CN108455652B - 一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法及应用 - Google Patents

一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，步骤是：先将摩尔比为1:(0.5～1.5)的无水氯化铜与氯化亚铜溶于50～90mL去离子水中，在水温30～70℃的水浴锅中搅拌10～30min混合均匀，得到浅绿色混合溶液；然后取质量浓度为36％～38％的氨水，用一次性滴管逐滴滴加入所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至9.5～11.5，搅拌30～80min，原溶液变为深蓝色；再以9000～11000r/min的转速离心5～6分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，35～45℃真空干燥，得到长度为150nm～2μm，直径为30～50nm的天蓝色固体纳米棒。本发明因不含有贵金属，也未有蛋白质等修饰，成本十分低廉；制备简单快速。本发明还公开了类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的应用及方法。

Description

一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法及应用
技术领域
本发明属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及过氧化物模拟酶的制备，尤其涉及一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法及应用。
背景技术
在温和条件下，天然酶能展现较高的活性与选择性。因此，它们常作为催化剂广泛应用于医学、药学、分析检测等领域。然而，天然酶具有若干明显缺点，包括催化活性对环境变化的敏感性、稳定性较低等。此外，它们的提取和纯化过程代价昂贵且耗时。因此，研究者正尝试研发潜在的酶模拟物。
自阎锡蕴等人(Lizeng Gao,et al.,Nature Nanotechnology,2007,2:577-583)发现四氧化三铁磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性后，基于纳米材料的模拟酶因其成本低廉、稳定性高、活性可调等优点而吸引了大量研究者的兴趣。当前，研究者已开发了多种具有类过氧化物酶催化活性的纳米材料；例如：
中国专利CN106011125A，公开了一种以金纳米粒子为载体，利用具有生物活性的五肽段(URGDC)进行自组装，得到了具有高活性的过氧化物纳米酶；
中国专利CN105665012A，公开了一种由高铁离子和蛋白作用生成的铁-蛋白复合物过氧化物模拟酶。通过将高铁离子溶液和牛血清蛋白在一定pH和温度下搅拌反应，再经过多次透析，最后冷藏得到铁-蛋白复合物模拟酶。
中国专利CN105675793A，公开了金银异质纳米棒可作为仿过氧化物酶催化剂的应用。将一定浓度的氯金酸、聚二烯丙基二甲基氯化按、硝酸银加入到乙二醇溶液中,在200℃下反应72小时后,离心洗涤获得产物。
中国专利CN105537619A，公开了一种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒的制备方法。将氯钯酸钠水溶液加入到退火的脱氧核普酸水溶液中,在一定温度下混匀,静置一段时间,加入一定浓度的还原剂水溶液,混匀,在一定温度下静置10～15小时,得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体。
上述已公开的类过氧化物酶虽然具有一定的催化效率，但仍具有以下缺点和不足：
1)这些类过氧化物酶的催化活性仍不理想；
2)使用的原料多为贵金属，价格较高，成本较大；或者原料为价格较为昂贵的蛋白质，保存条件较为苛刻；
3)在制备过程中要用到透析等操作，制备工艺复杂，制备成本仍较高，耗时耗力。
发明内容
本发明的目的是为解决上述现有技术存在的问题和不足，提供一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒(Cu(OH)2NRs)的制备方法及应用。
为达到上述目的，本发明实现目的所采用的技术方案是：
一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
1.将摩尔比为1:(0.5～1.5)的无水氯化铜与氯化亚铜溶于50～90mL的去离子水中，在水温30～70℃的水浴锅中搅拌10～30min混合均匀，得到浅绿色混合溶液；
2.取质量浓度为36％～38％的氨水，使用一次性滴管逐滴滴加入步骤1所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至9.5～11.5，持续搅拌30～80min，原溶液变为深蓝色；
3.以9000～11000r/min的转速离心5～6分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，35～45℃真空干燥，得到长度为150nm～2μm，直径为30～50nm的天蓝色固体纳米棒。
进一步，步骤1所述摩尔比优选为1:1，去离子水优选60mL，水温优选为50℃，搅拌的时间优选为20min。
进一步，步骤2所述氨水的质量浓度优选37％，pH优选为11，所述搅拌的时间优选为55min。
进一步，步骤3所述离心机转速优选10000r/min，时间优选6分钟，真空干燥优选40℃。
为达到上述目的，本发明实现目的所采用的另一技术方案是：
一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒在测定过氧化氢含量的应用。
一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒在测定过氧化氢含量的应用方法，是以氢氧化铜纳米棒作为类过氧化物酶，催化TMB和过氧化氢之间的氧化还原反应，产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定过氧化氢的含量，具体操作步骤如下：
1)分别取pH值为2～7的醋酸盐缓冲液、5mM/L的TMB、待测过氧化氢溶液和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液按40:(1～3):(1～3):(1～3)的质量比混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将步骤1)中混合体系在20～60℃水浴中反应5～20min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定步骤2)混合体系的紫外-可见吸收光谱，得到不同浓度待测过氧化氢溶液所对应的吸光度，其结果如图7所示。
其中所述醋酸盐缓冲液的pH值优选为4，醋酸盐缓冲液、过氧化氢溶液和氢氧化铜纳米棒悬浮液质量比优选为30:1:1:1；
所述水浴的温度优选为30℃，反应时间为12min。
在本说明书中，术语“类过氧化物酶”是指具有过氧化物酶催化活性的材料。
在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。
本发明所用反应物、试剂均为市售。
本发明的特点和有益效果：
1、利用氯化铜、氯化亚铜、氨水等常见的市售药品制备过氧化物模拟酶，该酶不含有贵金属，也未有蛋白质等修饰，成本十分低廉；
2、制备过程简单快速，不需要复杂的实验操作，对参数控制要求较低，在两小时内即可制得一批新样品；
3、制备的氢氧化铜纳米棒暴露出较多的活性表面和位点，对弱酸性环境中的过氧化氢显示出优良的催化活性，利用简单的比色反应即可对宽浓度范围内的过氧化氢进行可视化检测。
附图说明
图1为制备的Cu(OH)2NRs的SEM图；
图2为制备的Cu(OH)2NRs的TEM图；
图3为制备的Cu(OH)2NRs的XRD图；
图4为制备的Cu(OH)2NRs催化过氧化氢氧化TMB反应的UV-Vis图；
图5为反应温度对Cu(OH)2NRs催化过氧化氢氧化TMB反应在652nm处吸光度的影响；
图6为pH对Cu(OH)2NRs催化过氧化氢氧化TMB反应在652nm处吸光度的影响；
图7为利用Cu(OH)2NRs作为过氧化物纳米酶对不同浓度过氧化氢的UV-Vis响应。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
1)将摩尔比为1:0.5的无水氯化铜与氯化亚铜溶于50mL的去离子水中，在水温30℃的水浴锅中搅拌10min混合均匀，得颜色为浅绿色混合溶液；
2)取质量浓度36％的氨水使用一次性滴管逐滴滴加入第一步所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至9.5，持续搅拌30min，原溶液颜色变为深蓝色；
3)以9000r/min的转速离心5分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，35℃真空干燥，得到天蓝色固体。
获得的产物呈纳米棒状结构(图1和图2)长度为150nm～2μm，直径为30～50nm，经XRD确定为氢氧化铜物质(图3)。该氢氧化铜纳米棒可利用氯化铜、氯化亚铜、氨水等常见的市售药品制备，制备过程简单快速，不需要复杂的实验操作，对参数控制要求较低；
氢氧化铜纳米棒作为类过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB反应的应用实验，步骤是：
1)分别取pH值为4的醋酸盐缓冲液、5mM/L的TMB、待测过氧化氢溶液和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液液按20:1:1:1的比例混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将上述体系在30℃水浴中反应5min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。图4记录了制备的Cu(OH)2NRs在不同体系中催化过氧化氢氧化TMB反应的UV-Vis图。据图可以发现，当过氧化氢、TMB和Cu(OH)2NRs中的任何一种缺失时，未有颜色反应发生；当过氧化氢、TMB和Cu(OH)2NRs均存在时，发生颜色反应。此反应是由TMB和过氧化氢在Cu(OH)2NRs的催化下发生氧化还原导致的，证明制备的Cu(OH)2NRs具有良好的过氧化物酶活性。
实施例2
本发明的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
1)将摩尔比为1:1的无水氯化铜与氯化亚铜溶于60mL的去离子水中，在水温40℃的水浴锅中搅拌15min混合均匀得颜色为浅绿色混合溶液；
2)取质量浓度37％的氨水使用一次性滴管逐滴滴加入第一步所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至10.5，持续搅拌40min，原溶液颜色变为深蓝色；
3)以10000r/min的转速离心5分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，40℃真空干燥，得到天蓝色固体纳米棒，长度为150nm～2μm，直径为30～50nm。
氢氧化铜类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验，步骤是：
1)分别取pH值为4的醋酸盐缓冲液、5mM/L的TMB、待测过氧化氢溶液和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液液按30:1:1:1的比例混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将上述体系分别放在20、30、40、50、60℃水浴中反应12min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱，结果如图5所示，随着温度的升高，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在30℃时达到峰值。因此可得，把温度控制在30℃时，酶的催化活性最好。
实施例3
本发明的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
1)将摩尔比为1:1的无水氯化铜与氯化亚铜溶于60mL的去离子水中，在水温40℃的水浴锅中搅拌15min混合均匀，得颜色为浅绿色混合溶液；
2)取质量浓度37％的氨水使用一次性滴管逐滴滴加入第一步所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至11，持续搅拌60min，原溶液颜色变为深蓝色；
3)以10000r/min的转速离心5分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，40℃真空干燥，得到天蓝色固体纳米棒，长度为150nm～2μm，直径为30～50nm。
氢氧化铜类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验，步骤是：
1)分别取2.7mL pH值分别为2、3、4、5、6、7的醋酸盐缓冲液，5mM/L的TMB、待测过氧化氢溶液和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液液按30:1:1:1的比例混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将上述体系在30℃水浴中反应12min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱，结果如图6所示，随着pH的增大，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在pH控制在4时吸光度值最高，达到峰值。可得，pH控制在4时，酶的催化活性最好。
实施例4
本发明的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，包括如下步骤：
1)将摩尔比为1：1.5的无水氯化铜与氯化亚铜溶于90mL的去离子水中，在水温70℃的水浴锅中搅拌30min混合均匀，得颜色为浅绿色混合溶液；
2)取质量浓度38％的氨水使用一次性滴管逐滴滴加入第一步所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至11.5，持续搅拌80min，原溶液颜色变为深蓝色；
3)以11000r/min的转速离心6分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，45℃真空干燥，得到天蓝色固体纳米棒，长度为150nm～2μm，直径为30～50nm。
氢氧化铜类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验，步骤是：
1)分别取pH值为4的醋酸盐缓冲液、5mM/L的TMB和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液液依次加入浓度分别为0.001mM/L、0.005mM/L、0.010mM/L、0.020mM/L、0.050mM/L、0.100mM/L、0.200mM/L、0.500mM/L、0.800mM/L、0.001mM/L的待测过氧化氢溶液使其按40:1:1:1的比例混合均匀,将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；；
2)将上述体系在30℃水浴中反应20min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱，结果如图7所示，过氧化氢浓度的范围从0.001mM/L到1.000mM/L，随着过氧化氢浓度的增加，吸光度值呈逐渐增大的趋势，并在波长为652nm附近达到峰值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式。当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，任何熟悉本技术领域的技术人员，当可根据本发明作出各种相应的等效改变和变形，都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将摩尔比为1:(0.5～1.5)的无水氯化铜与氯化亚铜溶于50～90mL的去离子水中，在水温30～70℃的水浴锅中搅拌10～30min混合均匀，得到浅绿色混合溶液；
(2)取质量浓度为36％～38％的氨水，使用一次性滴管逐滴滴加入步骤(1)所得混合溶液中，边滴加边测试pH，调节pH至9.5～11.5，持续搅拌30～80min，原溶液变为深蓝色；
(3)以9000～11000r/min的转速离心5～6分钟分离产物，并用去离子水将产物洗涤干净，35～45℃真空干燥，得到长度为150nm～2μm，直径为30～50nm的天蓝色固体纳米棒。
2.根据权利要求1所述的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述摩尔比为1:1，所述去离子水为60mL，所述水温为50℃，所述搅拌时间为20min。
3.根据权利要求1所述的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述氨水的质量浓度为37％，所述pH为11，所述搅拌时间为55min。
4.根据权利要求1所述的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述离心机转速为10000r/min，所述时间为6分钟，所述真空干燥温度为40℃。
5.一种根据权利要求1-4任一所述的一种类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒的制备方法制得的类过氧化物酶的氢氧化铜纳米棒在测定过氧化氢含量中的应用。
6.一种权利要求5所述应用的应用方法，其特征在于，是以氢氧化铜纳米棒作为类过氧化物酶，催化TMB和过氧化氢之间的氧化还原反应，产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定过氧化氢的含量，具体操作步骤如下：
1)分别取pH值为2～7的醋酸盐缓冲液、5mM/L的TMB、待测过氧化氢溶液和1mg/mL的氢氧化铜纳米棒悬浮液按40:(1～3):(1～3):(1～3)的质量比混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将步骤1)中混合体系在20～60℃水浴中反应5～20min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色再褪色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定步骤2)混合体系的紫外-可见吸收光谱，得到不同浓度待测过氧化氢溶液所对应的吸光度。
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，步骤1)中所述醋酸盐缓冲液的pH值为4，所述醋酸盐缓冲液、TMB、过氧化氢溶液和氢氧化铜纳米棒悬浮液质量比为30:1:1:1。
8.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，步骤2)中所述水浴的温度为30℃，反应时间为12min。
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