JP4636225B2

JP4636225B2 - 検査試薬キット

Info

Publication number: JP4636225B2
Application number: JP2003436150A
Authority: JP
Inventors: 司甫横山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-11-30
Filing date: 2003-11-28
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2023-11-28
Also published as: JP2004191382A

Description

発明の詳細な説明

産業上の利用分野

本発明は、自己免疫疾患や感染症を検出するために用いられる検出方法及び測定試薬に関する。

従来、自己免疫疾患や感染症を検出するためには、血清が用いられている。
自己免疫疾患や感染症に罹患した患者等から血液を採取し、血清中の疾患に対応する抗体もしくは抗原を免疫反応で検出する方法が採られていた（例えば「リウマトイド因子」の測定、７２６頁「臨床検査ガイド２００１〜２００２」文光堂社刊）。
ここで、「自己免疫疾患や感染症に罹患した患者等」とは、発症した患者はもとより発症前の免疫原や原因菌（カビ、結核菌等の細菌、ウイルスを含む）及びこれらの抗体を体内に保有している者も含む。ウイルスには肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型Ｅ型他）、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、水痘ウイルスやＳＡＲＳウイルスを含む。
血清検体は、採血時に痛みがあり、特に乳幼児は嫌う。又、感染予防から注射針は患者毎に取り替えねばならず、手間と費用を要するとの問題があり、臨床上、より簡便な診断方法と診断試薬の出現が望まれていた。

発明が解決しょうとする課題

本発明者は、自己免疫疾患や感染症の検出に、患者の苦痛がなく簡便に測定できる方法と試薬を提供するものである。

課題を解決するための手段

本発明者は、通常用いる尿の定性試験で蛋白を陰性と判断される健常者の尿にも蛋白が微量に出ていることを定量測定で確認した。更に微量に出ている蛋白があたかも一つのものの様に扱われていることに疑問を持ち、尿蛋白の分析を続け、未解明の無数の各種蛋白が存在することを見出だした（例えば、健常者の尿中にＮＣ１が排泄されている事実）。そしてこの微量蛋白中に抗体になるべくＩｇＧはもとより、ＩｇＡをはじめ各種のグロブリンが存在することを認め、疾患時には血清に現れる特定抗原に対応する抗体が尿にも存在することを解明し、本発明を完成させた。もちろん、尿と血清では、疾患時のステージにより抗原や抗体の出現時期・量等の異同はある。
加えて、自己免疫疾患や感染症の患者等には、血清同様に尿にも抗原があることを見出だし、抗体の測定と同様に、抗原の測定方法と試薬をも完成させた。
更に測定の時の陽性標準として実験モデルのサルの生体試料（血清、尿他）を用いることが可能であることをつき止め、特殊な疾患での陽性患者の生体試料（血清、尿他）の入手困難さを解消した。
自己免疫疾患としては、腎炎をはじめ、関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、膠原病等があげられる。
例えば腎炎は、抗原抗体複合物を介して発症する一種のアレルギー反応と理解される。腎炎でも糸球体疾患に限れば、原発性糸球体疾患の病型として抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎を含む急性進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症をあげられる。又、二次性腎症としては、糖尿病性腎症等があげられる。
感染症とは、病原菌が体内に侵入した場合をいい、例えば、内臓真菌症、Ｂ型肝炎感染症、ＨＩＶ感染症、クラミジア感染症などがあげられるが、もちろん、免疫目的のワクチン投与の効果を尿の抗体測定で判定することも可能である。
自己免疫疾患の代表である腎炎では、糸球体やその他に抗体が沈着するが、対応する抗原はほとんどが不明である。この抗原が何であるかその解明が待たれている。
抗原が解明された例としての抗ＧＢＭ抗体腎炎では、抗原がＮＣ１であることが知られている。しかし、ＮＣ１は精製が困難である為、精製ＮＣ１に対する抗体検出試薬としてのキットが体外診断薬としてないのが現状である。
抗ＧＢＭ抗体腎炎の抗体検出キットはＮＣ１を含むＧＢＭ抽出物を抗原としているのが世界の現状であり、従って感度は悪く、検出精度の劣る検出試薬が市販されているに過ぎない。
ここで、本願発明者は、ＮＣ１の精製品でキット化すれば感度が上昇することになるのでは考え、鋭意研究の結果、「抗ＮＣ１抗体検出キット」を完成させた。
ところで一般的分類では、腎臓の糸球体は、細胞細分と細胞外基質から成る。
細胞細分はメサンギウム細胞、上皮細胞、内皮細胞及びボウマン嚢上皮細胞で、細胞外基質はメサンギウム基質、糸球体基底膜及びボウマン嚢基底膜によって構築される。糸球体の細胞外基質の主要成分は、タイプ４コラーゲンを主とするコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、フィブロネクチンなどの糖蛋白質であり、メサンギウム基質と糸球体基底膜ではこれらの構成成分の割合が異なっているとされる（４１３頁、「細胞外マトリックス」メデイカルレビュー社刊、１９９６）。
そこで、発明者は、タイプ４コラーゲンを構成しているＮＣ１及びタイプ４コラーゲン三本鎖領域が、原発性、二次性を問わず腎炎全ての抗原と成り得り、抗原として糸球体基底膜だけでなくメサンギウム領域をはじめ広く点在するのではと推定した。言い換えれば、抗ＧＢＭ抗体腎炎以外の抗原未解明の腎炎、例えばＩｇＡ腎症においてもＮＣ１及びタイプ４コラーゲン三本鎖領域が抗原であると推定した。つまり、抗原の確定していないＩｇＡ腎症ではメサンギウム領域にＩｇＡが沈着するのなら、抗ＧＢＭ抗体測定試薬で、ＮＣ１（又はタイプ４コラーゲン三本鎖領域）を抗原として、ＩｇＧ抗体測定でなくＩｇＡ抗体測定を採用して免疫反応で測定すれば良いと判断し、「抗ＮＣ１ＩｇＡ抗体測定キット」が血清測定で有用であることを見出だし、かつ尿測定に於いても適用できることを見出だした。
ここで、ＩｇＡ腎症の診断基準に触れる。
従来、ＩｇＡ腎症の診断基準は、確定診断として腎生検が唯一の方法で、具体的には、「びまん性にメサンギウム領域を主体とするＩｇＡの顆粒沈着」を蛍光抗体又は酵素抗体染色で所見するとしている（１０７１頁「臨床検査２００１〜２００２」文光堂刊）。
それ故、本願発明の「抗ＮＣ１ＩｇＡ抗体測定キット」は、ＩｇＡ腎症の血清や尿を測定できるので、従来の腎生検を不要とし、患者を多大の苦痛と束縛から、医師を格別の拘束時間と格段の技術習得から開放するものである。
又、本願発明の「抗ＮＣ１抗体測定キット（ＮＣ１をタイプ４コラーゲンに置き換えても良い）」は原発性及び、糖尿病性腎炎等の二次性腎炎の検出に役立つ。
特に「抗ＧＢＭ抗体腎炎」に対して「抗ＮＣ１抗体測定キット」は、ＧＢＭに豊富に存在するＮＣ１を抗原に用いているので格別に高感度と成り、血清中はもとより尿中のＩｇＡ抗体もＩｇＧ抗体も鋭敏に測定でき、特に尿中のＩｇＡに対しては鋭敏である。
本願発明のいずれの抗体測定キットも、抗体の尿中測定が血清中測定の代用と成り得るだけでなく、特に尿中のＩｇＡ測定は健常群と疾患群との見分けに優れている。
ところで、発明者は、次に述べる様に、ほとんど全ての腎炎は病名は異なっても成り立ちが同じであると考える。
即ち、何かの原因でグロブリンが補体やグロブリンと結合して巨大化するか粘着性を増した結果、腎臓の不特定の微細領域にたまたま引っ掛かり、最も広く存在するので接触する機会も多くなるタイプ４コラーゲンを構成しているＮＣ１及びタイプ４コラーゲン三本鎖領域を時間の経過と共に抗原として認識する様になり炎症が生じたものであると考える。
なぜなら、本願発明の「抗ＮＣ１抗体測定キット（ＮＣ１をタイプ４コラーゲンに置き換えても良い）」及び「ＮＣ１測定キット（ＮＣ１をタイプ４コラーゲンに置き換えても良い）」は原発性及び、糖尿病性腎炎等の二次性腎炎を問わず検出でき、特に早期の検体で、尿検体で一層有用であるからである。
自己免疫疾患や感染症を検出する為に、本発明者は、下記の具体的手段を確立した。本発明は、記載の測定方法及び試薬に限定されるものではない。
即ち、抗ＧＢＭ抗体腎炎において生ずる抗ＮＣ１抗体を患者等の尿中から検出する方法と測定試薬について血清の場合も並べて例示し、説明する。

１抗ＮＣ１抗体を血清及び又は尿中から検出する方法と測定試薬。
及び抗タイプ４コラーゲン抗体を血清及び又は尿中から検出する方法と測定試薬。
試薬として、１）ＮＣ１又はタイプ４コラーゲン（ここでは三本鎖領域を言う）をコートしたプレート、２）酵素標識抗ヒトＩｇＧ（又はＩｇＡ）抗体、３）発色基質（ＴＭＢ）、４）反応停止液（硫酸）を用いて測定する。
この時、陽性標準は、ヒト患者より入手しても良いが、発明者が見出だした様に実験モデルのサルから得たものがより良い。管理されて育成され、作製するサルの実験モデルの方が安定した標準となり得る。

免疫反応として、酵素免疫反応が代表的にあげられるが、それに限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ法，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含む。酵素免疫反応において酵素標識の抗体としては、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を問わない。又それを放射性物質（ＲＩＡ法）、発光物質で標識した物（免疫発光法）、無標識物（沈降法、凝集法）でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法他でも良いが、特にサンドイッチ法が望ましい。測定試薬の構成として、ＮＣ１又はタイプ４コラーゲンをコートするプレートを、ガラスや磁性物質にしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレートにＮＣ１又はタイプ４コラーゲン（以下抗原）をコートする時、間接コートにしコート物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分でも良い。
又、抗原は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド（特定分画、合成品を含む）でも良い。
測定試薬に用いる抗原の動物種としては、ヒトが望ましく、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、羊、ヤギ、ウサギ、ラット他の動物でも良くこれに限定されない。更に、抗原は、複数動物種を混合したものでも良い。
抗原の由来臓器は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。
更に第二抗体は、抗ヒトＩｇＡ抗体が特に望ましく、抗ヒトＩｇＧ抗体も望ましいが、これに限定されず、抗ヒトＩｇＭ抗体、その他の抗ヒトイムノグロブリン抗体でも良く混合でも良い。測定対象がラットやマウスなどヒト以外の動物の時は、前述のヒト用試薬成分を対象動物に合わせて測定することができる。しかしサルの場合は、ヒト用をそのまま用いる事ができる。

発明の効果

本発明は、免疫異常や感染症で、尿を検体とすることで、疾患の抗原に対応する抗体を手軽に検出する。加えて尿検体では抗原も検出できる。
更に、本発明によって検出された腎炎患者の場合、血液浄化時に、抗原「ＮＣ１及び又はタイプ４コラーゲン」に対応する抗体、及び又は抗「ＮＣ１及び又はタイプ４コラーゲン」抗体に対応する抗原を吸着除去させることで、浄化の効果を一層高められる。

準備；陽性標準として使用する為に、サル抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎モデルを以下の条件で作製した。
抗原；ＮＣ１
ウシ腎糸球体基底膜由来タイプ４コラーゲンＮＣ１領域の精製品
投与；ＮＣ１３ｍｇを同量のＦＣＡと共にカニクイザル背部皮内に投与
血清はＮＣ１投与後、１、２、６週時を採取した。
尿はＮＣ１投与後、１、２、６週時を採取した。
実施例；断らない限りいずれの実験も室温で行った。
１「抗ＮＣ１抗体測定キット」の作製（ＥＬＩＳＡ法で実施）
１）キットの構成
ＮＣ１結合マイクロプレート；ＮＣ１：０．０５〜０．２０ｕｇ／ｗｅｌｌ
検体希釈液；ＰＢＳ（含ＢＳＡ，Ｔｗｅｅｅｎ２０）
ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（又はＩｇＡ）ウサギ抗体
発色基質液；ＴＭＢ
反応停止液；１Ｎ硫酸
洗浄液；ＰＢＳ（含Ｔｗｅｅｎ２０）
２）操作方法
抗原結合マイクロプレートを１回洗浄→検体添加（ヒト検体はそのまま使用、サル血清・サル尿は希釈）→２時間後３回洗浄→ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（又はＩｇＡ）ウサギ抗体添加→１時間後３回洗浄→発色基質液添加→５分後に反応停止液添加→吸光度測定（４５０ｎｍ）
３）ヒト検体；抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎血清
市販「抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎測定試薬」の標準品を使用
（体外診断用医薬品）（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製・輸入販売／ニプロ社）
４）サル検体；「準備」で作製した抗ＧＢＭ抗体腎炎モデル
２「抗ＮＣ１抗体測定キット」はヒトの抗ＧＢＭ抗体腎炎を測定できるか検討した。
１）測定結果

２）結論
１）本発明の「抗ＮＣ１抗体測定キット」は、既存の体外診断用医薬品と同様に、ヒト検体を測定できる。加えてより高感度である。
−ＥＵＲ社キットではカットオフ値（１０Ｕ）でのＯＤが、陰性（０Ｕ）の１６倍であるのに、本発明キットでは２９倍である。
２）両測定試薬は、サル血清もヒトと同様に測定できる。従って、サルの血清はヒトの抗ＧＢＭ抗体腎炎検体の測定時に標準として使用し得る。
３）ヒト検体を指標として、サル血清を測定する時、発明の「抗ＮＣ１抗体測定キット」は、既存の体外診断用医薬品（６Ｗ）より早く陽性を認める（２Ｗ）。よって、発明キットはヒトの抗ＧＢＭ抗体腎炎の早期検出に有用である。
３ヒトの抗ＧＢＭ抗体腎炎では血清にＩｇＡ抗体も存在するかを検討した。
１）前述「抗ＮＣ１抗体測定キット」で「ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧウサギ抗体」を「ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＡウサギ抗体」に置き換えて測定した。
２）測定結果

３）結論
１）ヒトの抗ＧＢＭ抗体腎炎にはＩｇＡ抗体も存在する。よって、「抗ＮＣ１抗体測定キット」によるＩｇＡ抗体の測定はヒト抗ＧＢＭ抗体腎炎の検出に利用できる。ＩｇＡのカットオフ値と健常値のＯＤがほぼ等しいことは、ＩｇＧのそれが離れている時に、カットオフ値を示す検体が健常群であることを明瞭にする。
４「抗ＮＣ１抗体測定キット」は尿中の抗体を測定できるか検討した。
１）測定結果

２）結論
１）「抗ＮＣ１抗体測定キット」は尿中のＩｇＡ抗体もＩｇＧ抗体も測定できる。従って、尿の測定は血清測定の代用となり得る。
２）尿測定では、血清と異なり、ＩｇＡが優位となるので、これを測定するのが望ましい。
５「ＮＣ１測定キット」の作製（サンドイッチＥＬＩＳＡ法で実施）
１）キットの構成
抗ＮＣ１抗体結合マイクロプレート；抗血清１２０ｕｌ／ｗｅｌｌ
前出ＮＣ１で作製したラット由来抗血清を１０００倍希釈
検体希釈液；ＰＢＳ（含ＢＳＡ，Ｔｗｅｅｅｎ２０）
抗ＮＣ１抗体
前出ＮＣ１で作製したウサギ由来抗血清を５０００倍希釈
ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ由来）
発色基質液；ＴＭＢ
反応停止液；１Ｎ硫酸
洗浄液；ＰＢＳ（含Ｔｗｅｅｎ２０）
２）操作方法
抗体結合マイクロプレートを１回洗浄→検体添加（ヒト尿はそのまま使用、サル血清・サル尿は希釈）→２時間後３回洗浄→抗ＮＣ１抗体添加→２時間後３回洗浄→ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体添加→１時間後３回洗浄→発色基質液添加→５分後に反応停止液添加→吸光度測定（４５０ｎｍ）
３）ヒト検体；ヒト男健常者（４４才、１２才、１０才）の早朝一番尿市販のテルモ尿試験紙でいずれも陰性
４）サル検体；「準備」で作製した抗ＧＢＭ抗体腎炎モデル
５）測定結果１

・測定結果２

６）結論
１）健常血液及び健常尿中には抗原ＮＣ１が存在する。
２）血清よりも尿の方が、健常時と疾患時の開きが大きく、指標とし易い。
６「抗ＨＢｃ抗体測定キット」の作製（ＥＬＩＳＡ法で実施）
１）キットの構成
ＨＢｃ結合マイクロプレート；
検体希釈液；ＰＢＳ（含ＢＳＡ，Ｔｗｅｅｅｎ２０）
ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体
発色基質液；ＭＢ
反応停止液；１Ｎ硫酸
洗浄液；ＰＢＳ（含Ｔｗｅｅｎ２０）
２）操作方法
ＨＢｃ抗原結合マイクロプレートを１回洗浄→検体添加（ヒト尿を２倍希釈し使用）→室温で２時間反応後３回洗浄→ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体添加→室温で１時間反応後３回洗浄→発色基質液添加→１５分後に反応停止液添加→直ちに吸光度測定（４５０ｎｍ）
３）ヒト検体
血清測定でＨＢｃ抗体陽性を呈した男子３名と陰性男子３名の随時尿を用いた。
４）測定結果
尿でも血清陽性者は全て陽性を、陰性者は全て陰性を示した。
５）結論
Ｂ型肝炎の検査で、従来血清に用いられている抗ＨＢｃ抗体の測定は、随時の尿測定でも有用な判定を示す。
７「ＨＢｓ測定キット」の作製（サンドイッチＥＬＩＳＡ法で実施）
１）キットの構成
抗ＨＢｓ抗体結合マイクロプレート；
ポリクローナル抗体（カルテット社、ウサギ由来）を緩衝液（ｐＨ９．６）で１０００倍希釈してコート
検体希釈液；ＰＢＳ（含ＢＳＡ，Ｔｗｅｅｅｎ２０）
抗ＨＢｓ抗体
モノクローナル抗体（カルテット社、マウス由来）を緩衝液（ｐＨ７．４）で１０００倍希釈
ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ウサギ由来）
発色基質液；ＴＭＢ
反応停市液；１Ｎ硫酸
洗浄液；ＰＢＳ（含Ｔｗｅｅｎ２０）
２）操作方法
抗体結合マイクロプレートを１回洗浄→検体添加（ヒト尿をそのまま使用）→２時間後３回洗浄→抗ＨＢｓ抗体添加→２時間後３回洗浄→ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体添加→１時間後３回洗浄→発色基質液添加→１５分後に反応停止液添加→直ちに吸光度測定（４５０ｎｍ）
３）ヒト検体
血清測定でＨＢｓ抗原陽性を呈した男女各１名と陰性男子３名の随時尿を用いた。
４）測定結果
尿でも血清陽性者は全て陽性を、陰性者は全て陰性を示した。
５）結論
Ｂ型肝炎の検査で、従来血清に用いられているＨＢｓ抗原の測定は、随時の尿測定でも有用な判定を示す。

Claims

ヒト及び又は動物からの尿及び／又は血清を試料とする下記構成試薬を含む腎炎検出用サンドイッチＥＬＩＳＡキット。
１）抗ＮＣ１抗体固相化マイクロプレート、
２）ヒト及び／又は動物から採取した標準液、
３）標識抗ＮＣ１抗体。
請求項１の構成試薬が下記構成試薬である腎炎検出用サンドイッチＥＬＩＳＡキット。
１）ラット又はウサギ由来抗ＮＣ１抗体固相化マイクロプレート、
２）標準液としてサル腎炎由来の尿及び／又は血清の希釈液、
３）検体希釈液としてＰＢＳ、
４）酵素標識ウサギ由来又はラット由来抗ＮＣ１抗体液、
５）発色基質液としてＴＭＢ、
６）反応停止液として希硫酸、７）洗浄液としてＰＢＳ。