ES2965910T3

ES2965910T3 - Reactivo y método para medir complejo trombina antitrombina

Info

Publication number: ES2965910T3
Application number: ES16860023T
Authority: ES
Inventors: Tatsuya Yoshida; Yuhang Yang
Original assignee: PHC Corp
Current assignee: PHC Corp
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2024-04-17
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: JP6927472B2; KR102528090B1; EP3370064A1; KR20180069913A; US11378577B2; WO2017073795A1; CN117990906A; US20180238871A1; JPWO2017073795A1; EP3370064B1; CN108291911A; EP3370064A4

Abstract

Se proporciona un reactivo que sirve para medir el complejo trombina-antitrombina (TAT) dentro de una muestra de sangre de un sujeto de prueba mediante aglutinación de látex, caracterizándose dicho reactivo por comprender un policatión. Como resultado, es posible evitar la influencia de la heparina y medir con precisión el TAT. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivo y método para medir complejo trombina-antitrombina

Campo técnico

La presente invención se refiere a una utilización de un reactivo y un método para ensayar el complejo trombina (T)-antitrombina (AT) (TAT) en una muestra.

Antecedentes de la técnica

El complejo trombina-antitrombina (TAT) es un complejo proteínico producido en la sangre en el curso de la coagulación sanguínea, y la cuantificación de complejos TAT en sangre es útil para el diagnóstico de trombosis, tal como coagulación intravascular diseminada (CID). Sin embargo, la abundancia de complejo TAT es aproximadamente 1/100000 de la abundancia de antitrombina libre y, por tanto, la medición de complejo<t>A<t>no es sencilla.

Los ejemplos de un método de cuantificación de TAT prevalente en la actualidad incluyen métodos que utilizan equipos de reactivos que emplean tecnologías de inmunoensayo enzimático (ELISA), tales como Enzygnost (marca registrada) TAT micro de Siemens AG, y equipos de reactivos que emplean tecnologías de inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA), tales como STACIA (marca registrada) CLEIA TAT de LSI Medience Co. Sin embargo, cualquiera de ellos son métodos de ensayo que requieren separación entre fases sólidas y líquidas (separación unido/libre [U/L]), que necesitan laboriosas operaciones de lavado a mano o mediante máquinas especiales.

Las bibliografías de patentes 1 a 4 han notificado sistemas de reactivos basados en un ensayo de aglutinación de látex sin necesidad de separación U/L, cualquiera de los cuales tiene como objetivo ensayar muestras preparadas diluyendo complejos TAT, sintetizados exvivo,con una solución de tampón. Sin embargo, no hay ningún informe sobre algún reactivo que permita medir la concentración precisa de complejos TAT en muestras humanas utilizando un ensayo de aglutinación de látex. Además, en cualquiera de estas bibliografías, se elude el efecto de la reactividad cruzada de un anticuerpo utilizado preparando un reactivo de ensayo de TAT basado en la especificidad del mismo o añadiendo un agente aditivo. La bibliografía de patentes 5 da a conocer un ensayo de TAT mediante un método de ensayo de tipo sándwich que utiliza un anticuerpo sin reactividad cruzada, pero el ensayo carece de sensibilidad suficiente para utilización clínica.

Por consiguiente, ha existido una necesidad de un reactivo y un método para ensayar complejos TAT en una muestra biológica, con alta sensibilidad y alta exactitud, basado en un ensayo de aglutinación de látex, que esté caracterizado por operaciones de medición simplificadas.

Los inventores de la presente invención notificaron reactivos que permiten medir la concentración precisa de complejos TAT en muestras humanas utilizando un ensayo de aglutinación de látex sin necesidad de separación U/L (bibliografías de patentes 6 y 7). Sin embargo, los reactivos han sido susceptibles de mejora adicional para aplicaciones clínicas.

Lista de citaciones

Bibliografía de patentes

Bibliografía de patentes 1: patente japonesa abierta a la inspección pública (Kokai) n.° 2001-289850 Bibliografía de patentes 2: patente japonesa abierta a la inspección pública (Kokai) n.° 2001-221800 Bibliografía de patentes 3: patente japonesa abierta a la inspección pública (Kokai) n.° 07-238099

Bibliografía de patentes 4: patente japonesa abierta a la inspección pública (Kokai) n.° 2002-316999 Bibliografía de patentes 5: patente japonesa abierta a la inspección pública (Kokai) n.° 03-48158

Bibliografía de patentes 6: solicitud de patente japonesa n.° 2015-074168

Bibliografía de patentes 7: solicitud de patente japonesa n.° 2015-074173

Compendio de la invención

Problema técnico

Como se ilustra en la Figura 1, se utilizan dos anticuerpos, un anticuerpo que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de antitrombina del complejo TAT y un anticuerpo que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de trombina del complejo TAT, en un ensayo del complejo<t>A<t>basado en un ensayo de aglutinación de látex. En teoría, solo cuando existe el complejo TAT, ambos anticuerpos se unen entre sí, se produce la aglutinación de látex y el complejo TAT se puede cuantificar.

Sin embargo, el examen realizado por los inventores de la presente invención reveló que, incluso cuando se utiliza un anticuerpo monoclonal cuya reactividad a TAT es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina como anticuerpo que se une a la parte de antitrombina de dicho complejo TAT, como se utiliza en las bibliografías de patentes 6 y 7, se produce una reacción inespecífica debido a la influencia de la heparina (particularmente heparina no fraccionada) utilizada como anticoagulante en el tratamiento de tromboembolismo o CID, o similares, y se producen resultados de ensayo inexactos. Esto puede considerarse debido a que la heparina forma, junto con la antitrombina, complejos en la sangre, permitiendo de ese modo que la antitrombina sea un multímero. Se considera que dicho complejo heparina-antitrombina tiene una estructura más similar a la estructura de la antitrombina en el caso de formar complejos TAT, en comparación con la antitrombina típica, y se considera que forma más multímeros. Por tanto, en el caso de ensayar una muestra de un paciente que recibe heparina, incluso cuando se utilizan partículas de látex acopladas a un anticuerpo monoclonal cuya reactividad a complejos TAT es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina, las partículas reconocen los complejos heparina-antitrombina y se aglutinan individualmente, y dicha aglutinación se añade a esta reacción como reacción inespecífica. Dicha reacción inespecífica debida a los complejos heparina-antitrombina es un problema que no se produce en un método de ensayo que permite la separación U/L y que es peculiar para un reactivo de ensayo de TAT que emplea un ensayo de aglutinación de látex, encontrado por primera vez por los inventores de la presente invención.

Dichos métodos, como se describen en las bibliografías de patentes 1 y 2, se conocen como métodos para eludir el efecto de la antitrombina en un reactivo de ensayo de TAT mediante un ensayo de aglutinación de látex convencional. Sin embargo, no se ha sugerido en absoluto que la heparina genere un multímero de antitrombina. No se ha sugerido en absoluto un método para eludir el efecto de que la heparina permita que la antitrombina sea un multímero.

Por tanto, la presente invención sirve para proporcionar una utilización de un reactivo y un método para ensayar complejos TAT en una muestra de sangre utilizando un ensayo de aglutinación de látex que no requiere separación U/L ni operaciones de lavado, en donde se elude el efecto de la heparina y similares, y se pueden ensayar con precisión complejos TAT.

Solución al problema

Como resultado de un examen exhaustivo para solucionar dichos problemas, el inventor de la presente invención encontró que la adición de un policatión, tal como bromuro de hexadimetrina, en un reactivo de ensayo de TAT permite la elusión de la aglutinación inespecífica de complejos heparina-antitrombina y el ensayo preciso de complejos TAT en una muestra biológica. De ese modo, se consumó la presente invención.

Efectos ventajosos de la invención

Según la presente invención, un reactivo basado en un ensayo de aglutinación de látex permite ensayar (cuantificar) con precisión una ligera cantidad de complejos TAT en una muestra de sangre eludiendo a su vez el efecto de la heparina. Como resultado, se permite un ensayo de TAT preciso, basado en un ensayo de aglutinación de látex, incluso con plasma de un paciente que recibe heparina (o plasma muestreado mediante un recipiente de recogida de sangre heparinizado). Es útil desde el punto de vista diagnóstico que se puedan ensayar con precisión complejos TAT en una muestra de un paciente que recibe heparina, también utilizada para el tratamiento de CID.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista esquemática de un método de ensayo de TAT basado en un ensayo de aglutinación de látex. La Figura 2 es una vista esquemática de un sistema de reacción basado en un ensayo ELISA de inhibición indirecta. La Figura 3 es una vista que ilustra los resultados de la evaluación de la unión de un clon TAT-5 a cada antígeno mediante un ensayo ELISA de inhibición indirecta.

La Figura 4 es una vista que ilustra el efecto del bromuro de hexadimetrina en plasma con heparina añadida (muestra modelo).

La Figura 5 es una vista que ilustra los resultados de detección de cada sangre tratada con heparina y sangre no tratada con heparina en el caso de cambiar la concentración de bromuro de hexadimetrina.

Las Figuras 6A y 6B son vistas que ilustran los resultados de detección en el caso de añadir además suero a sangre tratada con heparina o sangre no tratada con heparina, de modo tal que la concentración de complejos TAT sea 50 ng/mL, y cambiar la concentración de bromuro de hexadimetrina (polibreno) en cada sangre. El diagrama inferior (Figura 6B) es un diagrama ampliado del diagrama superior (Figura 6A).

La Figura 7 es una vista que ilustra los resultados de detección en el caso de cambiar la concentración de sulfato de protamina en cada sangre tratada con heparina y sangre no tratada con heparina. El diagrama inferior es un diagrama ampliado del diagrama superior.

La Figura 8 es una vista que ilustra los resultados de ensayo de la evaluación de una muestra clínica utilizando un segundo reactivo A o un segundo reactivo B en presencia (+) o ausencia (-) de bromuro de hexadimetrina.

Descripción de las realizaciones

Un reactivo de ensayo de TAT utilizado en la presente invención es:

un reactivo para ensayar complejos trombina-antitrombina (TAT) en una muestra de sangre de un sujeto mediante un ensayo de aglutinación de látex. El reactivo comprende un policatión. El reactivo también comprende un primer anticuerpo anti-TAT, que reconoce un complejo<t>A<t>mediante unión a una parte de antitrombina del complejo TAT unido a látex, y un segundo anticuerpo anti-TAT, que reconoce un complejo TAT mediante unión a una parte de trombina del complejo TAT unido a látex. El sujeto es un paciente que recibe heparina. El policatión se selecciona del grupo que consiste en bromuro de hexadimetrina y sulfato de protamina.

Un ejemplo del reactivo de ensayo de TAT utilizado en la presente invención se describirá como una realización a continuación. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado al mismo.

El reactivo de ensayo de TAT utilizado en la presente invención es preferiblemente un reactivo de inmunoensayo para ensayar complejos TAT en una muestra biológica mediante un ensayo de aglutinación de látex en un sistema de tipo sándwich que utiliza partículas de látex acopladas a cada uno de dos anticuerpos anti-TAT.

Por ejemplo, como anticuerpos que se utilizan en la presente invención, se utilizan en combinación un anticuerpo (primer anticuerpo) que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de antitrombina del complejo TAT y un anticuerpo (segundo anticuerpo) que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de trombina del complejo TAT.

El primer anticuerpo es un anticuerpo que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de antitrombina del complejo TAT. Se utiliza preferiblemente un anticuerpo cuya reactividad al complejo TAT es al menos 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre. La reactividad del primer anticuerpo al complejo TAT puede ser 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre y es más preferiblemente 200 o más veces superior, todavía más preferiblemente 1000 o más veces superior, y de forma particularmente preferible 10000 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre. La magnitud máxima de reactividad cruzada no se especifica particularmente porque un nivel inferior de reactividad cruzada es mejor, pero la reactividad cruzada a antitrombina libre puede ser, por ejemplo, 100000 veces o 50000 veces menor que la reactividad a TAT.

En la preparación del anticuerpo, se puede utilizar tanto antitrombina libre como TAT para la inmunización en animales distintos de los seres humanos, y el anticuerpo resultante se puede utilizar en la presente invención siempre que pueda reconocer un complejo TAT mediante unión a la parte de antitrombina del complejo TAT.

Como se emplea en la presente invención, la expresión “unión a la parte de antitrombina” significa unión a antitrombina en un complejo (TAT) formado por la asociación de antitrombina libre, que es la más abundante en una muestra, con trombina libre. Por consiguiente, en casos donde se hace referencia a la antitrombina en una conformación lograda cuando forma el complejo, como antitrombina en la estructura en forma de complejo, y se hace referencia a la antitrombina en una conformación lograda cuando no forma el complejo, como antitrombina en la estructura en forma libre (antitrombina libre), la expresión “unión a la parte de antitrombina” significa unión a antitrombina en la estructura en forma de complejo.

La antitrombina en la estructura en forma libre tiene una conformación diferente a la de la antitrombina en la estructura en forma de complejo. El motivo es que la antitrombina en la estructura en forma libre cambia su conformación mediante la formación de un complejo, asociada a trombina libre, y mantiene la conformación cambiada.

La relación de TAT a antitrombina libre que no logra formar TAT, ambos presentes en un organismo vivo, se considera que varía de 1:60000 a 1:110000 sobre la base del intervalo medido en sujetos normales y generalmente se considera que es aproximadamente 1:100000. Además, aunque se sabe que la relación puede cambiar en pacientes con sepsis y/o hepatopatías, la relación se considera que es de alrededor de 1:50000 incluso en casos donde la cantidad de antitrombina libre es relativamente baja. Por tanto, si el primer anticuerpo también tiene reactividad a antitrombina libre, la cuantificación de TAT resultará difícil. Por tanto, para la cuantificación de TAT se debería utilizar un anticuerpo que tenga un nivel bajo de reactividad a antitrombina libre. Por lo tanto, se utiliza un anticuerpo que tiene un grado de reactividad a TAT que es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre.

Como se emplea en la presente invención, la expresión “un nivel de reactividad a TAT que es 100 o más veces inferior a la reactividad a antitrombina libre” se refiere a un caso donde la relación de las afinidades por antígenos individuales es 100 o más, un caso donde la relación de las cantidades de antígenos requeridos para presentar una determinada tasa de inhibición en la medición por medio de ELISA de inhibición indirecta, descrita a continuación, es 100 o más, y similares.

Un anticuerpo que tiene un nivel de reactividad a TAT que es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre se puede obtener mediante un método descrito en los ejemplos descritos más adelante. El caso donde el anticuerpo es examinado o cribado mediante ELISA de inhibición indirecta se describirá a continuación.

En primer lugar, se prepara un anticuerpo que reconoce un complejo TAT mediante unión a la parte de antitrombina del complejo TAT (un anticuerpo candidato para el primer anticuerpo). Dicho anticuerpo, como anticuerpo dirigido contra un sitio de unión sobre la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo, se puede seleccionar de entre anticuerpos obtenidos de antemano mediante un método, tal como el método descrito a continuación, para preparar anticuerpos monoclonales mediante células de hibridoma. Evidentemente, un anticuerpo previamente conocido dirigido contra un sitio de unión sobre la parte de antitrombina del complejo TAT y que reconoce el complejo se utilizaría de manera similar en el sistema de evaluación descrito a continuación.

Es decir, se permite que un anticuerpo candidato reaccione con una solución que contiene TAT, o un antígeno capaz de inhibir la reacción con TAT, en una cantidad determinada (por ejemplo, 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50 |ig/mL) durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 12 horas). A continuación, se permite que el líquido de reacción reaccione con un sustrato con TAT inmovilizado durante un cierto periodo de tiempo. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado para medir la cantidad del anticuerpo unido al TAT sobre el sustrato (el porcentaje de anticuerpo residual).

Por ejemplo, en primer lugar, se inmoviliza una determinada cantidad de complejos TAT sobre un sustrato, tal como una placa, en una condición donde no esté presente ningún antígeno que inhiba la reacción con el anticuerpo correspondiente. Los expertos en la materia podrán determinar de forma apropiada la cantidad del antígeno (TAT) inmovilizado sobre un sustrato en vista de las relaciones entre la cantidad del antígeno utilizado y el tipo del anticuerpo evaluado.

Se permite que el anticuerpo candidato para el primer anticuerpo descrito anteriormente reaccione en cada concentración (por ejemplo, 0,04 a 1 |ig/mL) con el sustrato con TAT inmovilizado descrito anteriormente durante un determinado periodo de tiempo, en una condición donde no esté presente ningún antígeno que inhiba la reacción con el anticuerpo correspondiente. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado (anti-IgG de ratón-HRP) para medir la cantidad del anticuerpo unido al TAT sobre el sustrato. Se determina la concentración del anticuerpo que da una absorbancia de alrededor de 1,0 (que corresponde a 1000 según el método descrito en la Tabla 1). Esta concentración de anticuerpo se puede considerar que es una concentración del anticuerpo en la inhibición con el antígeno (Tabla 3; concentración durante la reacción [|ig/mL]).

A continuación, se permite que el anticuerpo candidato reaccione en una concentración determinada, mediante el método descrito anteriormente, con una solución que contiene TAT o antitrombina libre en una determinada cantidad (por ejemplo, 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50 |ig/mL) durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 12 horas). A continuación, se permite que el líquido de reacción reaccione con un sustrato con TAT inmovilizado durante un cierto periodo de tiempo. Posteriormente, después del lavado, se utiliza un anticuerpo secundario marcado (anti-IgG de ratón-HRP) para medir la cantidad del anticuerpo unido al TAT sobre el sustrato (el porcentaje de anticuerpo residual).

Además, se puede calcular el porcentaje de anticuerpo residual con respecto al valor de detección obtenido para el caso donde no se realiza absorción con antígeno, que se considera como 100 %.

En casos donde la reactividad del anticuerpo a antitrombina libre es alta, la cantidad del anticuerpo capaz de unirse a TAT disminuye y, por tanto, la cantidad del anticuerpo detectado mediante el anticuerpo secundario marcado disminuye (el porcentaje de anticuerpo residual disminuye), mientras que en casos donde la reactividad del anticuerpo a antitrombina libre es baja, una cantidad mayor de anticuerpo sigue siendo capaz de unirse a TAT y, por tanto, la cantidad del anticuerpo detectado mediante el anticuerpo secundario marcado aumenta (el porcentaje de anticuerpo residual aumenta).

Este porcentaje de anticuerpo residual se comparará con un porcentaje de anticuerpo residual obtenido cuando se hace reaccionar primero el anticuerpo con TAT (la reacción de inhibición se realiza con TAT) y a continuación se hace reaccionar el líquido de reacción con el TAT inmovilizado.

A continuación, en casos donde, por ejemplo, se obtiene un porcentaje de anticuerpo residual de 50 % en la reacción de inhibición añadiendo antitrombina libre hasta una concentración de 50 |ig/mL, la cantidad de TAT requerido para lograr el mismo porcentaje de anticuerpo residual se calcula basada en el resultado descrito anteriormente de la inhibición con TAT. En casos donde la cantidad del antígeno inhibidor TAT requerido para lograr un porcentaje de anticuerpo residual de 50 % es menos de 0,50 |ig/mL cuando la inhibición se realiza con TAT, se puede considerar que la reactividad a TAT es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre.

El anticuerpo seleccionado de ese modo se puede seleccionar como primer anticuerpo. Además, en casos donde el primer anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, su afinidad (Kd) por TAT es preferiblemente igual a, o menos de, 10-8 Sin embargo, los expertos en la materia podrán seleccionar de forma apropiada un anticuerpo adecuado para un reactivo de látex basándose en el valor de afinidad por TAT.

El segundo anticuerpo no está limitado, siempre que sea un anticuerpo que reconozca un complejo TAT mediante unión a la parte de trombina del complejo TAT, pero se puede utilizar un anticuerpo que reaccione específicamente con trombina. A menudo, incluso se puede utilizar un anticuerpo que tenga reactividad cruzada a trombina libre debido a que las moléculas de trombina libre son bastante infrecuentes en una muestra. Los expertos en la materia podrán seleccionar y utilizar anticuerpos apropiados.

En la preparación del anticuerpo descrito anteriormente, se puede utilizar indistintamente trombina libre o TAT para la inmunización en animales distintos de los seres humanos, y el anticuerpo resultante se puede utilizar en la presente invención siempre que pueda reconocer un complejo TAT mediante unión a la parte de trombina del complejo TAT.

Como se emplea en la presente invención, la expresión “unión a la parte de trombina” significa unión a trombina en un complejo (TAT) formado mediante la asociación de trombina libre, que está presente en una muestra, con antitrombina. Por consiguiente, en casos donde se hace referencia a la trombina en una conformación lograda cuando forma el complejo, como trombina en la estructura en forma de complejo, y se hace referencia a la trombina en una conformación lograda cuando no forma el complejo, como trombina en la estructura en forma libre, la expresión “unión a la parte de trombina” significa unión a trombina en la estructura en forma de complejo.

Es posible que la trombina en la estructura en forma libre tenga una conformación diferente a la de la trombina en la estructura en forma de complejo. El motivo es que la trombina en la estructura en forma libre cambia su conformación mediante la formación de un complejo, asociada con antitrombina, y mantiene la conformación cambiada.

El segundo anticuerpo no está particularmente limitado, siempre que sea un anticuerpo que reconozca un complejo TAT mediante unión a la parte de trombina del complejo TAT. En el caso de un anticuerpo monoclonal, su afinidad (Kd) por TAT es preferiblemente igual a, o menos de, 10-8. Sin embargo, los expertos en la materia podrán seleccionar de forma apropiada un anticuerpo adecuado para un reactivo de látex basándose en el valor de afinidad por TAT.

Por ejemplo, dos anticuerpos que se unen específicamente a complejos TAT, es decir, que no reaccionan con trombina y antitrombina, sino que solo reaccionan específicamente con complejos TAT, y tienen diferentes epítopos se pueden utilizar en combinación como anticuerpos utilizados en la presente invención.

Se pueden utilizar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales para el primer y segundo anticuerpos descritos anteriormente. Los expertos en la materia podrán obtener estos anticuerpos según procedimientos conocidos.

Se pueden utilizar animales, tales como ovejas, caballos, cabras, conejos, ratones, ratas, y similares como animales que se van a inmunizar con un inmunógeno para la preparación de un anticuerpo y, especialmente para la preparación de anticuerpos policlonales, se utilizan preferiblemente conejos, cabras y similares. Además, se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante métodos conocidos para preparar células de hibridoma y, en ese caso, se utilizan preferiblemente ratones, ratas, conejos o similares. Se pueden preparar células de hibridoma y anticuerpos monoclonales según métodos convencionales, por ejemplo, los métodos descritos en “Zoku-Seikagaku Jikken Koza” (Curso de formación en experimentos bioquímicos; Sociedad Bioquímica Japonesa, ed.) o “Men-eki Seikagaku Kenkyu-hou” (Métodos de investigación inmunobioquímica; Sociedad Bioquímica Japonesa, ed.).

Se puede utilizar TAT como inmunógeno, como se describió anteriormente. Alternativamente, también se puede utilizar un anticuerpo producido utilizando un complejo asociado con vitronectina, VTAT, como inmunógeno en la presente invención. Además, se puede utilizar antitrombina y trombina para la producción del primer y segundo anticuerpos, respectivamente.

Para estos inmunógenos, se pueden utilizar complejos TAT purificados a partir de una materia prima, es decir, una muestra recogida de un organismo vivo, o complejos TAT sintetizadosin vitrocombinando moléculas de trombina libre y antitrombina libre. Los complejos TAT sintéticos pueden ser, por ejemplo, complejos TAT obtenidos incubando invitromoléculas de trombina y antitrombina disponibles como productos biológicos, aunque también se pueden recuperar, purificar y utilizar como inmunógeno complejos TAT expresados utilizando un sistema de traducción conocido, tal como aquellos enE. coli,células de mamífero, células de insecto infectadas con baculovirus, y similares.

Además, en casos donde se puede inducir inmunidad para reconocer una diferencia en la conformación con un péptido parcial solo, específicamente, en casos donde se desea en la producción de un anticuerpo para especificar el sitio de unión del anticuerpo, se pueden utilizar péptidos parciales de antitrombina y trombina para la producción del primer y segundo anticuerpos, respectivamente. En ese caso, como método para seleccionar una secuencia peptídica para un antígeno, método para sintetizar un fragmento peptídico y método de inmunización, se pueden utilizar métodos conocidos.

Los ejemplos del anticuerpo utilizado en la presente invención incluyen fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de un anticuerpo deseado, que además tienen la misma reactividad que el anticuerpo original. Los ejemplos de un fragmento de anticuerpo que se puede utilizar en la presente invención incluyen fragmentos tales como Fab, Fab', F(ab')<2>o Fv. Cualquiera de estos fragmentos se puede obtener, por ejemplo, mediante digestión de un anticuerpo con una enzima de degradación de proteínas según un método convencional, seguida de separación y purificación según métodos convencionales para la separación y purificación de proteínas. Estos fragmentos pueden inmovilizarse sobre partículas de látex y utilizarse directamente, aunque también pueden prepararse fragmentos como fragmentos Fab' o F(ab')<2>e inmovilizarse sobre partículas de látex. Los fragmentos Fab' y F(ab')<2>son más preferibles en vista de evitar una reacción inespecífica de un anticuerpo a fragmentos Fc.

Un anticuerpo utilizado en la presente invención se puede obtener produciendo primero anticuerpos anti-TAT (anticuerpos candidatos) mediante un método de producción para anticuerpos monoclonales con células de hibridoma, y similares, y seleccionando a continuación un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo de los anticuerpos anti-TAT (anticuerpos candidatos) según los procedimientos y criterios como se han descrito anteriormente.

La combinación del primer anticuerpo y el segundo anticuerpo no está particularmente limitada, siempre que permita el ensayo de TAT mediante un ensayo de aglutinación de látex, pero se selecciona preferiblemente una combinación de los anticuerpos que esté mínimamente afectada por las matrices contenidas en una muestra biológica, tal como plasma (fondo).

La sensibilidad requerida para el reactivo de ensayo de TAT debería ser suficiente para medir el valor de referencia con el cual se puedan distinguir claramente los sujetos normales de los pacientes, o una concentración 2 veces superior al valor de referencia y, por lo tanto, el reactivo de la presente invención es preferiblemente un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT en una concentración de 10 a 15 ng/mL, más preferiblemente un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT en una concentración de 3 a 4 ng/mL, y todavía más preferiblemente un reactivo capaz de cuantificar complejos TAT incluso a una concentración de alrededor de 1 ng/mL, en una muestra biológica.

Las partículas de látex a las que se acoplan el primer y segundo anticuerpos descritos anteriormente no están particularmente limitadas, siempre que se puedan utilizar en la reacción de aglutinación de látex, pero tienen un tamaño de partícula promedio de preferiblemente 0,05 |im a 0,5 |im, y más preferiblemente 0,2 |im a 0,4 |im.

Para las partículas de látex que se van a utilizar, se puede utilizar solo un tipo de partícula de látex o múltiples tipos de partículas de látex. Por ejemplo, se puede utilizar una combinación de partículas de látex con diferentes tamaños de partícula. Dado que, en la práctica, es difícil fabricar partículas de látex con un único tamaño de partícula, cualquier partícula de látex se especifica con el tamaño de partícula promedio de todas las partículas. Por consiguiente, en la referencia a un tamaño de partícula promedio de 0,05 |im a 0,5 |im, también se puede incluir en la presente invención un caso que comprenda partículas de látex fuera de este intervalo. El hecho de que se incluyan partículas de látex con diferentes tamaños de partícula en una partícula de látex determinada es de sentido común para los expertos en la materia, y los expertos en la materia podrán preparar un reactivo de látex utilizando una solución que contenga un grupo de partículas que tengan una distribución de tamaños no muy heterogénea.

Además, el tamaño de partícula promedio se puede medir según un método conocido y, por ejemplo, se puede calcular sobre la base de análisis de imágenes utilizando un sistema de microscopio electrónico de transmisión.

La partícula de látex utilizada según la presente invención no está particularmente limitada, siempre que se utilice habitualmente en la técnica, pero los ejemplos de la partícula de látex incluyen partículas fabricadas a partir de homopolímeros (por ejemplo, poliestireno, polímeros de metacrilato, polímeros de acrilato, y similares) compuestos por monómeros de vinilo polimerizados, tales como estireno, cloruro de vinilo, acrilonitrilo, acetato de vinilo, acrilato, metacrilato, y similares; partículas fabricadas a partir de copolímeros de butadieno (por ejemplo, copolímero de estireno-butadieno, copolímero de metilmetacrilato-butadieno, copolímero de acrilonitrilo-butadieno, y similares); y partículas fabricadas a partir de otros copolímeros (por ejemplo, copolímero de estireno-estirenosulfonato, copolímeros de metacrilato, copolímeros de acrilato, copolímeros de cloruro de vinilo-acrilato, y similares). Los ejemplos de la partícula de látex incluyen partículas que llevan un grupo carboxilo, un grupo amino primario, un grupo carbamoílo (-CONH<2>), un grupo hidroxilo, un grupo aldehído, o similares como grupo funcional y que tienen un cuerpo de base compuesto por cualquiera de los particulados orgánicos descritos anteriormente.

Para el método para inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex, los anticuerpos se pueden inmovilizar según un método conocido y se pueden inmovilizar mediante tratamientos utilizados habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, suspender el anticuerpo y partículas de látex en una solución de tampón, permitir que reaccionen a 25 °C durante una hora, seguido de centrifugación, tratamiento de bloqueo, y similares. Además, se puede seleccionar un método para inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex mediante enlace químico o mediante interacción biotina-avidina.

El acoplamiento de los anticuerpos a partículas de látex se realiza en condiciones donde los anticuerpos pueden mantener la reactividad y especificidad a TAT descritas anteriormente.

Por facilidad de preparación de reactivos preferibles, se puede preparar un líquido de látex con anticuerpo inmovilizado para cada anticuerpo como primera partícula de látex y segunda partícula de látex sobre las cuales se han inmovilizado el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo, respectivamente, aunque los reactivos también se pueden preparar inmovilizando el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo sobre un único tipo de partículas de látex. Los expertos en la materia podrán diseñar de forma apropiada cómo inmovilizar los anticuerpos sobre partículas de látex y preparar reactivos.

La muestra es una muestra de sangre obtenida de un ser humano que recibe heparina (que tiene una concentración final de, por ejemplo, 1 a 2 U/mL) y, preferiblemente, la presente invención se puede utilizar de forma particularmente preferible para ensayar plasma obtenido de un ser humano que recibe heparina.

El reactivo utilizado en la presente invención puede ser un sistema de un único reactivo o un sistema de dos reactivos. Si el reactivo utilizado en la presente invención es un sistema de un único reactivo, se pueden medir los complejos TAT en una muestra biológica añadiendo una suspensión de partículas de látex, que llevan el primer y segundo anticuerpos inmovilizados, respectivamente, y un líquido de reacción, que contiene un policatión seleccionado del grupo que consiste en bromuro de hexadimetrina y sulfato de protamina, a la muestra de sangre y causando una reacción antígeno-anticuerpo. Si el reactivo utilizado en la presente invención es un sistema de dos reactivos, se pueden medir los complejos TAT en una muestra de sangre añadiendo el primer reactivo, compuesto principalmente por ingredientes de tampón y que contiene un policatión seleccionado del grupo que consiste en bromuro de hexadimetrina y sulfato de protamina, a la muestra de sangre, añadiendo además a continuación el segundo reactivo, que contiene partículas de látex sobre las que se han inmovilizado el primer y segundo anticuerpos, respectivamente, y causando una reacción antígeno-anticuerpo. También se puede permitir que el segundo reactivo contenga el policatión y las partículas de látex unidas a anticuerpo. El sistema de dos reactivos se prefiere para la medición más precisa.

Se permite preferiblemente que el policatión que tiene una concentración final de 0,0002 a 1%(p/v) exista en un sistema de reacción, se permite más preferiblemente que el policatión que tiene una concentración final de 0,0005 a 0,1 % (p/v) exista en el sistema de reacción, y se permite todavía más preferiblemente que el policatión que tiene una concentración final de 0,001 a 0,05 % (p/v) exista en el sistema de reacción.

Habitualmente, existe una carga negativa, tal como SO3-, SO4-o COO-, sobre las partículas de látex. Por lo tanto, puede considerarse fácilmente que la adición de un policatión en un reactivo causa aglutinación debido a una carga positiva de un policatión, incluso en ausencia de una sustancia que se va a medir, y existe la preocupación de que la adición afecte a un sistema de medición. Por lo tanto, normalmente se producen dudas a la hora de utilizar dicho policatión. Sin embargo, el inventor de la presente invención encontró que un multímero de antitrombina, generado mediante unión de heparina a antitrombina en una muestra, es disociado por un policatión, tal como bromuro de hexadimetrina. Sorprendentemente, la utilización del policatión descrito anteriormente permite eludir solo el efecto de la heparina, sin provocar dicho efecto secundario (aglutinación), y ensayar con precisión complejos TAT.

El grado de aglutinación de las partículas de látex se puede medir, por ejemplo, utilizando absorbancia, mientras que la concentración de complejos TAT en una muestra se puede cuantificar buscando una concentración que corresponda al grado de aglutinación en una curva patrón de la referencia obtenida previamente. Además, la medición de absorbancia se puede realizar a una longitud de onda de medición de normalmente 340 nm a 1000 nm, y preferiblemente 500 nm a 900 nm. Cuando la reacción de aglutinación de látex se analiza mediante fotometría, la cinética de aglutinación, o la variación en la aglutinación a lo largo de un intervalo de tiempo fijo durante el transcurso de la reacción de aglutinación de látex, se puede determinar mediante fotometría. Por ejemplo, cuando se realiza la medición de absorbancia, la cinética de los cambios de absorbancia, o la variación en la absorbancia a lo largo de un intervalo de tiempo fijo dentro del periodo de 30 segundos a 5 minutos después del inicio de la reacción de aglutinación de látex, se puede determinar mediante fotometría. La temperatura de reacción es preferiblemente de 10 a 50 °C, y más preferiblemente de 20 a 40 °C. El tiempo de reacción se puede determinar de forma apropiada y la medición se puede realizar, por ejemplo, en un tiempo de reacción de 10 a 15 minutos en un analizador automático de utilización general. Además, los expertos en la materia podrán determinar de forma apropiada la temperatura de reacción, el tiempo de reacción, la longitud de onda de medición, el tiempo de medición, la composición del reactivo, la concentración de látex, la concentración de un anticuerpo que se va a inmovilizar sobre partículas de látex, y las concentraciones de diversos agentes aditivos en el análisis utilizando un instrumento óptico o un analizador automático de utilización general.

La concentración de partículas de látex utilizada en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que sea una concentración aplicable a un reactivo para un ensayo inmunológico basado en un ensayo de aglutinación de látex, pero la concentración de partículas de látex durante la reacción requerida para el ensayo de TAT es preferiblemente de 0,005 % (p/v) a 0,2 % (p/v), y más preferiblemente de 0,01 % (p/v) a 0,1 % (p/v).

El reactivo utilizado en la presente invención puede comprender, además de las partículas de látex sobre las que se han inmovilizado los anticuerpos, excipientes que se pueden añadir a un reactivo para un ensayo inmunológico basado en un ensayo de aglutinación de látex, tales como, por ejemplo, un tampón, un promotor de la aglutinación, un supresor de reacciones inespecíficas, un agente sensibilizante, y similares. Los ejemplos del agente sensibilizante que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención incluyen alginato de sodio, alginato de propilenglicol, y similares. Además, como promotor de la aglutinación que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención, se utiliza preferiblemente un polímero o una proteína solubles en agua. Los ejemplos del promotor de la aglutinación incluyen polímeros solubles en agua, tales como dextrano y sulfato de dextrano, alcohol polivinílico, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, y similares; albúminas, tales como albúmina sérica bovina; y globulinas, tales como y-globulina.

Como tampón se puede utilizar, por ejemplo, un tampón que tenga capacidad de tampón a un pH de 5,8 a 6,6. El pH es más preferiblemente de 6,0 a 6,4, todavía más preferiblemente de 6,1 a 6,3, y de forma particularmente preferible de 6,15 a 6,25. En el caso de un sistema de un único reactivo, el pH del reactivo se debería ajustar en el intervalo descrito anteriormente, mientras que en el caso de un sistema de dos reactivos, los reactivos deberían estar compuestos de modo tal que el pH esté en el intervalo descrito anteriormente cuando se mezclen. Por ejemplo, en un aspecto donde el sistema de reactivos comprende un primer reactivo, compuesto principalmente por ingredientes de tampón, y un segundo reactivo, que contiene partículas de látex sobre las cuales se han inmovilizado los anticuerpos, el pH del primer reactivo se ajusta en el intervalo descrito anteriormente, y el pH de la mezcla está en el intervalo descrito anteriormente cuando se mezclan ambos reactivos.

El pH se puede regular mediante un regulador de pH, y se ajusta preferiblemente mediante una solución de tampón. Se utiliza preferiblemente una solución de tampón, tal como tampón T ris, tampón Bis-T ris, tampón de fosfato o tampón de Good, y la concentración de la solución de tampón durante la reacción es preferiblemente de 10 a 500 mmol/L, y más preferiblemente de 20 a 200 mmol/L.

Los ejemplos del supresor de reacciones inespecíficas que se puede añadir al reactivo utilizado en la presente invención incluyen anticuerpos o receptores contra sustancias responsables de una reacción inespecífica; soluciones de tampón, tales como tampón T ris, tampón de fosfato, tampón de glicina, tampón de borato, tampón de citrato, tampón de acetato o tampón de Good; agentes quelantes, tales como EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, n Ta y NTP; sales, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, carbonato de calcio y carbonato de sodio; y tensioactivos no iónicos, tales como dietanolamidas de ácidos grasos, polioxietilen alquil éteres, polioxietilen alquilfenil éteres, ésteres de ácidos grasos de sorbitano, alquil poliglucósidos, alquil monogliceril éteres, ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitano, alcanolamidas de ácidos grasos y alquil glicósidos.

El reactivo utilizado en la presente invención puede incluir complejos TAT que se pueden utilizar como sustancia patrón. Los complejos TAT pueden ser complejos TAT purificados a partir de un organismo vivo o sintetizados mediante tecnología de ADN recombinante y similares. Los complejos TAT sintéticos se pueden obtener, por ejemplo, incubandoin vitromoléculas de trombina y antitrombina disponibles como productos biológicos. Además, los complejos TAT también se pueden sintetizar recuperando, purificando y mezclando los componentes que han sido expresados utilizando un sistema de traducción conocido en E.coli,células de mamífero, células de insecto infectadas con baculovirus, y similares.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de complejos TAT sintéticos

Se diluyeron por separado una formulación de trombina humana comercializada (fabricada por Japan Blood Products Organization) y una formulación de antitrombina comercializada (fabricada por Japan Blood Products Organization) con PBS (producido disolviendo el polvo de PBS (-) de Dulbecco “Nissui (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)” hasta una concentración de 9,6 g/L, y esas diluciones se mezclaron en una relación molar de 1:3 y se permitió que reaccionaran a continuación a 37 °C durante 30 minutos. Después de los 30 minutos, se añadió DFP (fluorofosfato de diisopropilo, fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hasta una concentración de 0,75 mM para detener la reacción.

Dado que el reactante obtenido contenía trombina y antitrombina sin reaccionar, se realizó la purificación con un Hiload 26/60 Superdex 200 HR (fabricado por GE Healthcare), equilibrado previamente con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 500 mM.

Después de la identificación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), se recuperaron las fracciones de TAT. La fracción de TAT obtenida se diluyó con solución salina que contenía BSA a 0,5 % y se analizó utilizando un reactivo CLEIA (STACIA (marca registrada) CLEIA TAT, fabricado por LSI Medience Co.) para determinar la concentración. Los complejos TAT obtenidos de ese modo se utilizaron como complejos TAT sintéticos.

Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo anti-TAT

Se llevó a cabo un método de fusión celular según el método descrito en Tamie Ando y Tatsuo Iwasaki, “Monoclonal Antibody/Hybridoma and ELISA” (Kodansha Ltd.).

El complejo TAT sintético preparado en el Ejemplo 1, en una cantidad de 50 |ig, se mezcló con adyuvante completo de Freund (fabricado por D<if>C<o>) para proporcionar un antígeno administrado.

El antígeno se administró a ratones BALB/c (hembra, cuatro semanas de edad) tres veces en un intervalo de dos semanas y 25 |ig del antígeno, es decir, la mitad de la cantidad del antígeno original administrado se inyectó por vía intravenosa en la cuarta administración.

Una semana después, se aislaron linfocitos del bazo, se mezclaron con células de mieloma P3x63-Ag.8 y a continuación se fusionaron utilizando polietilenglicol (PEG 4000, fabricado por Merck).

Se seleccionaron células de hibridoma en medio de selección HAT y a continuación se cribaron una semana más tarde para detectar clones de hibridoma que produjeran un anticuerpo de interés sobre la base de la actividad de unión para el complejo TAT sintético. Es decir, el complejo TAT sintético se diluyó individualmente con tampón de carbonato 0,05 M (pH 9,5) hasta una concentración de 0,2 |ig/mL y se añadió en 50 |iL/pocillo a una inmunoplaca (Maxisorp, fabricada por NUNC). Después de la reacción a 4 °C durante la noche, cada pocillo se lavó tres veces con PBS que contenía Tween-20 a 0,05 % y a continuación se bloqueó añadiendo al mismo 100 |iL de PBS que contenía BSA a 1,0 %. Posteriormente, se añadió el sobrenadante del cultivo en un volumen de 50|iL a cada pocillo, se dejó que reaccionara a 37 °C durante una hora y a continuación se lavó cada pocillo tres veces con PBS que contenía Tween-20 a 0,05 %. Se diluyó 1000 veces un anticuerpo antiinmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (fabricado por Dako) en PBS que contenía Tween-20 a 0,05 % y a continuación se añadió en un volumen de 50 |iL a cada pocillo.

Después de la reacción a 37 °C durante una hora, cada pocillo se lavó cinco veces de una forma similar y a continuación se añadió una solución de o-fenilendiamina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en un volumen de 50 |iL a cada pocillo. Después de la reacción a temperatura ambiente durante de 5 a 10 minutos, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2 N.

Se midió la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro de placas (EL312e, fabricado por BioTek Instruments, Inc.). Se seleccionaron células que producían anticuerpos que presentaban buena reactividad al complejo TAT sintético y a continuación se clonaron mediante dilución limitante. Diez días después, esas células se cribaron adicionalmente para obtener clones de hibridoma que producían anticuerpos que reaccionaban con el complejo TAT sintético.

Ejemplo 3: Preparación de anticuerpo antitrombina

Se obtuvieron anticuerpos antitrombina mediante un método similar al del Ejemplo 2, utilizando trombina como antígeno inmunizante. Se seleccionaron anticuerpos que reaccionaban específicamente con trombina y uno de esos clones se utilizó como anticuerpo antitrombina (T-1).

Ejemplo 4: Evaluación de la especificidad de los anticuerpos mediante ELISA de inhibición indirecta

La reactividad de cada anticuerpo se evaluó mediante ELISA de inhibición indirecta. En la Figura 2 se ilustra un modelo esquemático del sistema de reacción mediante ELISA de inhibición indirecta.

Cada candidato a anticuerpo que reconoce TAT (anticuerpo anti-TAT) que se va a evaluar, en una concentración de 0,04 a 0,4 |ig/mL, se mezcló y se incubó con cada antígeno inhibidor (protrombina [fabricada por Enzyme Research Laboratories], trombina, antitrombina, complejo TAT sintético). Esos anticuerpos candidatos, que incluían un grupo de anticuerpos inhibidos, se utilizaron como anticuerpos primarios y se les permitió unirse a complejos TAT sintéticos inmovilizados sobre placas de 96 pocillos. Además, se utilizó un anticuerpo antiinmunoglobulina de ratón marcado con peroxidasa (fabricado por Dako) como anticuerpo secundario y se le permitió unirse a las placas y, a continuación, se añadió un sustrato cromogénico a las placas para medir la absorbancia. Además, se calculó el porcentaje de anticuerpo residual en cada anticuerpo candidato basándose en la velocidad de cambio de color.

Para un anticuerpo particular (TAT-5), los valores de absorbancia obtenidos cuando se utilizó cada antígeno inhibidor se exponen en la Tabla 1, mientras que las relaciones de anticuerpo residual calculadas a partir de los valores de absorbancia se exponen en la Tabla 2.

Por ejemplo, si la concentración del antígeno inhibidor TAT es 10 |ig/mL, el porcentaje de anticuerpo residual será 285/1066 x 100 = 26,7 (%). Se calculó el porcentaje de anticuerpo residual en cada anticuerpo para cada concentración de cada antígeno. Además, en las tablas, Pro-T representa protrombina, T representa trombina y AT representa antitrombina.

Tabla 1. Resultados de la medición en ELISA de inhibición indirecta

Tabla 2. Porcentaje (%) de anticuerpo residual

Además, se calculó la cantidad del antígeno TAT requerido para lograr una tasa de inhibición que corresponda al porcentaje de anticuerpo residual obtenido mediante inhibición con antitrombina en 50 |ig/mL y se comparó con la cantidad de antitrombina para obtener la diferencia (aumento en veces) en la reactividad de cada anticuerpo a TAT con respecto a la reactividad a antitrombina. Una diferencia mayor en la reactividad de un anticuerpo indica la especificidad superior del anticuerpo para TAT con respecto a la antitrombina. El cálculo se realizó basado en la curva de inhibición de TAT (el logaritmo de la concentración del antígeno inhibidor añadido frente al porcentaje de anticuerpo residual) dibujada con la funciónspline.

Por ejemplo, en el caso de TAT-5, el porcentaje de anticuerpo residual obtenido con antitrombina en 50 |ig/mL es 74,0 %, mientras que la cantidad del antígeno TAT requerido para lograr un porcentaje de anticuerpo residual similar a ese porcentaje es 1,144 |ig/mL. Es decir, la diferencia de reactividad resulta ser 50 /1, 144 = 44 veces (Figura 3).

Además, se calculó el aumento en veces descrito anteriormente para 27 clones de anticuerpos. La diferencia (aumento en veces) en la cantidad de los complejos TAT añadidos con respecto a la de antitrombina añadida fue 100 o más en trece de ellos, 1000 o más en siete de ellos, y 10000 o más en dos de ellos. Cinco de esos anticuerpos se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3

Ejemplo 5: Efecto del bromuro de hexadimetrina en plasma con heparina añadida (muestra modelo)

Primer reactivo: para un primer reactivo, se utilizó Bis-Tris 100 mM (fabricado por DOJINDO LABORATORIES, pH 6,2), NaCl 700 mM (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), EMULGEN 150 a 0,05 % (fabricado por Kao Corporation), alginato de sodio a 0,20 % (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), BSA a 0,15 % (fabricado por Sigma-Aldrich) y bromuro de hexadimetrina a 0,05 % (fabricado por Sigma-Aldrich). Además, para un Ejemplo comparativo, se utilizó un reactivo obtenido eliminando el bromuro de hexadimetrina del primer reactivo.

Segundo reactivo: se obtuvo un reactivo (segundo reactivo A: concentración de partículas de látex de 0,01 %) diluyendo y mezclando, con solución de azida de sodio a 0,05 %, partículas de látex de poliestireno que adsorbían un anticuerpo monoclonal de ratón TAT-1, que tiene un grado de reactividad a TAT que es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina, y haciéndolas reaccionar con la parte de antitrombina de un complejo TAT, y partículas de látex de poliestireno que adsorbían un anticuerpo monoclonal de ratón antitrombina, de modo tal que las partículas sensibilizadas con cada anticuerpo tuvieran una absorbancia de 1,0 a 700 nm. Se obtuvo un reactivo (segundo reactivo B) diluyendo y mezclando, con solución de azida de sodio a 0,05 %, solo partículas de látex de poliestireno que adsorbían un anticuerpo monoclonal de ratón, que tiene un grado de reactividad a TAT que es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina, y haciéndolas reaccionar con la parte de antitrombina de un complejo TAT de modo tal que las partículas tuvieran una absorbancia de 1,0 a 700 nm. Cada reactivo se utilizó como un segundo reactivo.

Muestra: se añadió plasma humano normal combinado al que se añadió una inyección de heparina sódica “Tanabe” (fabricada por Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation), de modo tal que fuera 1 o 2 U/mL, o plasma humano normal combinado al que no se añadió heparina.

Instrumento de medición: 7170S (fabricado por Hitachi High-Technologies Corporation)

Parámetros: los parámetros se ajustaron a 12 |iL de volumen de muestra, 90 |iL del primer reactivo, 90 |iL del segundo reactivo, 570 nm de longitud de onda principal y 800 nm de longitud de onda auxiliar. Un valor obtenido sustrayendo la absorbancia en el punto de medición fotométrica n.° 20 de la absorbancia en el punto de medición fotométrica n.° 34 se consideró como AAbs, y se realizó la medición.

Resultados y debate

Los resultados se ilustran en la Figura 4. Se observó aglutinación inespecífica de heparina, dependiente de la concentración, a niveles similares en ambos segundos reactivos A y B en el caso de utilizar el primer reactivo del Ejemplo comparativo (sin bromuro de hexadimetrina), mientras que no se observó aglutinación en ninguno de los segundos reactivos A y B en el caso de utilizar el primer reactivo de los ejemplos (con bromuro de hexadimetrina).

Esto sugirió que la aglutinación inespecífica de complejos heparina-antitrombina es causada por partículas que adsorben un anticuerpo que reconoce la parte antitrombina de un complejo TAT, y la adición de bromuro de hexadimetrina permite que los complejos heparina-antitrombina desaparezcan.

Ejemplo 6: Examen de la cantidad de bromuro de hexadimetrina añadido

Primer reactivo: se utilizó el mismo primer reactivo que en el Ejemplo 5, a excepción de que la cantidad de bromuro de hexadimetrina añadido se cambió en un intervalo entre 0 y 0,05 % (p/v).

Segundo reactivo: se utilizó el segundo reactivo A del Ejemplo 5.

Muestra: plasma humano normal combinado al que se añadieron 2 U/mL de una inyección de heparina sódica “Tanabe” o plasma humano normal combinado al que se añadieron 2 U/mL de una inyección de heparina sódica “Tanabe” y se añadió suero hasta tener una concentración de TAT de 50 ng/mL.

Instrumento de medición y parámetros: se utilizaron el mismo instrumento de medición y parámetros que los del Ejemplo 5 para realizar la medición.

Resultados y debate: los resultados se ilustran en la Figura 5 y las Figuras 6A y 6B. La adición de bromuro de hexadimetrina (polibreno) a 0,0005 % (concentración final de 0,0002 %) hasta 2 U/mL de heparina presentó un efecto. Además, se confirmó que la aglutinación inespecífica de partículas de látex debida a la carga positiva del bromuro de hexadimetrina no se producía en el plasma de base al que no se añadió heparina, hasta la adición de 0,05 % (% de concentración final de 0,023 %). Por consiguiente, se encontró que el bromuro de hexadimetrina es preferiblemente igual a, o más de, 0,0005 % (concentración final de 0,0002 %), y más preferiblemente igual a, o más de, 0,005 % (concentración final de 0,002 %).

Como se ilustra en la Figura 6A, se confirmó que, incluso la adición de un policatión, no influía considerablemente en una reacción de detección de complejos TAT de interés. La Figura 6B es un diagrama ampliado de la proximidad de los valores de referencia.

Ejemplo 7: Efecto del sulfato de protamina

Primer reactivo: se preparó un primer reactivo de la misma manera que en el Ejemplo 5, a excepción de que la cantidad de sulfato de protamina añadido (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), en lugar de bromuro de hexadimetrina, se cambió en un intervalo entre 0 y 0,01 % (p/v).

Segundo reactivo: se utilizó el segundo reactivo A del Ejemplo 5.

Muestra: plasma humano normal combinado al que se añadieron 2 U/ml de una inyección de heparina sódica “Tanabe”.

Resultados y debate

Los resultados se ilustran en la Figura 7. En el caso de añadir 0,001 % (concentración final de 0,0005 %) o más de sulfato de protamina, la absorbancia del plasma con heparina añadida disminuyó considerablemente, y se observó una mejora en comparación con el caso de no añadir sulfato de protamina. Además, en el caso de añadir 0,01 % (concentración final de 0,005 %) de sulfato de protamina, se confirmó que la aglutinación inespecífica debida a la adición de heparina se suprimía aproximadamente de manera similar en el caso de añadir bromuro de hexadimetrina. Por consiguiente, se encontró que el sulfato de protamina es preferiblemente igual a, o más de, 0,001 % (concentración final del 0,0005 %), y más preferiblemente igual a, o más de, 0,01 % (concentración final del 0,005%).

Ejemplo 8: Efecto del bromuro de hexadimetrina en muestras reales

Primer reactivo: el mismo primer reactivo que el del Ejemplo 5.

Segundo reactivo: se utilizaron los segundos reactivos A y B del Ejemplo 5.

Muestras: dado que se observó reacción inespecífica, se utilizaron dos muestras de plasma con Na-citrato (muestras 1 y 2) a las que se estimó que se iba a administrar preparado de heparina.

Resultados y debate

Los resultados se ilustran en la Figura 8. Cuando no se añadió bromuro de hexadimetrina, se detectó una señal alta, incluso en el caso de utilizar cada uno del segundo reactivo A y el segundo reactivo B. Por el contrario, la adición de bromuro de hexadimetrina permitió que desapareciera la aglutinación inespecífica y permitió la detección específica de TAT en el caso de utilizar el segundo reactivo A, es decir, dos tipos de anticuerpos. Basándose en lo anterior, también se confirmó el efecto del bromuro de hexadimetrina también en las muestras de plasma reales.

Como se describió anteriormente, la disociación de un multímero de antitrombina, generado mediante unión de heparina a antitrombina en una muestra por un policatión, tal como bromuro de hexadimetrina, es un efecto sorprendente encontrado por el inventor de la presente invención. La utilización de un policatión permitió eludir solo el efecto debido a la heparina y ensayar con precisión los complejos TAT, sin causar dicho efecto secundario.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Utilización de un reactivo para ensayar un complejo trombina-antitrombina (TAT) en una muestra de sangre de un sujeto mediante un ensayo de aglutinación de látex, en donde dicho reactivo comprende un policatión y en donde el reactivo comprende un primer anticuerpo anti-TAT, que reconoce un complejo<t>A<t>mediante unión a una parte de antitrombina del complejo TAT unido a látex, y un segundo anticuerpo anti-TAT, que reconoce un complejo TAT mediante unión a una parte de trombina del complejo TAT unido a látex, en donde el sujeto es un paciente que recibe heparina, y en donde el policatión se selecciona del grupo que consiste en bromuro de hexadimetrina y sulfato de protamina.

2. La utilización según la reivindicación 1, en donde el primer anticuerpo anti-TAT es un anticuerpo cuya reactividad a un complejo TAT es 100 o más veces superior a la reactividad a antitrombina libre.

3. Un método para ensayar un complejo TAT existente en una muestra de sangre de un sujeto, comprendiendo el método ensayar un complejo TAT realizando un ensayo de aglutinación de látex que utiliza el reactivo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el sujeto es un paciente que recibe heparina.