CN116284411B - 抗培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种结合培重组人凝血因子VIII‑Fc融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，以及其用于检测样品中培重组人凝血因子VIII‑Fc融合蛋白存在或含量的用途。

Description

抗培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，特别是涉及抗培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
准确测定生物基质(如全血、血清、血浆、尿)中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要，这些数据可被用于支持药品的安全有效性，或根据毒动学、药动学和生物等有效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
免疫分析方法是以特异性抗原-抗体的反应为基础的分析方法。免疫分析技术和放射性核素示踪技术、酶促反应或荧光分析等高灵敏度的分析技术相结合，具有高特异性和高灵敏度的特点，特别适合测定复杂体系中的微量组分，以及药物生产中发酵液或细胞培养液中有效成分的快速测定。免疫分析方法的关键是筛选高效、灵敏、特异性结合待测药物的抗体。
专利申请WO2019219049A1公开了培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白，是一类PEG随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。将凝血因子VIII与Fc融合，同时结合PEG修饰手段，可以有效地提高多肽的体内稳定性，特别是PEG分子量为40kDa时，能够显著提高融合蛋白的体内稳定性。
目前尚未报道过针对培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的用于临床前和临床研究的生物分析方法。
发明内容
本申请的目的在于提供一种能够用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的单克隆抗体及其应用。
本申请为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：
本申请第一方面提供了一种结合培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中，
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示的氨基酸序列；或者
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
本申请第二方面提供了一种多核苷酸，其编码本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段；或，一种重组载体，其包含所述的多核苷酸；或，一种宿主细胞，其包含所述的多核苷酸或重组载体；或，一种杂交瘤细胞，其用于表达本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段。
本申请第三方面提供了本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段用于检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的用途。
本申请第四方面提供了一种使用本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的方法，其中，所述方法为夹心ELISA法，所述抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体和/或检测抗体。
本申请第五方面提供了一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体组合，其包括本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段的两种。
本申请第六方面提供了一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的试剂盒，其包括本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
有益效果：
本申请提供了一种抗培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体通过特异性结合培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白，可用于检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量。进一步地，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的不同表位，从而可以用于作为培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白检测的捕获抗体和/或检测抗体，采用本申请的抗体建立的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白检测方法具有高的稳定性、准确度、精密度、灵敏度以及特异性等。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
缩略语表
定义
除非另有说明，本申请的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本申请，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本申请所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocolsin MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于±5％、±2％、±1％和±0.1％。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
术语“百分比(％)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体等。已知基本的抗体结构单位包含四聚体，每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每各多肽链对具有一条“轻”链(L，约25kDa)和一条“重”链(H，约50-70kDa)。每条链的氨基端部分或片段可包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分或片段可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常将人轻链归类为κ轻链和λ轻链。此外，通常将人重链归类为μ、δ、γ、α或ε五类，并依据重链的不同将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，各自的可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.主编，第2版。Raven Press，N.Y.(1989))。
相对于抗体，术语“分离的抗体”表示该抗体基本上不含与其天然状态相关的其他细胞组分，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。可以理解为，所述分离的抗体为基本上纯化的状态，优选所述分离的抗体处于均质状态，所述分离的抗体可以是干燥或水性溶液。通常可以使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定抗体的纯度和均质性。术语“分离(的)”并非意指完全不存在上述物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本申请的抗体的实验或治疗应用的量存在。
术语“单克隆抗体”是由高度一致的免疫细胞制成的抗体，这些免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体具有单价亲和力，因为它们结合相同的表位(抗体识别抗原的部位)。所述单克隆抗体也可能包括少量天然存在的突变。相比之下，术语“多克隆抗体”结合多个表位，通常由几个不同的浆细胞(分泌抗体的免疫细胞)谱系组成，可以理解为是多种单克隆抗体的混杂物。修饰语“单克隆”不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”系指抗体中能够特异地与抗原的一部分或全部结合，并与抗原的一部分或全部互补的区域。当抗原很大时，抗体可能只能结合到抗原的一个特定的部分，该部分被称为表位。结合结构域可包含重链和轻链的可变结构域，即重链可变区VH和轻链可变区VL，其各自包括四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。CDR在序列上可变化并确定对特定抗原的特异性。
术语“全长”抗体，是指在天然存在时包含四条肽链的免疫球蛋白分子：两条重链(全长约50-70kDa)和两条轻链(全长约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和与互补决定区间隔分布的，具有更高保守性的框架区(FR)。每一个VH或VL从氨基末端至羧基末端的结构域排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区分别含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导抗体对宿主的组织或免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
术语“重链恒定区”或“CH”在本申请中可互换使用，其包含至少三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。示例性的，人重链恒定区包括γ、δ、α、ε和μ，各重链恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步再分成亚类，例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)；IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。同种型还可以包括一些修饰形式，所述修饰可以改变Fc功能，例如增强或减弱效应子功能或增强或减弱其对Fc受体的结合。
术语“轻链恒定区”或“CL”在本申请中可互换使用，其包含1个轻链恒定结构域CL。示例性的，根据轻链恒定区的不同，轻链可分为λ和κ两类。
术语抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或抗体的衍生物，所述“抗原结合片段”对应的抗体可称为亲代抗体。抗体的抗原结合片段通常包含亲代抗体的抗原结合区或可变区的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和单链Fv片段，双抗体，线性抗体，结构域抗体，单链抗体分子，例如scFv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体等。相同摩尔浓度下，抗原结合片段至少能够保持亲代抗体抗原结合活性的10％，至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。此外，抗体的抗原结合片段还可以包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语“核酸”或“多核苷酸”还包括含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。
“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)，其可衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，其可以以可操作的方式连接一或多个多核苷酸分子。本申请中，构建体通常本申请的多核苷酸分子，其可操作地连接至转录起始调节序列，这些序列会导引本申请的多核苷酸分子在宿主细胞中的转录。可使用异源启动子或内源启动子导引本申请的核酸的表达。
“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)中自主复制。另一些载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后，被整合至宿主细胞的基因组中，与宿主基因组一起复制。
本文所用术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体通常包含一或多个表型选择标记和复制起点，用于维护载体及在需要的情况下在宿主内进行扩增。
本申请第一方面提供了一种结合培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3和三个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中，
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示的氨基酸序列；或者
所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
本申请中，所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白(PEG-FVIII-linker-Fc)是PEG随机修饰的重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白，重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，由FVIII、接头分子(linker)、人IgG Fc部分组成。其中，FVIII氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，linker-Fc部分氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
PEG具有式I所示的结构：
在一些实施方式中，PEG分子量为40kDa。
对于抗体的互补决定区CDR的精确氨基酸序列边界，可根据公知方法来定义，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等，Nature 342:877-883，1989；Al-Lazikani等，Journal of Molecular Biology，273:927-948，1997)；或者基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health，1987)、AbM(University of Bath)、Contact(University College London)以及IMGT(theinternational ImMunoGeneTics database，1999Nucleic Acids Research,27,209-212)；或者基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。本申请中抗体的CDR可以由本领域技术人员根据本领域的任何方案(例如上述任选的定义方法)确定边界。
应该注意的是，基于不同定义方式获得的同一抗体的CDR的边界可能有所差异，即不同定义方式下获得的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，当采用本申请定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体还包括其互补决定区序列包含本申请所述的CDR的序列，只是由于采用了不同的CDR边界定义方式而导致其所声称的CDR边界与本申请所定义的具体CDR边界不同的抗体。
具有不同特异性(即，针对不同的抗原结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合，抗体CDR与抗原结合的最小重叠区域也称为用于抗原结合的“最小结合单位”，可使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种来确定。最小结合单位可以是CDR的一部分。正如本领域技术人员所明了的，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基，因此，本申请也考虑任何CDR的变体，例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区；或
与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区；或
氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或
与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQ ID NO:20所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的轻链(抗体9G10B3)；或
氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的轻链(抗体11A12C6)。
本申请第二方面提供了一种多核苷酸，其编码本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述多核苷酸包含编码本申请所提供的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。本申请中的多核苷酸包括双链或单链的DNA或RNA。
在一些实施方式中，编码本申请的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子还可以包括存在核苷酸缺失、插入或置换突变的，但仍与本申请的抗体或其抗原结合片段的CDR对应的编码区具有至少约60％、70％、80％、90％、95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在又一个方面，本申请提供了一种重组载体，其包含所述的多核苷酸。优选地，所述重组载体为真核表达载体。
在又一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含所述的多核苷酸或重组载体；优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞用于表达本申请所提供的抗体或其抗原结合片段。
本申请所提供的用于表达本申请的抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的多种永生化细胞系。示例性的，可以包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞、A549细胞、293T细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞可以包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。本领域技术人员可以通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。
在又一个方面，本申请还涉及一种用于表达本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞，其可以通过经抗原免疫的小鼠的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成。
本申请第三方面提供了本申请第一方面的抗体或其抗原结合片段用于检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的用途。
本申请第四方面提供了一种使用本申请的抗体或其抗原结合片段检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的方法，其包括使所述抗体或其抗原结合片段与样品接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与所述培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白形成的结合物，以及任选地对所述结合物进行定量测定。术语“检测”用于本申请中时，可以包括定量或定性检测。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在某些实施方式中，生物样品是全血、血清、血浆、尿或生物来源的其他液体样品。本申请对所述“对所述结合物进行定量测定”的方法不做限定，例如可以采用电化学发光法等。
在一些实施方式中，所述检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的方法为免疫分析检测，例如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定、电化学发光免疫分析或免疫荧光测定等。
在一些实施方式中，所述方法可以是夹心ELISA法。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体和/或检测抗体。
例如在一些实施方式中，可以采用一种本申请的抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体，用于捕获样品中的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。在另一些实施方式中，还可以采用另一种本申请的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体，用于检测被捕获抗体捕获的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。
在一些实施方式中，所述检测抗体可以是标记的抗体或抗原结合片段，所述“标记”可以理解为所述抗体或抗原结合片段与标记物连接；所述标记物为本领域的常用用于检测的标记物，例如辣根过氧化物酶(HRP)、生物素(Biotin)或荧光标签(如GFP、FAM、VIC、CY3等)。本领域技术人员有能力根据检测方法匹配需要的标记物，本申请在此不做限定。此外，标记物与抗体的连接为本领域的常规手段，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，以抗体9G10B3作为捕获抗体，捕获样品中的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白；以标记的抗体11A12C6作为检测抗体，用于检测被捕获抗体捕获的培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的存在或含量。
在一些实施方式中，所述标记的抗体11A12C6为生物素标记的抗体。
本申请第五方面提供了一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体组合，其包括本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段的两种。
在一些实施方式中，所述抗体组合中包含抗体9G10B3和抗体11A12C6。
本申请第六方面提供了一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的试剂盒，其包括本申请第一方面所提供的抗体或其抗原结合片段的至少一种。
在一些实施方式中，所述试剂盒中包含本申请的抗体组合；优选地，包含抗体9G10B3和抗体11A12C6。
下面通过具体实施例来说明本申请的抗体及其应用。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1单克隆抗体的制备
1、抗原制备
用于本实施例免疫动物的抗原为PEG-FVIII-linker-Fc，FVIII-linker-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，PEG结构如式I所示，分子量为40kD(购自北京键凯科技有限公司)。
制备方法：采用式I的分子量为40kD的PEG(购自北京键凯科技有限公司)与FVIII-linker-Fc融合蛋白进行交联反应。PEG的活性接头为琥珀酰亚胺酯，易与蛋白质中赖氨酸残基上的伯胺(-NH2)基团发生反应形成稳定的酰胺键，从而得到蛋白质-PEG交联产物。按照PEG与融合蛋白的不同摩尔比制备缀合物，例如1：30、1：50、1:100、1:120。其中，按照1:100比例制备的缀合物在之后的检测中显示优异的延长半衰期效果，其制备方法如下：按照摩尔比PEG∶蛋白＝100：1(质量比10.26:1)进行投料，于20℃±5℃反应2小时，交联后样品0.2μm滤膜过滤后，样品2-8℃暂存待进行纯化。
纯化方法：首先使用S200(GE healthcare)分子筛层析进行分离。使用结合缓冲液(binding buffer：20mM His-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02％ Tween 80,pH6.8-7.2)，以150cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；以150cm/h的线性流速进行上样；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM His-HCl,200mM NaCl,5mM CaCl2,0.02％ Tween 80,pH6.8-7.2)，以150cm/h的线性流速冲洗层析柱子3-5柱体积(CV)，平衡至pH及电导同缓冲液一致；用缓冲液(20mM His-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02％ Tween 80,pH6.8-7.2)进行洗脱，收集A280/260大于1.8的峰。第二步采用Source 15Q(GE healthcare)阴离子层析柱分离。使用结合缓冲液(binding buffer：20mM His-HCl，0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2)，以150cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；经第一步分子筛层析后得到的样品以150cm/h的线性流速进行上样；上样完毕后，使用平衡buffer(20mMHis-HCl,0.1M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween 80,pH6.8-7.2)，以150cm/h的线性流速冲洗层析柱子3-5柱体积(CV)，平衡至pH及电导同缓冲液一致；用洗脱缓冲液(20mM His-HCl,2MNaCl,5mM CaCl2,0.02％ Tween 80,pH6.8-7.2)按照0-100％以100cm/h线性速度进行洗脱，分管收集A280/260大于1.8的洗脱峰。
用于本实施例抗体检测的抗原包括：PEG-FVIII-linker-Fc、FVIII-linker-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)、FVIII(氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示)、linker-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示)、PEG。上述抗原均可采用本领域已知的常规方法制备，也可以采用例如专利ZL201610692838.0和/或WO2019219049A1中公开的方法制备和纯化。
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：21)
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY(SEQ ID NO：22)
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：23)
2、动物免疫
用步骤1的抗原PEG-FVIII-linker-Fc按照表1的免疫流程对5只BALB/c小鼠进行免疫。
表1.免疫流程
流程名称 时间 免疫剂量/途径
第一次免疫 T＝0天 50μg/每只，i.p.
第二次免疫 T＝14天 25μg/每只，i.p.
第三次免疫 T＝28天 25μg/每只，i.p.
i.p.代表腹腔注射
在T＝21天、T＝35天采血，通过ELISA法分别用抗原PEG-FVIII-linker-Fc、FVIII-linker-Fc、FVIII、linker-Fc、PEG检测血清中的抗体效价，其中抗原的包被浓度为1μg/ml，100μl/孔；包被缓冲液及稀释液为PBS(pH 7.4)；二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG。
3、细胞融合
(1)选取血清效价满足要求的2只小鼠(通常血清自1:1000开始以2的指数级梯度稀释，当血清在1:8000稀释时OD值＞1.0，且针对PEG-FVIII-linker-Fc、FVIII-linker-Fc、FVIII、linker-Fc的稀释倍数与针对PEG的稀释倍数拉开至少两个梯度，则被认为满足下一步融合要求)，取出脾脏，制备脾淋巴细胞，分别与同品系小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。
(2)初筛1：用PEG-FVIII-linker-Fc进行包板，用间接ELISA法筛选出PEG-FVIII-linker-Fc阳性(+)的杂交瘤细胞上清液。
(3)初筛2：初筛1筛选出的杂交瘤细胞上清液用FVIII-linker-Fc再次进行ELISA检测，并且用PEG进行反筛，筛选出FVIII-linker-Fc阳性(+)且PEG阴性(-)的杂交瘤细胞上清液。
(4)确认性筛选1和2：用ELISA法从初筛2得到的杂交瘤细胞上清液中筛选出5株特异性针对FVIII的杂交瘤细胞[即，FVIII阳性(+)且linker-Fc阴性(-)且PEG阴性(-)]；和5株特异性针对linker-Fc的杂交瘤细胞[即，linker-Fc阳性(+)且FVIII阴性(-)且PEG阴性(-)]。杂交瘤细胞上清液的ELISA检测结果见表2，其中包被抗原为：A，PEG-FVIII-linker-Fc；B，FVIII-linker-Fc；C，linker-Fc；D，PEG；E，FVIII；包被抗原的用量为1μg/ml，100μl/孔；包被缓冲液为PBS(pH7.4)；二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG；以630nm为参比波长，用酶标仪测定450nm的吸光度值。
表2.杂交瘤细胞上清液的ELISA检测结果
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4、抗体生产
将步骤3筛选出的10株杂交瘤细胞进行一轮亚克隆定株，然后用转瓶培养或小鼠腹水方式进行小规模的抗体生产，用蛋白A/G柱进行亲和纯化，每个细胞株得到2-5mg抗体。
5、抗体配对实验
将10株抗体分别进行生物素(Biotin)标记，以未标记的抗体(2.5μg/ml)包被多孔板(包被缓冲液为PBS，pH7.4)，以生物素标记的抗体(0.8-1μg/ml)作为检测抗体，抗原PEG-FVIII-linker-Fc进行倍比稀释，将10株抗体分别组合进行夹心ELISA检测，以630nm为参比波长，用酶标仪测定450nm的吸光度值，结果见表3。
表3.抗体配对结果
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(注：本文中抗体与对应的杂交瘤细胞使用相同的编号)
从表3可以看出，抗体9G10B3和11A12C6-Biotin是最佳的配对抗体。
建立标准曲线：通过夹心ELISA法，以9G10B3(2.5μg/ml)作为包被抗体(捕获抗体)，以11A12C6-Biotin(1μg/ml)作为检测抗体，药物PEG-FVIII-linker-Fc倍比稀释，以630nm为参比波长，用酶标仪测定450nm的吸光度值(表4)，得到标准曲线：y＝0.0002x+0.1033，R2＝0.9994。预期灵敏度达到约400-500ng/ml。
表4.配对抗体9G10B3和11A12C6-Biotin对药物的ELISA检测结果
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经测序，抗体9G10B3的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；抗体11A12C6的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
抗体9G10B3：
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISNGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNARITLYLQMSSLRSEDTALYYCVRDSFLRPYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQID NO:17)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGNSYLNWYHQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQGNEDPWTFGGGTNLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:18)
抗体11A12C6：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGNTNNNGKFKGKATLSADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAKRGHNYDVWYLDVWGAGTTVIVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(SEQ ID NO:19)
DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLTNRYGNTYLSWYLHKPGQSPQLLIYGISNRFFGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCFQGTHQPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:20)
实施例2检测食蟹猴血浆中药物浓度的生物分析方法
本实施例建立了电化学发光(ECL)法检测食蟹猴血浆中药物(PEG-FVIII-linker-Fc)浓度的生物分析方法，并对该方法进行标准曲线与定量范围、准确度、精密度、耐用性方面的部分方法学验证，为毒理、药代试验生物分析提供了论据。
1、方法原理
采用9G10B3作为包被抗体，包被吸附至96孔MSD板中，结合药物PEG-FVIII-linker-Fc后，加入检测抗体11A12C6-Biotin，随后加入钌标链霉亲和素(SA-Ru)，最后通过MSD读板缓冲液，利用电化学发光产生信号，信号强度与样本中PEG-FVIII-linker-Fc的含量呈正比。以理论浓度为横坐标，MSD测得的电化学发光信号为纵坐标，通过四参数回归模型来拟合标准曲线的相关参数，由Watson 7.6.1软件计算样品浓度。方法的LLOQ为0.030μg/mL。
2、关键试剂和主要仪器
实施例1制备的抗体9G10B3和11A12C6-Biotin；电化学发光分析仪MSD(1201MESOSECTOR S 600)。
3、标准曲线、质控样品的配制
表5.标准曲线样品的配制
(稀释液为食蟹猴血清)
表6.质控样品的配制
(稀释液为食蟹猴血清)
4、实验步骤
(1)包被：往MULTI-96-Well Plate NUNC High Bind孔板中加入50μL/孔的包被液(用PBS稀释9G10B3至4μg/mL)，2℃～8℃孵育16h～20h。
(2)洗板：洗板机洗板后(执行程序：C3 Wash Program)，在吸水纸上拍去残留液体。
(3)封闭：往MSD板中加入150μL/孔的封闭液(5％BSA-PBST)，放置于酶标板振荡器，300rpm，25±2℃孵育1h±10min。
(4)预处理：制备标准曲线样品，质控样品和待测样品(详见表5和6)。在稀释板中加入120μL/孔的稀释液(混合食蟹猴血浆)，然后加入40μL/孔的样品(MRD：4×，可根据需要成比例的调节体积)，混合混匀。
(5)洗板：洗板机洗板后(执行程序：C3 Wash Program)，在吸水纸上拍去残留液体。
(6)加样：往MSD板中加入50μL/孔的预处理样品，放置于酶标板振荡器，300rpm，25℃±2℃孵育2h±15min。
(7)洗板：洗板机洗板后(执行程序：C3 Wash Program)，在吸水纸上拍去残留液体。
(8)检测：往MSD板中加入50μL/孔的检测液，放置于酶标板振荡器，300rpm，25℃±2℃孵育1h±10min。
(9)洗板：洗板机洗板后(执行程序：C3 Wash Program)，在吸水纸上拍去残留液体。
(10)连接：往MSD板中加入50μL/孔的连接剂，放置于酶标板振荡器，300rpm，25℃±2℃孵育1h±10min。
(11)洗板：洗板机洗板后(执行程序：C3 Wash Program)，在吸水纸上拍去残留液体。
(12)显色：往MSD板中加入150μL/孔的Read Buffer，1-30min内读数。
(13)读数：使用Sector S 600电化学发光仪读板。
5、方法学验证结果
(1)标准曲线与定量范围
7个独立分析批验证结果显示均满足标准曲线的接受范围：
各浓度点的回算值与理论值之间的Bias％在-12.0％～18.3％范围内(Bias％在±20.0％范围内即为可接受)，ULOQ及LLOQ在-3.3％～20.0％范围内(ULOQ及LLOQ在±25.0％范围内即为可接受)；
各浓度点的复孔间CV％在8.5％之内(CV％≤20.0％即为可接受)，ULOQ及LLOQ在24.1％之内(ULOQ及LLOQ≤25.0％即为可接受)；
浓度点数量：75％以上的非零非锚定点浓度点且至少六个有效浓度点(包括LLOQ和ULOQ)用于标准曲线的计算，且满足以上标准；
锚定点没有接受标准，在有利于标准曲线拟合时可以剔除。
结果表明，此方法定量范围在0.030-3.240μg/mL范围内表现良好，验证结果满足指导原则要求，定量下限确定为0.030μg/mL。
(2)精密度与准确度
用混合食蟹猴血浆配制PEG-FVIII-linker-Fc至以下浓度的验证样品[ULOQ，3.240μg/mL；LLOQ，0.030μg/mL；HQC，2.430μg/mL；MQC，0.450μg/mL；LQC，0.090μg/mL]，配制完毕后分别进行检测，其中至少1个分析批的样品放置于超低温冰箱(-60～-80℃)，在保存12-72h后于室温融解后进行检测，至少1个分析批使用新鲜配制验证样品进行检测，考察批内及批间准确度、精密度(表7)。
表7.批内及批间准确度、精密度
结果表明，此方法精密度准确度验证结果良好，验证结果满足指导原则要求。
(3)耐用性
表8.方法的耐用性验证内容及结果
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的抗体或其抗原结合片段的组合，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如下所示的两种抗体或其抗原结合片段：
第一种抗体或其抗原结合片段：所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；和
第二种抗体或其抗原结合片段：所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的组合，其中：
所述第一种抗体或其抗原结合片段具有：氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区；和
所述第二种抗体或其抗原结合片段具有：氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的组合，其中：
所述第一种抗体或其抗原结合片段具有：氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的轻链；和
所述第二种抗体或其抗原结合片段具有：氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示的轻链。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.一种重组载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的重组载体。
7.权利要求1-3中任一项所述抗体或其抗原结合片段的组合用于检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的非诊断用途。
8.一种使用权利要求1-3中任一项所述抗体或其抗原结合片段的组合检测样品中培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白存在或含量的非诊断方法，其中，所述方法为夹心ELISA法，其中一种抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体，另一种抗体或其抗原结合片段作为检测抗体。
9.一种用于检测培重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的试剂盒，其包括权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合。
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