JPH08508510A

JPH08508510A - Ｃｋ−ｍｂに対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH08508510A
Application number: JP6523884A
Authority: JP
Inventors: ヒュブナー−パラジツ，クリスタ; エッシグ，ウルリッヒ; ラング，フリードル; ヴォーゲル，ルドルフ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1996-09-10
Anticipated expiration: 2013-07-09
Also published as: EP0698117B1; DE59410219D1; ATE229080T1; WO1994025617A3; EP1254913A1; WO1994025617A2; DE4314254A1; JP2774875B2; EP0698117A1; DK0698117T3; US5817469A; ES2189802T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢのＢサブユニットにもＭサブユニットにも、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも結合しないモノクローナル抗体、並びにこれら抗体を用いる均一診断検査でのＣＫ−ＭＢを診断的検出方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体本発明は、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢのＢサブユニットにもＭサブユニットにも、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも結合しないモノクローナル抗体、並びに診断検査においてこれら抗体を用いてＣＫ−ＭＢを検出する方法に関する。クレアチンキナーゼ（ＡＴＰ：クレアチン−Ｎ−ホスホトランスフェラーゼ，ＥＣ 2.7.3.2.）は、ＡＴＰの存在下でのクレアチンのリン酸クレアチンへの可逆的リン酸化を触媒する。この酵素は、そのＭ（筋特異性）型及びＢ（脳特異性）型が知られている２つのサブユニットから構成されており、それらは互いに７８．７％の相同性を有する。このダイマー酵素は、２つの同一サブユニットから構成されている（筋特異性ＣＫ−ＭＭイソ酵素及び脳特異性ＣＫ−ＢＢイソ酵素）か又はヘテロダイマーとして存在している。このヘテロダイマーＣＫ−ＭＢイソ酵素は、心筋に対して特異性であるので心筋層が傷ついた場合、例えば、心筋梗塞、進行性筋ジストロフィー又は毒性ミオパシーの場合にはとりわけ血清中で検出できる。その高い特異性のために、血清中でのＣＫ−ＭＢの確認は、心筋梗塞の診断の重要な緊急パラメーターである。従って、血清中のＣＫ−ＭＢを確認する幾つかの方法が既に記載されており、それら方法では、ＣＫ−ＭＢは電気泳動若しくはイオンクロマトグラフィー分離により検出され、又はある抗体でＭサブユニットを阻害しながら活性をラジオイムノアッセイにより若しくは酵素的測定により検出されている。しかしながら、これら方法は非常に時間を浪費する。ＣＫ−ＭＢの確認は特に緊急時に重要なので、適する検査はＣＫ−ＭＢに特異性であるだけでなく、迅速に行われるものでなければならない。従って、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢに対する抗体を用いてサンドイッチアッセイによりＣＫ−ＭＢを検出するイムノアッセイも記載されている。理論的にはこの方法によりＣＫ−ＭＢだけが検出可能な筈であるが、そのようなサンドイッチアッセイは、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢによる干渉を非常に受け易いことが明らかになった。というのは、抗ＣＫ−ＭＭ抗体はＣＫ−ＢＢとも交叉反応し、そして抗ＣＫ−ＢＢ抗体もＣＫ−ＭＭと交叉反応するからである。従って、そのようなサンドイッチアッセイは、容易に偽陽性結果をもたらす。ＣＫ−ＭＢに対して特異的なモノクローナル抗体も、Vaidyaら（Clin．Chem．32，1986，657-663）により開発された。これら抗体のうちの１種は、特によく特徴づけされている。この抗体は、いわゆる“Conan”抗体と言われており、ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体の基準抗体であると考えられている。しかしながら、この抗体及びこれまでに開発されたＣＫ−ＭＢに対する他の一連のモノクローナル抗体はＣＫ−ＭＢに対して低い親和性しか有さず、更に、全てが同じエピトープ、つまりＣＫ−ＭＢのいわゆる“Conan”エピトープしか認識しないので、これら抗体でのサンドイッチアッセイは可能ではない。これまでに記載されたサンドイッチアッセイでは、ただ１種のＣＫ−ＭＢ特異的モノクローナル抗体を用いるに過ぎない。第２抗体はＭ又はＢサブユニットに対する抗体なのでＣＫ−ＭＭ又はＣＫ−ＢＢをも認識する。従って、本発明の目的は、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも結合しないＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体を提供することである。この目的は、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのその結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるモノクローナル抗体により達成される。このモノクローナル抗体は、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するがＣＫ− ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合せずかつ“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングすることにより得ることができる。ＣＫ−ＭＢと特異的に反応するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に反応しないそのような抗体は、Ｍサブユニット並びにＢサブユニットにより形成されるコンフォメーションエピトープを認識するに違いない。抗体の結合領域は約６〜１０アミノ酸の抗原をエピトープとして認識するので、ＣＫ−ＭＢの２つのサブユニットそれぞれはこのコンフォメーションエピトープの約５アミノ酸を分担する。加えて、そのアミノ酸側鎖の立体配置並びにそれらの親水性のために、タンパク質配列の特定の部分だけが免疫原性であるに過ぎない。このことから、ダイマー抗原は、通常は、両サブユニットが互いにそれらの特異性に貢献している非常に少数のコンフォメーションエピトープを有するに過ぎない。従って、ＣＫ−ＭＢイソ酵素上の４つの異なるコンフォメーションエピトープを認識し、かくしてサンドイッチアッセイに適するか又はトリプレット形成（triplet formation）にさえ適するＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体を見出せたのは驚くべきことである。これら４エピトープは、第１エピトープについての“Conan MB 抗体”ＡＴＣＣＨＢ８９３９の結合並びに本発明のモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９及び／又はＤＳＭＡＣＣ２０５７の結合により、第２エピトープについてのモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８の結合により、第３エピトープについてのモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０６０の結合により、並びに第４エピトープについてのモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合により特徴付けられる。驚いたことに、モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５９及びＤＳＭＡＣＣ２１６８がこれまでに知られているＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体よりもＣＫ−ＭＢへの結合について大きな結合定数を有することが明らかになった。従って、これらモノクローナル抗体はＣＫ−ＭＢと非常に速やかに反応するので迅速な診断検査に特に適する。従って、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1 の結合定数を有する本発明のＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体は好ましいものである。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくはＩｇＧ１アイソタイプのモノクローナル抗体である。本発明のＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体は、ＣＫ−ＭＢ上の異なるエピトープを認識する２種の抗体を用いることを条件として、ＣＫ−ＭＢを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ用にどのようにお互いを組み合わせても並びにどのようにＣＫ−ＭＢに対する既知の抗体と組み合わせてもよい。本発明の抗体は、もちろん、クレアチンキナーゼのＭ又はＢサブユニットに対する抗体とも組み合わせることができる。できるだけ敏感である検査のためには、これら抗体はＣＫ−ＭＢに対して高い親和性を更に有するべきである。驚いたことに、前述のモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９及びＤＳＭＡＣＣ２０５７は、ＣＫ−ＭＢのこのエピトープに対するこれまでに知られた抗体よりも高い親和定数（affinity constan t）を有することが明らかになった。従って、本発明は、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのその結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９の結合と同等の様式で起こるモノクローナル抗体であって、ＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^- ¹ ×１の親和定数を有するモノクローナル抗体にも関する。このモノクローナル抗体は、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合せず、“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ −ＭＢへの結合から放逐されず、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸ モル^-1×１×秒^-1の親和定数を有する抗体を産生する不死化細胞をクローニングするステム（Pharmacia LKB）により速度評価キットソフトウェアー（Pharmacia LKB ，識別番号 BR-1000-19）を用いて行われる。上に挙げたモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７及びＤＳＭＡＣＣ２０５９は、更に４×１０^-4秒^-1未満の解離定数しか有さない。これは、抗体とＣＫ−ＭＢの複合体が非常にゆっくりにしか再び解離しないことを意味している。このことは、例えば、ＩＥＭＡ（イムノエンザイムメトリックアッセイ）の如き一定の免疫学的検査方法にとって大切である。というのは、抗体−ＣＫ−ＭＢ複合体の急速な解離は、標識抗体の分析物及び固定化抗原への結合の間に競合反応をもたらし、かくして誤った測定値を生じ得るからである。従って、本発明の好ましい主題は、モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９と同等の様式でＣＫ−ＭＢに結合し、かつ４ ×１０^-4秒^-1未満の解離定数しか有さないＣＫ−ＭＢイソ酵素に対する本発明のモノクローナル抗体である。本発明のそれらモノクローナル抗体は、更にＣＫ− ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する。本発明の抗体は、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素で免疫感作することにより得ることができる。驚いたことに、このマウス種を免疫感作すると、これのために慣用的に用いられているＢａｌｂ／ｃマウスよりもかなり高い抗体力価が得られることが明らかになった。加えて、免疫感作のために水酸化アルミニウム及び百日咳菌にＣＫ−ＭＢを吸着させることが、コンフォメーションエピトープに対する本発明の抗体を産生させるのに特に有益であることが分かった。約４ヶ月後に免疫感作したマウスの脾臓細胞を不死化し、所望の抗体を産生する不死化細胞をクローン化する。脾臓細胞の不死化は当業者にとって既知の方法に従って行われる。これら細胞を好ましくは骨髄腫細胞と融合させる。所望の抗体を産生する不死化細胞は、その培養上清液のサンプルのＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ又はＣＫ−ＢＢとの反応性を並行して確認することにより同定される。ＣＫ−ＭＢのコンフォメーションエピトープに対する所望の抗体は、ＣＫ−ＭＢと反応するがＣＫ−ＭＭともＣＫ−ＢＢとも実質的に反応しない。実質的に反応しないという用語は、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢとの反応性が低いために、ＣＫ−ＭＢを検出するための免疫学的検査において、生理学的濃度のＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢの存在により生ずる干渉が１％未満、好ましくは０．１％未満であることを意味する。この場合、ＣＫ−ＭＭとの反応は極微でなければならない。というのは、ＣＫ−ＭＭは血清又は血漿中に高濃度で存在するからである。ＣＫ−ＭＢは血清又は血漿中に極めて低濃度でしか存在しないので、これら抗体とこのイソ酵素との僅かな反応は取るに足らない。適切な不死化細胞は、慣用的方法により、例えば、蛍光活性化細胞選別装置による分離によりクローン化される。モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８と同等の様式でＣＫ−ＭＢに結合する抗体を産生するクローンを同定するのに、競合検査系を用いる。この目的のために、例えば、エンザイムイムノアッセイを用いて、その抗体がＣＫ−ＭＢへの結合について“Conan MB抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）とどの程度競合するかを検査する。このために、標識した形の“Conan MB抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）及び過剰の検査対象の抗体と共にＣＫ−ＭＢをインキュベートする。次いで、生成した複合体を固定化し、液相からその固体を分離し、そしてその２相のうちの１相中で結合した標識を測定することにより、検査対象の抗体が“Conan MB抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりその結合から放逐されるかを確認することができる。放逐されない場合は、ＣＫ−ＭＢへの結合は、殆ど間違いなく、モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式に相当する。ＣＫ−ＭＢへの結合について所望の結合定数若しくは解離定数を有するか又はＣＫ−ＭＢに対する所望の親和性を有する抗体を産生するクローンを同定するには、生成した抗体のＣＫ−ＭＢに対する結合定数、解離定数又は親和性を培養上清液のサンプル中（Pharmacia LKB，速度評価キット，識別番号BR-1000-19）により行われる。このようにして、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８を得ることが可能になった。本発明の特に好ましい主題は、ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及び／又はＤＳＭＡＣＣ２１６８のうちの１種から得ることができるモノクローナル抗体並びに前記ハイブリドーマ系である。加えて、本発明は、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのその結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるモノクローナル抗体を製造する方法であって、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、その免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合せず、かつ“Conan MB抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングし、そしてそのクローン化細胞又はそれらの培養上清液から既知の方法によりそのモノクローナル抗体を単離することによる方法に関する。本発明の方法の特定の態様では、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１× １０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数又は４×１０^-4秒^-1未満の解離定数又は少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する抗体を産生するクローンを選択する。本発明のモノクローナル抗体の助力により、ＣＫ−ＭＢの診断測定のための免疫学的検査操作であってＣＫ−ＭＢに特異的で異なるエピトープに対して高親和性の２種の抗体を必要とする操作が可能となる。従って、本発明は、更に、診断検査においてＣＫ−ＭＢを測定するための本発明のモノクローナル抗体の使用に関する。この測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＷＯ８６／０２７３４、ＷＯ８７／０６７０６、ＷＯ９２／１４１３８）、ラジオイムノアッセイ、蛍光偏光（polarization）イムノアッセイ、ＣＥＤＩＡ（Hendersonら，Clin．Chem．32（1986），1637-1641及び米国特許第４，７０８，９２９号）、ＩＥＭＡ又はＥＭＩＴの如き全ての慣用的なイムノアッセイによって行うことができる。この場合、この検査は、均一検査、例えば、競合イムノアッセイを経るもの並びに不均一検査として行うことができる。検査は、好ましくは、複数の反応パートナーのうちの１種の固定化で行われる。いわゆるＬＰＩＡ検査（ラテックス粒子イムノアッセイ）による測定が好ましい。このために、ＣＫ−ＭＢの異なるエピトープに対する２種の抗体をまずユニバーサルストレプトアビジンラテックスマトリックスに結合させる。次いで、これら結合体をサンプル又はＣＫ−ＭＢ標準物質と共にインキュベートし、その凝集により生ずる吸光度の増加を測定することにより、ＣＫ−ＭＢの測定を行う。従って、本発明は、均一診断検査でのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、本発明の少なくとも１種の抗体をラテックス粒子に結合させ、そしてサンプル溶液と共に、そして該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なるラテックス結合抗体と共にインキュベーションした後、該ラテックス結合抗体の凝集を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの濃度の指標として測定する方法にも関する。この場合、血清サンプルがサンプル溶液として用いられる。原則として、ＣＫ −ＭＢと反応するあらゆる抗体、即ち、クレアチンキナーゼのＢ又はＭサブユニットに対する抗体も、ラテックス粒子に結合させる第２抗体として用いることができる。しかしながら、好ましくは、ＣＫ−ＭＢのコンフォメーションエピトープに対する本発明の高親和性抗体を第２ラテックス結合抗体として用いる。ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８により産生される抗体がこれら２種のラテックス結合抗体の１種として特に好ましく用いられる。この場合、抗体は完全抗体としてでも機能性抗体断片としてでも用いることができる。Ｆａｂ’断片が好ましく用いられる。更に、本発明は、ＣＥＤＩＡ法による不均一診断検査においてＣＫ−ＭＢを検出する方法であって、本発明の抗体を用いる方法に関する。このＣＥＤＩＡ法では、２種の成分として存在するβ−ガラクトシダーゼの如き特定の酵素であって、そのそれぞれの成分が酵素的に不活性な大きなポリペプチド（酵素アクセプターＥＡ）と小さなポリペプチド（酵素ドナーＥＤ）である酵素をその検査に用いる。これら成分は、自発的に結合して酵素的に活性なタンパク質を形成する。ペプチド抗原は、ＣＫ−ＭＢの場合にはこのイソ酵素又はＣＫ−ＭＢ特異的エピトープを含有するその断片であるが、それがＥＤとＥＡとの結合を妨害しないようにしてＥＤと結合する。このＥＤとＥＡとの結合は、そのペプチド抗原に対する抗体がペプチド抗原−ＥＤ複合体に結合するときに阻害される。ＥＡ、ペプチド抗原−ＥＤ複合体、及びペプチド抗原特異的抗体が存在する試薬溶液中では、活性な酵素を生成することができない。ペプチド抗原、又はＣＫ−ＭＢ検査の場合におけるＣＫ−ＭＢイソ酵素を含有するサンプル溶液の添加後は、ＣＫ−ＭＢが、活性なＥＤ／ＥＡ複合体が生成するのを可能にする本発明の抗体への結合についてそのペプチド抗原−ＥＤ複合体と競合する。かくして、測定されるシグナルは、そのサンプル中に存在するＣＫ −ＭＢイソ酵素の量に比例する。このＣＥＤＩＡ法では、モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９と同等の様式でＣＫ−ＭＢに結合し、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する抗体がよく適している。７．０×１０⁸モル^-1×１の特に高い親和定数を有するモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９が特に好ましい。本発明は、更に、サンドイッチアッセイによるＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、本発明の少なくとも１種の抗体を固相に結合させ、サンプル溶液と共に、そして該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なる標識抗体と共にインキュベートして該固相と液相とを分離した後に、該２相のうちの１相中で該標識を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの濃度の指標として測定する方法に関する。この場合、好ましくは、ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８により産生される抗体が、２種の抗体のうちの１種として用いられる。第１抗体の固相への固定化は、当業者にとって既知の方法で達成される。好ましくは、抗体をビオチニル化し、そしてストレプトアビジンでコーティングした固相に結合させる。第２抗体は、慣用法で、例えば、酵素、蛍光性色素若しくは化学発光性色素での直接標識により、又は該第２抗体に向けられかつ適切な方法で標識された更なる抗体に結合させることにより標識される。ＷＯ８６／０２７３４、ＷＯ８７／０６７０６又はＷＯ９２／１４１３８に記載された電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイによる検出も好ましい。このためには、ＣＫ−ＭＢに対する抗体をまず磁性粒子に結合させる。この結合は、好ましくは、ストレプトアビジン及びビオチンにより達成される。ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子及びビオチニル化ＣＫ−ＭＢ抗体を用いる。本発明のＣＫ−ＭＢに対する第２抗体は、第１抗体からの異なるエピトープを認識しなければならない。この第２抗体を標識にカップリングさせる。ＷＯ８６／０２７３４及びＷＯ８７／０６７０６に記載された電気化学発光性化合物をこの標識として用いる。トリス（ビスピリジル）ルテニウムがこの標識として好ましく用いられる。この標識をその抗体に当該技術分野の現状の方法に従ってカップリングさせる。本発明の２種の抗体とサンプル及び磁性粒子とのインキュベーションは、同時に行っても連続的に行ってもよい。ＷＯ９０／１１５１１に記載された装置が測定に用いられる。このＥＣＬイムノアッセイでは、モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９又はＤＳＭＡＣＣ２０５７と同等の様式でＣＫ−ＭＢに結合する第１抗体が好ましく用いられる。第２抗体は、もう１つのエピトープと好ましくはＤＳＭＡＣＣ２０５８と同等の様式で結合する。サンドイッチアッセイでは、両方ともにＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するがＣＫ −ＭＢイソ酵素の単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも、そしてＣＫ− ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも結合せず、かつＣＫ−ＭＢ上の同じ結合部位について互いに競合しない２種のモノクローナル抗体であって、その少なくとも１種がＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗体を用いるのが特に有益であることが分かった。特に好ましくは、これら抗体のうち少なくとも１種は１．９×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する。本発明の上述のハイブリドーマ細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８及びＤＳＭＡＣＣ２０６０は１９９３年２月３日に、そしてハイブリドーマ細胞系ＤＳＭＡＣＣ２１６８は１９９４年４月１９日に、「細胞培養物及び微生物のドイツ収集所（“Deutsche Sammlung fur Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH”，Mascheroder Weg lb ，D-38124 Braunschebeig）」に寄託した。以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。実施例１ＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体の産生ａ）マウスの免疫感作１２週齢Ａ／Ｊマウスを最初に１００μｇのＣＫ−ＭＢ（Aalto Co．Dublin）で腹腔内に免疫感作する。この６週間後に更に２回の腹腔内免疫感作を１月の間隔を置いて行う。この過程で、各マウスに水酸化アルミニウムに吸着された１００μｇのＣＫ−ＭＢ（Paesel Company，Frankfurt）及び１０⁹の百日咳菌（Bord etella pertussis）（Behring Co．Frankfurt）を投与する。続いて２回の最終免疫感作を、融合の３日前及び２日前に各回についてＰＢＳ緩衝液中の１００μ ｇのＣＫ−ＭＢを用いて静脈内に行う。ｂ）融合及びクローニングａ）に従って免疫感作したマウスの脾臓細胞をGalfre,Methods in Enzymology 73，1981，３に従って骨髄腫細胞と融合させる。この過程で、免疫感作マウスの約１×１０⁸の脾臓細胞を２×１０⁷の骨髄腫細胞（Ｐ３×６３−Ａｇ８−６５３，ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）と混合しそして遠心分離する（３００ｇ及び４ ℃で１０分間）。次いで、これら細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）無しのＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄して再び４００ｇで５０ｍｌ円錐管中で遠心分離する。上清液を捨て、細胞堆積物をタッピングにより静かにほぐし、１ｍｌのＰＥＧ（分子量４０００，Merck，Darmstadt）を添加し、そしてピペッティングにより混合する。３７℃の水浴中で１分してから、ＦＣＳ無しの５ｍlのＲＰＭＩ１６４０を室温で４〜５分以内に滴下する。その後、１０％ＦＣＳを含有する５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を約１分以内に滴下し、十分に混合し、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ）で５０ｍｌにし、続いて４００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離する。堆積した細胞を１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に取り込み、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ中に１００mmol／ｌヒポキサンチン，１ μｇ／ｍｌアザセリン）中にまく。インターロイキン６（Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号1271172，１００Ｕ／ｍｌ）を増殖因子としてこの培地に添加する。約１０日後、一次培養物を特異性抗体合成及び交叉反応（実施例２を参照のこと）について検査する。イソ酵素ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢと実質的な交叉反応を示さないＣＫ−ＭＢ陽性一次培養物を、蛍光活性化細胞選別装置により９６ウェル細胞培養プレート中にクローン化する。この過程で、インターロイキン６（ Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号1271172，１００Ｕ／ｍｌ）を増殖添加剤としてこの培地に添加する。ＣＫ−ＭＢのコンフォメーションエピトープに対する抗体を産生するクローン（実施例２に従って確認する）のうち、ＣＫ−ＭＢに対して少なくとも９×１０⁷モル^-1×１の親和性を有する抗体（実施例３に従って確認する）及び／又は“Conan MB抗体”とは異なるエピトープを認識する抗体（実施例４に従って確認する）を有する培養物を選択する。ｃ）細胞培養上清液からのイムノグロブリンの単離得られたハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に１×１０⁵細胞／ｍｌの密度でまいて発酵器（Thermodux Co.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，注文番号144-050）内で７日間増殖させる。平均で１００μｇモノクローナル抗体／ｍｌの濃度がその培養上清液中に得られる。その培養上清液からのこの抗体の精製を、タンパク質化学における慣用的な方法（例えば、Methods in Enzymology 121（1986），587-6 95に従う方法）により行う。実施例２産生した抗体の特異性の確認ハイブリドーマ細胞の培養上清液中の抗体の特異性を確認するために、ＣＫ− ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢとの反応性を３つの並行ＥＬＩＳＡ混合液中で確認する。このために、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc）をまず２００μｌ／ウェルのサーモ−ＢＳＡ−ストレプトアビジン（１０μｇ／ｍｌコーティング緩衝液＝０．２モル／ｌ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム，ｐＨ９．３〜９．５，Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号0726559）でコーティング（震盪しながら室温で１時間インキュベーション）し、０．９％ＮａＣｌ／０．０５％ツィーン２０で１回洗浄する。ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢ（Aalto Co．Dublin，カタログ番号10901，10217及び10803）を並行してＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Bo ehringer Mannheim GmbH，カタログ番号01008960）で製造業者の使用説明書に従ってビオチニル化する。これらビオチニル化クレアチンキナーゼイソ酵素を、０．０５％ツィーン２０／ｌ％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中に２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で吸収させ、ウェル当たり１００μｌを、サーモ−ＢＳＡ−ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートに添加し、そして震盪しながら室温で１時間インキュベートする。続いてそれらを３×０．９％塩化ナトリウム／０．０５％ツィーン２０で洗浄する。検査すべき各抗体溶液１００μｌを、並行実験で、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ又はＣＫ−ＢＢでコーティングしたウェルに添加し、震盪しながら室温で１時間インキュベートする。０．９％塩化ナトリウム／０．０５％ツィーン２０で３回洗浄した後、マウス−Ｆｃ−γに対するヒツジからのポリクローナル抗体のＰＯＤ標識Ｆａｂ断片１００μｌ（Boehringer Mannheim GmbH，識別番号1047523 ，１００ｍＵに相当する）を添加してサンプルからの結合抗体を検出し、震盪しながら室温で１時間インキュベートし、続いて０．９％塩化ナトリウム／０．０５％ツィーン２０で３回洗浄する。最ログ番号1204521及び1204530）を各ウェルに添加して、室温で３０分した後、４５０／４９０ｎｍにおける吸光度をDynatech社からのMR 700マイクロプレートリーダーで測定する。実施例３産生した抗体の親和性、結合定数及び解離定数の測定並びにサンドイッチ適合性の確認産生した抗体の親和性、結合定数及び解離定数の測定並びにサテムに従って行う。この方法では、ＣＫ−ＭＢイソ酵素は共有結合するので、いわゆるセンサーチップの表面層に固定化される。測定すべき抗体の溶液を流すと、その間に抗体が固定化ＣＫ−ＭＢに非共有結合性相互作用力により結合し、その表面層において嵩比重（mass density）が増加する。この嵩比重の増加は、表面プラズモン共鳴により直接追跡できる。この固定化反応パートナー上に存在する結合部位の数に依存して第３及び第４反応パートナーを更に付着させることができる。それら結合は、第１反応パートナーの結合と全く同じく速度及び量に関して観察することができる。共有結合したＣＫ−ＭＢを除く全ての反応パートナーは、ＣＫ−ＭＢに損傷を与えることなく簡単な手段により離すことができるので、同じ一次層上で同一の境界条件下で更に結合実験を行うことができる。このセンサーチップの表面層にＣＫ−ＭＢを結合させるには、１０mmol／ｌ HEPES／３．４mmol／ｌＥＤＴＡ／１５０mmol／ｌＮａＣｌ／ｐＨ７．４中の２０μｇ／ｍｌのＣＫ−ＭＢ（Alto，Lot No．20410）の溶液を、センサーチップ上に２μｌ／分の流速で流す。続いて以下の抗体を添加して、ＣＫ−ＭＢへの結合についての結合定数又は解離定数並びにＣＫ−ＭＢへの抗体の親和性を製造 LKB，ソフトウェアー速度評価キット，識別番号BR-1000-19）により測定する。本発明の抗体並びに“Conan MB抗体”ＡＴＣＣＨＢ８９３９及びＣＫ−ＭＢに対する市販の抗体（Bios PacificのＢＰ１７２−Ａ２７２０）について、このようにして測定した値を表１に纏める。イッチ適合性を確認することが可能である。このために、マウスＩｇＧｌに対するポリクローナル抗体又はマウスＦｃγに対するポリクローナル抗体をまずセンサーチップ上に捕捉抗体として固定化する。続いてそれにまず検査すべきＣＫ− ＭＢに対する第１抗体を１０００共鳴単位の量まで付着させ、そして依然として遊離の捕捉抗体を、ＣＫ−ＭＢと交叉反応しないイムノグロブリンを流すことによりブロックする。ＣＫ−ＭＢを含有する溶液を流した後、平衡になるまでその結合を追跡し、続いて検査すべき潜在的サンドイッチパートナーを添加してそのサンドイッチ複合体の結合を平衡になるまで追跡する。この過程で、次の表２に列挙した本発明の抗体の組み合わせがＣＫ−ＭＢ検査に適するものであることが明らかになった。ＤＳＭＡＣＣ２０５７とＤＳＭＡＣＣ２０５８若しくはＤＳＭＡＣＣ２０６０との組み合わせ、又はＤＳＭＡＣＣ２０５９とＤＳＭＡＣＣ２０５８若しくはＤＳＭＡＣＣ２０６０との組み合わせが特に適していることが分かった。対照的に、ＣＫ−ＭＢに対する従来の標準的抗体（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）では弱いサンドイッチ形成しか認めることができなかったので、信頼できる診断検査には不適であるとみなさざるを得ない。モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７及びＤＳＭＡＣＣ２０５９を用いて、３種の抗体がＣＫ−ＭＢに結合するトリプレット形成を次の表３に示した組み合わせで達成することもできる。これにより、普通のサンドイッチアッセイと比較して感度及び特異性を更に向上できることを意味している。実施例４ＣＫ−ＭＢに対する抗体のエピトープ重複部分の確認競合エンザイムイムノアッセイを行って、本発明の抗体と抗体とのエピトープ重複部分を確認する。このために、ＣＫ−ＭＢをまずＤ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannheim GmbH，カタログ番号01008960）で製造業者の使用説明書に従ってビオチニル化する。１００μｌの容量のＰＢＳ中のこのビオチニル化抗原３００ｎｇを、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート（ＥＰ−Ａ０３４４５７８に従って調製したもの）に室温で１時間インキュベートすることによって結合させる。ＰＢＳ／０．０５％ツィーン２０で３回洗浄した後、それをペルオキシダーゼで標識した基準抗体（例えば、ＤＳＭＡＣＣ２０５９）（最終濃度５２ｍＵ／ｍｌ）及び評価すべき抗体と共に同時にインキュベートする。ＰＢＳ／０．０５％ツィーン２０で更酸ナトリウムを含有する緩衝液中で室温で３０分間インキュベートし、続いて４０５ｎｍにおける吸光度を、結合したＰＯＤ標識モノクローナル抗体の量の指標として測定する。この値を標識モノクローナル抗体単独でのインキュベーションで得られる吸光度と比較する。少なくとも５０％の競合が標識抗体の１０⁵倍過剰までの評価対象の抗体で検出できた場合は、エピトープ重複部分が存在する。細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０５７及びＤＳＭＡＣＣ２０５９からの抗体は強い競合を示したが、このことは、それらがいわゆる“Conan抗体”によっても認識される同じエピトープを認識するか又はそれらに結合することを意味している。細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８からの抗体は、これら他の２種の細胞系（ＤＳＭＡＣＣ２０５７及びＤＳＭＡＣＣ２０５９）からの抗体と競合しない。細胞系ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８からの２種の抗体を除いて、これら３種の抗体は競合を示さない。抗体ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８は弱い競合を示すので、これら２種のエピトープは僅かにオーバーラップしていると結論できる。従って、これら２種の抗体を例えばサンドイッチ検査に一緒に用いることは有利ではない。しかしながら、本発明の他の抗体との組み合わせでは、これら各々の抗体は非常に都合よく用いることができる。実施例５ＬＰＩＡ検査によるＣＫ−ＭＢの測定まず、サンドイッチ検査に適する本発明の２種の抗体を選び（実施例３を参照のこと）、そしてＦａｂ’断片をＥＰ−Ａ０４６４５５４の説明に従ってビオチニル化する。各場合において、２０μｌのＣＫ−ＭＢ標準物質（０、１１０及び２２０ｎｇＣＫ−ＭＢ／ｍｌヒト血清）又は分析すべきサンプルをｔ＝０分で日立７１７光度計でのサンプルとしてピペッティングする。これに、すぐに３３０μｌの試薬１（反応緩衝液＝５０mmol／ｌトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５、７５mmol／ｌ塩化ナトリウム、３％ＰＥＧ３５，０００、１％Pluronic F68、０．１％ Brij 3 5及び０．１％アジ化ナトリウム）をその装置により自動的にピペッティングする。ｔ＝４．５分で、５０μｌの試薬２（ラテックス懸濁液；２００mmol／ｌグリシン，ｐＨ７．５、２％スクロース、０．５％ＢＳＡＩ（ＢＳＡ純度レベルＩ、０．１％アジ化ナトリウム）中の各場合において１．６μｇの抗体／ｍｌで予めコーティングした０．０８３％ストレプトアビジンラテックス）をその装置により添加する。続いて凝集の増加を３４０ｎｍ（主波長）及び７００ｎｍ（副波長）で二色測定する（測定温度37℃）。ｔ＝５．３分及びｔ＝９．５分の間の吸光度の差をシグナルパラメーターとして用いる。この場合、抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９とＤＳＭＡＣＣ２０５８との組み合わせが特に適していることが分かった（３４２ｍＡの高いダイナミックレンジ（第２測定値とブランク値間の差）並びに検量線における高い初期増加（２．３ｍＡ×ｍｌ／ｎｇ）に相当する）。実施例６電気化学発光法を用いるサンドイッチ検査によるＣＫ−ＭＢの測定このＥＣＬ法は、ＷＯ８６／０２７３４、ＷＯ８７／０６７０６及びＷＯ９２／１４１３８に従って行った。モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５９を当該技術分野の現状の方法に従ってビオチニル化した（溶液２）。モノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８は、ＤＳＳ（ジスクシニル基質）（塩化トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム・６水和物）でルテニル化した（溶液３）。両方の抗体をＣＫ−ＭＢを含有するサンプルと共に溶液１中で５分間インキュベートし、続いてストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子（ドイツのDe utsche Dynal GmbH CompanyからのDynabeads M-280ストレプトアビジン）を添加し（溶液４）、そして再度５分間インキュベートした。この反応混合液を測定セル内に吸引することによりこの反応を終結する。合衆国のIgen CompanyからのOrigen 1.0-装置を用いた。この測定チャンバー内で磁性粒子を磁石により電極上に保持する。残留反応混合液を吸引して測定チャンバーをアッセイ用緩衝液（溶液５）で満たす。電圧をかけることにより発光を刺激する。次の溶液を用いた。溶液１：インキュベーション緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．００．１％ＢＳＡ０．１％メチルイソチアゾロン０．１％安息香酸ナトリウム溶液２：ビオチニル化ＭＡＢＤＳＭＡＣＣ２０５９インキュベーション緩衝液中２μｇ／ｍｌ溶液３：ルテニウム−ビスピリジル標識ＭＡＢＤＳＭＡＣＣ２０５８インキュベーション緩衝液中２μｇ／ｍｌ溶液４：５０ｍＭ Hepes、０．１％ＢＳＡ、０．１％ Thesit、０．１％クロロアセトアミド、０．０１％メチルイソチアゾロン，ｐＨ７．０中にストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子５００ μｇ／ｍｌ溶液５：アッセイ用緩衝液：ｐＨ６．８０．１６Ｍトリス−プロピルアミン、０．２Ｍリン酸水素二カリウム、０．１％ポリドカノール（Thesit）、０．１％ Oxaban A。

【手続補正書】【提出日】１９９６年２月６日【補正内容】請求の範囲１．ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合しないモノクローナル抗体。２．モノクローナル抗体が、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるものである請求項１記載のモノクローナル抗体。３．Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合せずかつ“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ −ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングすることにより得ることができる、請求項１記載のモノクローナル抗体。４．ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。５．ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、この結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９の結合と同等の様式で起こり、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する、ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体。６．Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合しない抗体であって“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されずかつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１ ×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する抗体を産生する不死化細胞をクローニングすることにより得ることができる、請求項５記載のモノクローナル抗体。７．４×１０^-4秒^-1未満の解離定数を有する、請求項５記載のモノクローナル抗体。８．ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する、請求項５又は６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。９．ＣＫ−ＭＢイソ酵素にだけ結合し、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合しないモノクローナル抗体を製造する方法であって、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、ＣＫ −ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも結合せずかつ“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングし、そして該クローン化細胞又はそれらの培養上清液から既知の方法に従って該モノクローナル抗体を単離することによる方法。10 ．モノクローナル抗体が、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるものである請求項９記載の方法。 11 ．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1 の結合定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項９又は10記載の方法。12 ．ＣＫ−ＭＢイソ酵素にだけ結合し、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９の結合と同等の様式で起こり、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和性を有するモノクローナル抗体を製造する方法であって、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、ＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも結合せずかつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１Ｘ１０⁸モル^-1×１の親和性を有する抗体を産生する不死化細胞をクローニングし、そして該クローン化細胞又はそれらの培養上清液から既知の方法に従って該モノクローナル抗体を単離することによる方法。13 ．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について４×１０^-4秒^-1未満の解離定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項12記載の方法。14 ．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1 の結合定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項12又は13のいずれか１項に記載の方法。15 ．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及び／又はＤＳＭＡＣＣ２１６８から得ることができる、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体。16 ．ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体を産生し、かつＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８の群から選ばれるハイブリドーマ細胞系。17 ．免疫学的診断検査においてＣＫ−ＭＢを測定するための、請求項１〜８又は 15 のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。18 ．均一診断検査でのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、請求項１〜８又は 15 のいずれか１項に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体をラテックス粒子上に固定化し、そして測定されるべきサンプルと共に並びに該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なるラテックス結合抗体と共にインキュベーションした後、その凝集の増加を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの量の指標として測定する方法。19 ．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５８又はＤＳＭＡＣＣ２０６０により産生される抗体がラテックス結合抗体のうちの１種として用いられる、請求項18記載の方法。20 ．サンドイッチイムノアッセイによるＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、請求項１〜８又は15のいずれか１項に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体を固相に結合させ、そして測定されるべきサンプルと共に及び該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なる標識抗体と共にインキュベーションして該固相と液相とを分離した後に、該２相のうちの１相中で該標識を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの量の指標として測定する方法。21 ．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５８又はＤＳＭＡＣＣ２０６０により産生される抗体がサンドイッチイムノアッセイにおける２種の抗体のうちの１種として用いられる、請求項20記載の方法。22 ．ＣＥＤＩＡ原理に従う均一検査でのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗体が用いられる方法。23 ．サンドイッチイムノアッセイでのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ −ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合しない少なくとも２種のモノクローナル抗体であって、ＣＫ−ＭＢ上の同じ結合部位について互いに競合せずかつその少なくとも１種のモノクローナル抗体がＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１ ×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗体を用いる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者エッシグ，ウルリッヒドイツ連邦共和国ディー―82152 プラネッグ，ヨセフ―フォン―ヒルシュ―シュトラーセ 51番地 (72)発明者ラング，フリードルドイツ連邦共和国ディー―82327 チュトツィンク，ヘルツォグスタンドシュトラーセ２番地 (72)発明者ヴォーゲル，ルドルフドイツ連邦共和国ディー―82362 ヴァイルハイム，アムエッセルスバーグ７番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるモノクローナル抗体。２．Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合せずかつ“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ −ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングすることにより得ることができる、請求項１記載のモノクローナル抗体。３．ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。４．ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、この結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９の結合と同等の様式で起こり、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する、ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体。５．Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、そしてＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも実質的に結合しない抗体であって“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されずかつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１ ×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有する抗体を産生する不死化細胞をクローニングすることにより得ることができる、請求項４記載のモノクローナル抗体。６．４×１０^-4秒^-1未満の解離定数を有する、請求項４記載のモノクローナル抗体。７．ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1の結合定数を有する、請求項４又は５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。８．ＣＫ−ＭＢイソ酵素にだけ結合し、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０又はＤＳＭＡＣＣ２１６８の結合と同等の様式で起こるモノクローナル抗体を製造する方法であって、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、ＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも結合せずかつ“Conan MB 抗体”（ＡＴＣＣＨＢ８９３９）によりＣＫ−ＭＢへの結合から放逐されない抗体を産生する不死化細胞をクローニングし、そして該クローン化細胞又はそれらの培養上清液から既知の方法に従って該モノクローナル抗体を単離することによる方法。９．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1 の結合定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項８記載の方法。 10．ＣＫ−ＭＢイソ酵素にだけ結合し、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭイソ酵素にもＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、ＣＫ−ＭＢへのこの結合がモノクローナル抗体ＤＳＭＡＣＣ２０５７又はＤＳＭＡＣＣ２０５９の結合と同等の様式で起こり、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和性を有するモノクローナル抗体を製造する方法であって、Ａ／Ｊマウス（Ｈ−２^aハプロタイプ）をＣＫ−ＭＢイソ酵素でアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて免疫感作し、該免疫感作マウスの脾臓細胞を不死化し、ＣＫ−ＭＢに結合するがＣＫ−ＭＭにもＣＫ−ＢＢにも結合せずかつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和性を有する抗体を産生する不死化細胞をクローニングし、そして該クローン化細胞又はそれらの培養上清液から既知の方法に従って該モノクローナル抗体を単離することによる方法。 11．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について４×１０^-4秒^-1未満の解離定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項10 記載の方法。 12．更に、ＣＫ−ＭＢへの結合について少なくとも１×１０⁵モル^-1×１×秒^-1 の結合定数を有する抗体を産生するクローンが選ばれる、請求項10又は11のいずれか１項に記載の方法。 13．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及び／又はＤＳＭＡＣＣ２１６８から得ることができる、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体。 14．ＣＫ−ＭＢに対するモノクローナル抗体を産生し、かつＤＳＭＡＣＣ２０５９、ＤＳＭＡＣＣ２０５７、ＤＳＭＡＣＣ２０５８、ＤＳＭＡＣＣ２０６０及びＤＳＭＡＣＣ２１６８の群から選ばれるハイブリドーマ細胞系。 15．免疫学的診断検査においてＣＫ−ＭＢを測定するための、請求項１〜７又は 13のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。 16．均一診断検査でのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、請求項１〜７又は 13のいずれか１項に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体をラテックス粒子上に固定化し、そして測定されるべきサンプルと共に並びに該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なるラテックス結合抗体と共にインキュベーションした後、その凝集の増加を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの量の指標として測定する方法。 17．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５８又はＤＳＭＡＣＣ２０６０により産生される抗体がラテックス結合抗体のうちの１種として用いられる、請求項16記載の方法。 18．サンドイッチイムノアッセイによるＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、請求項１〜７又は13のいずれか１項に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体を固相に結合させ、そして測定されるべきサンプルと共に及び該第１抗体をそのＣＫ−ＭＢへの結合から放逐することなくＣＫ−ＭＢに結合する更なる標識抗体と共にインキュベーションして該固相と液相とを分離した後に、該２相のうちの１相中で該標識を該サンプル中のＣＫ−ＭＢの量の指標として測定する方法。 19．ハイブリドーマ系ＤＳＭＡＣＣ２０５８又はＤＳＭＡＣＣ２０６０により産生される抗体がサンドイッチイムノアッセイにおける２種の抗体のうちの１種として用いられる、請求項18記載の方法。 20．ＣＥＤＩＡ原理に従う均一検査でのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合せず、かつＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗体が用いられる方法。 21．サンドイッチイムノアッセイでのＣＫ−ＭＢの診断的検出方法であって、ＣＫ−ＭＢイソ酵素に結合するが、ＣＫ−ＭＢの単独のＢサブユニットにもＭサブユニットにも結合せず、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＢＢイソ酵素にも実質的に結合しない少なくとも２種のモノクローナル抗体であって、ＣＫ−ＭＢ上の同じ結合部位について互いに競合せずかつその少なくとも１種のモノクローナル抗体がＣＫ−ＭＢに対して少なくとも１×１０⁸モル^-1×１の親和定数を有するモノクローナル抗体を用いる方法。