CN108918478B - 一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法 - Google Patents

一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测α‑葡萄糖苷酶活性的方法。首先，邻苯二胺（OPD）被MnO2纳米片氧化生成荧光产物2,3‑二氨基吩嗪（DAP），与加入的AgNCs发生内滤效应，使AgNCs的荧光被猝灭，根据DAP和AgNCs的荧光强度比构成比率荧光探针；其次，底物AAG在α‑葡萄糖苷酶的催化下产生抗坏血酸，将MnO2纳米片还原为不具有类氧化酶的Mn2+，无法将OPD氧化生成DAP，因此，DAP的荧光强度降低，而AgNCs的荧光强度增加。最后，根据DAP和AgNCs两者荧光强度的比值对α‑葡萄糖苷酶的浓度进行定量检测，该方法灵敏度高、选择性好，而且检测简便。

Description

一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于MnO2纳米片的比率荧光法用于定量测定α-葡萄糖苷酶的活性。
背景技术
糖尿病是一种严重的慢性疾病，通常伴随着可怕的晚期并发症如神经病变、微血管病变、视网膜病变、白内障等。近年来，糖尿病的发生率正在不断增加，年轻人正在成为高风险人群。众所周知，α-葡萄糖苷酶是一种位于小肠上皮细胞的膜结合酶，在碳水化合物消化中起着至关重要的作用。α-吡喃葡萄糖苷键的特异性水解导致的葡萄糖分子的释放是饭后血糖水平升高的主要原因。庞贝病是由溶酶体酸α-葡萄糖苷酶缺陷引起的，因此，α-葡萄糖苷酶被认为是筛选庞贝病的最主要的生物标志物。此外，测量精浆中的α-葡萄糖苷酶活性也可用于诊断无精子症。现有的α-葡萄糖苷酶的检测方法有：荧光法、电化学法、比色法等，但这些方法大都基于人工合成的有机染料、标记的荧光团以及需要长时间合成、复杂标记和纯化的纳米材料，使得检测过程耗时、繁琐、成本高。因此，开发一种简单、低成本、无标记的方法用于灵敏高效的检测α-葡萄糖苷酶是非常必要的。
近年来，MnO2纳米片作为一种具有良好生物相容性的新型、易于合成的二维纳米材料，引起了人们的极大关注。由于其出色的物理和化学特性，已被广泛用于检测酶、金属离子和其他小分子。检测原理大致分为以下两类：一类是与标记的荧光团、有机染料、量子点、上转换纳米粒等荧光物质结合，利用MnO2纳米片的高效荧光淬灭能力达到检测的目的；另一类是利用MnO2纳米片的类氧化酶的特性，将其与比色底物(如3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB)结合,虽然比色法可以产生可视化信号(氧化TMB显蓝色)，但是与荧光法相比，比色法的灵敏度较低、稳定性较差。
比率荧光法近年来在传感和生物成像领域引起了越来越多的关注。通过记录两种不同波长处荧光强度的比，干扰环境/背景因素在很大程度上被最小化。与单信号稳态荧光相比，这种方法可以实现更精确、有效的检测，因此已有许多比率荧光传感器用于各种目标分子的检测。但据我们所知，目前还没有基于MnO2纳米片的比率荧光法用于α-葡萄糖苷酶的检测。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，基于MnO2纳米片的比率荧光探针，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，步骤如下：
(1)、制备MnO2纳米片：1mM KMnO4加入到10mL 0.01M MES缓冲溶液中，超声30min，所得产物在10000rpm离心10min，并用去离子水清洗，真空干燥备用；(参考文献：Z.Z.Dong,L.Lu,C.N.Ko,C.Yang,S.Li,M.Y.Lee,C.H.Leung,D.L.Ma,A MnO2nanosheet-assisted GSHdetection platform using an iridium(iii)complex as a switch-on luminescentprobe,Nanoscale,9(2017)4677-4682)。
(2)、制备AgNCs：10mg还原型谷胱甘肽置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.46)溶解，再加入0.5mL 2mg/mL AgNO3溶液，室温搅拌几分钟之后，油浴加热回流，当温度加热至140℃时加入0.5mL 4mg/mL NaBH4溶液，反应16h，所得产物置于4℃冰箱备用；(参考文献：S.Roy,A.Baral,A.Banerjee,Tuning of silver cluster emissionfrom blue to red using a bio-active peptide in water,ACS Appl MaterInterfaces,6(2014)4050-6)。
(3)、将不同浓度的α-葡萄糖苷酶与底物AAG于37℃孵育后，底物AAG在α-葡萄糖苷酶的催化下产生抗坏血酸；
底物AAG浓度为0.2-4mM；随着浓度的增加，荧光强度的比值先减后维持不变，在荧光强度的比值基本保持恒定时，检测更佳，因此较佳底物AAG浓度为1-4mM。
底物AAG与α-葡萄糖苷酶的作用时间为10-60min，较佳地，作用时间为20-60min，更佳地，作用时间为30-60min。
(4)、加入MnO2纳米片，产生的抗坏血酸将MnO2纳米片还原为不具有类氧化酶的Mn2 +。
(5)、再加入邻苯二胺，继续反应，邻苯二胺在MnO2纳米片的类氧化酶作用下，氧化生成荧光产物2,3-二氨基吩嗪；不具有类氧化酶的Mn2+，无法将邻苯二胺氧化生成荧光产物2,3-二氨基吩嗪；
邻苯二胺的浓度为20-400μM，较佳地，浓度为100-400μM；
邻苯二胺的反应时间为5-40min，较佳地，反应时间为20-40min。
(6)、加入AgNCs，荧光产物2,3-二氨基吩嗪与AgNCs发生内滤效应，从而使得AgNCs的荧光被猝灭。
(7)、根据荧光产物2,3-二氨基吩嗪和AgNCs两者在450nm及575nm处的荧光强度的比值对α-葡萄糖苷酶的浓度绘制标准曲线。
(8)、根据标准曲线，获得样品中α-葡萄糖苷酶的浓度，完成对α-葡萄糖苷酶的定量检测。
本发明定量检测α-葡萄糖苷酶活性的原理是：
首先，利用MnO2纳米片的类氧化酶的特性，将邻苯二胺(OPD)氧化生成荧光产物2,3-二氨基吩嗪(DAP)，当加入AgNCs时，由于两者之间可以发生内滤效应(IFE)，从而使得AgNCs的荧光被猝灭，根据DAP和AgNCs两者荧光强度之比可构成比率荧光探针；
其次，以2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AAG)作为底物，在α-葡萄糖苷酶的催化下产生抗坏血酸(AA)，将溶液中的MnO2纳米片还原为Mn2+，Mn2+不具有类氧化酶的特性，无法将OPD氧化生成荧光产物DAP，因此，DAP的荧光强度会降低，而AgNCs的荧光强度会增加。
最后根据DAP和AgNCs两者荧光强度的比值对α-葡萄糖苷酶的浓度进行定量检测。
有益效果：本发明利用MnO2纳米片类氧化酶的特性，以DAP以及AgNCs的荧光作为信号指示，构建了一种基于MnO2纳米片的比率荧光探针，用于定量测定α-葡萄糖苷酶的活性。与传统的检测方法相比，不仅具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，而且扩展了MnO2纳米片的类氧化酶特性在比率荧光检测中的应用。
附图说明
图1是实施例1制备得到的MnO2纳米片的透射电子显微镜图；如图所示，MnO2纳米片呈薄片状。
图2A是实施例2制备得到的AgNCs的透射电子显微镜图；如图所示，AgNCs粒径约在2-4nm，均匀分散。
图2B是实施例2制备得到的AgNCs的紫外吸收以及荧光激发和发射图；如图所示，在200nm到400nm处有紫外吸收，最大激发波长为370nm，最大发射波长为450nm。
图3A是底物AAG的浓度对目标物响应的影响曲线，可见随着浓度的增加，荧光强度的比值先减后维持不变。
图3B是底物与酶的反应时间对目标物响应的影响曲线，可见随着反应时间的增加，荧光强度的比值先减后维持不变。
图3C是OPD的浓度对目标物响应的影响曲线；可见随着浓度的增加，荧光强度的比值先增后维持不变。
图3D是OPD反应时间对目标物响应的影响曲线；可见随着反应时间的增加，荧光强度的比值先增后维持不变。
图4A是实施例7中加入不同量α-葡萄糖苷酶后溶液荧光强度的变化图，如图所示，随着α-葡萄糖苷酶浓度的增加(0.2、0.4、1、2、4、6、8U/mL)，450nm处的荧光强度逐渐增加，575nm处的荧光强度逐渐减小。
图4B是实施例7中α-葡萄糖苷酶浓度与荧光强度比值的线性相关图；由图可知，在一定浓度范围内，α-葡萄糖苷酶浓度与荧光强度比值呈线性，线性回归方程为y＝-0.1619x+1.6311，相关系数R2＝0.9974，检测限为0.03U/mL。
具体实施方式
α-葡萄糖苷酶、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(购自上海源叶生物科技有限公司)；高锰酸钾、2-吗啉乙磺酸、还原型谷胱甘肽、硝酸银、硼氢化钠、邻苯二胺(国药集团化学试剂有限公司)。
实施例1MnO2纳米片的制备(参考文献：Z.Z.Dong,L.Lu,C.N.Ko,C.Yang,S.Li,M.Y.Lee,C.H.Leung,D.L.Ma,A MnO2nanosheet-assisted GSH detection platformusing an iridium(iii)complex as a switch-on luminescent probe,Nanoscale,9(2017)4677-4682.)，步骤如下：
1mM KMnO4加入到10mL 0.01M MES缓冲溶液中，超声30min，所得产物在10000rpm离心10min，并用去离子水清洗，真空干燥备用。其透射电镜图如图1所示。
实施例2AgNCs的制备(参考文献：S.Roy,A.Baral,A.Banerjee,Tuning of silvercluster emission from blue to red using a bio-active peptide in water,ACSAppl Mater Interfaces,6(2014)4050-6.)，步骤如下：
10mg还原型谷胱甘肽置于50mL圆底烧瓶中，加入4mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.46)溶解，再加入0.5mL 2mg/mL AgNO3溶液，室温搅拌几分钟之后，油浴加热回流，当温度加热至140℃时加入0.5mL 4mg/mL NaBH4溶液，反应16h，所得产物置于4℃冰箱备用。其透射电镜图、紫外吸收以及荧光激发和发射图如图2所示。
实施例3考察底物AAG的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将α-葡萄糖苷酶(2U/mL)与底物AAG(0.2、0.5、1、2、3、4mM)于37℃孵育30min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(邻苯二胺，200μM)，继续反应30min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度。考察底物AAG的浓度对目标物响应的影响，结果如图3A所示。
实施例4底物与酶反应的时间对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将α-葡萄糖苷酶(2U/mL)与底物AAG(2mM)于37℃孵育10、20、30、40、50、60min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(200μM)，继续反应30min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度。考察底物与酶反应的时间对目标物响应的影响，结果如图3B所示。
实施例5OPD的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将α-葡萄糖苷酶(2U/mL)与底物AAG(2mM)于37℃孵育30min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(20、50、100、200、300、400μM)，继续反应30min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度。考察OPD的浓度对目标物响应的影响，结果如图3C所示。
实施例6OPD的反应时间对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将α-葡萄糖苷酶(2U/mL)与底物AAG(2mM)于37℃孵育30min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(200μM)，继续反应5、10、20、30、40min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度。考察OPD的反应时间对目标物响应的影响，结果如图3D所示。
实施例7荧光强度比值与α-葡萄糖苷酶浓度的相关性实验，步骤如下:
将α-葡萄糖苷酶(2U/mL)与底物AAG(2mM)于37℃孵育30min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(200μM)，继续反应30min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度，如图4A所示，荧光强度比值与浓度的相关性结果如图4B所示。
实施例8小牛血清样品中α-葡萄糖苷酶活性的检测，步骤如下：
使用PB缓冲液将血清样品稀释50倍作为基质，随后加入不同浓度的α-葡萄糖苷酶溶液(0.3-1.5U/mL)，与底物AAG(2mM)于37℃孵育30min后，加入MnO2纳米片，反应15min后，再加入OPD(200μM)，继续反应30min，最后加入AgNCs，测定450nm及575nm处的荧光强度，其回收率结果如表1所示。
表1是实施例8中小牛血清样品检测的回收率结果，如表所示，回收率均在97.8％到109％之间，说明复杂基质对α-葡萄糖苷酶的检测不产生明显干扰，该方法具有良好的选择性，可以用于实际样品的测定。
表1
Figure BDA0001612956850000091

Claims (6)

1.一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，步骤如下：
（1）、制备MnO2纳米片；
（2）、制备AgNCs；
（3）、将不同浓度的α-葡萄糖苷酶与底物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸于37℃孵育后，底物AAG在α-葡萄糖苷酶的催化下产生抗坏血酸；
（4）、加入MnO2纳米片，产生的抗坏血酸将MnO2纳米片还原为不具有类氧化酶的Mn2+；
（5）、再加入邻苯二胺，继续反应，邻苯二胺在MnO2纳米片的类氧化酶作用下，氧化生成荧光产物2,3-二氨基吩嗪；不具有类氧化酶的Mn2+，无法将邻苯二胺氧化生成荧光产物2,3-二氨基吩嗪；
（6）、加入AgNCs，荧光产物2,3-二氨基吩嗪与AgNCs发生内滤效应，从而使得AgNCs的荧光被猝灭；
（7）、根据荧光产物2,3-二氨基吩嗪和AgNCs两者荧光强度的比值对α-葡萄糖苷酶的浓度绘制标准曲线；
（8）、根据标准曲线，获得样品中α-葡萄糖苷酶的浓度，完成对α-葡萄糖苷酶的定量检测。
2.根据权利要求1所述的定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤（3）中，底物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸浓度为0.2-4 mM。
3.根据权利要求1所述的定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤（3）中，底物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸与α-葡萄糖苷酶的作用时间为10-60 min。
4.根据权利要求1所述的定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤（5）中，邻苯二胺的浓度为20-400 μM。
5.根据权利要求1所述的定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于：步骤（5）中，邻苯二胺的反应时间为5-40 min。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步骤（7）中，根据荧光产物2,3-二氨基吩嗪和AgNCs在450 nm及575 nm处的荧光强度的比值对α-葡萄糖苷酶的浓度绘制标准曲线。
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