CN116003818B - 一种制备功能化多金属有机骨架纳米酶的方法及其过氧化物酶活性的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种功能化多金属有机骨架纳米酶的制备方法以及利用其过氧化物酶活性在生物分析中的应用。首先在N,N‑二甲基甲酰胺溶液中加入氨基对苯二甲酸、六水合氯化镍和六水合氯化铁使用溶剂热法合成功能化多金属有机骨架纳米酶。然后利用肌氨酸能在肌氨酸氧化酶的催化下生成过氧化氢，将制备的功能化多金属有机骨架纳米酶加入到此酶促体系、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺和缓冲液体系中，进行吸光度检测。本发明制备的功能化多金属有机骨架纳米酶对底物亲和力高、水溶性高、稳定性高、对环境友好且制备方法简单、易于操作，以其过氧化物酶活性为基础建立的检测体系灵敏度高、选择性好。
Description
技术领域
本发明涉及功能化多金属有机骨架纳米酶、生物分析技术领域，尤其涉及一种制备功能化多金属有机骨架纳米酶的方法及其过氧化物酶活性的应用。
背景技术
肌氨酸(N-甲基甘氨酸)是一种甘氨酸衍生物，属于人体内非必需氨基酸，在能量代谢上有着不可替代的作用。经证实，前列腺癌患者的尿液中肌氨酸含量会明显升高，这对于快速检测早期前列腺癌有着非凡的意义。目前临床上检测肌氨酸的方法有直接检测法和间接检测法两大类，其中直接检测法使用质谱仪检测肌氨酸，但其检测信号较弱；间接检测包括荧光法、比色法和电化学方法，荧光法不稳定；电化学法重现性较差；基于过氧化物酶活性的比色法的天然过氧化物酶容易失活，并且催化条件苛刻，成本很高，限制了其广泛性应用。所以开发一种可以替代天然过氧化物酶的试剂对肌氨酸的检测具有非常重要的意义。
纳米酶近年来因其具有高稳定性、耐受性、易批量生产且低成本等特点备受关注，逐渐被应用于医药、环境、分析等领域。金属有机骨架是由有机配体与过渡金属离子组装而成的配位聚合物，其具有多孔隙、比表面积大和金属位点多等优势，被广泛应用于纳米酶的领域。利用具有过氧化物酶特性的金属有机骨架纳米酶，可构建一种金属有机骨架纳米酶-肌氨酸的级联催化传感体系，将其应用于人尿液中肌氨酸含量的检测。
发明专利CN 115227719 A公开了一种制备具有过氧化物酶活性的钙磷纳米酶方法，但是该方法需用表面活性剂合成，其对环境会造成污染。发明专利CN115032381A公开了一种制备具有过氧化物酶活性的金铂纳米酶颗粒的方法，但是该方法所用的H2AuCl4作为原料，难以保存且成本较高，此外通过化学原位还原法在金纳米颗粒表面包裹铂原子层的步骤繁琐。本专利以氯化铁和氯化镍为原料，以溶剂热法制备具有过氧化物酶活性的功能化多金属有机骨架纳米酶，并将其应用于人体尿液中肌氨酸含量的检测，成本低廉、操作快捷、选择性强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是制备一种可以替代天然过氧化物酶的纳米酶试剂。据此问题，提供了由溶剂热法制备一种功能化多金属有机骨架纳米酶的制备方法及其过氧化物酶活性的应用。该材料具有催化活性高、稳定性强、选择性高、易于规模化生产的优点。本研究发明了一种新的过氧化物酶试剂，可用于人体尿液中肌氨酸含量的检测。
一种功能化多金属有机骨架纳米酶的制备方法，具体是按照以下步骤完成：
步骤一、功能化多金属有机骨架纳米酶的制备过程：在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入氨基对苯二甲酸、六水合氯化镍和六水合氯化铁，超声5min；溶质溶解完成后将混合溶液转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放入设定反应时间为8h～10h，温度为120℃～140℃的恒温烘箱中；反应结束后将反应釜从恒温烘箱中取出并冷却到室温；步骤中所述氨基对苯二甲酸与六水合氯化镍的质量比为1g∶0.2g～0.4g；步骤中所述氨基对苯二甲酸与六水合氯化铁的质量比为1g∶0.5g～0.7g；步骤中所述氨基对苯二甲酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1g∶40mL～60mL；
步骤二、功能化多金属有机骨架纳米酶的纯化过程：将冷却至室温的反应釜中的产物转移至设定转速为6000rpm～7000rpm，时间为8min～12min的离心机中，用N,N-二甲基甲酰胺溶液离心两次后用无水乙醇离心一次，将得到的固体产物置于50℃～60℃真空烘箱中隔夜干燥，得到功能化多金属有机骨架纳米酶。
一种功能化多金属有机骨架纳米酶的过氧化物酶活性的应用过程，具体按以下步骤完成：
步骤一、肌氨酸标准溶液的检测：在100μL不同浓度的肌氨酸标准溶液中加入pH＝8.0～8.4磷酸缓冲溶液60μL、0.8mg·mL-1～1mg·mL-1肌氨酸氧化酶40μL，在设定温度为36℃～37℃的恒温烘箱中孵育25min～35min，将得到的溶液加入0.8mg·mL-1～1mg·mL-1的功能化多金属有机骨架纳米酶的N,N-二甲基甲酰胺溶液100μL、4.5mmol·L-1～5mmol·L- 13,3',5,5'-四甲基联苯胺100μL并用pH＝4.2～4.5的醋酸钠溶液稀释至2mL，在室温下静置12min～17min；测定并记录不同浓度肌氨酸标准溶液体系在652nm处的吸光度值；步骤中所用肌氨酸标准溶液的浓度为0.2μmol·L-1～120μmol·L-1；
步骤二、人体尿液样本中肌氨酸浓度的检测：将尿液放置于恒温水浴锅内，设定温度为70℃～80℃，加热40min～50min，将加热好的尿液样本置于离心机中，设定转速为9500rpm～11000rpm，时间为18min～22min，离心完成后取上清液；按如上所述步骤一中的方法检测人体尿液样本中的肌氨酸浓度。
本发明优点：1、本发明采用溶剂热法制备了功能化多金属有机骨架纳米酶用于人体尿液中肌氨酸含量的检测，方法简单安全易于操作；2、本发明掺加的铁和镍双金属丰富了纳米酶的催化活性位点；而且氨基的成功引入，使结构中产生了缺陷，形成了开放的可及位点，此外还增加了材料的水溶性；3、本发明制备得到的具有类酶催化活性的功能化多金属有机骨架纳米酶和底物间亲和力优异，以过氧化氢为底物时的Km＝0.00753mmol·L-1，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为底物时的Km＝0.0566mmol·L-1；4、本发明基于功能化多金属有机骨架纳米酶构建的级联催化传感体系对尿液中的肌氨酸具有特异性且准确的识别能力，在生物医学分析领域具有良好的应用潜力。
附图说明
图1是实施例1功能化多金属有机骨架纳米酶扫描电镜图。由图1可以看出，功能化多金属有机骨架纳米酶为梭锥状结构。
图2是实施例1功能化多金属有机骨架纳米酶的X射线光电子谱图。如图2A所示，在709.1eV、721.6eV铁元素是以+2价形式存在；在711eV、724eV铁元素是以+3价形式存在。如图2B所示，在853.6eV、871.8eV镍元素是以+2价存在。以上事实揭示了材料中铁是以氧化还原电子对的形式存在。
图3是对实施例1功能化多金属有机骨架纳米酶类酶催化活性检测的示意图。由图3曲线c可知3,3',5,5'-四甲基联苯胺和功能化多金属有机骨架纳米酶的体系在光谱400nm～800nm扫描范围内未出现吸收峰，说明纳米酶不具备氧化酶活性；由曲线b，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液的体系对应的光谱在652nm处有一个弱吸收峰，说明3,3',5,5'-四甲基联苯胺能被过氧化氢微弱氧化；而实验组曲线a，即含有功能化多金属有机骨架纳米酶、过氧化氢、3,3',5,5'-四甲基联苯胺体系对应的光谱曲线在652nm处有一个强吸收峰。以上结果表明，所制备的功能化多金属有机骨架纳米酶具有类过氧化物酶催化活性。
图4是实施例1中功能化多金属有机骨架纳米酶的催化机理检测示意图。采用超氧化物歧化酶作为超氧自由基清除剂，色氨酸作为单线态氧自由基清除剂，异丙醇作为羟基自由基清除剂。由图4可知，相较于空白对照组，只有加入异丙醇的体系在652nm处的吸光度发生明显下降，说明功能化多金属有机骨架纳米酶具有类过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢生成羟基自由基活性中间产物。
图5是实施例1中功能化多金属有机骨架纳米酶的稳态动力学研究示意图。采用米氏动力学方程分别研究了功能化多金属有机骨架纳米酶对于3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢的亲和力，即其中，S代表底物；米氏常数(Km)描述酶与底物的亲和程度，其数值只与酶自身有关，且Km的值越小说明底物与酶的亲和力越大；最大反应速率(Vmax)描述在最佳反应条件下酶催化反应的最大速率，其数值越大表明酶在该条件下的催化活性越高。经过计算，得到以过氧化氢为底物时的Km＝0.00753mmol·L-1，Vmax＝8.193×10-8M·s-1；以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为底物时的Km＝0.0566mmol·L-1，Vmax＝16.838×10-8M·s-1。
图6是实施例2中功能化多金属有机骨架纳米酶在3,3',5,5'-四甲基联苯胺和不同浓度肌氨酸酶促体系在652nm处的吸光度与肌氨酸浓度的线性关系曲线图。以催化反应体系652nm处的吸光度为纵坐标，肌氨酸浓度为横坐标，通过Origin2019软件作图，肌氨酸的浓度在0.2μmol·L-1～120μmol·L-1的范围内时，随着肌氨酸浓度增加，吸光度呈线性上升，线性回归方程为Abs＝0.0031C+0.03743(R2＝0.99)，该方法对肌氨酸检出限为0.17μmol·L-1。
图7是测试实施例2中检测体系选择性能力图：亮氨酸、组氨酸、CO3 2-、尿素、甘氨酸、葡萄糖、尿酸、酪氨酸、色氨酸、Mg2+、K+、脯氨酸、Na+、谷氨酸作为选择性物质，在反应体系内的浓度均为2mmol·L-1，肌氨酸的浓度为120μmol·L-1。如图7所示，除了含有肌氨酸的酶促体系，其他测试物质对体系吸光度的变化影响可以忽略不计，这表明建立的方法选择性高。
具体实施方式
实施例1：本实施方式是一种功能化多金属有机骨架纳米酶的制备方法，具体是按以下步骤完成的：
步骤一、功能化多金属有机骨架纳米酶的制备过程：在40mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中加入0.907g氨基对苯二甲酸、0.248g六水合氯化镍、0.540g六水合氯化铁，超声5min；溶质溶解完成后将混合溶液转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放入设定反应时间为8h，温度为120℃的恒温烘箱中；反应结束后将反应釜从恒温烘箱中取出并冷却到室温；
步骤二、功能化多金属有机骨架纳米酶的纯化过程：将冷却至室温的反应釜中的产物转移至设定转速为6500rpm，时间为10min的离心机中，用N,N-二甲基甲酰胺溶液离心两次和无水乙醇离心一次，将得到的固体产物置于56℃真空烘箱中隔夜干燥，得到功能化多金属有机骨架纳米酶。
实施例2：本实施方式是一种功能化多金属有机骨架纳米酶的过氧化物酶活性的应用过程，具体按以下步骤完成的：
步骤一、肌氨酸标准溶液的检测：在100μL的0.2μmol·L-1～120μmol·L-1肌氨酸标准溶液中加入pH＝8.0磷酸缓冲溶液60μL、1mg·mL-1肌氨酸氧化酶40μL，在设定温度为37℃的恒温烘箱中孵育30min，将得到的溶液加入1mg·mL-1的功能化多金属有机骨架纳米酶的N,N-二甲基甲酰胺溶液100μL、5mmol·L-13,3',5,5'-四甲基联苯胺100μL并用pH＝4.5的醋酸钠溶液稀释至2mL，在室温下静置15min；测定并记录不同浓度肌氨酸标准溶液体系在652nm处的吸光度值；
步骤二、人体尿液样本中肌氨酸浓度的检测：将尿液放置于恒温水浴锅内，设定温度为70℃，加热40min，将加热好的尿液样本置于离心机中，设定转速为10000rpm，时间为20min，离心完成后取上清液；按如上所述步骤一中的方法检测人体尿液样本中的肌氨酸浓度。
Claims (2)
1.一种功能化多金属有机骨架纳米酶的制备方法，其特征在于，所述方法按以下步骤进行：
步骤一、功能化多金属有机骨架纳米酶的制备过程：在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入氨基对苯二甲酸、六水合氯化镍和六水合氯化铁，超声5min；溶质溶解完成后将混合溶液转移至内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中，将反应釜放入设定反应时间为8h～10h，温度为120℃～140℃的恒温烘箱中；反应结束后将反应釜从恒温烘箱中取出并冷却到室温；步骤中所述氨基对苯二甲酸与六水合氯化镍的质量比为1g∶0.2g～0.4g；步骤中所述氨基对苯二甲酸与六水合氯化铁的质量比为1g∶0.5g～0.7g；步骤中所述氨基对苯二甲酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1g∶40mL～60mL；
步骤二、功能化多金属有机骨架纳米酶的纯化过程：将冷却至室温的反应釜中的产物转移至设定转速为6000rpm～7000rpm，时间为8min～12min的离心机中，用N,N-二甲基甲酰胺溶液离心两次后用无水乙醇离心一次，将得到的固体产物置于50℃～60℃真空烘箱中隔夜干燥，得到功能化多金属有机骨架纳米酶。
2.利用权利要求1所述制备方法制备的功能化多金属有机骨架纳米酶在检测人体尿液中肌氨酸中的应用，其特征在于，所述应用按以下步骤进行：
步骤一、肌氨酸标准溶液的检测：在100μL不同浓度的肌氨酸标准溶液中加入pH＝8.0～8.4磷酸缓冲溶液60μL、0.8mg·mL-1～1mg·mL-1肌氨酸氧化酶40μL，在设定温度为36℃～37℃的恒温烘箱中孵育25min～35min，将得到的溶液加入0.8mg·mL-1～1mg·mL-1的功能化多金属有机骨架纳米酶的N,N-二甲基甲酰胺溶液100μL、4.5mmol·L-1～5mmol·L-13,3',5,5'-四甲基联苯胺100μL并用pH＝4.2～4.5的醋酸钠溶液稀释至2mL，在室温下静置12min～17min；测定并记录不同浓度肌氨酸标准溶液体系在652nm处的吸光度值；步骤中所用肌氨酸标准溶液的浓度为0.2μmol·L-1～120μmol·L-1；
步骤二、人体尿液样本中肌氨酸浓度的检测：将尿液放置于恒温水浴锅内，设定温度为70℃～80℃，加热40min～50min，将加热好的尿液样本置于离心机中，设定转速为9500rpm～11000rpm，时间为18min～22min，离心完成后取上清液；按肌氨酸标准溶液的检测的方法检测人体尿液样本中的肌氨酸浓度。
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