoclonal Antibody, BiosPacific, Inc. 제조의 CK-BB Monoclonal Antibody, Fitzgerald I. I. 제조의 CKBB antibody 등을 들 수 있다.

제 1 항체 및 제 2 항체는, 불용성 담체에 고정화 (담지) 시켜 사용해도 된다. 제 1 항체를 고정화시킨 라텍스 입자 및 제 2 항체를 고정화시킨 라텍스 입자를 구성 시약으로서 함유하는 시판되는 키트를 사용하면 간편하다. 그러한 시판되는 키트로는, 예를 들어, L 타입 와코 CK-MB mass (와코 순약 공업 (주) 제조) 등을 들 수 있다.

제 1 항체 및 제 2 항체를 불용성 담체에 고정화시켜 사용하는 경우, 사용되는 불용성 담체로는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 담체이면 어느 것도 사용 가능하지만, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리클로로카보네이트, 실리콘 수지, 실리콘 러버 등의 합성 고분자 화합물, 다공성 유리, 불투명 유리, 알루미나, 실리카 겔, 활성탄, 금속 산화물 등의 무기 물질 등을 재료로 하여 조제된 것을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 또, 이들 담체는, 라텍스 입자, 비즈, 튜브, 디스크상 편 (片), 미립자 등 다종 다양한 형태로 사용할 수 있다.

상기한 불용성 담체 중에서도, 라텍스 입자는 인공 담체이며, 목적에 따라 담체 표면을 화학적 처리하기 쉬운 것, 또 비특이 반응이 잘 일어나지 않는 것 등의 점에서 특히 바람직하다. 그 재질은 특별히 한정되지 않으며, 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 폴리스티렌 라텍스 입자 등의 스티렌계 라텍스 입자, 아크릴산계 라텍스 입자 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 또한, 이들 라텍스 입자 중, 유화제를 사용하지 않는 유화 중합에 의해 얻어지는 폴리스티렌 라텍스 입자 등은, 표면의 소수성이 강하기 때문에, 단백질 혹은 펩티드를 원활하게 흡착하고, 또한 표면의 부 (負) 전하끼리의 반발에 기초하여, 유화제 없이도 용액 중에서 안정적으로 분산된다는 성질을 갖고 있으므로, 특히 바람직하다. 또, 다양한 변성 라텍스 입자 (예를 들어, 상기 폴리스티렌 중에 카르복실기를 도입한 카르복실산 변성 라텍스 입자), 자성 라텍스 입자 (자성 입자를 내포시킨 라텍스 입자) 등도, 필요에 따라 사용할 수 있다.

제 1 항체를 고정화시키는 라텍스 입자와 제 2 항체를 고정화시키는 라텍스 입자의 재질은, 상기와 같은 것이면 동일해도 되고, 각각 상이해도 된다.

또, 본 발명에 관련된 라텍스 입자로는, 시판되는 것을 사용해도 되지만, 단위 중량당의 표면적이 큰 것이 항체를 효율적으로 감작시킬 수 있으므로 바람직하다. 구체적으로는, 통상적으로 0.05 ∼ 2.4 ㎛, 바람직하게는 0.05 ∼ 1.0 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.05 ∼ 0.50 ㎛ 의 평균 입경의 것을 들 수 있다.

제 1 항체를 고정화시키는 라텍스 입자와 제 2 항체를 고정화시키는 라텍스 입자는 동일한 입경의 것이어도 되지만, 상기 범위 중에서 선택된 평균 입경이 상이한 것을 조합하여 사용해도 된다.

또, 제 1 항체를 고정화시키는 라텍스 입자는, 동일한 입경의 것이어도 되고 상이한 것이어도 된다. 제 2 항체를 고정화시키는 라텍스 입자도, 동일한 입경의 것이어도 되고 상이한 것이어도 된다.

제 1 항체 및 제 2 항체의 불용성 담체로의 고정화 방법으로는, 각 항체와 불용성 담체를 접촉시킴으로써 이루어지면 되며, 자체 공지된 고정화 방법, 예를 들어 공유 결합에 의해 고정화시키는 방법, 물리적으로 흡착시켜 고정화시키는 방법 등의 고정화 방법을 이용하면 된다.

불용성 담체에 담지시키는 제 1 항체의 양, 및 불용성 담체에 담지시키는 제 2 항체의 양은, 그 담체에 따라 상이한데, 담체 1 g 에 대하여 통상적으로 0.5 ∼ 2000 ㎎Ab, 바람직하게는 2 ∼ 500 ㎎Ab 가 되도록 조제된다. 담체가 라텍스 입자인 경우, 라텍스 입자 1 g 에 대하여 통상적으로 0.5 ∼ 2000 ㎎Ab, 바람직하게는 2 ∼ 500 ㎎Ab 이다.

제 1 항체를 고정화시킨 불용성 담체와 제 2 항체를 고정화시킨 불용성 담체는, 각각 제 1 항체만을 고정화시킨 것 및 제 2 항체만을 고정화시킨 것이어도 되고, 제 1 항체와 제 2 항체를 동일한 불용성 담체에 고정화시킨 것이어도 된다.

본 발명에서는, 제 1 항체와 제 2 항체는, 불용성 담체에 결합시켜 사용해도 되지만, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는 불용성 담체에 결합시켜 사용하지 않는다. 예를 들어 불용성 담체로서 라텍스 입자를 사용하여 본 발명의 CK-MB 측정법을 실시한 경우, 시료 중의 CK-MB 와 라텍스에 고정화된 제 1 항체와 라텍스에 고정화된 제 2 항체로 가교 구조를 형성하여, 광학적 변화가 발생한다. 그러나, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, 시료 중의 CK-MB 의 B 서브유닛에 결합은 하지만, 가교 구조의 형성에는 관여하지 않는다.

본 발명의 CK-MB 의 측정 방법의 공정 1 은, CK-MB 를 함유하는 시료와, 제 1 항체와, 제 2 항체와, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 반응시키는 공정이다.

공정 1 에서는, 최종적으로, 시료와 제 1 항체와 제 2 항체와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액이 얻어지면 되는데, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, 시료와 제 1 항체 및 제 2 항체 중 적어도 하나를 접촉·반응시키기 전에 첨가하는 것이 바람직하다. 바꿔 말하면, 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 먼저 접촉시킨 후에 제 1 항체와 제 2 항체를 접촉시키는 것이 바람직하다.

공정 1 에서는, 본 발명에 관련된 제 1 항체, 제 2 항체, 및 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체는, 완충액 등의 용액에 현탁시켜 용액의 형태로 사용되는 경우가 많다. 이와 같은 시약 용액을 조제하기 위해 사용되는 완충액으로는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 pH 5.0 ∼ 10.0, 바람직하게는 pH 6.5 ∼ 8.5 의 중성 부근에 완충 작용을 갖는 것을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 HEPES 완충제, 붕산, 트리스 완충제, 인산 완충제, 베로날 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다. 또, 이들 완충액의 완충제 농도로는, 통상적으로 10 ∼ 1000 mM, 바람직하게는 10 ∼ 300 mM 의 범위에서 적절히 선택된다.

또, 제 1 항체나 제 2 항체를 고정화시킨 라텍스 입자를 구성 시약으로서 함유하는 상기한 바와 같은 시판되는 키트를 사용하는 경우에는, 그 키트에 첨부된 완충액을 사용해도 된다.

후술하는 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 제 1 시약과 제 1 항체 및 제 2 항체를 함유하는 제 2 시약의 2 시약계로 측정을 실시하는 경우, 제 1 시약의 pH 는, 안정성을 고려하면 pH 6.0 ∼ 8.0 정도가 바람직하다. 제 2 시약의 pH 도, 안정성을 고려하여 제 1 시약과 동일하게 pH 6.0 ∼ 8.0 정도가 바람직하다.

상기와 같은 완충액에 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 현탁시킨 시약 용액 중의 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체의 농도는, 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액을 혼합하였을 때에 목적으로 하는 농도 범위 내가 되는 농도이면 된다. 예를 들어 0.1 ∼ 200 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 1 ∼ 40 ㎍Ab/㎖, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 20 ㎍Ab/㎖ 이면 된다. 즉, 하한값은 0.1 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 0.5 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 1 ㎍Ab/㎖ 이다. 또 그 상한값은 200 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 50 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 40 ㎍Ab/㎖, 더욱 바람직하게는 20 ㎍Ab/㎖ 이다.

또, 상기와 같은 완충액에 제 1 항체 또는/및 제 2 항체를 현탁시킨 시약 용액 중의 제 1 항체 또는/및 제 2 항체의 농도는, 측정하는 CK-MB 의 농도에 따라 상이한데, 통상적으로 0.4 ∼ 4200 ㎍/㎖, 바람직하게는 2 ∼ 4200 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 2 ∼ 420 ㎍/㎖ 이다.

또, 상기와 같은 완충액에 제 1 항체 및 제 2 항체를 고정화시킨 불용성 담체를 현탁시킨 시약 용액 중의 각 불용성 담체의 함량으로는, 사용되는 담체의 종류에 따라 상이한데, 통상적으로 0.001 ∼ 10 w/v％, 바람직하게는 0.005 ∼ 5 w/v％ 이다. 담체가 라텍스 입자인 경우, 통상적으로 0.1 ∼ 10 w/v％, 바람직하게는 0.2 ∼ 5 w/v％ 이다.

또한, 본 발명에 관련된 항체를 함유하는 용액에는, 추가로 증감제, 계면 활성제, 방부제 (예를 들어 아지화나트륨, 살리실산, 벤조산 등), 안정화제 (예를 들어 알부민, 글로불린, 수용성 젤라틴, 당류 등), 부활제, 공존 물질의 영향 회피제, 그 밖에 이 분야에서 사용되고 있는 것으로서, 공존하는 시약과의 안정성을 저해하거나, 항원 항체 반응을 저해하지 않는 것을 갖고 있어도 된다. 또 이들 시약류 등의 농도 범위 등도, 자체 공지된 그 측정 방법에 있어서 통상적으로 사용되는 농도 범위 등을 적절히 선택하여 사용하면 된다.

공정 1 에 있어서, 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 접촉·반응시킬 때의 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체의 반응액 중의 농도는, 항 CK-MB 항체가 시료 중의 CK-BB 와 결합하는 반응을 억제·회피하여 CK-MB 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향을 회피할 수 있는 양이면 된다. 예를 들어 0.1 ∼ 200 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 1 ∼ 40 ㎍Ab/㎖, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 20 ㎍Ab/㎖ 이면 된다. 즉, 하한값은 0.1 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 0.5 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 1 ㎍Ab/㎖ 이다. 또 그 상한값은 200 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 50 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 40 ㎍Ab/㎖, 더욱 바람직하게는 20 ㎍Ab/㎖ 이다.

또, 공정 1 에 있어서 시료와 제 1 항체와 제 2 항체를 접촉·반응시킬 때의 제 1 항체 및 제 2 항체의 반응 개시시의 반응액 중의 농도는, 시료 중의 CK-MB 의 농도에 따라 상이하며, 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 0.1 ∼ 1000 ㎍Ab/㎖, 바람직하게는 0.5 ∼ 1000 ㎍Ab/㎖, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 100 ㎍Ab/㎖ 이다.

또, 불용성 담체로서 라텍스 입자를 사용하는 경우로서, 공정 1 에 있어서 시료와 제 1 항체 고정화 라텍스와 제 2 항체 고정화 라텍스를 접촉·반응시킬 때의 반응액 중의 라텍스의 농도는, 0.01 ∼ 3 w/v％, 바람직하게는 0.01 ∼ 1.2 w/v％ 이다.

또, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체, 및 제 1 항체와 제 2 항체의 그 반응시의 pH 로는, 항원 항체 반응을 억제하지 않는 범위이면 특별히 한정되지 않고, 통상적으로 6.0 ∼ 10.0, 바람직하게는 6.0 ∼ 8.0 의 범위를 들 수 있으며, 반응시의 온도도 항원 항체 반응을 억제하지 않는 범위이면 특별히 한정되지 않고, 통상적으로 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 의 범위를 들 수 있다. 또, 그 반응 시간은, 사용되는 본 발명에 관련된 항체 그리고 pH 및 온도 등의 반응 조건에 따라 상이하므로, 각각에 따라 1 ∼ 60 분, 바람직하게는 1 ∼ 15 분 정도로 반응시키면 된다.

당해 공정 1 의 구체적인 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.

(ⅰ) 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액과, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하는 용액을 각각 조제하고, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 용액, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하는 용액의 순서로 시료와 혼합하는 방법 (2 시약계),

(ⅱ) 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액과, 제 1 항체를 함유하는 용액과, 제 2 항체를 함유하는 용액을 각각 조제하고, 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액을 혼합하고 나서, 제 1 항체를 함유하는 용액, 제 2 항체를 함유하는 용액을 순차적으로 혼합하는 방법 (제 1 항체를 함유하는 용액과 제 2 항체를 함유하는 용액은 어느 쪽을 먼저 첨가해도 된다),

(ⅲ) 제 1 항체와 제 2 항체와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액을 조제하고, 시료와 그 용액을 혼합하여, 이들 성분을 한 번에 작용시키는 방법.

이상 중에서도, 예를 들어 자동 분석기를 사용한 측정을 실시하는 경우나 작업 효율을 고려하면, (ⅰ) 의 방법으로, CK-MB 를 함유하는 시료와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 반응시킨 후, 제 1 항체 및 제 2 항체를 반응시키는 것이 바람직하다.

또한, 시료 중의 공존 물질의 영향 회피제 등의 시료의 전처리액을, 본 발명에 관련된 항체보다 먼저 시료와 접촉시켜도 된다.

또, 통상적으로 임상 검사의 분야에서 사용되는 항 CK-MB 항체를 사용하는 CK-MB 측정용 시판 키트를 구성하는 시약류 중 어느 것에, 상기 중 어느 상태가 되도록, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 존재시켜 사용해도 된다.

본 발명의 CK-MB 의 측정 방법의 공정 2 는, 공정 1 의 반응에 의해 발생한 광학적 변화를 측정하는 공정이다.

이 공정 2 에서는, 자체 공지된 항 CK-MB 항체를 사용하는 측정법에 따라, 반응에 의해 발생한 광학적 변화의 측정을 실시하면 된다.

당해 광학적 변화로는, 흡광도 변화, 탁도 변화, 또는 산란광 강도 변화 등을 들 수 있다.

광학적 변화의 측정이란, 면역 응집의 결과 발생하는 광학적 변화를 측정하는 것으로서, 구체적으로는, 면역 비탁법, 면역 비롱법 등의 면역 응집법 등을 들 수 있다. 이들 측정 방법은, 자체 공지된 방법에 준하여 실시하면 되는데, 예를 들어, 면역 비탁법을 사용하는 경우에는,「카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.853-854」등에, 예를 들어, 면역 비롱법을 사용하는 경우에는「카네하라 출판 주식회사 임상 검사법 제요 제30판 p.851-853 등」등에 기재된 방법에 준하여 실시하면 된다.

그 중에서도 면역 비탁법에 의한 측정이 바람직하고, 특히 라텍스 입자를 사용한 라텍스 비탁법이 측정 감도가 높고, 범용의 자동 분석 장치를 사용한 측정이 가능하고, 간편하며, 또한 본 발명의 효과를 보다 향수할 수 있는 점에서 바람직하다.

본 발명의 측정법을 라텍스 비탁법에 의해 실시하는 경우, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 시료와 접촉 혼합시키는 것 이외에는, 자체 공지된 라텍스 비탁법에 의한 CK-MB 의 측정 방법의 측정 조건 (예를 들어 측정 파장 등) 이나, 측정 조작법에 준하여 실시하면 된다.

라텍스 비탁법에 의한 CK-MB 의 측정을 실시하는 경우의 흡광도 측정을 위한 측정 파장은, 통상적으로 340 ∼ 880 ㎚, 바람직하게는 540 ∼ 800 ㎚ 이다. 2 파장에서 측정하는 경우에는, 주파장 540 ㎚ 부근, 부파장 800 ㎚ 부근에서 측정하면 된다.

본 발명에 관련된 광학적 변화는, 예를 들어 이하와 같이 구하면 된다.

(1) 제 1 항체 고정화 불용성 담체와 제 2 항체 고정화 불용성 담체와 CK-MB 의 반응 개시 후, 반응액의 광학적 측정을 적당한 간격으로 2 회 실시하고, 그 측정값의 차를 광학적 변화로 한다 (엔드법).

(2) 제 1 항체 고정화 불용성 담체와 제 2 항체 고정화 불용성 담체와 CK-MB 의 반응 개시 후의 반응액의 광학적 변화율 (특히, 그 최대 변화율) 을 흡광도 변화로 한다 (레이트법).

흡광도 변화, 탁도 변화, 또는 산란광 강도 변화의 측정은, 용수법 (用手法) 에 의해 실시해도 되는 것은 물론이지만, 본 발명의 방법은, 자동 분석 장치를 사용한 측정계에 적용할 수 있으므로, 자동 분석 장치, 분광 광도계 등의 생화학 범용기나 레이저 네펠로미터 등의 비롱 측정용 전용기 등을 사용하여 측정을 실시하면 되며, 상세하게는 각 기기의 매뉴얼에 따르면 된다.

용수법 또는 자동 분석 장치를 사용하여 측정을 실시하는 경우의 시약류의 조합에 대해서는, 특별히 한정은 되지 않으며, 적용하는 자동 분석 장치의 환경, 그 밖의 요인 등에 맞춰 적절히 실시하면 된다.

본 발명의 CK-MB 측정 방법의 공정 2 를, 예를 들어 라텍스 비탁법에 의해 CK-MB 를 측정하는 방법을 이용하는 시판되는 키트와 범용 자동 분석 장치를 사용하여 실시하는 경우, 키트의 구성 시약 중 어느 것에 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유시켜 사용하면 된다. 그리고, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 다른 항체와 동시에 또는 다른 항체보다 먼저 시료와 접촉·반응시키는 것 이외에는, 키트에 첨부된 취급 설명서에 따라, 및 자동 분석 장치를 사용한 통상적인 CK-MB 의 측정을 실시하면 된다.

본 발명의 CK-MB 측정 방법의 공정 3 은,「공정 2 에서 얻어진 결과에 기초하여 CK-MB 의 양을 구하는 공정」이다.

예를 들어, 공정 2 에서 측정한 광학적 변화량을, 예를 들어 미리 CK-MB 농도가 이미 알려진 표준액 등을 시료로서 사용하여 동일한 측정 방법으로 구한, CK-MB 농도와 광학적 변화량의 관계를 나타내는 검량선에 적용시킴으로써, 시료 중의 CK-MB 량을 산출하면 된다.

본 발명의 CK-MB 의 측정법 (공정 1 ∼ 공정 3) 을, 상기 (ⅰ) 의 방법 (본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 용액, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하는 용액을 조제하고, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 용액, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하는 용액의 순서로 시료와 혼합하는 방법) 으로, 또한 라텍스 입자를 사용한 면역 비탁법에 의해 측정하는 방법을 예로 들어 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같이 된다.

먼저, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 등의 CK-MB 를 측정해야 할 시료와, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 0.1 ∼ 200 ㎍Ab/㎖ 함유하는 제 1 시약을 접촉 혼합시키고, 통상적으로 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 에서, 통상적으로 1 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1 ∼ 15 분, 더욱 바람직하게는 5 분간 정도 반응시킨다. 이어서, 그 반응액과, 라텍스 입자에 고정화시킨 제 1 항체와 라텍스 입자에 고정화시킨 제 2 항체를 함유하는 제 2 시약을 혼합하고, 통상적으로 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 에서, 통상적으로 1 ∼ 60 분간, 바람직하게는 1 ∼ 15 분, 더욱 바람직하게는 5 분간 정도 반응시킨다. 그 결과 발생한 항원 항체 반응에서 기인하는 반응액의 흡광도 변화를, 예를 들어 340 ∼ 880 ㎚, 바람직하게는 540 ∼ 800 ㎚ 의 측정 파장에서 측정한다. 별도로 예를 들어 미리 농도가 이미 알려진 CK-MB 표준품을 시료로서 사용하여 동일하게 측정을 실시하고, CK-MB 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선을 작성해 둔다. 그리고, CK-MB 를 측정해야 할 시료를 사용하여 얻어진 측정값을 그 검량선에 적용시켜 CK-MB 의 농도를 구함으로써, 시료 중의 CK-MB 를 정량한다.

본 발명의 CK-MB 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향 회피 방법으로는, CK-MB 를 함유하는 시료에 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 첨가하여, 그 시료를 처리하는 방법을 들 수 있다. 그 때에 사용되는 시약 및 처리 방법의 구체예는, 상기 시료 중의 CK-MB 의 측정 방법의 란에 기재한 것을 들 수 있다.

본 발명의 CK-MB 측정용 키트는, 제 1 항체, 제 2 항체, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 시약을 구성 시약으로서 함유하여 이루어지는 것이면 된다. 각각의 구성 요소의 바람직한 양태, 구체예 및 농도 등에 대해서는, 상기의 본 발명의 CK-MB 의 측정 방법에 관한 설명에 기재한 바와 같다.

또, 당해 제 1 항체, 제 2 항체, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하는 시약은, 적당한 완충액 중에 본 발명에 관련된 항체나, 제 1 항체 고정화 불용성 담체, 제 2 항체 고정화 불용성 담체, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 등을 현탁시킨 현탁액 등의 용액 상태의 것, 혹은 이것을 동결시킨 동결품이나 동결 건조시킨 동결 건조품이어도 된다. 이 목적으로 사용되는 완충제 등의 구체예, 그 pH 및 농도는 상기한 바와 같다.

또, 이들 키트에 함유되는 시약 중에는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충제, 증감제, 계면 활성제, 방부제 (예를 들어 아지화나트륨, 살리실산, 벤조산 등), 안정화제 (예를 들어 알부민, 글로불린, 수용성 젤라틴, 당류 등), 부활제, 공존 물질의 영향 회피제, 그 밖에 이 분야에서 사용되고 있는 것으로서, 공존하는 시약과의 안정성을 저해하거나, 항원 항체 반응을 저해하지 않는 것을 갖고 있어도 된다. 또 이들 시약류 등의 농도 범위 등도, 자체 공지된 그 측정 방법에 있어서 통상적으로 사용되는 농도 범위 등을 적절히 선택하여 사용하면 된다.

또, 당해 키트가 복수의 시액으로 구성되는 경우, 각 시액 중에는, 측정 대상 성분을 측정하기 위해 필요한 시약류도 함유시키는데, 이들 시약류는, 각 시액을 혼합한 시점에서 목적으로 하는 성분 측정의 반응이 개시되도록 각 시액 중 어느 것에 적절히 분산시켜 함유시키면 된다. 이들 시액을 구성하는 시약류의 사용 농도는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 범위에서 적절히 선택하면 된다.

또한, 당해 키트에는, CK-MB 를 측정할 때에 사용되는 검량선 작성용의 CK-MB 표준품이 조합되어 있어도 된다. 그 표준품은, 시판되는 표준품을 사용해도 되고, 공지된 방법에 따라 제조된 것을 사용해도 상관없다.

추가로 또 본 발명의 키트에는, CK-MB 를 측정하는 방법의 설명서 등을 포함시켜 두어도 된다. 당해「설명서」란, 당해 방법에 있어서의 특징·원리·조작 순서, 판정 순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 당해 키트의 취급 설명서, 첨부 문서, 혹은 팸플릿 (리플릿) 등을 의미한다.

본 발명의 키트의 구체적인 실시양태로는, 예를 들어 이하와 같은 구성을 들 수 있다.

(1) 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 제 1 시약과, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하여 이루어지는 제 2 시약을 구성 시약으로 하는 것,

(2) 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 제 1 시약과, 제 1 항체를 함유하여 이루어지는 제 2 시약과, 제 2 항체를 함유하여 이루어지는 제 3 시약을 구성 시약으로 하는 것, 또는

(3) 제 1 항체와 제 2 항체와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 시약을 구성 시약으로 하는 것.

본 발명에 관련된 시료로는, CK-MB 를 함유하는 시료이면 되는데, 구체적으로는, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 관절액, 늑막액, 림프액, 골수액 등의 체액이나 뇨, 대변, 타액 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 혈청, 혈장 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1.

시판되는 CK-MB 측정 키트인 L 타입 와코 CK-MB mass (와코 순약 공업 (주) 제조) 를 사용하여, 키트의 첨부 문서의 기재에 따라, 이하와 같이 측정을 실시하였다.

상기 키트는, 서로 에피토프가 상이한 2 종의 항 CK-MB 항체를 각각 고정화시킨 라텍스 입자를 사용하여, 라텍스 비탁법에 의해 CK-MB 를 측정하는 방법에 사용하는 키트이다.

(1) CK-BB 시료의 조제

인간 뇌 유래 정제 CK-BB (Meridian Life Science, Inc.) 를 400 ng/㎖ 및 2000 ng/㎖ 가 되도록 인간 혈청에 첨가하여, CK-BB 시료로 하였다.

(2) 제 1 시약의 조제

키트에 첨부된 완충액에, 항 CK-B 항체로서 시판되는 마우스 항 CK-BB 모노클로날 항체인 MAb to CK-BB (Meridian Life Science, Inc. 제조), 또는 CKBB Monoclonal Antibody (Roche Diagnostics K. K. 제조) 를 첨가하여, 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ㎍/㎖ 농도의 항체 함유 완충액 (제 1 시약) 을 조제하였다.

또한, CK-BB 시료와 제 1 시약을 혼합하였을 때의 반응 용액 중의 항 CK-B 항체의 농도는, 각각 0, 1.2, 2.3, 4.9, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150 ㎍/㎖ 이다.

(3) 제 2 시약

키트에 첨부된 라텍스 시액을 제 2 시약으로서 사용하였다. 라텍스 시액은, 인식하는 에피토프가 서로 상이한 2 종류의 항 CK-MB 항체를 각각 고정화시킨 2 종류의 라텍스 입자를 함유한다.

(4) CK-MB 의 측정 (2 포인트 엔드법)

히타치 7170 자동 분석 장치 ((주) 히타치 하이테크놀로지즈 제조) 를 사용하여, 이하의 측정을 실시하였다.

즉, 상기 (1) 에서 조제한 CK-BB 시료 10 ㎕ 에 상기 (2) 에서 조제한 제 1 시약 150 ㎕ 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 5 분 보온 후, 제 2 시약 50 ㎕ 를 첨가하고 추가로 5 분 보온하였다. 제 2 시약 첨가 후 30 초 후부터 5 분 후까지의 660 ㎚ 에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

대조로서, 제 1 시약으로서 항 CK-B 항체를 함유하지 않는 완충액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 시약, 측정 기기를 사용하여, 동일한 방법으로, 동일한 시료 중의 CK-MB 의 측정을 실시하였다.

(5) 결과

항 CK-B 항체로서 MAb to CK-BB 를 함유하는 제 1 시약을 사용한 경우의 결과를 표 1 에 나타낸다.

또, 표 1 에는, 400 ng/㎖ 및 2000 ng/㎖ 의 CK-BB 시료를 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시하여 얻어진 측정값 (CK-MB 측정) 과, 측정에 사용한 CK-BB 시료의 농도에 대한 그 시료를 사용하여 CK-MB 측정을 실시하여 얻어진 CK-MB 측정값의 비율을 함께 나타낸다 (CK-BB 교차율).

[표 1]

본 실시예에서는, CK-MB 를 함유하지 않는 시료 중의 CK-MB 값을 측정하고 있게 된다. 그러나, 표 1 에 의하면, 예를 들어, 400 ng/㎖ 의 CK-BB 를 함유하는 시료를 사용하고, 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우 (항 CK-B 항체의 첨가 농도가 0 ㎍/㎖ 인 경우), 18.6 ng/㎖ 라는 측정값이 얻어졌다. 이 시료에는 400 ng/㎖ 의 CK-BB 가 함유되어 있는 점에서, 이 측정에서는 18.6 (ng/㎖)/400 (ng/㎖) × 100 ≒ 약 4.6 ％ 의 교차율로, CK-BB 를 후하게 측정하였음 (거짓 높은 값) 을 알 수 있다. 동일하게, 2000 ng/㎖ 의 CK-BB 를 함유하는 시료를 사용하고, 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우의 교차율은 5.3 ％ 였다.

이에 대하여, 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시하면, CK-BB 의 교차율이 현저하게 저하되었다. 예를 들어 5 ㎍/㎖ 의 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우의 CK-BB 교차율은 400 ng/㎖ 의 시료, 2000 ng/㎖ 의 시료를 사용한 어느 경우에도 0.8 ％ 였다. 즉, 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시하면, 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB) 를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우와 비교하여, CK-MB 측정값에 대한 CK-BB 의 영향을 현저하게 억제할 수 있었다.

동일하게, 항 CK-B 항체로서 CKBB Monoclonal Antibody 를 함유하는 제 1 시약을 사용한 경우의 결과를 표 2 에 나타낸다.

[표 2]

표 2 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 항 CK-B 항체 (CKBB Monoclonal Antibody) 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우에도, 항 CK-B 항체 (CKBB Monoclonal Antibody) 를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우와 비교하여, CK-BB 의 영향을 현저하게 억제할 수 있었다.

이상과 같은 점에서, 종래의 라텍스 비탁법에 의한 CK-MB 의 측정계에 항 CK-B 항체 (CKBB Monoclonal Antibody) 를 첨가함으로써, 시료 중에 존재하는 CK-BB 의 영향을 회피하여, CK-MB 에 특이성이 높은 측정을 실시할 수 있음을 알 수 있다.

또, 데이터는 나타내지 않았지만, 항 CK-B 항체로서 BiosPacific, Inc. 제조의 CK-BB Monoclonal Antibody, 또는 Fitzgerald I. I. 제조의 CKBB antibody 를 함유하는 제 1 시약을 사용하는 것 이외에는, 상기와 동일한 방법으로 CK-MB 의 측정을 실시하였다. 그 결과, 이들 항체를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우와 비교하여, CK-BB 의 영향을 현저하게 억제할 수 있었다. 따라서, 종래의 라텍스 비탁법에 의한 CK-MB 의 측정계에, 이들 CK-B 항체 (BiosPacific, Inc. 제조의 CK-BB Monoclonal Antibody 또는 Fitzgerald I. I. 제조의 CKBB antibody) 를 첨가함으로써, 시료 중에 존재하는 CK-B 의 영향을 회피하여, CK-MB 에 특이성이 높은 측정이 가능함을 알 수 있다.

실시예 2

실시예 1 의 결과로부터, 실시예 1 에서 사용한 항 CK-B 항체 (본 발명에 관련된 항 CK-B 항체) 가 라텍스 비탁법에 의한 CK-MB 측정시의 CK-BB 의 영향을 회피하는 것을 확인할 수 있었으므로, 이들 항체의 항원성을 이하의 방법으로 확인하였다.

(1) 웨스턴 블로팅

0.1 ㎎/㎖ 의 인간 뇌 유래 정제 CK-BB (Meridian Life Science, Inc.) 2 ㎕ 를 SuperSep^TM (전기 영동용 겔, 와코 순약 공업 (주), 5 ∼ 20 ％ 의 그래디언트 겔) 에 어플라이하여, SDS-PAGE 전기 영동 (정전류 25 ㎃) 을 실시하였다. 이어서, 영동 후의 획분을 세미드라이 블로팅법으로 PVDF 멤브레인에 전사하였다.

PBS-T (Phosphate Buffered Saline with Tween^TM 20, pH 7.4, 와코 순약 공업 (주)) 에 4 w/v％ 농도가 되도록 블록 에이스 (DS 파마 바이오메디컬 (주) 제조) 를 용해시켜 블로킹액으로 하였다. 이 블로킹액에 상기 전사 후의 PVDF 멤브레인을 침지시키고, 1 시간 실온에서 블로킹 처리하였다. 이어서, 각 획분의 레인마다 PVDF 멤브레인을 절단하여, 각각 새로운 블로킹액에 침지시켰다.

이어서, CK 의 B 서브유닛의 전체 아미노산 배열 (배열 번호 1) 중의 각각 200aa-300aa (N 말단으로부터 200 ∼ 300 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분) 를 항원으로 하는 (인식하는) 항 CK-B 항체, 350aa-C 말단 (N 말단으로부터 350 번 ∼ C 말단 아미노산까지의 아미노산 배열 부분) 을 항원으로 하는 항 CK-B 항체, 165aa-357aa (N 말단으로부터 165 ∼ 357 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분) 를 항원으로 하는 항 CK-B 항체, 또는 1aa-100aa (N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분) 를 항원으로 하는 항 CK-B 항체로서, 시판되는 토끼 항 CK-BB 폴리클로날 항체 (모두 Abcam plc 제조) 4 종을 각각 PVDF 멤브레인을 침지시킨 블로킹액에 첨가하고, 실온에서 2 시간 처리하였다.

이어서, 실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 항 CK-B 항체 (Mab to CK-BB 또는 CK-BB Monoclonal Antibody, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체) 를, 상기 멤브레인을 침지시킨 블로킹액에 추가로 첨가하고, 4 ℃ 에서 밤새도록 침지시켰다. 이어서 블로킹액을 충분량의 PBS-T 로 교환하여 멤브레인을 PBS-T 에 10 분간 침지시킨 후, 새로운 BPS-T 로 교환하는 방법으로 멤브레인을 3 회 세정하였다. 그 후 새로운 블로킹액에 멤브레인을 침지시키고, Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP (DAKO A/S) 를 블로킹액에 첨가하여 실온에서 1 시간 침지시켰다. 이어서, 충분량의 PBS-T 로 멤브레인을 세정하고, ECL^TM Prime Western Blotting Detection Reagent (퍼옥시다아제의 화학 발광 기질, GE Healthcare 제조) 로 발광시키고, LAS4000 (후지 필름 (주) 제조) 을 사용하여 노광 시간 10 초에서 검출하였다.

(2) 결과

본 발명에 관련된 항 CK-B 항체로서 MAb to CK-BB 를 사용하여 얻어진 결과를 도 1 에, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체로서 CK-BB Monoclonal Antibody 를 사용하여 얻어진 결과를 도 2 에 각각 나타낸다.

도 1 및 도 2 에 있어서, CK-BB 의 전기 영동 획분의 위치를 화살표로 나타낸다.

또, 도 1 및 도 2 에 있어서「첨가 없음」은,「토끼 항 CK-B 항체를 사용한 전기 영동 획분의 전처리를 실시하지 않은」경우를 나타낸다.

또한, 예를 들어「200-300」은,「CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 200 ∼ 300 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체와 전기 영동 획분을 먼저 반응시킨 후, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 [MAb to CK-BB (도 1) 또는 CKBB Monoclonal Antibody (도 2)] 와 추가로 반응시킨 경우」의 결과를 나타낸다.

「350-C」는,「CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 350 번 ∼ C 말단 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체와 전기 영동 획분을 먼저 반응시킨 후, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 [MAb to CK-BB (도 1) 또는 CKBB Monoclonal Antibody (도 2)] 와 추가로 반응시킨 경우」의 결과를 나타낸다.

「165-357」은,「CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 165 ∼ 357 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체와 전기 영동 획분을 먼저 반응시킨 후, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 [MAb to CK-BB (도 1) 또는 CKBB Monoclonal Antibody (도 2)] 와 추가로 반응시킨 경우」의 결과를 나타낸다.

「1-100」은,「CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체와 전기 영동 획분을 먼저 반응시킨 후, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 [MAb to CK-BB (도 1) 또는 CKBB Monoclonal Antibody (도 2)] 와 추가로 반응시킨 경우」의 결과를 나타낸다.

도 1 및 도 2 로부터 분명한 바와 같이,「1-100」의 경우, 즉「CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체와 전기 영동 획분을 먼저 반응시킨 후, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 [MAb to CK-BB (도 1) 또는 CKBB Monoclonal Antibody (도 2)] 와 추가로 반응시킨 경우」에만, 획분의 염색 정도가 현저하게 감소하였다.

이것은, 사용한 토끼 항 CK-B 항체 (CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분을 항원으로 하는 토끼 항 CK-B 항체) 와 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB 및 CKBB Monoclonal Antibody) 가, 항원 (CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산까지의 아미노산 배열 부분) 에 대하여 경합하였음을 나타낸다.

이상과 같은 점에서, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 (MAb to CK-BB 및 CKBB Monoclonal Antibody) 는, CK 의 B 서브유닛의 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항체임이 밝혀졌다.

비교예 1.

이하의 방법으로, CK 의 B 서브유닛의「N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역」이외의 영역을 인식하는 항체가, CK-MB 의 측정에 있어서의 CK-BB 의 영향을 회피할 수 있는지를 조사하였다.

(1) CK-BB 시료의 조제

실시예 1 과 동일한 CK-BB 시료를 사용하였다.

(2) 제 1 시약의 조제

키트 (L 타입 와코 CK-MB mass) 에 첨부된 완충액에 하기의 각각 상이한 영역을 인식하는 시판되는 항 CK-B 항체를 첨가하여, 5 ㎍/㎖ 농도의 항체 함유 완충액 (제 1 시약) 을 각각 조제하였다. 각 항체의「항원」은, 각 항체의 첨부 문서의 항원 영역에 관한 기재에 기초한다.

항체 a : CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 200 ∼ 300 번 아미노산까지의 아미노산 배열을 인식하는 항 CK-B 항체 (토끼 항 CK-BB 폴리클로날 항체, Abcam plc 제조)

항체 b : CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 350 번 ∼ C 말단 아미노산까지의 아미노산 배열을 인식하는 항 CK-B 항체 (토끼 항 CK-BB 폴리클로날 항체, Abcam plc 제조)

항체 c : CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 165 ∼ 357 번 아미노산까지의 아미노산 배열을 인식하는 항 CK-B 항체 (토끼 항 CK-BB 폴리클로날 항체, Abcam plc 제조)

항체 d : MAb to CK-BB (Meridian Life Science, Inc. 제조, 실시예 1 에서 사용한 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체).

(3) 제 2 시약

실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 키트에 첨부된 라텍스 시액을 제 2 시약으로서 사용하였다.

(4) CK-MB 의 측정 (2 포인트 엔드법)

실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 기기를 사용하여, 동일한 방법으로 CK-MB 의 측정을 실시하였다.

(5) 결과

결과를 표 3 에 나타낸다.

또, 표 3 에는, 400 ng/㎖ 및 2000 ng/㎖ 의 CK-BB 시료를 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시하여 얻어진 측정값 (CK-MB 측정) 과, 측정에 사용한 CK-BB 시료의 농도에 대한 그 시료를 사용하여 CK-MB 측정을 실시하여 얻어진 CK-MB 측정값의 비율을 함께 나타낸다 (CK-BB 교차율).

[표 3]

표 3 으로부터 분명한 바와 같이, 항체 a ∼ c 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우에는, 항체 a ∼ c 를 함유하지 않는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우와 비교하여, CK-BB 와의 교차율에 거의 변화가 없었다. 항체 d (본 발명에 관련된 항 CK-B 항체) 를 함유하는 제 1 시약을 사용하여 CK-MB 의 측정을 실시한 경우에만, CK-BB 와의 교차율이 현저하게 저하되었다.

이상과 같은 점에서, CK 의 B 서브유닛의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노의 영역 이외의 영역을 인식하는 항체 (항체 a ∼ c) 는, CK-MB 의 측정계에 대한 CK-BB 의 영향을 억제할 수 없음을 알 수 있다.

실시예 3

실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 시판되는 CK-MB 측정 키트인 L 타입 와코 CK-MB mass (와코 순약 공업 (주)) 를 사용하여, 키트의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라, 이하의 측정을 실시하였다.

(1) 본 발명의 방법에 의한 CK-MB 의 측정

1) 측정 시료

(주) 베리타스·닛토보 메디컬 (주) 나 코쿠사이 바이오 (주) 로부터 구입한 혈청 중에서 CK-BB 가 함유되어 있는 것을 확인한 인간 혈청을 측정 시료로서 사용하였다.

2) 제 1 시약의 조제

키트에 첨부된 완충액에 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체 (Mab to CK-BB 또는 CK-BB Monoclonal Antibody) 를 첨가하여, 5 ㎍/㎖ 농도의 항체 함유 완충액 (제 1 시약) 을 조제하였다.

또한, 측정 시료와 제 1 시약을 혼합하였을 때의 반응 용액 중의 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체의 농도는 4.7 ㎍/㎖ 이다.

3) 제 2 시약

실시예 1 과 동일한 키트에 첨부된 라텍스 시액을 제 2 시약으로서 사용하였다.

4) CK-MB 의 측정 (2 포인트 엔드법)

LABOSPECT008 자동 분석 장치 ((주) 히타치 하이테크놀로지즈 제조) 를 사용하여 측정을 실시하였다. 상기 1) 의 CK-MB 함유 시료 7 ㎕ 에 상기 2) 에서 조제한 제 1 시약 100 ㎕ 를 혼합하고, 37 ℃ 에서 5 분 보온 후, 제 2 시약 33 ㎕ 를 첨가하고 추가로 5 분 보온하였다. 라텍스 시액 첨가 후 30 초 후부터 5 분 후까지의 660 ㎚ 에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

대조로서, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 함유하지 않는 완충액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 시약, 측정 기기를 사용하여, 동일한 방법으로, 동일한 시료 중의 CK-MB 의 측정을 실시하였다.

(2) 종래법 (전기 화학 발광 면역 측정법) 에 의한 CK-MB 의 측정

동일한 시료 중의 CK-MB 를, 전기 화학 발광 면역 측정법에 의한 CK-MB 측정용 키트인 에크루시스 시약 CK-MBII (로슈·다이아그노스틱스 주식회사 제조) 를 사용하여, cobas8000 (로슈·다이아그노스틱스 주식회사 제조) 을 사용하여 측정하였다.

(3) 결과

결과를 하기 표 4 에 나타낸다.

[표 4]

표 4 에 있어서, CK-MB 단백량의 참고 기준값「5.0 ng/㎖ (임상 검사법 제요 제33판으로부터)」이하의 CK-MB 값이 얻어진 경우에 음영을 부여하여 나타냈다.

표 4 로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 측정값 (「Mab to CK-BB 첨가」또는「CKBB Monoclonal Antibody 첨가」) 은, 본 발명에 관련된 항 CK-B 항체를 공존시키지 않고 실시하는 종래의 라텍스 비탁법에 의해 얻어진 측정값 (「항 CK-B 항체 무첨가」) 과 비교하여, 종래의 전기 화학 발광 면역 측정법에 의한 측정값과 컷 오프 판정이 완전히 일치하고 있어, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 측정값의 신뢰도가 높음을 알 수 있다.

산업상 이용가능성

본 발명의 CK-MB 의 측정 방법은, 시료 중에 CK-BB 가 공존하고 있어도, 그 영향을 회피하여, CK-MB 를 특이적으로 측정할 수 있다. 또, 본 발명의 CK-MB 의 측정 방법은, 범용 자동 분석 장치에도 적용할 수 있으므로, 임상 검사의 분야에 있어서 CK-MB 의 측정에 사용할 수 있는 점에서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. <120> Methd of detecting CK-MB <130> F1984WAKOPAT <150> JP2014-093351 <151> 2014-04-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Phe Ser Asn Ser His Asn Ala Leu Lys Leu Arg Phe Pro Ala 1 5 10 15 Glu Asp Glu Phe Pro Asp Leu Ser Ala His Asn Asn His Met Ala Lys 20 25 30 Val Leu Thr Pro Glu Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Ala Lys Ser Thr Pro 35 40 45 Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro 50 55 60 Gly His Pro Tyr Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Glu Asp Arg 85 90 95 His Gly Gly Tyr 100 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Phe Ser Asn Ser His Asn Ala Leu Lys Leu Arg Phe Pro Ala 1 5 10 15 Glu Asp Glu Phe Pro Asp Leu Ser Ala His Asn Asn His Met Ala Lys 20 25 30 Val Leu Thr Pro Glu Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Ala Lys Ser Thr Pro 35 40 45 Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Val Ile Gln Thr Gly Val Asp Asn Pro 50 55 60 Gly His Pro Tyr Ile Met Thr Val Gly Cys Val Ala Gly Asp Glu Glu 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Asp Pro Ile Ile Glu Asp Arg 85 90 95 His Gly Gly Tyr Lys Pro Ser Asp Glu His Lys Thr Asp Leu Asn Pro 100 105 110 Asp Asn Leu Gln Gly Gly Asp Asp Leu Asp Pro Asn Tyr Val Leu Ser 115 120 125 Ser Arg Val Arg Thr Gly Arg Ser Ile Arg Gly Phe Cys Leu Pro Pro 130 135 140 His Cys Ser Arg Gly Glu Arg Arg Ala Ile Glu Lys Leu Ala Val Glu 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ser Leu Asp Gly Asp Leu Ala Gly Arg Tyr Tyr Ala Leu 165 170 175 Lys Ser Met Thr Glu Ala Glu Gln Gln Gln Leu Ile Asp Asp His Phe 180 185 190 Leu Phe Asp Lys Pro Val Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ser Gly Met Ala 195 200 205 Arg Asp Trp Pro Asp Ala Arg Gly Ile Trp His Asn Asp Asn Lys Thr 210 215 220 Phe Leu Val Trp Val Asn Glu Glu Asp His Leu Arg Val Ile Ser Met 225 230 235 240 Gln Lys Gly Gly Asn Met Lys Glu Val Phe Thr Arg Phe Cys Thr Gly 245 250 255 Leu Thr Gln Ile Glu Thr Leu Phe Lys Ser Lys Asp Tyr Glu Phe Met 260 265 270 Trp Asn Pro His Leu Gly Tyr Ile Leu Thr Cys Pro Ser Asn Leu Gly 275 280 285 Thr Gly Leu Arg Ala Gly Val His Ile Lys Leu Pro Asn Leu Gly Lys 290 295 300 His Glu Lys Phe Ser Glu Val Leu Lys Arg Leu Arg Leu Gln Lys Arg 305 310 315 320 Gly Thr Gly Gly Val Asp Thr Ala Ala Val Gly Gly Val Phe Asp Val 325 330 335 Ser Asn Ala Asp Arg Leu Gly Phe Ser Glu Val Glu Leu Val Gln Met 340 345 350 Val Val Asp Gly Val Lys Leu Leu Ile Glu Met Glu Gln Arg Leu Glu 355 360 365 Gln Gly Gln Ala Ile Asp Asp Leu Met Pro Ala Gln Lys 370 375 380

Claims

하기 공정으로 이루어지는 시료 중의 CK-MB 의 측정 방법 ;
(1) 시료와, 크레아틴키나아제 MB 아이소자임 (이하,「CK-MB 」로 약기한다) 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, 크레아틴키나아제의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 반응시키는 공정 (공정 1),
(2) 그 반응에 의해 발생한 광학적 변화를 측정하는 공정 (공정 2),
(3) 공정 2 에서 얻어진 결과에 기초하여, 당해 시료 중의 CK-MB 의 양을 구하는 공정 (공정 3).
제 1 항에 있어서,
공정 1 이, 시료와 당해 항 CK-B 항체를 반응시킨 후, 제 1 항체 및 제 2 항체를 반응시킴으로써 이루어지는 방법.
제 1 항에 있어서,
당해 항 CK-B 항체가 인식하는 영역이, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것인 방법.
제 1 항에 있어서,
광학적 변화가 흡광도 변화, 탁도 변화, 또는 산란광 강도 변화인 방법.
제 1 항에 있어서,
제 1 항체 및/또는 상기 제 2 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는 방법.
제 5 항에 있어서,
불용성 담체가 라텍스 입자인 방법.
크레아틴키나아제의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체로 시료를 처리하는 것을 특징으로 하는 CK-MB 측정에 있어서의 크레아틴키나아제 BB 아이소자임의 영향 회피 방법.
CK-MB 에 대한 제 1 항체와, 제 1 항체와는 인식하는 에피토프가 상이한 CK-MB 에 대한 제 2 항체와, 크레아틴키나아제의 B 서브유닛의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 1 ∼ 100 번 아미노산의 영역을 인식하는 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 CK-MB 측정용 키트.
제 8 항에 있어서,
당해 항 CK-B 항체를 함유하여 이루어지는 제 1 시약과, 제 1 항체와 제 2 항체를 함유하여 이루어지는 제 2 시약을 함유하여 이루어지는 키트.
제 8 항에 있어서,
당해 항 CK-B 항체가 인식하는 영역이, 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것인 키트.
제 8 항에 있어서,
제 1 항체 및/또는 상기 제 2 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는 키트.
제 11 항에 있어서,
불용성 담체가 라텍스 입자인 키트.