CN110186862B - 一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒 - Google Patents
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于钯纳米颗粒可视化检测鱼精蛋白的试剂盒，采用简单、环境友好的液相还原法合成了具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒，在pH7.0的磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠缓冲液中，鱼精蛋白的加入可以有效的抑制钯的过氧化物酶活性，进而改变相应溶液在652nm处的紫外吸光度，通过652nm处紫外吸光度对鱼精蛋白浓度作图，得到鱼精蛋白浓度与吸光度之间的线性方程为：y＝‑0.6806x+0.7388且线性相关系数R2为0.991，根据线性方程通过检测加入鱼精蛋白后的溶液的吸光度进而判断加入的鱼精蛋白浓度。本发明的试剂盒能方便地用于人血清和商业中鱼精蛋白含量的测定，具有灵敏度高、选择性好、检测范围宽等优点。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和生物检测领域，具体涉及一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒。
背景技术
鱼精蛋白是一种带有大量正电荷的低分子蛋白，主要在鱼类(如鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在。鱼精蛋白是一种强碱，能与强酸性肝素钠或肝素钙形成稳定的盐而使肝素失去抗凝作用，因此可以用于肝素注射过量而引起的出血，及自发性出血如咯血等，它是目前体外循环心脏手术唯一对抗肝素的药物。除此之外，鱼精蛋白还具有很高的营养性和功能性，能降血压、助呼吸、促消化等，这些也成为研究的热点。目前对鱼精蛋白的检测试剂盒有很多，但是操作过于复杂，检测灵敏度达不到要求[Talanta76(2008)736–741；Analytical Chemistry 77(2005)5221–5228；Journal ofpharmaceutical and biomedical analysis 62(2012)61–67]。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒,包括如下组分：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；
(2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)过氧化氢水溶液；
(4)pH为4.0的磷酸盐缓冲溶液；
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒用下述方法制成：按比例，将50-200μL 20-80mM pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，10-120μL 10-120mM四氯钯酸钠水溶液，12-240μL 0.1-2mM的肝素水溶液加入到1.5mL的离心管中，并加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，20-30℃下静置1-3h，得反应液，将新制备的二甲基硼烷水溶液加入到反应液中，在20-30℃还原10-24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；所述二甲基硼烷的简写为DMAB；[DMAB]/[Na2PdCl4]的摩尔比为3.3。
pH为4.0的磷酸盐缓冲液的浓度为20-80mM。
pH为4.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液。
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度为10-50mM。
过氧化氢水溶液的浓度为4-10M。
pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液。
本发明的优点：
利用本发明的试剂盒能够方便地对人血清和商业中鱼精蛋白含量进行测定，其具有灵敏度高、选择性好、检测范围宽等优点。
附图说明
图1是实施例1中合成的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的透射电镜图。
图2是实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体对不同浓度过氧化氢的动力学曲线图。
图3为图2的双倒数曲线图。
图4是实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体对不同浓度3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的动力学曲线图。
图5为图4的双倒数曲线图。
图6为实施例4的标准工作曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例1
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒用下述方法制成：
将100μL40mM pH为7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，12μL 100mM四氯钯酸钠水溶液，48μL 0.5mM的肝素水溶液加入到1.5mL的离心管中，并加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，25℃下静置2h，得反应液，将新制备的二甲基硼烷水溶液加入到反应液中，在25℃还原12h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；所述二甲基硼烷的简写为DMAB；[DMAB]/[Na2PdCl4]的摩尔比为3.3。
通过透射电镜扫描获得其平均粒径为3.5nm。(见图1)
测定钯纳米颗粒的过氧化物酶活性：
取100μL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液于1500μL离心管中并加入900μL蒸馏水进行稀释混匀，在8个4mL比色皿中，均加入6.7μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液、500μL 40mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，25μL 10mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液并加入蒸馏水使其体积维持在1966.7μL后，最后分别向1-8个比色皿中依次加入33.3μL的1.5M、1.8M、2.4M、3M、4.8M、6M、7.5M、9M过氧化氢水溶液后采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱随时间的变化，得到吸光度随时间的变化率，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。(见图2和图3)
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对过氧化氢的Km值为78mM。
取100μL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液于1500μL离心管中并加入900μL蒸馏水进行稀释混匀，在8个4mL比色皿中，均加入6.7μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液、1000μL 20mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液后，再向1-8个比色皿中依次加入10μL的6mM、10mM、12mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，并加入蒸馏水使其体积维持在1974.5μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液后采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱随时间的变化，得到吸光度随时间的变化率，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。(见图4和图5)
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.036mM。
实施例2
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒用下述方法制成：
将200μL 20mM pH为7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液，120μL 10mM四氯钯酸钠水溶液，12μL 2mM的肝素水溶液加入到1.5mL的离心管中，并加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，20℃下静置3h，得反应液，将新制备的二甲基硼烷水溶液加入到反应液中，在20℃还原24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；所述二甲基硼烷的简写为DMAB；[DMAB]/[Na2PdCl4]的摩尔比为3.3。
通过透射电镜扫描获得其平均粒径为3.1nm。
测定方法同实施例1，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.045mM，对过氧化氢的Km值为89.5mM。
实施例3
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒用下述方法制成：
将50μL 80mM pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液，10μL120mM四氯钯酸钠水溶液，240μL 0.1mM的肝素水溶液加入到1.5mL的离心管中，并加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，30℃下静置1h，得反应液，将新制备的二甲基硼烷水溶液加入到反应液中，在30℃还原10h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；所述二甲基硼烷的简写为DMAB；[DMAB]/[Na2PdCl4]的摩尔比为3.3。
通过透射电镜扫描获得其平均粒径为4.8nm。
测定方法同实施例1，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.052mM，对过氧化氢的Km值为97.6mM。
实施例1-3均采用相同的试剂盒测定钯纳米颗粒对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺以及过氧化氢的Km值，总结见表1。
表1
结论：具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒对过氧化氢的Km值小，说明具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒与过氧化氢的亲和力高，反应速率快，催化活性高。
实施例4
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒，包括如下组分：
(1)实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；
(2)25mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)9.8M过氧化氢水溶液；
(4)40mM的pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液。
实施例5
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒，包括如下组分：
(1)实施例2制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；
(2)10mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)4M过氧化氢水溶液；
(4)20mM的pH为4.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液。
实施例6
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒，包括如下组分：
(1)实施例3制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；
(2)50mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)10M过氧化氢水溶液；
(4)80mM的pH为4.0的磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液。
实验例1
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒(实施例4)，使用具体步骤如下：
取100μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液于1500μL纯化管中并加入900μL蒸馏水进行稀释混匀，在12个4mL比色皿中，均加入6.7μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mMpH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-12个比色皿中依次加入20μL浓度分别为：100μg/mL、100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL鱼精蛋白钠水溶液，加入蒸馏水使体系体积为1974.5μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液(各试剂浓度采用实施例4鱼精蛋白检测体系的母液浓度)，混匀后反应30min；
采用紫外分光光度计扫描1-12个检测溶液在652nm处的吸收光谱，计算不同浓度的鱼精蛋白在652nm处的吸光度获得其校准曲线为y＝-0.6806x+0.7388，其中y代表肝素检测液在652nm处的紫外吸收值，x则表示鱼精蛋白浓度(见图6)。其线性相关系数R2为0.991，线性检测范围为0.02-0.8μg/mL，检测限为0.0141μg/mL。
分别用实施例5、6的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒对鱼精蛋白进行可视化检测，步骤同实验例1，所获得的校准曲线与实验例1获得的相似。
实验例2
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒(实施例4)，对血清中鱼精蛋白进行可视化检测，使用具体步骤如下：
取100μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液于1500μL纯化管中并加入900μL蒸馏水进行稀释混匀，在3个4mL比色皿中，均加入6.7μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-3个比色皿中分别加入：
10μL稀释100倍的人血清、20μL 20μg/mL鱼精蛋白水溶液、
10μL稀释100倍的人血清、20μL 40μg/mL鱼精蛋白水溶液、
10μL稀释100倍的人血清、20μL 60μg/mL鱼精蛋白水溶液；
再向每个管中加入：
加入蒸馏水使体系体积为1974.5μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液，混合反应30min，采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱，根据线性方程测定样品溶液，从而得出样品溶液中鱼精蛋白的含量。(见表2)
表2
分别用实施例5、6的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒对血清中鱼精蛋白进行可视化检测，步骤同实验例2，所获得的结果与实验例2获得的相似。
实验例3
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒(实施例4)，对血清中鱼精蛋白进行可视化检测，使用具体步骤如下：
取100μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液于1500μL纯化管中并加入900μL蒸馏水进行稀释混匀，在3个4mL比色皿中，均加入6.7μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-3个比色皿中分别加入：
10μL稀释100倍的人血清、20μL 10μg/mL鱼精蛋白水溶液、
10μL稀释100倍的人血清、20μL 30μg/mL鱼精蛋白水溶液、
10μL稀释100倍的人血清、20μL 50μg/mL鱼精蛋白水溶液；
再向每个管中加入：
加入蒸馏水使体系体积为1974.5μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液，混合反应30min，采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱，根据线性方程测定样品溶液，从而得出样品溶液中鱼精蛋白的含量。(见表3)
表3
分别用实施例5、6的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒对血清中鱼精蛋白进行可视化检测，步骤同实验例3，所获得的结果与实验例3获得的相似。
Claims (6)
1.一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测鱼精蛋白的试剂盒,其特征是包括如下组分：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；
(2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)过氧化氢水溶液；
(4)pH为4.0的磷酸盐缓冲溶液；
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒用下述方法制成：按比例，将50-200μL 20-80mM pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，10-120μL 10-120mM四氯钯酸钠水溶液，12-240μL 0.1-2mM的肝素水溶液加入到1.5mL的离心管中，并加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，20-30℃下静置1-3h，得反应液，将新制备的二甲基硼烷水溶液加入到反应液中，在20-30℃还原10-24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒合成液；所述二甲基硼烷的简写为DMAB；[DMAB]/[Na2PdCl4]的摩尔比为3.3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述pH为4.0的磷酸盐缓冲液的浓度为20-80mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是pH为4.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度为10-50mM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述过氧化氢水溶液的浓度为4-10M。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸缓冲溶液。
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