CN111965136B - 一种类过氧化物纳米酶β-FeOOH的制备方法及其在H2O2检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类过氧化物纳米酶β‑FeOOH的制备方法及其在H2O2检测中的应用，属于无机纳米材料技术领域。该类过氧化物纳米酶β‑FeOOH通过简单的一步低温水解沉淀法得到，且可以催化H2O2产生具有强氧化性的羟基自由基，在极短时间内催化TMB产生显色反应。与天然酶相比，该方法制备的类过氧化物纳米酶β‑FeOOH具有稳定性高，易于存储，工艺简单的优点，此外该方法制备的类过氧化物纳米酶β‑FeOOH与H2O2有更高的亲和能力，有望进行低浓度H2O2的检测应用。
Description
技术领域
本发明属于无机纳米材料技术领域，涉及一种类过氧化物纳米酶β-FeOOH 的制备方法及其在H2O2检测中的应用。
背景技术
天然过氧化氢酶是一类具有催化功能的蛋白质，少量存在即可极大地加快反应速度，且反应前后自身不发生变化，常用于食品、织物及细菌的检测和水体污染物的治理等方面。然而天然酶易变性失活，价格昂贵，提纯困难，储藏和使用成本高，使得模拟酶的研究成为当务之急。
经典的Fenton反应能产生大量具有强氧化性能力的羟自由基，已经被广泛应用于废水的处理。但此方法需要以Fe2+作为消耗剂，产生大量铁泥，引起后续的处理问题。因此人们改进了技术，如采用电化学法或光催化来加速Fe3+转化为 Fe2+，从而提高Fenton反应的效率。但是这种方法也伴随着大量人力、物力和能源的损耗。在近些年，研究者采用四氧化三铁作为显色催化剂(Li zeng,Zhuang, Xi yun,et al.《生物物理学报》,2009:304-305.)，但是四氧化三铁与H2O2的亲和力较低(Km＝154)，这就意味着体系中的H2O2浓度较低时反应将十分缓慢，大大降低了作业速率。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种类过氧化物纳米酶β-FeOOH的制备方法及其在H2O2检测中的应用，以解决现有的过氧化氢模拟酶反应效率较低的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
类过氧化物纳米酶β-FeOOH在H2O2检测中的应用。
优选地，首先，将10mg/ml的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与20mM的显色底物混合，然后向其中加入待测的H2O2，静置反应1～5min，得到待测混合溶液，将待测混合溶液置于紫外可见近红外光谱仪中，得到待测混合溶液的吸光度，基于类过氧化物纳米酶β-FeOOH催化H2O2显色反应得到的米氏方程，计算得到待测的H2O2浓度。
优选地，所述的米氏方程的建立过程如下：将10mg/ml的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与20mM的显色底物混合，分别向其中加入浓度不同、浓度梯度差相同的H2O2，所述H2O2的浓度为0.1～1mM，得到混合溶液，将混合溶液静置反应0～5min，测量含有不同浓度H2O2的混合溶液在不同反应时间下的吸光度，得到H2O2浓度与反应速率的关系，得到关于H2O2浓度的米氏方程；所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH为类过氧化物纳米酶β-FeOOH。
一种基于类过氧化物纳米酶β-FeOOH建立米氏方程的方法，所述显色底物的体积为0.2～2.2ml；所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH的体积为20～40μL。
优选地，所述显色底物为TMB，通过紫外可见近红外光谱仪测定652nm处的吸光度。
优选地，所述显色底物为ABTS，通过紫外可见近红外光谱仪测定734nm处的吸光度。
优选地，测量含有不同浓度H2O2的混合溶液的吸光度时，向不同的混合溶液中分别加入pH为3.6～6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液至混合溶液的体积为2.8～3.0 ml。
优选地，所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为2.8～4.1。
类过氧化物纳米酶β-FeOOH的制备方法，将20mmol三氯化铁加入体积为 100ml、质量百分数为0.1％～0.5％的聚乙烯亚胺水溶液中，反应1.5-2.5h后洗涤离心，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH。
优选地，所述反应温度为75～95℃。
优选地，所述洗涤是利用去离子水和乙醇进行交替洗涤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种类过氧化物纳米酶β-FeOOH在H2O2检测中的应用，类过氧化物纳米酶β-FeOOH能够作为芬顿试剂催化H2O2与有机显色底物(TMB 或ABTS)的氧化分解，在H2O2存在下，类过氧化物纳米酶β-FeOOH发生 Fe2+/Fe3+的电子转移，从而加速H2O2产生羟基自由基，由羟基自由基作为氢供应体，使体系具有强氧化性，氧化显色底物，发生显色反应，一方面通过体系的颜色变化大致确定H2O2的范围，另一方面通过加入不同浓度的H2O2，得到关于H2O2的米氏方程，并利用该米氏方程，精确测定待测的H2O2的浓度。根据米氏方程计算得出类过氧化物纳米酶β-FeOOH对H2O2的Km值为0.49，而现有技术中利用HRP(辣根过氧化物酶)催化H2O2时对应的米氏常数Km值为3.702，Vm为 17.57×10-8mM/s，该结果表明相比于HRP，本发明制备的类过氧化物纳米酶β -FeOOH与H2O2有更好的亲和能力，同时本发明中的反应速率Vm值为8.7×10﹣8mM/s，证明本发明的反应速率更快，显色时间大大缩短，检测速度加快。即在低浓度H2O2存在的情况下，催化效果更加灵敏。因此，本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH能够用于H2O2的检测。
进一步地，在获得米氏方程的过程中，即在类过氧化物纳米酶β-FeOOH、显色底物和不同浓度的H2O2的混合反应后，测量吸光度之前，分别向不同的混合溶液中加入pH为3.6～6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使得每个混合溶液的最终体积都保持在2.8～3.0ml，从而能够避免不同体积对吸光度的影响，使得测量结果更精确另一方面，采用该缓冲溶液可以为反应提供酸性环境，促使H2O2与Fe2+反应生成具有强氧化性的羟基自由基，更有利于反应的进行。
本发明公开了类过氧化物纳米酶β-FeOOH的制备方法，通过简单的一步低温水解沉淀法得到，该类过氧化物纳米酶β-FeOOH可以催化H2O2产生具有强氧化性的羟基自由基，能够在极短时间内催化TMB或ABTS产生显色反应。与天然酶相比，该方法制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH具有稳定性高，易于存储，工艺简单的优点，此外该方法制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与H2O2有更高的亲和能力，有望进行低浓度H2O2的检测应用。
附图说明
图1为本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的扫描电镜图；
图2为本发明中以TMB为显色底物，检测0.1～1mM范围内H2O2的浓度与类过氧化物纳米酶β-FeOOH吸光度的关系图；
图3为本发明中以TMB为显色底物，H2O2的浓度与催化反应速率的米氏曲线图；
图4为本发明中以ABTS为显色底物，H2O2的浓度与催化反应速率的米氏曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1
类过氧化物纳米酶β-FeOOH是一种常见的天然地质矿物，含量丰富，无毒无害。这种矿物常被用于制备Fe3O4和Fe2O3的前驱体，类过氧化物纳米酶β-FeOOH对重金属有着强大的亲和力，可用于除去水体系中的重金属污染物。本发明通过新的制备方法制备一种比表面积高、稳定性好且含有丰富的羟基基团的类过氧化物纳米酶β-FeOOH，并将其作为催化剂使用。
在本实施例中，将20mmol三氯化铁固体加入100ml、质量浓度为0.1％聚乙烯亚胺水溶液中进行充分搅拌，在80℃条件下混合反应2h，利用去离子水和乙醇交替洗涤三次，洗涤之后进行离心浓缩，使类过氧化物纳米酶β-FeOOH水溶液最终浓度为10mg/mL，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH，即类过氧化物纳米酶β-FeOOH。
对上述制得的类过氧化物纳米酶β-FeOOH进行微观形貌表征，其扫描电镜图(SEM)如图1所示，聚乙烯亚胺在粒子生长过程中作为一种软模板，附着在粒子的高能表面，限制了粒子的生长，为达到表面能量的稳定，粒子逐渐伸长，形成一种棒状结构。由图1的结果可知，利用本发明的制备方法得到的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为4.1。
实施例2
取20μL实施例1制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH溶液，将其与200μL、 20mM的TMB混合，加入体积为6μL的H2O2，最后使用pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至3mL，使得H2O2最终浓度范围为0.1mM。反应5min后，使用紫外可见近红外光谱仪测定652nm处的吸光度，根据公式(1)计算出反应过程中不同时刻H2O2的浓度C，
其中，A为吸光度，εTMBox为摩尔吸光系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关。C为吸光物质的浓度，单位为mol/L，L为吸收层厚度，单位为 cm。
然后在混合反应0～5min内，测量不同反应时间下混合溶液的吸光度，并计算对应的H2O2浓度，由此得出H2O2的浓度随反应时间变化的关系，并计算得到 H2O2的初始浓度为0.1mM时的反应速率。
同理根据计算出H2O2的初始加入体积为12μL、24μL、36μL、48μL、60 μL，对应的H2O2的初始浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM，检测不同初始浓度对应的反应速率，并做出[S]～V曲线，其中[S]为H2O2在整个体系中的初始浓度。
从而可以得出H2O2浓度和显色反应速率的关系式，即为米氏曲线。
由图2中的结果可知，当显色底物为TMB时，652nm处的吸光度与H2O2浓度呈现良好的线性关系(R2＝0.995)取未知浓度的H2O2水溶液，向其中加入 20-40μL类过氧化物纳米酶β-FeOOH溶液与200μL、20Mm TMB并混合，使用pH为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至3mL，使用紫外可见近红外光谱仪测定652nm处的吸光度，根据得到的吸光度与浓度的线性关系，计算得到H2O2的浓度。
实施例3
取30μL上述制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH溶液与20mM TMB混合，分别加入体积为6μL、12μL、24μL、36μL、48μL、60μL的H2O2，最后使用0.02M、pH为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至3mL，使得H2O2最终浓度分别对应为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM。使用紫外可见近红外光谱仪在混合溶液的不同反应时间下测定652nm处的吸光度，得到 H2O2浓度与反应速率的关系，用米氏方程(Michealis-Menten方程)进行拟合作图，结果如图3所示。米氏方程如下：
Michealis-Menten曲线
根据图3得到的米氏方程，讨论β-FeOOH对H2O2的亲和能力，根据上述 Michealis-Menten方程计算得出本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH对 H2O2的Km值为0.49，Vm为8.7×10-8mM/s。而参考文献(Gao L Z,Zhuang J,Nie L,et al.Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagneticnanoparticles[J].Nature nanotechnol,2007,2(9):577-583.)中HRP(辣根过氧化物酶)对应的米氏常数 Km值为3.702，Vm为22.36×10-8mM/s。该结果表明相比于HRP，本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与H2O2有更好的亲和能力，且在低浓度H2O2存在的情况下，催化效果更加灵敏，反应速率更快，可以在更短时间内得到反应结果，缩短检测时间。
实施例4
取40μL上述制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH溶液与20mM ABTS混合，分别加入体积为6μL、12μL、24μL、36μL、48μL、60μL的H2O2，最后使用0.02M、pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至3mL，使得对应的H2O2的最终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM。使用紫外可见近红外光谱仪在混合溶液的不同反应时间下测定734nm处的吸光度，得到H2O2浓度与反应速率的关系，用米氏方程(Michealis-Menten方程)进行拟合作图，结果如图4所示。
根据图4得到的米氏方程，讨论在ABTS存在下，β-FeOOH对H2O2的亲和能力，根据上述Michealis-Menten方程计算得出本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH对H2O2的Km值为0.59，Vm为17.57×10-8mM/s。而参考文献中HRP(辣根过氧化物酶)对应的米氏常数Km值为3.702，Vm为8.7×10-8mM/s。该结果表明，本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与H2O2有更好的亲和能力，且在低浓度H2O2存在的情况下，催化效果更加灵敏，反应速率更快，可以在更短时间内得到反应结果，缩短检测时间。
实施例5
将20mmol三氯化铁固体加入100ml、质量浓度为0.5％聚乙烯亚胺水溶液中进行充分搅拌，在85℃条件下混合反应1.5h，利用去离子水和乙醇交替洗涤三次，洗涤之后进行离心浓缩，使类过氧化物纳米酶β-FeOOH水溶液最终浓度为 10mg/mL，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH，即类过氧化物纳米酶β-FeOOH。本实施例制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为2.9。
实施例6
将20mmol三氯化铁固体加入100ml、质量浓度为0.4％聚乙烯亚胺水溶液中进行充分搅拌，在80℃条件下混合反应2.5h，利用去离子水和乙醇交替洗涤三次，洗涤之后进行离心浓缩，使类过氧化物纳米酶β-FeOOH水溶液最终浓度为 10mg/mL，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH，即类过氧化物纳米酶β-FeOOH。本实施例制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为3.15。
实施例7
将20mmol三氯化铁固体加入100ml、质量浓度为0.2％聚乙烯亚胺水溶液中进行充分搅拌，在90℃条件下混合反应2h，利用去离子水和乙醇交替洗涤三次，洗涤之后进行离心浓缩，使类过氧化物纳米酶β-FeOOH水溶液最终浓度为 10mg/mL，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH，即类过氧化物纳米酶β-FeOOH。本实施例制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为3.5。
实施例8
将20mmol三氯化铁固体加入100ml、质量浓度为0.5％聚乙烯亚胺水溶液中进行充分搅拌，在75℃条件下混合反应2h，利用去离子水和乙醇交替洗涤三次，洗涤之后进行离心浓缩，使类过氧化物纳米酶β-FeOOH水溶液最终浓度为10 mg/mL，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH，即类过氧化物纳米酶β-FeOOH。本实施例制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为2.8。
上述实施例中，显色底物为TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐)或ABTS(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)，在H2O2存在下，类过氧化物纳米酶β-FeOOH与显色底物发生显色反应，并通过体系的颜色变化来测定H2O2的含量，反应原理如下：
Fe3++H2O2→FeOOH2++H+
FeOOH2+→Fe2++HO2·
Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH
·OH+HO2·→H2O+O2
TMB+·OH→ox-TMB
ABTS+·OH→ox-ABTS
综上所述，本发明制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH，工艺简单，成本低廉，且可以催化H2O2产生具有强氧化性的羟基自由基，使TMB或ABTS在极短时间内产生显色反应，显著提高反应速率，可在短时间内通过颜色变化及吸光度快速测定样品中H2O2的含量。与天然酶相比，该方法制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH具有稳定性高，易于存储，工艺简单，成本低廉的优点，此外该方法制备的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与H2O2有更高的亲和能力，有望进行低浓度 H2O2的检测应用。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (8)
1.类过氧化物纳米酶β-FeOOH在H2O2检测中的应用，其特征在于，首先，将10 mg/ml的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与20mM的显色底物混合，所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH的长径比为2.8~4.1；然后向其中加入待测的H2O2，静置反应1~5 min，得到待测混合溶液，将待测混合溶液置于紫外可见近红外光谱仪中，得到待测混合溶液的吸光度，基于类过氧化物纳米酶β-FeOOH催化H2O2显色反应得到的米氏方程，计算得到待测的H2O2浓度。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的米氏方程的建立过程如下：将10mg/ml的类过氧化物纳米酶β-FeOOH与20mM的显色底物混合，分别向其中加入浓度不同、浓度梯度差相同的H2O2，所述H2O2的浓度为0.1~1mM，得到混合溶液，将混合溶液静置反应0~5min，测量含有不同浓度H2O2的混合溶液在不同反应时间下的吸光度，得到H2O2浓度与反应速率的关系，得到关于H2O2浓度的米氏方程；所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH为类过氧化物纳米酶β-FeOOH。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述显色底物的体积为0.2~2.2ml；所述类过氧化物纳米酶β-FeOOH的体积为20~40μL。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述显色底物为TMB，通过紫外可见近红外光谱仪测定652 nm处的吸光度。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述显色底物为ABTS，通过紫外可见近红外光谱仪测定734 nm处的吸光度。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，测量含有不同浓度H2O2的混合溶液的吸光度时，向不同的混合溶液中分别加入pH为3.6~ 6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液至混合溶液的体积为2.8~3.0 ml。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，类过氧化物纳米酶β-FeOOH的制备方法为：将20mmol三氯化铁加入体积为100ml、质量百分数为0.1 %~0.5 %的聚乙烯亚胺水溶液中，反应1.5-2.5h后洗涤离心，得到类过氧化物纳米酶β-FeOOH。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，反应温度为75~95℃；所述洗涤是利用去离子水和乙醇进行交替洗涤。
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