KR101566090B1 - 항―인간 ＩｇＧ１ 항체 - Google Patents

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Abstract

본원에서는, 인간 IgG1 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 면역글로불린에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체, 및 면역검정에서의 상기 항체의 용도가 보고되어 있다.

Description

항―인간 ＩｇＧ１ 항체 {ANTI-HUMAN IgG1 ANTIBODY}
본원에서는, 인간 IgG1 클래스의 항체에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도가 보고된다.
1974년 Koehler 와 Milstein 이 최초로 단일클론 항체를 개발한 이래로 인간 치료에 적합한 항체의 개발에 많은 노력이 있었다. 사용가능하게 된 최초 단일클론 항체는 마우스 및 래트에서 개발되었다. 과거 10년간 더욱 많은 수의 인간 단일클론 항체 또는 인간화된 (humanized) 단일클론 항체가 시판되었다. 잘 알려진 예로는, 예를 들어 Hoffmann-La Roche, Basel 의 Herceptin® 및 MabThera® 가 포함된다.
상당히 많은 수의 인간 또는 인간화된 단일클론 항체가 검토되고 있고 인간에의 도입 이전에 실험 동물에 대하여 연구할 필요가 있으며, 이를 첫 번째 시험 목적상 고려할 수 있다. 생체이용률 및 항체 클리어런스와 같은 중요한 조건이 연구되어야 하는 두가지 예로서 언급된다. 많은 이들 연구는 실험 동물의 항체를 배경으로 하여 치료학적 항체를 정량화하는 것을 요구한다. 대부분의 경우에서 포유동물이 실험 동물로서 사용된다. 독물학은 마우스 또는 래트와 같은 설치류에서 우선 평가된다. 약물 개발의 진행 단계에서, 특히 인간에게 약물을 도입하기 전에, 심지어 원숭이도 이러한 임상전 연구에 포함되어야만 한다.
포유동물은 대개 순환혈액 ml 당 약 10 내지 약 30 mg 의 항체를 갖는다. 치료용 단일클론 항체는 통상적으로 ml 당 약 1 나노그램 내지 ml 당 약 100 마이크로그램 범위 수준의 혈청과 함께 시험해야 한다. 따라서, 치료용 항체는 약 100배 내지 1000만배의 과량으로 존재하는 실험 동물의 항체를 바탕값으로 하여 검출되어야만 한다.
실험 동물의 항체의 바탕값 중에서 인간 또는 인간화된 치료용 항체를 검출하는 것은 약리학자에게는 상당한 과업을 의미한다. 인간 또는 인간화된 항체의 검출은 시험 동물이 호모 사피엔스와 더 밀접하게 관련될수록 더욱 더 어려워진다.
US 2004/214761 에서는, 다발성 골수종을 치료하는 방법이 보고되어 있다. IgG 인간 항체 클래스의 질적 및 양적 측정이 EP-A-1 098 198 에 보고되어 있다. WO 2006/066912 에서, 실험 동물에서 치료용 항체의 검출이 보고되어 있다.
항-약물 항체 검정이 WO 2008/031532 에서 보고되어 있다. US 5,332,665 에서는, 종 특이적, 고 친화도 단일클론 항체가 보고되어 있다.
문헌 [Jefferis, R., et al., report (Immunol. Lett. 31 (1992) 143-168] 및 [Immunol. Lett. 10 (1985) 223-252)] 에서는 인간 IgG 하위클래스에 대해 특이성을 갖는 단일클론 항체의 평가가 나타나 있다. 쥐과 단일클론 항체에 의해 인식되는 인간 IgG 하위클래스-특이적 에피토프는 문헌 [Jefferis, R. (Monographs in Allergy, Karger, Basel (CH), 20 (1986) 26-33)] 에 보고되어 있다. Lewis, A.P., 등은 게잡이 원숭이 면역글로불린 cDNA 카파 및 감마 클로닝 및 서열 분석을 보고하고 있다 (Dev. Compar. Immunol. 17 (1993) 549-560). 게잡이 원숭이 게잡이 원숭이 IgG 하위클래스의 분자 및 기능적 특징화는 문헌 [F.W., et al. (J. Immunol. 186 (2011) 341-349)] 에서 보고되어 있다. 문헌 [(Scand. J. Immunol. 49 (1999) 595-610)] 에서는 3 개의 마카크 면역글로불린 G 하위클래스의 특징화를 보고하고 있다. 인간이 아닌 영장류로부터의 혈청 샘플에서 치료용 항체의 인간-특이적 정량화에 대한 면역검정 평가가 문헌 [K-G., et al. (J. Pharm. Biomed. Analysis 49 (2009) 1003-1008)] 에 보고되어 있다. 문헌 [Liang, T., et al. (Vet. Immunol. Immunopat. 80 (2001) 259-270)] 은 4 개의 상이한 개과 면역글로불린 감마 사슬을 인코딩하는 cDNA 의 특징화 및 클로닝을 보고하고 있다.
발명의 개요
본원에서는 면역글로불린 클래스 IgG1 의 인간 항체 상에 존재하는 (클래스 IgG2, IgG3 및 IgG4의 인간 항체 상에 존재하지 않음) 에피토프에 대해 보고되어 있다. 또한 이러한 에피토프는 게잡이 원숭이의 항체 상에 존재하지 않는다.
하나의 양태에서, 본원에서는 인간 IgG1 클래스의 항체 및 침팬지 IgG 클래스의 항체에 특이적으로 결합하고 게잡이 원숭이와 같은 실험 동물의 항체에 특이적으로 결합하지 않는 항체가 보고되어 있다.
또한, 본원에서는 검정에서의 본원의 항체의 용도가 보고되어 있다.
본원에 보고되는 바와 같은 항체는 예를 들어 레서스 원숭이 및 게잡이 원숭이에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 측정에 대해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에서는 SEQ ID NO: 04 (인간 IgG1 CH1 도메인) 의 아미노산 위치 16, 82, 및 97 을 포함하는 것을 특징으로 하는 에피토프가 보고된다.
또다른 양태에서, 본원에서는 세포주 DSM ACC3076 (M-1.19.31) 로부터 수득될 수 있는 항체가 보고된다. 이러한 항체는 세포주 DSM ACC2708 에 의해 생산되는 항체 M-R10Z8E9 와 비교하여 종간 크로스-반응이 감소된다. Fab-영역에서 상이한 에피토프에 결합하는 항체는 근처 글리코실화 부위에 의해 영향을 받지 않으며, 이들 치료용 항체에서 오직 1 회 존재하는 항체의 각각의 결합 부위로서 인간 IgG1 CH1 도메인을 포함하는 Fab 항체 및 인간 IgG1 클래스의 전장 항체의 측정에 대핸 면역검정에서, 세포주 DSM ACC3006 에 의해 생산되는 항체 M-1.3.2, 세포주 DSM ACC3007 에 의해 생산되는 항체 M-1.5.8, 세포주 DSM ACC3008 에 의해 생산되는 항체 M-1.7.10, 및 DSM ACC2708 에 의해 생산되는 항체 M-R10Z8E9 로부터 선택되는 항체와 사용될 수 있다.
하나의 양태에서 본원에서는 인간 IgG1 클래스의 항체 및 침팬지 IgG 클래스 항체 또는 이의 Fab 단편에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 보고된다. 하나의 구현예에서, 항체는 비-인간 동물 유래 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 IgG1 클래스의 항체의 중쇄 불변 영역에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 IgG1 클래스의 항체의 Fab 영역에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서 항체는 인간 IgG1 클래스의 항체의 CH1 도메인에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서 항체는 침팬지 IgG 클래스의 항체 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서 항체는 실험 동물의 항체에 특이적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서 항체는 게잡이 원숭이 항체 및 레서스 원숭이 항체에 특이적으로 결합하지 않는다.
또다른 양태에서, 본원에서는 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 단일클론 항체가 보고된다.
또다른 양태에서, 본원에서는 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 보고된다.
하나의 양태에서, 본원에서는 세포주 DSM ACC3076 가 보고된다.
또한, 본원에 보고되는 바와 같은 양태는 면역검정에서 본원에 보고되는 바와 같은 항체의 용도이다.
본원에 보고되는 바와 같은 추가의 양태는 하기를 포함하는 키트이다:
a) 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체,
b) 세포주 DSM ACC2708, 또는 DSM ACC 3006, 또는 DSM ACC3007, 또는 DSM ACC3008 로부터 수득되는 항체.
또한 본원에 보고되는 바와 같은 양태는 하기 단계를 포함하는 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 검출하는 방법이다:
a) 분석 샘플을 제공하는 단계,
b) 본원에 보고되는 바와 같은 항체로 샘플을 인큐베이션하는 단계,
c) 전체, 활성, 항-약물 항체 (ADA)-결합, 또는 항원-결합 치료용 항체의 선택적 검출을 위한 시약으로 샘플을 임의적으로 인큐베이션하는 단계, 및
d) 단계 (b) 또는 (c) 에서 형성된 착물과 치료용 항체의 존재와의 상관관계를 나타내고, 이로써 치료용 항체를 검출하는 단계.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 포획 항체 및 추적 항체를 포함하는 항원 브릿지 면역검정을 사용하여 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 측정하는 방법이며, 포획 항체 및 추적 항체 둘 모두는 세포주 DSM ACC 3006, 또는 DSM ACC3007, 또는 DSM ACC3008, 또는 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 치료용 항체는 인간 IgG1 CH1 도메인을 포함하는 Fab 단편이다. 하나의 구현예에서 실험 동물은 마모셋 및 타마린, 구세계 원숭이, 드워프 및 애기여우 원숭이, 긴팔원숭이, 참여우 원숭이, 및 이의 교배종 패밀리 구성원을 포함하는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 실험 동물은 레서스 원숭이, 또는 마모셋 원숭이, 또는 개코 원숭이, 또는 게잡이 원숭이이다. 하나의 구현예에서 실험 동물은 늘보 원숭이 또는 마카크 원숭이이다. 하나의 구현예에서 실험 동물 게잡이 원숭이 또는 레서스 원숭이이다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 치료용 항체의 농도를 측정하기 위해 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 특이적으로 결합하는 항체의 용도이다 (이로써 항체는 세포주 DSM ACC3006, 또는 DSM ACC3007, 또는 DSM ACC3008, 또는 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일한 에피토프에 결합함).
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 세포주 DSM ACC3006, 및/또는 세포주 DSM ACC2708, 및/또는 세포주 DSM ACC3007, 및/또는 세포주 DSM ACC3008, 및/또는 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체의 혼합물을 포함하는 항체 조성물이다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는 본원에 보고되는 바와 같은 방법에서의 본원에 보고되는 바와 같은 항체 조성물의 용도이다.
하나의 구현예에서 면역검정은 샌드위치 면역검정이다. 또다른 구현예에서 항체의 이의 접합 파트너로의 접합은, 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기 및/또는 항체의 아미노산 골격의 상이한 라이신, 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀성 관능성 기의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기 (라이신), ε-아미노 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서 포획 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 고정된다. 하나의 구현예에서 포획 항체는 비오틴에 접합되고 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다. 하나의 구현예에서 추적 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 라벨에 접합된다. 하나의 구현예에서 디곡시게닌에 접합되고 검출가능한 라벨에 연결되는 추적 항체는 디곡시게닌에 대항하는 항체를 통해 수행된다. 하나의 구현예에서 치료용 항체 인간 또는 인간화 항체이다. 하나의 구현예에서 인간 또는 인간화 항체는 단일클론 항체이다. 하나의 구현예에서 총 치료용 항체가 검출되고, 또다른 구현예에서 활성 치료용 항체가 검출되고, 추가의 구현예에서 이의 항원에 결합하는 치료용 항체가 검출된다.
도 1 - 실험 동물에서 인간 항체 (인간 IgG) 의 정량화를 위한 완전한 총체적 검정의 검정 포맷.
도 2 - 항-인간 IgG 항체의 점 블롯; 예시적 참조 항체로서 P-셀렉틴에 대항하는 항체가 선택됨; 점으로 나타내는 참조 항체는 니트로셀룰로오스 막 상에서 천연 (좌측 컬럼) 및 변성 (우측 컬럼) 형태이고 각각 디곡시게닌화 항-인간 IgG 항체에 의해 검출됨; a) M-R10Z8E9, b) M-1.19.31.
도 3 - 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 항체 유도체를 정량화하기 위한 검정 : 도식적 검정 설정.
도 4 - 실험 동물에서 인간 IgG 의 구조적 온전성을 증명하기 위한 검정: a) 도식적 검정 설정, b) 교정 곡선.
M-R10Z8E9 (세포주 DSM ACC2708 로부터 수득됨) 나타내는 항-인간 IgG 항체는 글리코실화 부위 Asn297 근처의 클래스 G 의 인간 면역글로불린의 CH2 도메인에서 에피토프에 결합한다. 본원에서 보고되는 항체 M-1.19.31 (세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산됨) 은 항체 M-R10Z8E9 에 비해 감소된 교차반응성을 나타내고, 이는 Fab-영역 에서 세포주 DSM ACC2708 에 의해 생산되는 항체 M-R10Z8E9, 세포주 DSM ACC3006 에 의해 생산되는 M-1.3.2, 세포주 DSM ACC3007 에 의해 생산되는 M-1.5.8, 및 세포주 DSM ACC3008 에 의해 생산되는 M-1.7.10 와 상이한 에피토프에 결합하며, 이는 근처 글리코실화 부위에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 세포주 DSM ACC2708 에 의해 생산되는 항체 M-R10Z8E9, 항체 세포주 DSM ACC3006 에 의해 생산되는 M-1.3.2, 세포주 DSM ACC3007 에 의해 생산되는 항체 M-1.5.8, 및/또는 세포주 DSM ACC3008 에 의해 생산되는 항체 M-1.7.10 로 치료용 항체, 특히 Fab 치료용 항체의 측정을 위한 면역검정에서 혼합될 수 있다 (각각의 항체의 결합 부위는 인간 또는 인간화 항체의 Fab-단편에만 오직 1회만 존재함).
"치료용 항체" 란 용어는 인간 치료제로서 승인되기 위해 임상 연구에서 시험되고 있는 항체를 지칭하며 이는 질병의 치료를 위해 개별적으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 치료용 항체는 단일클론 항체이다. 추가의 구현예에서, 치료용 항체는 인간 항체 유전자자리를 갖고 변형된 동물 또는 유인원 로부터 수득되거나, 인간 단일클론 항체이거나, 또는 인간화 단일클론 항체이다. 하나의 구현예에서 치료용 항체는 인간 단일클론 항체이다. 하나의 구현예에서 치료용 항체는 인간화 단일클론 항체이다. 치료용 항체는 종양학적 질환 (예를 들어 비-호치킨 림프종, 유방암, 및 결장직장암을 포함하는 의학혈액학 및 고형 악성물), 면역학적 질환, 중심 신경 질환, 혈관 질환, 또는 감염 질환과 같은 다양한 질환의 치료를 위해 폭넓게 이용된다. 그러한 항체는, 예를 들어, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y 항원, IL-6 수용체 (IL6R), 또는 IGF-1 수용체 (IGF1R) 에 대항하는 항체이다.
용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 본원에 보고되는 바와 같은 항체는 하나의 구현예에서 인간 항체, 인간화 항체, 키메라성 항체, 또는 T 세포 항원 감손 항체이다. 항체의 유전적 조작은 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체는 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 으로 나뉜다. 이들 클래스 중 몇몇은 하위클래스 (아이소타입) 로 추가로 나뉘는데, 즉, IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 로, 또는 IgA 는 IgA1 및 IgA2 로 추가로 나뉜다. 항체가 속하는 면역글로불린 클래스에 따라 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 각각 α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), 및 μ (IgM) 으로 불린다. 용어 "인간 IgG1 클래스의 항체" 는, SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, 또는 SEQ ID NO: 04 에서 나타낸 바와 같은 불변 도메인의 아미노산 서열이 인간 IgG1 의 아미노산 서열로부터 유래하는 항체를 나타낸다. 그러한 항체에서 적어도 CH1 도메인이 존재해야만 한다. 용어는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라성 항체 및 항체 접합체를 포함한다.
비인간 (예, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린 및 인간 면역글로불린으로부터 유래된 일부 서열을 함유한 키메라성 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 그 과가변 영역의 잔기가 원하는 특이성 및 친화성을 갖는 마우스, 래트, 래빗 또는 비인간 영장류 등의 비인간 종 (공여체 항체) 의 과가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용체 항체) 으로부터 유도된다. 일부의 경우, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기가 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 나아가, 인간화된 항체는, 예컨대 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견할 수 없는 아미노산 잔기와 같은 추가적인 개질을 포함할 수 있다. 그러한 개질은 대응하는 모 서열과 유사하나 동일하지는 않은 수용체 또는 공여체 항체의 변형체를 낳는다. 이러한 개질은 항체 성능을 더욱 개량하기 위해 행해진다.
일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프가 비인간 공여체 항체의 것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 이 인간 수용체 항체의 것인 하나 이상, 통상적으로는 두 개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함한다. 또한 인간화된 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 중 최소한 일부 (통상적으로는 인간 면역글로불린의 것) 를 포함한다.
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 공개되어 있다. 바람직하게, 인간화된 항체는 비인간에서 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기를 종종 "수입" 잔기라 부르는데, 이는 통상적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 유래된 것이다. 인간화는 본질적으로 Winter 및 공동 연구자들의 방법에 따라, 인간 항체의 대응 서열을 과가변 영역 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 실질적으로 인간 가변 도메인의 전체보다 작은 부분이 비인간 종의 대응 서열로 치환되어 있는 키메라성 항체이다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 과가변 영역 잔기 및 가능한 일부 골격 영역 잔기가 설치류 또는 비-인간 영장류 항체 내 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
본원에서 "단일클론 항체" 란 용어는 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득된 항체, 즉 집단을 이루는 개별 항체가, 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생할 가능성이 있는 돌변연이를 제외하고는 동일한 항체를 말한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이어서 단일한 항원성 부위를 표적으로 한다. 게다가 상이한 항원 부위 (결정인자 또는 에피토프) 를 표적으로 하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와는 달리, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일한 결정인자를 표적으로 한다. 그 특이성 외에도, 단일클론 항체는 다른 항체에 의해 오염됨이 없이 합성가능하다는 점에서 유리하다. 수식어구인 "단일클론" 은 실질적으로 동질적인 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 성격을 가리키는 것이지 어떠한 특정 방법에 의해 항체를 제조해야 하는 것으로 해석되지 않는다.
용어 "키메라성 항체" 는, 제 1 종으로부터는 가변 도메인, 즉 결합 영역, 및 제 2 의 상이한 종 또는 원천으로부터 유래하는 불변 영역의 일부 이상을 포함하는 항체 (통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조됨) 를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "실험 동물" 은 마모셋 및 타마린 (Callitrichidae 과), 신대륙원숭이 (Cebidae 과), 구대륙 원숭이 (Cercopithecidae 과), 드워프 및 애기여우 원숭이 (Cheirogaleidae 과), 다람쥐원숭이 (Daubentoniidae 과), 갈라고원숭이 (Galagonidae 과), 긴팔원숭이 ( Hylobatidae 과), 인드리, 시파카, 및 친척류 (Indridae 과), 참여우원숭이 (Lemuridae 과), 로리스 (Loridae 과), 스포티브 레머 (Megaladapidae 과), 안경원숭이 (Tarsiidae 과) 및 이들의 교배종을 포함하는 영장류 순서의 과 (family) 의 구성원을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 실험 동물은 마모셋 및 타마린, 구세계 원숭이, 드워프 및 애기여우 원숭이, 긴팔원숭이, 참여우 원숭이 과의 구성원 및 이의 교배종 구성원을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, 인류와 가장 가까운 종인 유인원, 특히 침팬지, 보노보, 고릴라 및 오랑우탄의 군은 배제된다. 하나의 구현예에서 실험 동물 늘보 원숭이 속 구성원이다. 하나의 구현예에서 실험 동물은 늘보 원숭이 파시큘라리스 (게잡이 원숭이) 및 늘보 원숭이 물라타 (레서스 원숭이) 로부터 선택된다.
"샘플" 은 실험 동물로부터 수득되는 임의의 조직 또는 액체 샘플을 나타낸다. 하나의 구현예에서 샘플은 타액, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 액체 샘플이다. 추가의 구현예에서 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다.
"인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체" 또는 "실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않으면서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에는 특이적으로 결합하는 항체" 는 적어도 10-8 mol/l 의 해리 상수 (=KDiss) 를 갖는 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 결합한다. 따라서, 용어 "특이적으로 결합하는" 이란, 10-8 mol/l 이하의 해리 상수 (=KDiss) 를 갖는 항체 또는 Fab 단편의 결합을 나타낸다. 용어 "특이적으로 결합하지 않는" 이란, 기껏해야 10-7 mol/l 또는 그 이상, 즉, 10-5 mol/l 의 해리 상수 (=KDiss) 를 갖는 항체 또는 Fab 단편의 결합을 나타낸다. 동시에, "실험 동물의 항체에 특이적으로 결합하지 않는" 특성은 10-7 mol/l 또는 더욱 안 좋은 KDiss 에 의해 보증된다. 하나의 구현예에서 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체는, 인간 IgG1 클래스의 항체와 실험 동물의 항체 사이의 반응성에서 100-배 이상의 KDiss-차이를 보일 것이다.
항체의 결합 특성, 특히 KDiss 는, 하나의 구현예에서 BIAcore® 기기에 의해 평가된다. 이 방법에서, 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 의 변화에 의해 평가된다. 조사 중 상기 항체를 고상 ('칩'으로 불림) 에 결합시켜 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 심지어 IgG 를 포함하는 혈청의 상기 코팅된 칩과의 결합을 평가하는 것이 편리하다.
"에피토프" 란 용어는 항체에 특이적으로 결합가능한 단백질 결정인자를 가리킨다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측사슬과 같은 화학적 활성 표면 분자 그룹으로 이루어지고 특이적인 3차원 구조 특성과 특이적인 전하 특성을 통상 가진다. 입체배열 및 비(非)-입체배열 에피토프는, 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서는 손실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구분된다. 하나의 구현예에서 본원에 보고되는 바와 같은 항체는 자연 인간 IgG1 에는 결합하나 변성 인간 IgG1 에는 결합하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는" 이란, 항체 M-1.19.31 (세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산됨) 이 결합하는 인간 IgG1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 본원에 보고되는 바와 같은 인간 IgG1 클래스의 항체에 결합하는 항체의 에피토프 결합 특성은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 인간 IgG1 로의 결합은, 인간 IgG1 로의 항체 M-1.19.31 의 결합을 저해하기 위한 시험 항체의 친화도를 결정하기 위한 시험관내 경쟁 결합 저해 검정으로 25 ℃ 에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해 측정될 수 있다. 이는 예를 들어 실시예 12 에서 보고되는 바와 같은 BIAcore 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 조사될 수 있다. 실시예 12 에서, 결합 항체 M-1.19.31 와 경쟁하는, 본원에 보고되는 바와 같은 인간 IgG1 클래스의 항체에 결합하는 항체의 예상 결합 반응의 백분율 (%) 은 식 I 에 의해 계산된다 (BIAcore 검정 에피토프 맵핑 장치에서 기술되는 바와 같음):
Figure 112013013943996-pct00001
이때 rMax 는 식 II 에 의해 계산된다:
Figure 112013013943996-pct00002
최소 결합 반응은 또한 동일한 항체 1 및 2 의 쌍으로부터 계산된다 (참조, 실시예 12). 수득되는 최대 값 + 50 % 는 현저한 경쟁에 대한 역치로서 설정되고, 따라서 동일한 에피토프에 대한 현저한 결합이다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태에서, 상기 항체는 인간 IgG1 클래스의 항체 결합하는 것에 대해 항체 M-1.19.31 와 경쟁한다. 그러한 결합 경쟁은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 항체의 결합은, 인간 IgG1 클래스의 항체에 대한 항체 M-1.19.31 의 결합을 저해하기 위해 시험 항체의 친화도를 결정하기 위한 시험관내 경쟁 결합 저해 검정으로 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 으로 25 ℃ 에서 측정된다. 이는 예를 들어 실시예 12 에서와 같은 BIAcore 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 조사될 수 있다.
인간 IgG1 클래스의 (치료용) 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체는, 하나의 구현예에서 단일클론 항체, 또는 그러한 항체의 단편, 또는 그러한 항체의 결합 도메인을 포함하는 유전적 구성물이다. 인간 IgG1 클래스의 항체에 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 상기 기준을 보유하는 임의의 항체 단편이 사용될 수 있다.
실험 동물에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 적용에 연결되는 다양한 양태는 임상전 연구 동안 평가될 수 있다. 특정 세팅에서, 존재하는 치료용 항체의 총량을 분석하는 것이 적절할 수 있으며, 또는 치료용 항체의 특정 단편, 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 일부의 변형, 항원에 결합된 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 농도 또는 여전히 항원에 결합 가능한 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 단편을 분석하는 것이 중요할 수 있다. 하나의 구현예에서 본원에 보고되는 바와 같은 항체 및 방법은, 각각 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "전체 치료용 항체" 는, 항체가 활성 (즉, 이의 항원에 여전히 반응성이 있음), 비활성 및/또는 항원-결합 여부에 관계없이 검출된 임의의 항체를 말한다.
전체 치료용 항체는 활성 치료용 항체 및 불활성 치료용 항체로 나뉠 수 있다.
용어 "활성 치료용 항체" 는 여전히 자신의 항원과 결합가능한, 실험 동물에 존재하는 치료용 항체를 말한다. 예컨대 이러한 항체는 자신의 항원과 또는 자신의 항원 결합 부위에 임의의 다른 분자와 결합하지 않는 것이다.
"비활성 치료용 항체" 는 항원-결합 치료용 항체, 항-치료-항체 항체-결합 치료용 항체 (항-약물 항체-결합 치료용 항체; ADA-결합 치료용 항체), 및 변성된 항체로 나뉠 수 있다.
용어 "항원-결합 치료용 항체" 는 이의 항원에 결합하는 실험 동물의 순환에서 존재하는 바와 같은 치료용 항체를 말한다.
상기 정의되는 바와 같은 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 치료용 항체는, 본원에 보고되는 바와 같은 방법에서 항체를 이용하여 직접 검출될 수 있다. 또한, 항-약물 항체, 또는 항-이디오타입 항체, 또는 특히 중화 항-약물 항체에 의해 결합되는 치료용 항체와 같은 비-활성 치료용 항체의 다른 형태를 검출하는 것이 가능하다.
또한, 임의의 "비활성 치료용 항체" 를 간접적으로 평가하는 것이 가능하다. 그러한 비활성 치료용 항체는 예를 들어 이의 항원에 결합되는 치료용 항체일 수 있거나, 교차-반응성 항원에 결합되는 치료용 항체일 수 있거나, 치료용 항체에 대한 자가- 또는 항-이디오타입 항체에 의해 블로킹되는 치료용 항체일 수 있다. 전체 항체의 양이 활성 항체 및 항원-결합된 항체의 합계를 초과하는 경우, 자신의 상응하는 항원에 결합되지 않은 비활성 항체를 포함하는 항체의 추가 단편이 존재할 수 있다.
예를 들어 전체 치료용 항체는 소위 경쟁 면역분석 시스템 또는 소위 샌드위치형 면역분석 시스템으로 검출될 수 있다. 그러한 검정은 세척 단계 없이 (균질 면역분석법) 또는 세척 단계를 갖고 (비균질 면역분석법) 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 전체 치료용 항체는 샌드위치형 면역분석법으로 검출되는 것이 바람직하며, 여기서 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체는 상기 샌드위치 측정의 양면에서 모두 사용된다. 상기 샌드위치의 한 면에서 사용되는 항체는 고상에 결합되어 있거나 결합가능한 반면 (종종 포획 항체로서 지칭됨), 상기 샌드위치의 다른 한 면의 항체는 직접 또는 간접 검출이 용이한 (소위 검출 항체) 방식으로 표지되어 있다. 상기 샌드위치 분석 절차에서 결합된 검출 항체의 양은 조사된 표본 주으이 치료용 항체의 양에 직접 관련된다.
샘플에서 활성 치료용 항체의 검출은 종래 기술의 절차에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 전체 치료용 항체 또는 자신의 항원에 결합된 치료용 항체의 단편의 검출은 다소 복잡하고 상당히 다른 분석 설정을 요하며 특히 각각의 다른 분석을 위한 맞춤 시약을 요한다. 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는, 본원에 보고되는 바와 같은 항체를 이용하여, 서로 유사한 시험 시스템에서 활성 치료용 항체, 전체 치료용 항체, ADA-결합, 또는 항원-결합된 치료용 항체의 단편을 평가하는 것이 가능하다. 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 치료의 이러한 종류의 비교 평가는 한번의 양적 비교가 치료용 항체의 다양한 단편 사이에 이루어진다는 커다란 장점을 갖는다.
하나의 구현예에서 샌드위치형 검정 포맷이 활성 치료용 항체를 검출하기 위해 설정된다. 하나의 구현예에서 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체는 포획 항체로 사용되고, 상기 샌드위치 측정의 검출부는 표지된 형태의 항원을 이용하거나, 또는 항원의 결합 후 치료용 항체에 의해 인식된 에피토프에 결합되거나 경쟁하지 않는 제 2 항체를 이용하며, 여기서 상기 제 2 항체는 직접 또는 간업 검출이 용이한 방식으로 특이적으로 검출가능하고/검출가능하거나 표지되어 있다.
상기 항원-결합된 치료용 항체는 하나의 구현예에서 샌드위치형 검정 포맷에서 포획 시약으로서 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체를 사용하여 검출된다. 검출에서, 하나의 구현예에서, 상기 치료용 항체의 에피토프와 경쟁하지 않는 에피토프에서 상기 항원에 결합하는 제 2 항체가 사용된다. 상기 제 2 항체는 직접 또는 간접 측정이 용이한 방식으로 표지된다.
직접 검출의 경우, 상기 표지기는 임의의 공지된 검출 표지기, 예컨대 염료, 화학발광표지기와 같은 발광 표지기, 예컨대 아크리디늄 에스터 또는 다이옥세테인, 또는 형광 염료, 예컨대 플루오리세인, 로다민, 옥사진, 레조루핀, 시아닌 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지기의 다른 예는 발광 금속 복합체, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 복합체, 효소, 예컨대 ELISA 또는 CEDIA (클로닝된 효소 공여 면역분석법) 에 사용된 효소, 및 방사성동위원소가 있다. 또한, 하나의 구현예에서, 면역측정법에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 검출 가능한 라벨로서 사용되는 신호-방출기이고, 특히 바람직하게는 루테늄 킬레이트이다. 하나의 구현예에서 라벨링 기는 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트이다.
예를 들어 간접 검출 시스템은 상기 검출 시약, 예컨대 상기 검출 항체가 결합쌍의 제 1 파트너로 표지되는 것을 포함한다. 적합한 결합쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사물질, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사물질/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예컨대 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 하나의 구현예에서 제 1 결합쌍 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 하나의 구현예에서 합텐은 디곡신 및 비오틴 및 이들의 유사물질로부터 선택된다. 상기 결합쌍의 제 2 파트너, 예컨대 항체, 스트렙타비딘 등은 대개 직접 검출을 위해, 예컨대 상기 언급된 표지에 의해 표지된다.
상기 모든 면역학적 검출 방법에서, 시약 조건은 사용된 시약의 결합, 예컨대 항체의 자신의 상응하는 항원과의 결합을 고려하여 선택된다. 숙련된 기술자는 복합체라는 용어를 사용하여 상기 결합의 결과를 지칭한다. 본 발명에 따른 분석법에서 형성된 복합체는 최신 기술의 절차에 의해 상기 치룡용 항체의 상응하는 농도에 관련된다. 사용된 검출 시약에 따라, 상기 관련시키는 단계는 전체, 활성 또는 항원-결합 치료용 항체의 농도를 생성할 것이다.
숙련된 기술자가 이해하는 바에 따라, 본 발명에 따른 방법은 전체, 항원-결합된, 활성 또는 심지어 비활성 치료용 항체의 농도만을 나타내지는 않을 것이다. 서로 다른 측정법에서 바람직한 하나의 동일한 시약, 즉, 치료용 항체에는 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체를 사용하기 때문에, 수득된 값은 서로 쉽게 비교될 수 있고 심지어 이들의 비율도 쉽게 평가될 수 있다. 또한 바람직한 실시양태에서 본 발명은 활성 치료용 항체 대 전체 치료용 항체의 비율에 관한 것이다. 이 비율은 당연히 치료용 항체의 효능에 대한 척도로서 작용한다.
인간 IgG1 클래스 항체 상에 존재하는 하나의 에피토프가, 다른 인간 IgG 클래스 항체, 예컨대 IgG2, IgG3 및 IgG4 상에는 존재하지 않으며, 실험 동물의 항체, 특히 게잡이 원숭이 또는 레서스 원숭이의 면역글로불린 상에는 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 에피토프는 수탁된 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체 M-1.19.31 로의 이의 결합을 특징으로 한다. 따라서, 본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태에서 항체는 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산된다.
수탁된 세포주에 의해 생산되는 항체에 의해 인식되는 에피토프가 인간 IgG1 클래스의 항체의 Fab 영역에서 독특하며, 본원에 보고되는 바와 같은 또다른 양태는 수탁된 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체에 결합하는 에피토프이다. 항체가 항체 Fab 단편으로의 결합에 의해 확인되었기 때문에, 에피토프는 인간 IgG1 클래스 항체의 Fab 단편 상에서 존재하는 것을 추가의 특징으로 한다. 하나의 구현예에서 에피토프는 인간 IgG1 의 CH1 도메인 상에서 존재하는 것을 특징으로 한다. 하나의 양태에서, 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 특이적으로 결합하나 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는, 본원에 보고되는 바와 같은 항체는 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 2 개의 상이한 항체에 결합하는 에피토프의 에피토프 동일성 또는 오버랩을 경쟁 시험 시스템의 도움으로 측정되는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 효소 면역검정의 도움을 이용하여, 의심 항체가 고정 표적 항원에 결합하기 위한 공지된 항체와 경쟁하는 정도를 시험하는 것이 존재한다. 이러한 목적을 위해, 적절하게 고정된 표적 항원은 라벨링된 형태로 공지된 항체 및 과량의 의심 항체로 인큐베이션된다. 결합 라벨링을 검출함으로써, 의심 항체가 결합으로부터 공지된 항체를 대체할 수 있는 정도를 용이하게 확인할 수 있다. 20 % 초과, 또다른 구현예에서 30 % 초과 (동일한 농도에서) 또는 70 % 초과, 또다른 구현예에서 80 % 초과 (보다 높은 농도에서) 의 치환이 존재하는 경우, 하나의 구현예에서 103-105-배 과량의 의심 항체가 공지된 항체를 지칭하는 경우, 에피토프 오버랩이 존재하며 둘 모두의 항체는 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 결합한다.
수탁된 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체의 특이성은, 상이한 종으로부터 각각의 항체 및 혈정의 각각의 비오틴화 및 디곡시게닌화 변이체를 사용하는 샌드위치-ELISA 에서 나타날 수 있다. 검정에서 (도 1 참조), 포획 및 검출 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 동일한 세포주로부터 수득된다. 실험 동물의 혈청에서 인간 IgG 의 검출 및 정량화에 대한 일반적으로 적용가능한 검정을 위해, 그러한 검정은 결합 부위가 임의의 2차 항체 변형, 예컨대 글리코실화 부위 또는 잠재적인 탈아민화 부위와 독립적인 항-인간 IgG 항체를 요구한다. 다르게는, 검출되고 정량화되는 각각의 새로운 치료용 항체에 대한 검정을 최적화하기 위한 것이 필요하다. 또한, 본원에서 보고되는 항체는 분석될 치료용 항체와는 상이하며 참조 표준 및 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
본원에 보고되는 바와 같은 항체가, 면역글로불린 클래스 G 의 인간 및 침팬지 면역글로불린에 대해 매우 특이적이며, 항체 M-R10Z8E9 보다 더욱 양호한 종간 특이성을 나타내고, 실험 동물의 클래스 G 의 면역글로불린에 특이적으로 결합하지 않음을 알 수 있다.
또한, 본원에 보고되는 바와 같은 항체의 특이성은 BIAcore 기술을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 실험으로 나타낼 수 있다. 점-블롯 실험을 사용함으로써, 본원에 보고되는 바와 같은 항체에 의해 결합되는 에피토프가 결합시 손실된 변성 인간 면역글로불린의 형태적 에피토프임을 나타낼 수 있다 (도 2).
본원에 보고되는 바와 같은 또다른 양태는 본원에 보고되는 바와 같은 비오틴화 항체 (포획 항체) 및 본원에 보고되는 바와 같은 디곡시게닌화 항체 (추적 항체) 를 포함하는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서, 인간 IgG1 CH1 도메인을 포함하는 Fab-단편과 같은, 인간 IgG1 클래스의 인간 항체 또는 이의 유도체를 정량화하기 위한 검정법이다. 도 3 에서는 도식적 검정 설정이 나타난다 (포획 항체, 예를 들어 비오틴화 M-1.19.31, 분석물: 인간 항체의 Fab-단편, 추적 항체, 예를 들어 디곡시게닌화 M-1.3.2). 이러한 검정은, 2 개의 상이한 에피토프 상에서 인간 IgG 의 Fab 단편에 결합하는 포획 및 추적 항체를 요구한다.
본원에 보고되는 바와 같은 또다른 양태는, 인간 IgG 의 상이한 도메인 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 및 추적 항체를 포함하는 검정법이다. 이러한 검정에서, 오직 온전한 치료용 항체가 양성 검정 결과를 내고 검출가능한 신호를 나타낸다. 하나의 구현예에서 포획 항체 및 추적 항체는 한편으로는 항체 M-1.3.2, M-1.5.8, M-1.7.10 및 M-1.19.31, 및 다른 한편으로는 항체 M-R10Z8E9 로부터 독립적으로 선택된다. 예시적으로, 포획 항체 비오틴화 M-R10Z8E9 으로서, 분석물 항-IL13Rα1 항체로서, 및 추적 항체 디곡시게닌화 M-1.19.31 으로서, 실험 동물에서 인간 IgG 의 구조적 온전함을 증명하기 위한 이러한 양태에 따른 검정이 사용될 수 있다 (도 4 에서는 이러한 검정에 대한 도식적 검정 설정 및 교정 곡선이 나타난다).
본원에 보고되는 바와 같은 추가의 양태는, 항-인간 IgG 항체가 항-약물 항체 (ADA) 를 모방하기 위한 참조 표준 및/또는 양성 대조군으로서 사용되는 검정이다. 이는 검정의 최적 검정 조건 및 시험 강건도를 측정하기 위해, 즉 상이한 표준 시약/양성 대조군과의 검정 성능을 확인하기 위해 검정 진행 동안 유용할 수 있다. ADA 가 다클론이고, 대개는 Fab 단편 및 Fc 부분 둘 모두에 향한다는 사실에서 이러한 설정이 유리하다.
본원에 보고되는 바와 같은 추가의 양태에서, 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체는, 본원에 보고되는 바와 같은 방법에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 특이적으로 결합하며 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체로서 사용된다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 농도를 측정하기 위한, 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 특이적으로 결합하면서 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 항체의 용도에 관한 것이다. 하나의 구현예에서 상기 방법에 사용되는 항체는, 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체에 의해 인식되는 바와 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 결합하는 항체로부터 선택된다.
본원에 보고되는 바와 같은 하나의 양태는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 전체 활성의 ADA-결합, 또는 항원-결합 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체의 농도를 측정하기 위한, 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에 특이적으로 결합하면서 실험 동물의 항체에는 특이적으로 결합하지 않는 2 개의 항체 둘 모두의 용도에 관한 것이며, 이때 항체 중 하나는 포획 항체이고 다른 하나의 항체는 추적 항체이다. 하나의 구현예에서 치료용 항체는 Fab 단편이다.
하이브리도마 세포주 MAK<H-IgG>M-1.3.2, MAK<H-IgG>M-1.5.8, MAK<H-IgG> M-1.7.10, MAK<H-IgG>M-1.19.31 (각각, 항체 M-1.3.2, M-1.5.8, M-1.7.10, 및 M-1.19.31 발현) 를 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany" 의 특허 절차용 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약 하에서 기탁하였다:
Figure 112013013943996-pct00003
세포주 및 세포주로부터 수득되는 항체는 본 발명의 양태이다.
특정 구현예
구현예 1: 인간 IgG1 클래스의 항체에는 특이적으로 결합하나 레서스 원숭이, 마모셋 원숭이, 개코 원숭이 및 게잡이 원숭이의 면역글로불린에는 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구현예 2: 구현예 1 에 있어서, 카파 경쇄를 갖는 인간 IgG1 클래스의 항체에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 3: 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 람다 경쇄를 갖는 인간 IgG1 클래스의 항체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 4: 구현예 1 또는 2 에 있어서, 람다 경쇄를 갖는 인간 IgG1 클래스의 항체에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 5: 구현예 1, 2 및 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 IgG2 클래스의 항체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 6: 구현예 1, 2 및 4 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 IgG4 클래스의 항체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 7: 구현예 1, 2 및 4 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 람다 경쇄를 갖는 인간 IgG1 클래스의 항체의 Fab 에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 8: 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 카파 경쇄를 갖는 인간 IgG1 클래스의 항체의 Fab 에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 9: 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 IgG3 클래스의 항체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 10: 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 비-인간 동물 유래된 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 11: 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 IgG1 클래스의 항체의 중쇄 불변 영역 1 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
구현예 12: 세포주 DSM ACC3006 으로부터 수득되는 단일클론 항체.
구현예 13: 세포주 DSM ACC3006 또는 세포주 DSM ACC3007 에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구현예 14: 세포주 DSM ACC3006.
구현예 15: 세포주 DSM ACC3007 로부터 수득되는 단일클론 항체.
구현예 16: 세포주 DSM ACC3008 로부터 수득되는 단일클론 항체.
구현예 17: 세포주 DSM ACC3008 에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구현예 18: 세포주 DSM ACC3007.
구현예 19: 세포주 DSM ACC3008.
구현예 20: 세포주 DSM ACC3076 로부터 수득되는 단일클론 항체.
구현예 21: 세포주 DSM ACC3076 에 의해 생산되는 항체와 동일하거나 오버랩핑되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
구현예 22: 세포주 DSM ACC3076.
구현예 23: 구현예 1 내지 13, 15 내지 17, 20 또는 21 중 어느 한 구현예에 따른 항체의 면역검정에서의 용도.
구현예 24:
a) 포획 시약으로서, 세포주 DSM ACC3006, 또는 DSM ACC3007, 또는 DSM ACC3008, 또는 DSM ACC3076 으로부터 수득되는 항체,
b) 검출 시약으로서, 세포주 DSM ACC3006, 또는 DSM ACC3007, 또는 DSM ACC3008, 또는 DSM ACC3076 로부터 수득되는 항체
를 포함하는 키트.
구현예 25: 하기 단계를 포함하는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 검출하기 위한 방법:
a) 구현예 1 내지 13 및 15 내지 17 및 20 내지 21 중 어느 한 구현예에 따른 단일클론 항체로 분석 샘플을 인큐베이션하는 단계,
b) 전체 활성의 ADA-결합 또는 항원-결합 치료용 항체의 선택적 검출을 위한 시약으로 샘플을 임의적으로 인큐베이션하는 단계, 및
c) 단계 (a) 또는 (b) 에서 형성된 착물과 치료용 항체의 존재와의 상관관계를 나타내고, 이로써 치료용 항체를 검출하는 단계.
구현예 26: 포획 항체 및/또는 추적 항체 둘 모두가 구현예 1 내지 13 및 15 내지 17 및 20 내지 21 중 어느 한 구현예에 따른 항체로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 포획 항체 및 추적 항체를 포함하는 면역검정을 사용하여 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 측정하기 위한 방법.
구현예 27: 구현예 25 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료용 항체가 Fab 인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 28: 실험 동물이 마모셋 및 타마린, 구세계 원숭이, 드워프 및 애기여우 원숭이, 긴팔원숭이, 참여우 원숭이 과의 구성원 및 이의 교배종 구성원을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 구현예 1 내지 13 및 15 내지 17 및 20 내지 21 중 어느 한 구현예에 따른 항체, 및 구현예 25 내지 27 중 어느 한 구현예에 따른 방법.
구현예 29: 실험 동물의 면역글로불린에 특이적으로 결합하지 않으면서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에는 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 13 및 15 내지 17 및 20 내지 21 중 어느 한 구현예에 따른 항체의, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 전체 활성의 ADA-결합 또는 항원-결합 치료용 항체의 농도를 측정하기 위한 용도.
구현예 30: 세포주 DSM ACC3006, 및/또는 세포주 DSM ACC3007, 및/또는 세포주 DSM ACC3008, 및/또는 세포주 DSM ACC3076, 및/또는 세포주 DSM ACC2708 에 의해 생산되는 항체 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물.
구현예 31: 구현예 30 에 따른 항체 조성물의, 구현예 25 내지 27 중 어느 한 구현예에 따른 방법에서의 용도.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕고자 함이며, 본 발명의 실제 범주는 첨부된 특허청구범위에 나타낸다. 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않는 과정에서의 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.
서열 목록 설명
SEQ ID NO: 01 인간 IgG1 (코카시안 알로타입)
SEQ ID NO: 02 인간 IgG1 (아프로아메리칸 알로타입)
SEQ ID NO: 03 인간 IgG1 변이체 (코카시안 알로타입)
SEQ ID NO: 04 인간 IgG1 CH1 도메인
실시예 1
인간 IgG (면역원) 의 F( ab' ) 2 단편의 제조
100 mM 시트르산 나트륨 완충제 (pH 3.7) 중 클래스 G (인간 IgG) 의 전장 인간 항체를 펩신 (IgG 1 mg 당 1 μg 의 펩신) 으로 인큐베이션하였다. 단편화를 분석 겔 여과로 분석하고, 인산 칼륨의 첨가에 의해 pH 값을 6.5 로 조정함으로써 90 분 후 이를 중지시켰다. 10 mM 염화 나트륨을 갖는 10 mM 시트르산 나트륨 완충제 (pH 5.5) 에 대한 혼합물의 투석 후, 용액을 SP-세파로오스 크로마토그래피 컬럼에 적용하고 염 구배 중 용리된 단리 분획을 분석 겔 여과에 의해 개별적으로 분석하였다. 항체 F(ab')2 단편을 함유하는 풀을 인간 Fcg 에 대한 고정 다클론 항체를 이용하여 친화도 매트릭스에 적용하여 미량의 Fcg 단편을 제거하였다. 통과하는 플로우를 풀링하고, 약 16 mg/ml 로 농축하고 최종적으로 겔 여과 컬럼 (Superdex 200) 에 적용하였다.
실시예 2
단일클론 항-인간 IgG 항체의 생성
a) 마우스의 면역화
생후 8-12 주의 암컷 NMRI 마우스를 각각, CFA (완전 프로인트 항원 보강제) 와 혼합된 실시예 1 에 따라 제조된 항체 F(ab')2 단편 100 μg 을 이용하여 복막내에서 1차적으로 면역화하였다. IFA (불완전 프로인트 항원 보강제) 와 혼합된 마우스 당 항체 F(ab')2 단편 100 μg 을 각각 이용하여, 6 주 및 10 주 후, 2 개의 추가의 복막내 면역화 단계를 수행하였다. 이어서, 융합 3 일전 PBS (포스페이트 완충 염수) 중 항체 F(ab')2 단편 50 μg 를 이용하여, 각각 정맥내 부스트 면역화를 수행하였다.
b) 융합 및 클로닝
단계 a) 에 따른 면역화 마우스의 비장 세포를 Galfre 및 Milstein 에 따른 골수종 세포와 융합하였다 (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46). 대략 2.1 x 108 스플리노사이트를 4.2 x 107 골수종 세포 (P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580) 와 혼합하고 원심분리하였다 (300 x g 및 4 ℃ 에서 10 분). 이후, FCS (우태 혈청) 이 없는 배양 배지 RPMI 1640 를 이용하여 세포를 1회 세척하고, 포인트 바이알 50 ml 에서 400 x g 에서 다시 원심분리하였다. 이후, 1 ㎖ 의 PEG (폴리(에틸렌 글리콜), 분자량 4,000 g/mol) 를 첨가하고, 피펫팅으로 혼합하였다. 1분 후, 37 ℃ 에서 수욕 중에서, 5 ㎖ 의 RPMI 1640 (FCS 없음) 을 적가하고, 현탁액을 혼합하고, 10% (v/v) FCS 를 갖는 RPMI 1640 을 50 ml 의 최종부피가 되게 첨가하고, 원심분리하였다. 침전된 세포를 10% FCS 를 갖는 RPMI 1640 중 재현탁하고, 성장 인자 재조합 쥐과 인터루킨 6 (Peprotech, 0.5 ng/ml) 를 함유하는 하이포잔틴-아자세린 선택 배지 (10% FCS 를 갖는 RPMI 1640 중 1 μg/ml 아자세린, 100 mmol/l 하이포잔틴) 중에서 플레이팅하였다. 11 일 후, 1차 배양액을 특이적 항체 합성에 대해 검정하였다 (실시예 3 참조). 비오틴화 항체 F(ab')2 단편 및 비오틴화 인간 정상 IgG 에 대한 결합을 나타내는 1차 배양액을 성장 인자 재조합 쥐과 인터루킨 6 (Peprotech, 0.5 ng/ml) 을 함유하는 배지 중에서 유세포 분석기 (FACSAria, BD Biosciences) 를 사용하여 96-웰 세포 배양 플레이트로 단일 세포 퇴적에 의해 개별화하였다. 이러한 프로토콜을 따름으로써, 세포주 DSM ACC3076 을 수득하였다.
c) 면역글로불린의 제조
단계 b) 에서 수득되는 하이브리도마 세포주를 통상적으로 사용되는 보충물 및 10 % FCS 로 보충된 RPMI 1640 에서 ml 당 약 2 x 105 세포의 초기 세포 밀도 (생세포) 에서 접종시키고, 대략 3 주의 기간 동안 T-플라스크 (Celline, IBS) 에서 확장시켰다. 예를 들어 문헌 [Bruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596] 에 보고된 바와 같은 표준 단백질 화학 방법에 따라 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다.
실시예 3
항-인간 IgG 항체 검출을 위한 스크리닝 검정
a) 인간 IgG 에 결합하는 항체에 대한 1 차 스크리닝
하이브리도마 세포의 배양 상청액 중에서 항체의 특이성을 결정하기 위해, 재조합 스트렙타비딘 (MicroCoat, Bernried, lot MC 1098) 로 예비-코팅된 MTP (미세적정기 플레이트) 를 면역화 공정을 위해 사용되는 비오틴화 인간화된 IgG 250 ng/ml, 또는 비오틴화 인간 IgG 250 ng/ml 로 코팅하고 (각각 1.0% (w/v) BSA II 로 완충된 PBS 중에서) (진탕 하에, 주위 온도에서 60 분 인큐베이션, 웰 당 100 ㎕), 이어서 0.9 % (w/v) NaCl / 0.05% Tween® 20 으로 3 회 세척하였다. 다음 단계에서, 웰 당 100 ㎕ 의 검정 항체 용액 (배양 상청액) 을 첨가하고, 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 웰 당 0.9% (w/v) NaCl / 0.05% Tween® 20 을 이용하여 3 회의 세척 단계 후, 양 항-마우스 Fcγ 항체 (다클론 항체) 의 호스래디쉬 페록시다아제-라벨링된 F(ab')2 단편 100 ㎕ 를 결합된 샘플 항체의 검출을 위해 첨가하고, 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기와 같이 세척을 수행하였다. 최종적으로, 웰 당 100 ㎕ 의 ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany; catalog no. 1684302) 을 첨가하였다. 주위 온도에서 30 분의 인큐베이션 후, 시판되는 미세적정기 플레이트 ELISA Reader 에서 405 및 492 nm [405/492] 에서 소멸 (OD) 을 측정하였다. 이러한 스크리닝으로, 인간화 IgG 및 인간 IgG 에 대해 항체가 결합하는 웰을 선택하였다. 항체의 이러한 선택을 검정 b) 로 추가로 처리하였다.
b) 다른 종의 IgG 에 대한 최소 교차반응성을 갖는 항체의 선별
비오틴화 인간 IgG 를 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅된 미세적정기플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켰다. 과량의 결합되지 않은 항체를 세척 제거하였다. 이후, 샘플 및 참조 표준 (예를 들어 실시예 2 를 이용하여 수득되는 바와 같은 항-인간 IgG 항체) 을 완충제 및 10% 게잡이 원숭이 혈청 중에서 희석시켰다. 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 물질을 세척 제거한 후, 제 1 단계의 인간 IgG (디곡시게닌화 형태) 를 플레이트의 웰에 첨가하고 추가의 60 분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 디곡시게닌화 항체를 항-디곡시게닌 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 항체-효소 접합체의 HRP (호스래디쉬 페록시다아제) 는 ABTS 기질의 색 반응을 촉매작용하였다. 405 nm 파장 (참조 파장: 490 nm) 에서 ELISA 판독기에 의해 신호를 측정하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼중으로 측정하였다.
게잡이 원숭이 혈청 및 완충제에서 높은 검정 반응을 나타내는 항체를 선별하였다. 이러한 제 2 스크리닝으로, 다른 종의 IgG 에 대한 최소 교차반응성을 갖는 인간 IgG 에 대해 항체가 결합하는 웰을 선택하였다.
실시예 4
표면 플라즈몬 공명에 의한 항체 결합/특이성의 평가
모든 측정을 CM5-칩을 사용하여 BIAcore® T100 장치를 사용하여 수행하여다. 항체를 갖는 이러한 칩의 코팅을 표준 아민 커플링에 의해 달성하였다. 달리 지시되지 않는 한, 25 ℃ 에서 HBS-완충제 (HEPES, NaCl, pH 7.4) 에서 모든 인큐베이션을 수행하였다. 다클론 염소 항-마우스 Fc-감마 항체의 포화량을 CM5-칩의 유세포 상에서 아민 커플링에 의해 고정하였다. 이어서, 인간 IgG 에 대해 단일클론 마우스 항체를 30 ㎕/분의 유속으로 60 초 동안 주입하고 항-마우스 Fc 항체에 의해 결합시켰다. 모든 동물 혈청을 HBS 완충제에서 희석시켰다. 결합을 희석 혈청에서 100 에 1 의 주입으로 분석하고 30 ㎕/분의 유속에서 60 초 동안 인큐베이션하였다. 180 초 동안 HBS 완충제로 칩 표면을 세척함으로써 해리를 측정하였다. BIAcore® 로부터의 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 해리 상수 값 (=KD) 을 1:1 Langmuir 피팅 모델로 계산하였다. 모든 동물 혈청에 대해 이러한 계산은 IgG 수준이 15 mg/ml 이라는 가정에 기초한 것이었다. 시험 항체의 주입 후 80 초의 신호 값을 결합된 IgG 의 양을 비교하기 위해 선택하였다 (표 1 참조).
[표 1] 상이한 단일클론 항-인간 IgG 항체에 대한 동물 혈청의 결합을 위한 결합 신호 [RU] 및 KD-값
Figure 112013013943996-pct00004
실시예 5
a) 마우스 단일클론 항-인간 IgG 항체의 정제
실시예 2 에서 수득되는 세포주의 발효 상청액을 약 10 배 농축하고, 20 mM TRIS, 1 M 황산 암모늄을 갖는 완충제 (pH 9.0) 로 이동시키고, 단백질 A-세파로오스 크로마토그래피 컬럼에 적용하였다. pH 5.0 에서 0.2 M 시트르산 나트륨, 0.2 M 황산 암모늄을 이용하여 수득되는 용리액을 포스페이트 완충제 (pH 7.5) 에 대해 투석하였다. 소 IgG 의 오염물 (발효 브로쓰 중에서 FCS 로부터) 을 소 소 IgG 에 대한 고정 항체를 이용하여 면역흡착에 의해 분리하였다.
b) 비오틴화 항-인간 IgG 항체의 제조
포스페이트 완충제 (pH 8.5) 중 단계 a) 에서 수득되는 항-인간 IgG 항체를 약 5 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하였다. D-바이오티노일-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드를 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. L-라이신을 첨가함으로써 60 분 후 반응을 정지시키고, 라벨링 시약의 나머지를 50 mM 인산 칼륨 완충제 (150 mM NaCl 가짐, pH 7.5) 에 대해 투석하여 제거하였다.
c) 디곡시게닌화 항-인간 IgG 항체의 제조
포스페이트 완충제 (pH 8.5) 중 단계 a) 에서 수득되는 항-인간 IgG 항체를 약 5 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하였다. 디곡시게닌 3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드를 DMSO 에 용해시키고 1:4 의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. L-라이신을 첨가함으로써 60 분 후 반응을 중지시키고, 50 mM 인산 칼륨 완충제 (150 mM NaCl 가짐, pH 7.5) 에 대한 투석에 의해 라벨링 시약의 나머지를 제거하였다.
실시예 6
실험 동물로부터의 샘플에서 인간 항체 (인간 IgG ) 의 정제를 위한 완전 총체적 검정
비오틴화 항체 M-1.19.31 는 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅된 미세적정기 플레이트 (SA-MTP) 에 결합할 수 있다. 과량의 결합되지 않은 항체를 세척으로 제거하였다. 게잡이 원숭이 혈청에서 스파이크된 샘플/표준, 예를 들어 항-IL1R 항체, 항-IL13Rα1 항체, 항-Abeta 항체 및 항-IL6R 항체를 일련의 농도로 플레이트에 첨가할 수 있었고 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 세척 제거한 후, 100 ㎕ 의 디곡시게닌화 항체 M-1.19.31 을 플레이트에 첨가할 수 있었다. 세척 후, 결합된 디곡시게닌화 항체를 항-디곡시게닌-항체-HRP 접합체로 검출할 수 있었다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼중으로 측정하였다 (도식적 방법에 대해 도 1 참조).
실시예 7
실험 동물로부터의 샘플에서 인간 항체 유도체 (예를 들어 Fab -단편) 의 정량화를 위한 검정
비오틴화 항체 M-1.19.31 는 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅된 미세적정기 플레이트 (SA-MTP) 에 결합할 수 있었다. 과량의 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거할 수 있었다. 게잡이 원숭이 혈청 중 스파이크된 샘플/표준, 예를 들어 항-IGF1R 항체 Fab 단편을 웰에 첨가할 수 있었고, 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 세척 제거한 후, 100 ㎕ 의 디곡시게닌화 항체 M-1.3.2 를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세척 후, 결합된 디곡시게닌화 항체를 항-디곡시게닌 항체-HRP 접합체로 검출할 수 있었다. 각 혈청 샘플에 대한 흡광도 값을 삼중으로 측정할 수 있었다 (도식적 방법에 대해 도 3 참조).
실시예 8
실험 동물로부터의 샘플에서 인간 IgG 의 구조적 온전성을 검사하기 위한 검정
비오틴화 항체 M-1.19.31 는 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅된 미세적정기 플레이트 (SA-MTP) 에 결합할 수 있었다. 과량의 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거할 수 있었다. 게잡이 원숭이 혈청 중 스파이크된 샘플/표준, 예를 들어 항-IL13Rα1 항체를 플레이트에 첨가할 수 있었고 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 세척 제거한 후, 100 ㎕ 의 디곡시게닌화 항체 M-1.3.2 플레이트에 첨가할 수 있었다. 세척 후, 결합된 디곡시게닌화 항체를 항-디곡시게닌 항체-HRP 접합체로 검출할 수 있었다. 각 혈청 샘플에 대한 흡광도 값을 삼중으로 측정할 수 있었다.
실시예 9
본 발명에 따른 항-인간 IgG 항체와 조합으로 Fc -융합 단백질 (항원) 을 사용하는 실험 동물로부터의 샘플 중 인간 항체 (인간 IgG ) 의 정량화를 위한 검정
비오틴화 항원 (Bi-X) 를 제 1 단계에서 스트렙타비딘-코팅된 미세적정기 플레이트 (SA-MTP) 에 결합시켰다. 과량의 결합되지 않은 항원을 세척에 의해 제거하였다. 이후, 게잡이 원숭이 혈청 중 스파이크된 항-X 항체를 고정된 인간 수용체 X 에 결합시켰다. 결합되지 않은 물질을 세척 제거한 후, 결합된 항-X 항체를 인간 Fab 단편 (항체 M-1.19.31) 에 대해 디곡시게닌화 단일클론 항체를 이용하여 검출한 다음 호스래디쉬 페록시다아제 라벨링된 항-디곡시게닌 항체로 인큐베이션하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼중으로 측정하였다.
[표 2] OD 데이터.
Figure 112013013943996-pct00005
실시예 10
점 블롯 확인 대 선형 에피토프
항-인간 IgG 항체가 입체배열 에피토프 또는 선형 에피토프를 검출하는지 여부를 결정하기 위해, 점-블롯 분석을 수행하였다.
이러한 시험 동안, 항원-단백질 (인간 IgG) 을 천연 및 변성 형태로 니트로셀룰로오스 막에 점으로 나타냈다. 변성 형태를 수용하기 위해, 항원-단백질을 밤새 37℃ 에서 진탕기에서 SDS 로 인큐베이션하였다. 둘 모두의 형태를 일련의 농도로 막에 점으로 나타냈다. 막의 건조 완료 후, 표면을 진탕 하에 주위 온도에서 60 분 동안 블로킹 완충제 (Roti-Block, Roth, Germany) 로 블로킹하였다. 막의 세척 후, 이를 디곡시게닌화 항체 M-1.19.31 을 함유하는 용액으로 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 디곡시게닌화 항체를 항-디곡시게닌 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 항체-효소 접합체의 HRP 는 BM-블루 기질의 색 반응을 촉매작용하였다. 신호를 가시적으로 직접 제어하고 스캐너로 캡쳐하였다.
실시예 11
ELISA 에 의한 항체 결합/특이성의 평가
인간 IgG 하위클래스의 어느 종류가 연구되는 항-인간 항체에 의해 결합되는지를 결정하기 위해, 가교 ELISA 분석을 수행하였다.
비오틴화 항체 M-R10Z8E9, M-1.3.2, M-1.5.8, M-1.7.10 및 M-1.19.31 을 제 1 단계에서 스트렙타비딘 미세적정기플레이트에 결합시켰다. 제 2 단계에서, 상이한 하위클래스의 인간 IgG 항체를 인큐베이션하였다. 인간 IgG1 카파; 인간 IgG1 람다; 인간 IgG4; 키메라성 인간 IgG1; 인간 IgG2 (다클론 정제된 인간 IgG2) 및 인간 IgG3 (다클론 정제된 인간 IgG3) 을 희석 시리즈로 제조하고 스트렙타비딘 미세적정기플레이트에 인큐베이션하고, 비오틴화 항-인간 항체로 코팅하였다. 세척 단계 후, 코팅에 사용되는 바와 동일한 항체를 디곡시게닌화 형태로 검출 항체로서 사용하였다. 이는, 동일한 항-인간 항체 클론이 코팅 및 검출에 대해 사용됨을 의미한다. 예를 들어 하나의 플레이트를 M-1.7.10 Bi 로 코팅하고 M-1.7.10-Dig 를 검출에 사용하였다. 인큐베이션 및 세척 단계 후, 호스래디쉬 페록시다아제 라벨링된 항-디곡시게닌 항체로 인큐베이션하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼중으로 측정하였다.
[표 3] 가교 ELISA 분석의 추정
Figure 112013013943996-pct00006
실시예 12
SPR 을 이용함으로써 교차-경쟁을 기초로 하는 인간 IgG1 클래스의 항체에 대해 항체의 에피토프 특성화
기기: BIACORE® T100
칩: CM5 (BIAcore BR-1006-68)
커플링: 아민 커플링
완충제: PBS (BIAcore BR-1006-72), pH 7.4, 25℃
교차-경쟁을 통한 에피토프 결합 검정에 대해, 다량의 항-마우스 Fcγ 항체 (염소로부터, Jackson Immuno Research Cat. No. 115-005-071) 를 항-인간-IgG 항체의 표시에 대한 센서 칩 표면에 커플링하였다 (대략 8,000 - 12,000 RU). 10 ㎍/㎖ 의 제 1 항-인간-IgG 항체의 주입 후, 포획 항-마우스 항체의 잔류하는 자유 결합 용량을 250 μg/ml 마우스 면역글로불린으로 포화시켰다. 자유 항-마우스 결합 부위의 블로킹 후, 인간 Fab 단편을 1 분 동안 10 μg/ml 의 농도로 주입하였고 제 1 의 항-인간 IgG 항체에 의해 결합된다. 제 2 항-인간-IgG 항체를 1 분 동안 10 μg/ml 의 농도로 주입하였다. 제 1 및 제 2 항체의 상이한 결합 부위의 경우, 제 2 항체는 고정된 인간 Fab 단편에 결합할 수 있다. 동일한 결합 부위는 제 2 의 항-인간-IgG 항체의 결합이 없음을 초래한다. 제 2 의 결합에 대한 양성은 10 RU 결합의 커트-포인트에 의해 규정된다. 각 사이클 후, 센서 칩을 100 mM H3PO4 의 주입에 의해 재생시켜, 결합 면역 복합체를 제거하였다. 오직 공유 결합된 항-마우스 항체만이 칩에 결합되어 남아 있게 된다.
항-인간 항체의 모든 가능한 조합을 분석함으로써, 에피토프 그룹을 규정할 수 있다.
[표 4] BIAcore 결합 검정의 결과 (RU 로 반응)
Figure 112013013943996-pct00007
[표 5]: 생성 에피토프 그룹
Figure 112013013943996-pct00008
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) DSMACC2708 20041222 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) DSMACC3006 20090924 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) DSMACC3007 20090924 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) DSMACC3008 20090924 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) DSMACC3076 20100630
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Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 variant <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val

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  20. 세포주 DSM ACC3076 으로부터 수득되는 단일클론 항체.
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  22. 세포주 DSM ACC3076.
  23. 제 20 항에 따른 항체를 면역검정에 사용하는 방법.
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  25. 하기 단계를 포함하는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 검출하기 위한 방법:
    a) 제 20 항에 따른 단일클론 항체로 분석 샘플을 인큐베이션하는 단계, 및
    b) 단계 (a) 에서 형성된 착물과 치료용 항체의 존재와의 상관관계를 나타내고, 이로써 치료용 항체를 검출하는 단계.
  26. 포획 항체, 추적 항체, 또는 포획 항체 및 추적 항체가 제 20 항에 따른 항체로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 포획 항체 및 추적 항체를 포함하는 면역검정을 사용하여 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 측정하기 위한 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 치료용 항체가 Fab 인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 실험 동물이 마모셋 및 타마린, 구세계 원숭이, 드워프 및 애기여우 원숭이, 긴팔원숭이, 참여우 원숭이 과의 구성원 및 이의 교배종 구성원을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 실험 동물의 면역글로불린에 특이적으로 결합하지 않으면서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체에는 특이적으로 결합하는, 제 20 항에 따른 항체를, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 전체 활성의 ADA-결합 또는 항원-결합 치료용 항체의 농도를 측정하기 위하여 사용하는 방법.
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  32. 제 26 항에 있어서, 치료용 항체가 Fab 인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 실험 동물이 마모셋 및 타마린, 구세계 원숭이, 드워프 및 애기여우 원숭이, 긴팔원숭이, 참여우 원숭이 과의 구성원 및 이의 교배종 구성원을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 하기 단계를 포함하는, 실험 동물로부터 수득되는 샘플에서 인간 IgG1 클래스의 치료용 항체를 검출하기 위한 방법:
    a) 제 20 항에 따른 단일클론 항체로 분석 샘플을 인큐베이션하는 단계,
    b) 전체 활성의 ADA-결합 또는 항원-결합 치료용 항체의 선택적 검출을 위한 시약으로 샘플을 인큐베이션하는 단계, 및
    c) 단계 (b) 에서 형성된 착물과 치료용 항체의 존재와의 상관관계를 나타내고, 이로써 치료용 항체를 검출하는 단계.
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